專利名稱：玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及活性分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一段DNA序列，在低溫脅迫下它可以作為啟動(dòng)子調(diào)控基因的表達(dá)，具體涉及一種來(lái)源于玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3并在植物中高度表達(dá)的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。
背景技術(shù)：
中國(guó)是一個(gè)人口眾多的農(nóng)業(yè)大國(guó)，糧食安全生產(chǎn)事關(guān)國(guó)計(jì)民生與社會(huì)穩(wěn)定。低溫傷害(包括冷害和凍害)是影響我國(guó)大部分地區(qū)的嚴(yán)重氣象災(zāi)害，尤其是東北和黃淮海地區(qū)，如東北地區(qū)在1969年、1972年和1976年發(fā)生了 3次嚴(yán)重的低溫冷害，每次均使糧食減產(chǎn)50億千克以上。由于我國(guó)幅員遼闊，地形多樣，低溫冷凍害發(fā)生范圍非常廣，從亞熱帶、 暖溫帶、中溫帶一直到寒溫帶都有冷凍害發(fā)生，如2008年初發(fā)生在我國(guó)南方大部分地區(qū)的雨雪冰凍及低溫冷凍災(zāi)害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)11億多元。目前，冷凍害對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失人們還沒(méi)有太好的辦法。對(duì)于蔬菜等相對(duì)小規(guī)模的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，人們采用了溫室栽培， 可以一定程度上抵御冷凍害對(duì)生產(chǎn)造成的損失，但溫室的建設(shè)無(wú)疑增加了生產(chǎn)成本，用過(guò)的塑料等也容易造成污染。而對(duì)于小麥等需要大面積種植的糧食作物，利用溫室栽培顯然不現(xiàn)實(shí)，人們只能根據(jù)氣象專家對(duì)氣候的預(yù)測(cè)來(lái)避開低溫時(shí)期，但由于氣候的多變性，預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性很低，對(duì)生產(chǎn)指導(dǎo)意義不大。因此，科學(xué)研究者只能轉(zhuǎn)而培育抗低溫的品種。自轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟以來(lái)，科學(xué)家們已經(jīng)得到了很多轉(zhuǎn)基因品種。然而，由于轉(zhuǎn)入的基因大多數(shù)是由組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的，組成型啟動(dòng)子具有高效表達(dá)、且在植物整個(gè)生長(zhǎng)期都表達(dá)的特點(diǎn)，這使得大部分的轉(zhuǎn)基因作物都具有植株矮小的特點(diǎn)，不利于植物的正常生長(zhǎng)。而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，能夠快速有效地誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)抵御不良環(huán)境的影響。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)是它能根據(jù)自身的需求在特定的組織器官、環(huán)境下誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，解決組成型啟動(dòng)子面對(duì)的問(wèn)題。，解決組成型啟動(dòng)子面對(duì)的問(wèn)題。迄今為止，從玉米中分離的逆境誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子很少。目前，分離和鑒定的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子并不多，主要有油菜的bnll5、擬南芥 rc^9A、corlfe和adh、小麥wes 120和玉米mlip 15等基因啟動(dòng)子。其中擬南芥Columbia 品種的基因組中分離得到corlfe基因的啟動(dòng)子，片段大小為900bp，并構(gòu)建了與GUS基因融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入馬鈴薯，進(jìn)行⑶S活性檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯經(jīng)過(guò)低溫處理之后，可檢測(cè) GUS的活性，反之，則檢測(cè)不到GUS的活性，說(shuō)明該啟動(dòng)子受低溫誘導(dǎo)。美國(guó)康涅狄格大學(xué)的 Mariya K等構(gòu)建了 corlfe基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)FAD7基因的質(zhì)粒，將其整合到煙草的基因組中，使煙草獲得了抗低溫的特性。利用低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗低溫基因的高效表達(dá)，從而改良作物的耐低溫性成為目前研究的熱點(diǎn)。然而，目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少。因此，對(duì)于新的抗低溫相關(guān)啟動(dòng)子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用， 以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后啟動(dòng)子研究的重點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子來(lái)源于玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于植物轉(zhuǎn)化的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子真核表達(dá)載體，該載體指導(dǎo)高水平表達(dá)目的基因ZmDBP3的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和5’非翻譯區(qū)。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米成熟胚，該轉(zhuǎn)基因玉米胚能反映啟動(dòng)子誘導(dǎo)活性的高低。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了用于植物轉(zhuǎn)化的載體，所述載體包含帶有ZmDBP3基因的5’非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。隨后利用所述載體在玉米成熟胚中誘導(dǎo)表達(dá)，并觀察到該啟動(dòng)子與低溫誘導(dǎo)相關(guān)的高水平活性。本發(fā)明提供一種獲得的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至-1151bp區(qū)(見序列表)的DNA核苷酸序列，低溫可以在植物中誘導(dǎo)本發(fā)明所述的啟動(dòng)子的高水平活性。獲得的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列源自玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3。一種克隆得到的玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+255bp區(qū)(見序列表)的DNA核苷酸序列，本發(fā)明所述的玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻譯區(qū)能通過(guò)增強(qiáng)導(dǎo)入植物中的目標(biāo)外源基因的翻譯效力，而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于玉米轉(zhuǎn)化的低溫誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體包含玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因 ZmDBP3的5，非翻譯區(qū)。上述用于玉米轉(zhuǎn)化的低溫誘導(dǎo)型載體是指能夠在轉(zhuǎn)基因植物中持久表達(dá)外源基因的二元載體。所述二元載體可以是任何包含T-DNA (轉(zhuǎn)移DNA)的RB (右邊界序列)和 LB (左邊界序列)，能夠在根癌農(nóng)桿菌(Agrobaterium tumefaciens) Ti質(zhì)粒存在下轉(zhuǎn)化植物的二元載體。該載體可以是經(jīng)常用于相關(guān)領(lǐng)域的二元載體，例如PCAMBIA1301載體、 PBI121 載體。一種用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米成熟胚，包含玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻譯區(qū)。本發(fā)明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。關(guān)于本發(fā)明所述的用于植物的誘導(dǎo)型載體(pCAMBIA1301)，所述的玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)在植物表達(dá)載體中位于外源基因的前面。本發(fā)明提供通過(guò)插入本發(fā)明所述的玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)至含有GUS報(bào)告基因的載體中而構(gòu)建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其它有用的外源基因來(lái)代替。本發(fā)明提供一種應(yīng)用低溫誘導(dǎo)型瞬時(shí)表達(dá)的玉米成熟胚。植物能通過(guò)使用根癌農(nóng)桿菌(An，G. 1987，Plant Physiology)或粒子轟擊方法 (Lacorte等，1997，Plant Cell R印orts)將上述植物低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子二元載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明提供來(lái)自玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和 5’非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)使得能夠在植物中進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明的有益效果在于可用于啟動(dòng)抗低溫基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于不耐低溫的植物中使植株獲得抗低溫的性狀，對(duì)于解決低溫地區(qū)糧食危機(jī)、生態(tài)惡化等問(wèn)題都有積極意義。


圖1為玉米(B73)基因組電泳 2 為 ZmDBP3_pro PCR 電泳3為ZmDBP3_pro連T載酶切鑒定電泳 4 為 ZmDBP3-pro 連 pCAMBIA-130IPCR 鑒定電泳5為ZmDBP3-pro連pCAMBIA-1301酶切鑒定電泳6為pCAMBIA 1301 ZmDBP3-Pro轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌PCR鑒定電泳 1 至圖 6 中=Maker 從大到小依次為 1849bp ； 1470bp ； 1090bp ；738bp ；424bp ； 280bp圖7為植物表達(dá)載體構(gòu)建示意8為ZmDBP3啟動(dòng)子的⑶S檢測(cè)(背面)照片
圖9為ZmDBP3啟動(dòng)子的⑶S檢測(cè)(正面)照片圖8和9中ZmDBP3 (a) :4°C處理；ZmDBP3 (b)未處理；35S 應(yīng)用最廣泛的組成型
啟動(dòng)子
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖介紹具體實(shí)施步驟，將能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí)施本發(fā)明。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)施方式
來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的啟動(dòng)子(啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至-1151bp區(qū)的DNA核苷酸序列)，在玉米ZmDBP3基因的 5’區(qū)序列中得到鑒定。玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3登錄在NCBI GenBank (登錄號(hào) FJ805751. 1)，序列表顯示本發(fā)明上述基因的植物低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和5’非翻譯區(qū)的DNA 序列。在本文件的啟動(dòng)子序列表中，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基C用+1示出。并用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站分析了啟動(dòng)子的核心元件。啟動(dòng)子分析網(wǎng)站 http //bioinformatics, psb. ugent. be/webtools/plantcare/ html/。以玉米基因組DNA (圖1)為模板，擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分析， 擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1406bp的條帶(圖2)，并進(jìn)行回收?；厥掌闻cPMD18-T載體連接得到重組質(zhì)粒pMD18-T: :ZmDBP3ftx)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖3)，并測(cè)序。
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更具體地說(shuō)，通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆的玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的啟動(dòng)子和25^p的5’非翻譯區(qū)(見序列表)，上述PCR所用引物詳細(xì)顯示在表1中。對(duì)于PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序:95V 3min ；95°C 30S，58. 5°C 30S,72°C 2min，32 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ；表1:引物
權(quán)利要求
1.一種獲得的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于 SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-Ibp至_1151bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列源自玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的獲得的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，其特征在于一種克隆得到的玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的5，非翻譯區(qū)包含相對(duì)于SEQ ID NO 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的+Ibp至+255bp區(qū)的DNA核苷酸序列。
4.一種用于玉米轉(zhuǎn)化的低溫誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，其特征在于所述植物表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3所述的玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻譯區(qū)。
5.一種用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米成熟胚，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因玉米成熟胚包含權(quán)利要求1所述的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和權(quán)利要求3所述的玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻譯區(qū)。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及活性分析屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種獲得的玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列，包含相對(duì)于SEQ ID NO1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的-1bp至-1151bp區(qū)的DNA核苷酸序列；同時(shí)提供用于玉米轉(zhuǎn)化的低溫誘導(dǎo)型的植物表達(dá)載體，包含玉米低溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列和玉米DRE響應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因ZmDBP3的5′非翻譯區(qū)；用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米成熟胚；SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的PCR引物適于擴(kuò)增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段。本發(fā)明可用于啟動(dòng)抗低溫基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于不耐低溫的植物中使植物獲得抗低溫的性狀，對(duì)于解決低溫地區(qū)糧食危機(jī)有積極意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102399783SQ20111037648
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者余剛, 劉金亮, 張世宏, 李桂華, 潘洪玉, 賈承國(guó), 趙淑莉, 陳宣明 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)