專利名稱：原生質(zhì)體不對(duì)稱融合制備抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程，具體來(lái)說(shuō)涉及一種原生質(zhì)體不對(duì)稱融合創(chuàng)制抗霜霉病結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的育種途徑。
背景技術(shù)：
甘藍(lán)類蔬菜包括結(jié)球甘藍(lán)、花椰菜、綠菜花、球莖甘藍(lán)、芥藍(lán)、抱子甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)等，是我國(guó)人民喜愛并廣為栽培的主要蔬菜類群之一。甘藍(lán)霜霉病是由專性寄生菌寄生霜霉引起的一種世界性病害，這種真菌性病害常引起幼苗和成株葉片枯黃，導(dǎo)致產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降，給甘藍(lán)生產(chǎn)上帶來(lái)極大的損失。而且，目前生產(chǎn)上基本沒(méi)有對(duì)霜霉菌高抗甚至免疫的結(jié)球甘藍(lán)品種，所以選育抗霜霉病的結(jié)球甘藍(lán)品種迫在眉睫。在長(zhǎng)期自然選擇下，抱子甘藍(lán)有許多對(duì)病蟲害具備高度抗性以至免疫力，要利用這些抗性基因，一個(gè)方法是克隆基因，并通過(guò)基因工程手段導(dǎo)入目標(biāo)材料中。但是許多抗病性是受多基因控制，僅分離、導(dǎo)入一個(gè)基因，轉(zhuǎn)基因材料獲得的抗病性常不理想。而且，對(duì)于抗性基因的分析、定位、克隆和轉(zhuǎn)化存在著技術(shù)難度大，周期長(zhǎng)，投資高，以及市場(chǎng)的準(zhǔn)入和接受程度等問(wèn)題。另一個(gè)方法可以通過(guò)有性雜交的手段，向栽培品種引入抗性基因，但是物種間的生殖隔離使常規(guī)的有性雜交非常困難甚至不可能。借助非對(duì)稱體細(xì)胞融合技術(shù)可以克服通過(guò)基因工程手段獲得抗病品種遇到的難題，而且也避免了常規(guī)育種方法中遠(yuǎn)緣雜交不親和的問(wèn)題，同時(shí)與對(duì)稱融合相比，由于形成的雜種中一般只含有供體的部分染色體，因此在提高雜種的育性及縮短育種年限等方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。非對(duì)稱體細(xì)胞融合技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同物種間的抗性基因轉(zhuǎn)移，是進(jìn)一步創(chuàng)造新的育種基礎(chǔ)材料的有效途徑。在蕓薹屬作物中，Kartha等(1974)首次培養(yǎng)油菜葉肉原生質(zhì)體再生植株后，直到 80年代中期才在甘藍(lán)、芥菜、芥藍(lán)、大白菜上取得突破，培養(yǎng)技術(shù)日趨完善。采用原生質(zhì)體融合形成異源四倍體、創(chuàng)造新型胞質(zhì)或核質(zhì)組合、轉(zhuǎn)移人們感興趣的遠(yuǎn)緣物種染色體片段或基因等方面也取得了很大的成績(jī)。如鄧秀新研究組(1997)通過(guò)柑桔體細(xì)胞雜交獲得抗寒、 抗高溫和抗病的雜種后代，夏光敏等(2006 )利用不對(duì)稱體細(xì)胞雜交技術(shù)將近源植物的染色體小片段導(dǎo)入小麥體細(xì)胞中，創(chuàng)制耐鹽、抗旱、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)小麥新種質(zhì)及新品種。所以采用非對(duì)稱體細(xì)胞融合創(chuàng)制抗霜霉病結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)是一條可行的、科學(xué)的途徑，對(duì)于獲得新的抗病種質(zhì)，以及利用這些種質(zhì)培育新的抗病品種具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的意義。

發(fā)明內(nèi)容
解決的問(wèn)題
本發(fā)明是針對(duì)上述情況，利用通過(guò)聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的非對(duì)稱原生質(zhì)體融合，將抱子甘藍(lán)的抗寄生霜霉基因轉(zhuǎn)入具有優(yōu)良性狀的感病結(jié)球甘藍(lán)中，得到具有抗霜霉病的優(yōu)良結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)，用于結(jié)球甘藍(lán)霜霉病抗性育種。技術(shù)方案
原生質(zhì)體不對(duì)稱融合制備抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的方法，其特征在于所述攜帶抗霜霉病基因的抱子甘藍(lán)為供體，供體原生質(zhì)體經(jīng)過(guò)UV射線處理；感霜霉病的具有其他優(yōu)良經(jīng)濟(jì)和農(nóng)藝性狀的結(jié)球甘藍(lán)為受體，通過(guò)原生質(zhì)體融合途徑創(chuàng)制抗霜霉病結(jié)球甘藍(lán)新種種質(zhì)， 該新種質(zhì)是采用下述方法得到的
(1)首先將收集的結(jié)球甘藍(lán)霜霉病菌通過(guò)苗期人工接種，篩選獲得抗十字花科霜霉病的抱子甘藍(lán)基因型，作為抗性基因供體材料，其中該霜霉病菌是十字花科霜霉菌；
(2)受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體的制備采用酶解法分離和純化易感霜霉病結(jié)球甘藍(lán)的下胚軸原生質(zhì)體，獲得受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體；
(3)供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體的制備采用酶解法分離和純化抗霜霉病抱子甘藍(lán)的葉肉原生質(zhì)體，獲得供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體；
(4)利用0.075 J · cm_2 UV射線處理上述的供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體；
(5)用預(yù)融合液分別調(diào)整供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體、受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體的濃度至 2X IO6個(gè)^Γ1，按1:1的比例均勻混合得到原生質(zhì)體懸液，將原生質(zhì)體懸液用40%聚乙二醇融合液融合得到融合產(chǎn)物；
(6)融合后原生質(zhì)體的培養(yǎng)及不定芽誘導(dǎo)，雜種植株再生，得到抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì) BlOll 植株開展度45 cm左右，外葉深綠，葉柄長(zhǎng)，蠟粉中，外葉數(shù)12片，葉球圓，球色綠，球葉厚，中心柱短，單球重0.7 kg，高抗霜霉病，自交親和，配合力好。其中步驟(2)中所述的受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體的具體的制備方法為取在暗培養(yǎng)箱發(fā)芽5 6 d的易感霜霉病結(jié)球甘藍(lán)基因型的下胚軸，放入加有5 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中切段后，再加入5 mL質(zhì)壁分離液，25°C暗培養(yǎng)1 h，質(zhì)壁分離后，去分離液加入5 mL 酶解液V，黑暗條件下，25°C、30 rpm震蕩12 16 h酶解細(xì)胞壁，將酶解后的混合物用孔徑 50 80 ym的尼龍網(wǎng)過(guò)濾、濾液中加入清洗液W5，離心后收集酶液與清洗液溶液界面之間的原生質(zhì)體，再用W5清洗2次，洗滌后得到的結(jié)球甘藍(lán)下胚軸原生質(zhì)體用原生質(zhì)體培養(yǎng)基調(diào)濃度至2 X IO6個(gè)· πιΓ1，獲得受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體；
所述的步驟(3)中所述的供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體的制備方法為取15 20 d繼代一次的抗霜霉病抱子甘藍(lán)無(wú)菌組培苗的完全伸展幼葉2 3片，將其放入加有5 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中切細(xì)條后，黑暗條件下，25°C質(zhì)壁分離5 h，加入2 3 mL酶解液I，黑暗條件下，25°C、30 rpm, 12 16 h酶解細(xì)胞壁，將酶解后的混合物用孔徑為50 80 μπι的尼龍網(wǎng)過(guò)濾、濾液離心后，用0.6 M的蔗糖8 mL+清洗液W5 2 mL重新懸浮細(xì)胞，離心，收集兩溶液界面間的原生質(zhì)體，用清洗液W5溶液洗滌2次，洗滌后收集獲得抱子甘藍(lán)葉肉原生質(zhì)體。其中步驟(6)的培養(yǎng)方法為融合產(chǎn)物培養(yǎng)3 7 d后，經(jīng)顯微鏡觀察到大量的細(xì)胞進(jìn)入一次分裂時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，此后每3 d加入1次該培養(yǎng)基，同時(shí)觀察雜種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，待有細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)時(shí)，轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)基中促使愈傷組織形成，同時(shí)轉(zhuǎn)為正常光照培養(yǎng)；當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)到1 5 mm時(shí)，轉(zhuǎn)移愈傷組織到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)不定芽形成。 分離愈傷組織上形成的不定芽，轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基中，使再生成為完整植株。 整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程均在25°C，Wh/8h(光/暗)光周期條件下進(jìn)行。
4
攜霜霉病抗性基因供體抱子甘藍(lán)和具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)和農(nóng)藝性狀感病受體結(jié)球甘藍(lán)種子，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。根據(jù)江蘇省南京(受體結(jié)球甘藍(lán))、宜興、泰州和浙江杭州、海寧不同地方田間結(jié)球甘藍(lán)的病害癥狀，以及病原物鏡檢和回接鑒定，明確所得病原菌是十字花科霜霉菌(即寄生霜霉)。同時(shí)收集這些地方的病原菌并進(jìn)行活體培養(yǎng)、純化，在抱子甘藍(lán)拉十字期時(shí)進(jìn)行苗期抗性鑒定，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)抱子甘藍(lán)對(duì)江浙一帶寄生霜霉菌高抗甚至免疫；
有益效果
霜霉病是影響結(jié)球甘藍(lán)生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病害。本發(fā)明是利用原生質(zhì)體非對(duì)稱融合方法，結(jié)合UV射線處理，將抱子甘藍(lán)抗霜霉病基因轉(zhuǎn)入感病結(jié)球甘藍(lán)中，得到抗霜霉病兼具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)和農(nóng)藝性狀的結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)。利用原生質(zhì)體非對(duì)稱融合，不僅克服了基因克隆技術(shù)難度大，成本高等問(wèn)題，及常規(guī)育種遠(yuǎn)源雜交不親和等問(wèn)題，通過(guò)原生質(zhì)體融合創(chuàng)制抗霜霉病結(jié)球甘藍(lán)將在結(jié)球甘藍(lán)在結(jié)球甘藍(lán)育種實(shí)踐很有價(jià)值。從而克服了抱子甘藍(lán)抗病基因的分離、克隆及轉(zhuǎn)化等基因工程的技術(shù)難度大，周期長(zhǎng)，投資高等缺點(diǎn)，同時(shí)也克服了抱子甘藍(lán)與結(jié)球甘藍(lán)常規(guī)育種種間雜交不親和的問(wèn)題。由于本研究所用抱子甘藍(lán)材料對(duì)江浙一帶地區(qū)專性寄生霜霉高抗，說(shuō)明該材料對(duì)寄生霜霉病菌具有廣譜的抗性。因此，利用原生質(zhì)體融合得到的抗霜霉病優(yōu)質(zhì)結(jié)球甘藍(lán)推動(dòng)了結(jié)球甘藍(lán)抗病育種，同時(shí)為結(jié)球甘藍(lán)抗病育種提供了新的途徑。


圖1 抱子甘藍(lán)和結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體不對(duì)稱融合方案圖； 圖2 結(jié)球甘藍(lán)霜霉病菌圖，寄生霜霉； 圖3 甘藍(lán)苗期霜霉病抗性鑒定；
圖4 結(jié)球甘藍(lán)下胚軸原生質(zhì)體； 圖5:抱子甘藍(lán)葉肉原生質(zhì)體； 圖6:融合后的雜合原生質(zhì)體； 圖7:細(xì)胞團(tuán)的形成； 圖8 愈傷組織的形成； 圖9 再生芽的培養(yǎng)； 圖10 再生植株。
具體實(shí)施方式
(結(jié)合表和附圖具體說(shuō)明)
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明實(shí)施方式不限于此。本發(fā)明所需培養(yǎng)基和各種溶液如下
原生質(zhì)體培養(yǎng)基B5基本培養(yǎng)基(Gamborg et al.，1976)的大量元素、微量元素和有機(jī)成分+ 150 mg · Γ1水解酪蛋白(casein hydrolysate) + 875 mg · Γ1 二水合氯化鈣 (CaCl2 · 2H20) + 45500 mg · L-1 山梨醇(sorbitol) + 45500 mg · L-1 甘露醇(mannitol) + 2500 mg · L-1 葡萄糖(Glucose) +125 mg · L-1 2-脫氧-核糖(2-Deoxy-D-ribose) + 0. 5 mg.L—1 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)+ 0.2 mg · L—1 萘乙酸(NAA) + 0.2 mg · L—1 6-芐氨基嘌呤(6-BA)，pH 5.8 - 6.0，過(guò)濾滅菌。質(zhì)壁分離液54.6 g · Γ1 山梨醇 + 7. 4 g · Γ1 CaCl2 · 2H20, pH 5. 6 - 5. 8，121 °C高壓滅菌20 min。酶解液V :1. 0% 纖維素酶(Cellulase R-10) + 0. 1% 離析酶(Macerozyme R-10) 溶解在含585 mg · L_12- (N-嗎啡)乙基磺酸(MES) + 100 mg · Γ1磷酸二氫鈉(NaH2PO4) + 1 g · L—1 CaCl2 · 2H20 + 63.7 g · L-1 甘露醇 + 63. 7 g · L-1 山梨醇的溶液中，pH 6. 0，過(guò)濾滅菌。酶解液I :2%纖維素酶+ 0. 5%崩潰酶(Driselase) + 0. 5% (半纖維素酶) (Hemicellulase) + 1.0% 果膠酶(Pectinase)溶解在含 585 mg · L-1 MES+ 100 mg · L-1 NaH2PO4+ 1 g · Γ1 CaCl2 · 2H20+ 63. 7 g · Γ1 甘露醇 + 63. 7 g · Γ1 山梨醇的溶液中，pH 6.0，過(guò)濾滅菌。清洗液W5 :18.4 g · Γ1 二水合氯化鈣 + 9.0 g · Γ1 氯化鈉(NaCl) + 0. 8 g · Γ1 氯化鉀(KCl)+ 1.0 g·!/1 葡萄糖，pH 5.6 - 5. 8，121°C高壓滅菌 20 min。UV 溶液54. 6 g · L-1 山梨醇 + 7. 4 g · L-1 CaCl2 · 2H20, pH 5. 6 - 5. 8，121 °C高壓滅菌20 min。預(yù)融合液0.15 M 山梨醇 + 0. 03 M CaCl2 ·2Η20+ 0. 075 M KCl+ 0. 05Μ三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)，pH 7. 2，過(guò)濾滅菌。40 % 聚乙二醇(PEG1450)的融合液40 % PEG1450+ 0. 3M 葡萄糖 + 50mM CaCl2 · 2H20, pH7. 0，過(guò)濾滅菌。PEG 清洗液 I :13%PEG1450+ 0.1 M 葡萄糖 + 0.067 M 山梨醇 + 0.067 M CaCl2 · 2H20, pH 7. 0，過(guò)濾滅菌。PEG 清洗液 II :6. 7% 的 PEG1450+ 0.05 M 葡萄糖 + 0.083 M 山梨醇 + 0.083 M CaCl2 · 2H20, pH 7. 0，過(guò)濾滅菌。細(xì)胞培養(yǎng)基B5基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和有機(jī)成分+ 150 mg 水解酪蛋白 + 2500 mg · L—1 葡萄糖 + 125 mg · L—1 2-脫氧-核糖 + 20000 mg · L—1 蔗糖 + 0. 5 mg · L-1 2，4-D + 0. 2 mg · L-1 NAA + 0. 2 mg · L-1 6-BA，pH 5. 8 - 6. 0,過(guò)濾滅菌。愈傷組織培養(yǎng)基B5基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和有機(jī)成分+ 150 mg · L—1 水解酪蛋白 + 30000 mg .I71 蔗糖 + 0. 5 mg 4-D+ 0. 2 mg .L-1NAA+ 0. 2 mg .171 6-BA + 10000 mg · L-1 瓊脂，ρΗ5· 8 - 6. 0，121 °C高壓滅菌 20 min。分化培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基的大量元素和微量元素+ B5基本培養(yǎng)基的有機(jī)成分+ 150 mg · L-1 水解酪蛋白 + 30000 mg · L-1 蔗糖 + 0. 2 mg · L-1 NAA+ 2. 0 mg · L_16-BA+ 1000 mg · Γ1 瓊脂，ρΗ5· 8 - 6· 0，121 °C高壓滅菌 20 min。實(shí)施例1
首先確定受體感病結(jié)球甘藍(lán)霜霉病是由十字花科寄生霜霉引起，并收集江浙一帶十字花科寄生霜霉菌進(jìn)行鑒定。同時(shí)將收集到的不同霜霉菌接種到抗病抱子甘藍(lán)材料上，進(jìn)行抗性鑒定，其具體方法如下
根據(jù)江蘇宜興、泰州、南京和浙江杭州、海寧田間感病結(jié)球甘藍(lán)自然發(fā)病材料的病害癥狀，并對(duì)新鮮病葉處理培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)葉背產(chǎn)生大量的霉?fàn)蠲箤?，鏡檢觀察其表型特征鑒定病原物孢囊梗單生或叢生，無(wú)色，無(wú)隔，主枝基部稍膨大，重復(fù)的二叉分枝，頂部二叉狀銳角分枝4 8次，頂端的小梗尖銳、向內(nèi)彎曲稍作鉗狀；每端長(zhǎng)1個(gè)孢子囊，孢子囊無(wú)色，單孢， 卵形、橢圓形和圓形，無(wú)乳突；孢子囊一般是產(chǎn)生在特殊分化的孢囊梗上，孢子囊較易從孢囊梗上脫落。通過(guò)孢囊梗和孢子囊的特征，明確該病原菌是十字花科霜霉菌(即寄生霜霉) (如圖2)。在抱子甘藍(lán)拉十字期時(shí)，將所收集的不同地方的結(jié)球甘藍(lán)十字花科霜霉菌活體培養(yǎng)后，以1 X IO5孢子^L-1的孢子懸浮液(也可用在100倍顯微鏡下觀察，其濃度為每視野平均孢子囊數(shù)50 100個(gè))用于接種。接種材料置黑暗條件下培養(yǎng)M h以便孢子萌發(fā)和穿透，溫度保持10 20 °C，相對(duì)濕度則控制在75 100%，隨后在溫度12 25 °C，弱光照下培養(yǎng)。病情調(diào)查前，在20 °C條件下，再次置黑暗條件下保濕培養(yǎng)M h。采用五點(diǎn)法進(jìn)行三次病情調(diào)查(調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)主要參考李樹德等編著《中國(guó)主要蔬菜抗病育種進(jìn)展》，1995。) 結(jié)果表明抱子甘藍(lán)高抗十字花科霜霉菌(如圖3，表1)。實(shí)施例2
本發(fā)明涉及到原生質(zhì)體非對(duì)稱融合。首先得到受體感霜霉病結(jié)球甘藍(lán)下胚軸原生質(zhì)體和供體抗霜霉病抱子甘藍(lán)葉肉原生質(zhì)體，按照本實(shí)驗(yàn)室建立的蕓苔屬植物下胚軸及葉肉原生質(zhì)體的分離純化方法獲得純凈原生質(zhì)體。然后利用UV射線處理供體葉肉原生質(zhì)體，具體步驟如下
1、結(jié)球甘藍(lán)下胚軸原生質(zhì)體的分離和純化以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)和農(nóng)藝性狀結(jié)球甘藍(lán)為受體，將該品種種子經(jīng)70%乙醇表面消毒30 S，然后用0. 1%取(12溶液滅菌處理15 min，用無(wú)菌水沖洗3 5次，濾紙吸干后接種到無(wú)激素MS基本培養(yǎng)基上萌發(fā)，24 °C暗培養(yǎng)5 6 d后，取50 80個(gè)下胚軸，放入加有5 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基的直徑 9 cm培養(yǎng)皿中，橫切成0. 1 0.5 mm小段后，將培養(yǎng)基吸出，再加入5 mL質(zhì)壁分離液，用封口膜將培養(yǎng)皿封住，放入25°C暗培養(yǎng)箱中靜置1 h，然后去掉質(zhì)壁分離液，加入5 mL酶解液 V，置搖床中25°C、30 rpm，黑暗條件下酶解12 16 h。然后用孔徑50 80 μ m的尼龍網(wǎng)將酶解液過(guò)濾至無(wú)菌離心管中，沿管壁緩慢加入2 4 mL清洗液W5至10 mL,1100 rpm離心10 min.收集酶液與清洗液W5溶液界面之間的原生質(zhì)體于一個(gè)新的離心管中，用W5洗滌液洗滌兩次，每次1000 rpm離心5 min。原生質(zhì)體洗滌完畢后，用原生質(zhì)體培養(yǎng)基調(diào)濃度至2X IO6個(gè)^mr1,用于原生質(zhì)體融合(如圖4)。2、供體抱子甘藍(lán)葉肉原生質(zhì)體的分離和純化以實(shí)施例1中篩選出的霜霉病抗性抱子甘藍(lán)基因型為供體，種子消毒滅菌同結(jié)球甘藍(lán)，無(wú)菌苗培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基中，每15 20 d天繼代一次，實(shí)驗(yàn)中取無(wú)菌組培苗完全伸展的幼葉2 3片，將其放入加有5 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，切成0.5 1 mm寬的細(xì)條，培養(yǎng)皿用封口膜封住，放入暗培養(yǎng)箱中，25°C質(zhì)壁分離5 h。然后加入2 3 mL的酶解液I，置搖床中25°C、30 rpm，黑暗條件下酶解12 16 h。然后用孔徑為50 80 μ m的尼龍網(wǎng)將濾液過(guò)濾至無(wú)菌的離心管中，1000 rpm離心5 min。倒掉上清液，用0.6 M的蔗糖8 mL重新懸浮細(xì)胞，再緩慢加入清洗液W5 2 mL，形成梯度液層，1100 rpm離心10 min。收集兩溶液界面間的原生質(zhì)體于一個(gè)新的離心管中，再用清洗液W5溶液洗滌2次，每次1000 rpm離心5 min。原生質(zhì)體洗滌完畢后， 可繼續(xù)進(jìn)行UV處理(如圖5)。3、UV射線處理供體抱子甘藍(lán)葉肉原生質(zhì)體用UV溶液調(diào)整實(shí)施例2得到的抱子甘藍(lán)葉肉原生質(zhì)體濃度為1 X IO6個(gè)· mL—1，放入培養(yǎng)皿，在皿底形成一薄層，以保證原生質(zhì)體的厚度為1 2層細(xì)胞，放入紫外交聯(lián)儀(CEX-800 Electronic UV Crosslinker, ULTRALUM, Inc.)，紫外線輻照劑量為0. 075 J · cm_2進(jìn)行UV處理，處理后將原生質(zhì)體移入
7一個(gè)新的離心管中，1000 rpm離心5 min。倒掉上清液，收集葉肉原生質(zhì)體以用于原生質(zhì)體融合。實(shí)施例3
本發(fā)明所涉及的不對(duì)稱原生質(zhì)體融合，是采用聚乙二醇(PEG)融合法，步驟如下用預(yù)融合液分別調(diào)整供體抱子甘藍(lán)、受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體濃度至2X IO6 ^mL-1,按1:1的比例均勻混合得到原生質(zhì)體懸液。在直徑為6 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中均勻分布7滴混合原生質(zhì)體溶液，每滴40 yL，靜止放置10 min，使原生質(zhì)體沉積在培養(yǎng)皿底部，然后在每滴兩側(cè)加 60 μ L含40%聚乙二醇(PEG1450)的融合液，靜止5 min，促進(jìn)原生質(zhì)體融合，稍微傾斜培養(yǎng)皿，沿原生質(zhì)體懸液邊緣吸去培養(yǎng)皿中的混合液，隨即小心加入2 mL PEG清洗液I，靜止5 min后吸去，再小心加入2 mL PEG清洗液II，靜止5 min后去掉。用原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)皿兩次，再加入2 mL原生質(zhì)體液體培養(yǎng)基，混勻，調(diào)整原生質(zhì)體密度為IO5 IO6 個(gè)· ml/1，于25°C暗培養(yǎng)。實(shí)施例4
本發(fā)明所涉及的雜種細(xì)胞培養(yǎng)及再生植株誘導(dǎo)，也是獲得抗霜霉病結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，具體步驟如下
1、雜種細(xì)胞培養(yǎng)及再生植株誘導(dǎo)將上述融合的原生質(zhì)體在原生質(zhì)體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 7 d左右，當(dāng)觀察到較多量的細(xì)胞進(jìn)入一次分裂時(shí)，向每培養(yǎng)皿中加入400 μ L細(xì)胞培養(yǎng)基，此后每3 d加入1次細(xì)胞培養(yǎng)基，大約15 d以后有細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)時(shí)，轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)基中促使愈傷組織形成，同時(shí)轉(zhuǎn)為正常光照培養(yǎng)。當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)到約5 mm時(shí)，轉(zhuǎn)移愈傷組織到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)不定芽形成。當(dāng)幼苗的真葉形成時(shí)，轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基中使再生植株正常生長(zhǎng)并生根。上述培養(yǎng)過(guò)程的培養(yǎng)溫度均為25V。2、原生質(zhì)體雜合細(xì)胞鑒定由于葉肉原生質(zhì)體具有綠色的葉綠體，而來(lái)源于暗培養(yǎng)的下胚軸原生質(zhì)體為近白色，因此融合的細(xì)胞中有明顯的葉綠體及白色細(xì)胞質(zhì)存在(如圖6)。此特征可以作為早期鑒別雜種細(xì)胞的標(biāo)志。據(jù)此計(jì)算，本融合處理?xiàng)l件下，融合原生質(zhì)體培養(yǎng)1 d后，隨機(jī)選擇3個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行觀察(顯微鏡視野下雜種細(xì)胞個(gè)數(shù)/視野里總的細(xì)胞數(shù)，5個(gè)視野取其平均值)，計(jì)算原生質(zhì)體的異源融合率為12.3 (如表2)。培養(yǎng)3 5 d后，觀察到細(xì)胞進(jìn)入1 2次分裂，12 d后看到大的細(xì)胞團(tuán)(如圖7)，18 d左右有星狀細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)，此時(shí)轉(zhuǎn)入愈傷組織培養(yǎng)基。40 50 d后愈傷組織約1 5 mm大小(如圖8)，將它們轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽的形成(如圖9)。在幼苗的真葉形成后，及時(shí)轉(zhuǎn)到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基中可獲得生長(zhǎng)正常的植株(如圖10)。3、雜合體結(jié)球甘藍(lán)基本特征和抗性鑒定將獲得在幼苗的真葉形成后，及時(shí)轉(zhuǎn)到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基中可獲得生長(zhǎng)正常的植株，選擇植株開展度45 cm左右，外葉深綠， 葉柄長(zhǎng)，蠟粉中，外葉數(shù)12片左右，葉球圓，球色綠，球葉厚，單球重0.7 kg,自交親和，配合力好。將所得到的BlOll株系進(jìn)行苗期十字花科霜霉菌抗性鑒定，鑒定病源菌和方法同攜抗病基因供體抱子甘藍(lán)抗霜霉病鑒定(圖3)，鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)BlOll在不同地方高抗霜霉菌 (表 1)。表1供體抱子甘藍(lán)和雜合體結(jié)球甘藍(lán)對(duì)不同地方十字花科霜霉菌種抗性鑒定
權(quán)利要求
1.一種原生質(zhì)體不對(duì)稱融合制備抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的方法，其特征在于攜帶抗霜霉病基因的抱子甘藍(lán)為供體，供體的原生質(zhì)體經(jīng)過(guò)UV射線處理；對(duì)霜霉病敏感且具有其它優(yōu)良經(jīng)濟(jì)和農(nóng)藝性狀的結(jié)球甘藍(lán)為受體，通過(guò)原生質(zhì)體不對(duì)稱融合途徑創(chuàng)制抗霜霉病結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)，該新種質(zhì)是采用下述方法得到的(1)首先通過(guò)苗期人工接種，篩選獲得抗十字花科霜霉病的抱子甘藍(lán)基因型，作為抗性基因供體材料；(2)易感霜霉病受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體的制備采用酶解法分離和純化易感霜霉病結(jié)球甘藍(lán)的下胚軸原生質(zhì)體，獲得受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體；(3)抗霜霉病供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體的制備采用酶解法分離和純化霜霉病抗性抱子甘藍(lán)的葉肉原生質(zhì)體，獲得供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體；(4)利用0.075 J · cm_2 UV射線處理上述的供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體；(5)用預(yù)融合液分別調(diào)整供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體、受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體的濃度至 2X IO6個(gè)^Γ1，按1:1的比例均勻混合得到原生質(zhì)體懸液，將原生質(zhì)體懸液用40%聚乙二醇融合液融合得到融合產(chǎn)物，原生質(zhì)體培養(yǎng)基培養(yǎng)，于25°C暗培養(yǎng)；(6)融合后原生質(zhì)體的培養(yǎng)及不定芽誘導(dǎo)，雜種植株再生，得到抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)植株開展度45 cm左右，外葉深綠，葉柄長(zhǎng)，蠟粉中，外葉數(shù)12片左右，葉球圓，球色綠， 球葉厚，中心柱短，單球重0.7 kg，高抗霜霉病，自交親和，配合力好。
2.按照權(quán)利要求1所述原生質(zhì)體不對(duì)稱融合制備抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的方法，其特征在于步驟(2)中所述的受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體的具體的制備方法為取在暗培養(yǎng)箱發(fā)芽 5 6 d的易感霜霉病結(jié)球甘藍(lán)的下胚軸，放入加有5 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中切段后，再加入5 mL質(zhì)壁分離液，25°C暗培養(yǎng)1 h，質(zhì)壁分離后，去分離液加入5 mL酶解液V，黑暗條件下，25°C、30 rpm震蕩12 16 h酶解細(xì)胞壁，將酶解后的混合物用孔徑50 80 μ m 的尼龍網(wǎng)過(guò)濾、濾液中加入清洗液W5，離心后收集酶液與清洗液溶液界面之間的原生質(zhì)體， 再用清洗液W5清洗2次，洗滌后得到的結(jié)球甘藍(lán)下胚軸原生質(zhì)體用原生質(zhì)體培養(yǎng)基調(diào)濃度至2X106個(gè).πιΓ1，獲得受體結(jié)球甘藍(lán)原生質(zhì)體。
3.按照權(quán)利要求1所述原生質(zhì)體不對(duì)稱融合制備抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的方法，其特征在于步驟(3)中所述的供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體的制備方法為取15 20 d繼代一次的抗霜霉病抱子甘藍(lán)無(wú)菌組培苗的完全伸展幼葉2 3片，將其放入加有5 mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中切細(xì)條后，黑暗條件下，25°C質(zhì)壁分離5 h，加入2 3 mL酶解液I，黑暗條件下，25°C、30 rpm, 12 16 h酶解細(xì)胞壁，將酶解后的混合物用孔徑為50 80 ym的尼龍網(wǎng)過(guò)濾、濾液離心后，用0.6 M的蔗糖8 mL+清洗液W5 2 mL重新懸浮細(xì)胞，離心，收集兩溶液界面間的原生質(zhì)體，用清洗液W5溶液洗滌2次，收集獲得供體抱子甘藍(lán)原生質(zhì)體。
4.按照權(quán)利要求1所述原生質(zhì)體不對(duì)稱融合制備抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的方法，其特征在于步驟(6)的培養(yǎng)方法為融合產(chǎn)物培養(yǎng)3 7 d后，經(jīng)顯微鏡觀察到大量的細(xì)胞進(jìn)入一次分裂時(shí)，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，此后每3 d加入1次該培養(yǎng)基，同時(shí)進(jìn)行觀察雜種細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，待有細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)時(shí)，轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)基中促使愈傷組織形成，同時(shí)轉(zhuǎn)為正常光照培養(yǎng)；當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)到1 5 mm時(shí)，轉(zhuǎn)移愈傷組織到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)不定芽形成；當(dāng)幼苗的真葉形成時(shí)，轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基中，使再生植株正常生長(zhǎng)并生根；整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程均在25 °C條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過(guò)原生質(zhì)體不對(duì)稱融合技術(shù)創(chuàng)制抗霜霉病結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的途徑，解決目前生產(chǎn)上基本沒(méi)有對(duì)十字花科霜霉菌高抗甚至免疫的結(jié)球甘藍(lán)品種，以及克服遠(yuǎn)源雜交不親和和基因工程技術(shù)難度大、投資高等問(wèn)題。一種原生質(zhì)體不對(duì)稱融合制備抗霜霉結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)的方法，其特征在于攜帶抗霜霉病基因的抱子甘藍(lán)為供體，供體的原生質(zhì)體經(jīng)過(guò)UV射線處理；對(duì)霜霉病敏感且具有其它優(yōu)良經(jīng)濟(jì)和農(nóng)藝性狀的結(jié)球甘藍(lán)為受體，通過(guò)原生質(zhì)體不對(duì)稱融合途徑創(chuàng)制抗霜霉病結(jié)球甘藍(lán)新種質(zhì)，本發(fā)明將抱子甘藍(lán)抗霜霉病基因轉(zhuǎn)入結(jié)球甘藍(lán)，建立了利用原生質(zhì)體融合；技術(shù)進(jìn)行快速抗病新種質(zhì)的選育體系，建立了現(xiàn)代甘藍(lán)種質(zhì)資源創(chuàng)新及抗病育種高效技術(shù)平臺(tái)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102181424SQ201110074018
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者劉凡, 宗梅, 李建斌, 王神云, 王紅 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院