專利名稱：纖細炭角菌及其分離培養(yǎng)、保存復(fù)壯方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菌及其分離培養(yǎng)、保存復(fù)壯方法，尤其涉及炭角菌及其分離培 養(yǎng)、保存復(fù)壯方法。
背景技術(shù)：
炭角菌科(Xylariaceae)是真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、球殼目的一 科，本科真菌通常有子座，無柄或有柄，?？芍绷ⅲ幽夜麨樽幽覛?，埋生于 子座內(nèi)，通常暗色，有孔口，有喙，單生或聚生，側(cè)絲線形，分枝，成熟時有 所消解，子囊單囊壁，壁薄，頂部常變厚并有頂環(huán)構(gòu)造，遇碘變藍色，大多柱 形、棒形，較少球形，很少消解，子囊孢子單胞，成褐色至黑色，卵形、橢圓 形、紡錘形等，大多有芽縫，有時頂部有膠質(zhì)的附屬物，成粘團射出或溢出， 大多腐生在爛木、樹皮、糞等基物上，最常見的是層炭殼屬、炭團菌屬、炭角 菌屬等，還有一些是弱寄生菌，少數(shù)的種是重要的植物病原菌，本科真菌廣泛 分布于全世界各地，熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為常見，炭角菌作為珍稀物種在我國 分布歲廣但產(chǎn)量積少，天然的子實體貴如黃金，如現(xiàn)在市場上已經(jīng)有的人工培 養(yǎng)的黑柄炭角菌，均采用天然黑柄炭角菌分離得到的菌種，黑柄炭角菌 (Xylaria nignipes)作為炭角菌類中的一種，是一種名貴的食藥用菌,產(chǎn)量極 少，價格昂貴，黑柄炭角菌屬于子囊菌亞門、炭角菌目，是一種生長在地下黑 翅土白蟻廢巢中，黑柄炭角菌包括分子痤和菌核兩部分，上部子痤單根和分支， 高3cm-15cm，長棒狀或近圓柱狀，內(nèi)部實，近白色，外部暗色、灰褐色或黑褐 色，頂部純圓，長1.5cm-12cm,粗0. 2cm-0. 5cm,粗糙，柄長1. 3cm-6cm，粗 0.2cm-0.3cm，有縱皺，基部延伸呈根狀，子囊殼突起，半埋生，呈長方橢圓形，680-780*310-400um，孔口疣狀，暗黑色，子囊呈圓筒狀,孢子近橢圓形、不 等邊或半扁球形，褐色，4-5.2*6-3um，菌株菌絲呈白色毛狀、細長，黑柄炭 角菌菌絲體經(jīng)薄層層折能顯示三個亮藍色熒光斑點；其他炭角菌有委陵菜生炭
角菌(XylariapotentillaeA. SXusp. nov.)，該種子座直立，頭部分叉或柄 基分枝，地上部分高2 4. 5cm，頂端可孕，子囊座柱狀或圓錐狀或扁平，長 1 3cm，寬3 7腿，表面精糙，桑葚狀，黑色5內(nèi)部蠟質(zhì)，中實，白色，柄柱 狀，直或扭轉(zhuǎn)，具縱皺折，地下具延伸的假根，子囊殼卵圓形，450 500X200 300ym，孔口突出，盾狀或疣狀，子囊棒狀，70 100X6 8um， 8孢子，頂 端遇Melzer's試劑變藍部分為長方體狀，6X2.5um，子囊孢于單行排列，梭 形、不等邊橢圓形至半球形，10 163X5 7.5um，成熟后褐至黑褐色，光滑， 芽縫不明顯，直，稍短于孢子長度。側(cè)絲多，細長，徑15um，無色，無隔； 再如筆狀炭角菌，子座一般不分枝，罕分枝呈叉狀，圓柱狀，高1.8-8cm,粗 0.3-0.9cm，表面黑色，稍皺，內(nèi)部白色，充實近木質(zhì),柄短，黑色，長0.4-lcm， 子囊殼近球形，埋生于子座內(nèi)，炭色，表面黑色，孔口稍凸起，有龜裂紋， 300-560 ymX220-430 um;子囊棒狀，有孢子部分為50-70u mX4-6u m，內(nèi)有 孢子8個，單行排列；孢子橢圓形至近紡綞形，稍歪斜，6-10umX3.5-4um， 可做藥用；再如多角炭角菌目、炭角菌科、炭角菌屬，形態(tài)特征:子座一般中 等，單生或幾個在基部連在一起，干時質(zhì)地較硬，上部呈棒形、圓柱形、橢圓形、 亞鈴形、近球形或扁曲，高3-12cm,粗0. 5-2. 2cm，內(nèi)部肉色，表皮多皺，暗色或 黑褐色至黑色；另外還有叢枝炭角菌、總狀炭角菌，鹿角炭角菌等。但目前炭 角菌種類依然不足，有待進一步研發(fā)、探究，而纖細炭角菌[Xylaria gracillima]是黑翅土白蛟蚊巢中的共生菌和寄生菌，在自然條件下纖細炭角 菌不能獨立生長，而是和眾多雜菌共生在黑翅土白蚊蚊巢中，并很難分離提取及大批量生產(chǎn)更難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的炭角菌種類少、很難分離提取的問題提供了纖 細炭角菌。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決-選取沒有污染的、成巢三年以上的黑翅土活白蚊主巢，用無菌器械把黑翅
土活白蚊主巢從地下取出，直接裝入無菌容器中，立即全封閉，放入5'C的環(huán) 境下，使黑翅土活白蚊主巢中的黑翅土活白蚊自然死亡，待黑翅土活白蚊死亡 后，將容器中的二氧化碳氣體的體積比由0.03%提高到1%-2%，將容器再次全 封閉，存放在2(TC黑暗環(huán)境中，逐步培養(yǎng)出纖細炭角菌(Xylariagracillima)， 該菌種于2006年被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會"普通微生物中心"， 登記入冊編號CGMCC No. 1625。該纖細炭角菌形態(tài)特征為該纖細炭角菌子 實體細長呈線形，直或彎曲，長5-15.6cm，粗0.2-0.3 cm,下部粗達0. 5 cm, 有分枝，幼枝灰白或灰黑色或帶灰蘭色，上部色淺，靠頂端灰白至污白色具細 絨毛，內(nèi)部充實暗色，自然狀態(tài)下可以產(chǎn)生近球形的子囊殼，突出于子座表面, 由上述可知纖細炭角菌形態(tài)特征與目前已知道的其他炭角菌菌種不同，屬于一 新的炭角菌菌種。
本發(fā)明的另一個目的是針對纖細炭角菌很難分離提取及大批量生產(chǎn)難度 很大的問題，提供了纖細炭角菌的分離培養(yǎng)、保存復(fù)壯方法。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決
纖細炭角菌的分離培養(yǎng)方法，包括下列步驟
第一步從自然界地下的土層下取出成巢三年以上的黑翅土活白蚊主巢， 用無菌器械把黑翅土活白蚊主巢從地下取出，直接裝入無菌容器中，立即全封閉，放入5r的環(huán)境下，使黑翅土活白蛟主巢中的黑翅土活白蚊自然死亡，待
黑翅土活白蚊死亡后，將容器中的二氧化碳氣體的體積比由O. 03%提高到1%-2%，
將容器再次全封閉，存放在2crc黑暗環(huán)境中；
第二步經(jīng)過5-10天，當(dāng)與黑翅土活白蛟主巢共生的纖細炭角菌菌種中
逐步出現(xiàn)纖細炭角菌優(yōu)勢菌時，讓優(yōu)勢菌在全封閉的容器中保存30-50天后， 優(yōu)勢菌上逐步形成銀白色菌絲體，復(fù)蓋整個黑翅土活白蚊主巢并產(chǎn)生菌絲的代 謝產(chǎn)物；
第三步銀白色菌絲體再經(jīng)過15-20天后逐步形成菌索，5-8天后，打開 容器，讓自然空氣流入容器中，降低容器中的二氧化碳含量，采用開放式培養(yǎng) 方法，菌索逐步生成成熟子實體；
第四步將成熟子實體，用無菌水沖洗2-5次，再用70%濃度的酒精在成 熟子實體表面進行滅菌后，用刀片將其切成3mm長的塊狀斜面體，接種在改良 培養(yǎng)基上面；
所述的改良培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉 5-10克/升、磷酸二氫鉀1-2克/升、磷酸氫二鉀0. 5-1克/升、瓊脂20克/升； 第五步將上步的塊狀成熟子實體，放在2(TC-25"C下培養(yǎng)8天，當(dāng)接種處周 圍長出薄薄的一層灰白色的菌絲后，再培養(yǎng)1-2天，當(dāng)菌絲布滿整個改良培養(yǎng) 基表面時，即可得纖細炭角菌菌絲體，纖細炭角菌菌絲體再慢慢生長發(fā)育形成 纖細炭角菌菌索，最終成纖細炭角菌。
纖細炭角菌的保存復(fù)壯方法，包括下列步驟
纖細炭角菌菌種保存在醫(yī)用低溫冰箱中，經(jīng)30分鐘復(fù)蘇后，在無菌室中 用接種刀切成邊長為2mm的正方體方塊，接入新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在25'C下 靜止暗培養(yǎng)5天，等到菌絲長滿斜面后，放入溫度保持在4X:的冰箱中保存。上述過程中所用到的斜面培養(yǎng)基配方為馬鈴薯100克/升、天然白蟻巢
組織200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉5-10克/升、磷酸二氫鉀1-2克/升、
磷酸氫二鉀0. 5-1克/升、瓊脂20克/升、pH為5-6。
按照本發(fā)明的技術(shù)方案，提供了纖細炭角菌新菌株，導(dǎo)致目前的炭角菌種 類增加，同時提供纖細炭角菌的分離培養(yǎng)、保存復(fù)壯方法，解決了纖細炭角菌 很難分離提取及難運用于大批量工業(yè)生產(chǎn)的難題。
保藏信息
生物材料分類命名纖細炭角菌(Xylaria gracillima);
保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏編號CGMCC No. 1625; 保藏日期2006年02月24日；
保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所。
具體實施例方式
下面通過具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細描述 實施例1，纖細炭角菌的分離培養(yǎng)方法，包括下列步驟 第一步從自然界地下的土層下取出成巢三年以上的黑翅土活白蚊主巢， 用無菌器械把黑翅土活白蚊主巢從地下取出，直接裝入無菌容器中，立即全封 閉，放入5'C的環(huán)境下，使黑翅土活白蚊主巢中的黑翅土活白蚊自然死亡，待 黑翅土活白蚊死亡后，將容器中的二氧化碳氣體的體積比由0.03%提高到1%,
將容器再次全封閉，將容器存放在20。C黑暗環(huán)境中；
第二步經(jīng)過5天，當(dāng)與黑翅土活白蚊主巢共生的纖細炭角菌菌種中逐步
出現(xiàn)纖細炭角菌優(yōu)勢菌時，讓優(yōu)勢菌在全封閉容器中保存30天后，優(yōu)勢菌上 逐步形成銀白色菌絲體，復(fù)蓋整個黑翅土活白蚊主巢并產(chǎn)生菌絲的代謝產(chǎn)物；第三步銀白色菌絲體再經(jīng)過15天后逐步形成菌索，5天后，打開容器， 讓自然空氣流入容器中，降低容器中的二氧化碳含量，采用開放式培養(yǎng)方法， 菌索逐步生成成熟子實體；第四步將成熟子實體，用無菌水沖洗2次，再用70%濃度的酒精在成熟 子實體表面進行滅菌后，用刀片將其切成3mm長的塊狀斜面體，接種在改良培 養(yǎng)基上面；所述的改良培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉5 克/升、磷酸二氫鉀l克/升、磷酸氫二鉀0.5克/升、瓊脂20克/升； 第五步將上步的塊狀成熟子實體，放在2CTC下培養(yǎng)8天，當(dāng)接種處周圍長出 薄薄的一層灰白色的菌絲后，再培養(yǎng)1天，當(dāng)菌絲布滿整個改良培養(yǎng)基表面時， 即可得纖細炭角菌菌絲體，纖細炭角菌菌絲體再慢慢生長發(fā)育形成纖細炭角菌 菌索，最終成纖細炭角菌。實施例2，纖細炭角菌的分離培養(yǎng)方法，包括下列步驟第一步從自然界地下的土層下取出成巢三年以上的黑翅土活白蚊主巢，用無菌器械把黑翅土活白蚊主巢從地下取出，直接裝入無菌容器中，立即全封閉，放入5。C的環(huán)境下，使黑翅土活白蚊主巢中的黑翅土活白蚊自然死亡，待 黑翅土活白蚊死亡后，將容器中的二氧化碳氣體的體積比由0. 03%提高到2%，將容器再次全封閉，將容器存放在20。C黑暗環(huán)境中；第二步經(jīng)過10天，當(dāng)與黑翅土活白蚊主巢共生的纖細炭角菌菌種中逐 步出現(xiàn)纖細炭角菌優(yōu)勢菌時，讓優(yōu)勢菌在全封閉的容器中保存50天后，優(yōu)勢 菌上逐步形成銀白色菌絲體，復(fù)蓋整個黑翅土活白蚊主巢并產(chǎn)生菌絲的代謝產(chǎn) 物；第三步銀白色菌絲體再經(jīng)過20天后逐步形成菌索，8天后，打開容器，讓自然空氣流入容器中，降低容器中的二氧化碳含量，采用開放式培養(yǎng)方法， 菌索逐步生成成熟子實體；第四步將成熟子實體，用無菌水沖洗5次，再用70%濃度的酒精在成熟 子實體表面進行滅菌后，用刀片將其切成3mm長的塊狀斜面體，接種在改良培 養(yǎng)基上面；所述的改良培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉 10克/升、磷酸二氫鉀2克/升、磷酸氫二鉀l克/升、瓊脂20克/升； 第五步將上步的塊狀成熟子實體，放在25。C下培養(yǎng)8天，當(dāng)接種處周圍長出 薄薄的一層灰白色的菌絲后，再培養(yǎng)2天，當(dāng)菌絲布滿整個改良培養(yǎng)基表面時， 即可得纖細炭角菌菌絲體，纖細炭角菌菌絲體再慢慢生長發(fā)育形成纖細炭角菌 菌索，最終成纖細炭角菌。實施例3，纖細炭角菌的分離培養(yǎng)方法，包括下列步驟第一步從自然界地下的土層下取出成巢三年以上的黑翅土活白蚊主巢，用無菌器械把黑翅土活白蚊主巢從地下取出，直接裝入無菌容器中，立即全封閉，放入5"的環(huán)境下，使黑翅土活白蚊主巢中的黑翅土活白蚊自然死亡，待 黑翅土活白蚊死亡后，將容器中的二氧化碳氣體的體積比由O. 03%提高到1. 5%， 將容器再次全封閉，將容器存放在20。C黑暗環(huán)境中；第二步經(jīng)過8天，當(dāng)寄生在黑翅土活白蚊主巢上的纖細炭角菌菌種中逐步出現(xiàn)纖細炭角菌優(yōu)勢菌時，讓優(yōu)勢菌再在全封閉的容器中保存40天后，優(yōu)勢菌上逐步形成銀白色菌絲體，復(fù)蓋整個黑翅土活白蚊主巢并產(chǎn)生菌絲的代謝 產(chǎn)物；第三步銀白色菌絲體再經(jīng)過17天后逐步形成菌索6天后，打開容器，讓自然空氣流入容器中，降低容器中的二氧化碳含量，采用開放式培養(yǎng)方法，菌索逐步生成成熟子實體；第四步將成熟子實體，用無菌水沖洗4次，再用70%濃度的酒精在成熟 子實體表面進行滅菌后，用刀片將其切成3mm長的塊狀斜面體，接種在改良培 養(yǎng)基上面；所述的改良培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉7 克/升、磷酸二氫鉀1.5克/升、磷酸氫二鉀0.8克/升、瓊脂20克/升； 第五步將上步的切成塊狀斜面體的成熟子實體，放在23。C下培養(yǎng)8天，當(dāng)接 種處周圍長出薄薄的一層灰白色的菌絲后，再培養(yǎng)1.5天，當(dāng)菌絲布滿整個改 良培養(yǎng)基表面時，即可得纖細炭角菌菌絲體，纖細炭角菌菌絲體再慢慢生長發(fā) 育形成纖細炭角菌菌索，最終成纖細炭角菌。實施例4，纖細炭角菌的保存復(fù)壯方法，包括下列步驟 將纖細炭角菌菌種保存在醫(yī)用低溫冰箱中，經(jīng)30分鐘復(fù)蘇后，在無菌室 中用接種刀切成邊長為2mm的正方體方塊，接入新鮮斜面培養(yǎng)基上，在25'C下 靜止暗培養(yǎng)5天，等到菌絲長滿斜面后，放入溫度保持在4'C的冰箱中保存。上述過程中所用到斜面培養(yǎng)基配方馬鈴薯100克/升、天然白蟻巢組織 200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉5克/升、磷酸二氫鉀1克/升、磷酸氫二 鉀0.5克/升、瓊脂20克/升、pH為5。實施例5，纖細炭角菌的保存復(fù)壯方法，包括下列步驟 將纖細炭角菌菌種保存在冰箱中，經(jīng)30分鐘復(fù)蘇后，在無菌室中用接種 刀切成邊長為2mm的正方體方塊，接入新鮮的斜面培養(yǎng)基上，25"C下靜止暗培養(yǎng)5天，等到菌絲長滿斜面后，放入溫度保持在4t:的冰箱中保存。上述過程中所用到的斜面培養(yǎng)基配方為馬鈴薯100克/升、天然白蟻巢 組織200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉10克/升、磷酸二氫鉀2克/升、磷酸氫二鉀l克/升、瓊脂20克/升、pH為6。總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所作 的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.纖細炭角菌(Xylaria gracillima)，CGMCC No.1625。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖細炭角菌，其特征在于所述的纖細炭角菌的子實體細長呈線形，直或彎曲，長5-15.6cm，粗0.2-0. 3 cm,下部粗達0. 5 cm，有分枝，幼枝灰白或灰黑色或帶灰蘭色，上部色淺，靠頂端灰白至污白色具細絨毛，內(nèi)部充實暗色，自然狀態(tài)下可以產(chǎn)生近球形的子囊殼，突出于子座表面。
3. 權(quán)利要求1或2所述的纖細炭角菌的分離培養(yǎng)方法，其特征在于包括下列步驟第一步從自然界地下的土層下取出成巢三年以上的黑翅土活白蚊主巢，用無菌器械把黑翅土活白蚊主巢從地下取出，直接裝入無菌容器中，立即全封閉，放入5T:的環(huán)境下，使黑翅土活白蚊主巢中的黑翅土活白蚊自然死亡，待黑翅土活白蚊死亡后，將容器中的二氧化碳氣體的體積比由0.03%提高到1%-2%，將容器再次全封閉，存放在2(TC黑暗環(huán)境中；第二步經(jīng)過5-10天，當(dāng)共生在黑翅土活白蚊主巢中的纖細炭角菌菌種中逐步出現(xiàn)纖細炭角菌優(yōu)勢菌時，讓優(yōu)勢菌再在全封閉的容器中保存30-50天后，優(yōu)勢菌上逐步形成銀白色菌絲體，復(fù)蓋整個黑翅土活白蚊主巢并產(chǎn)生菌絲的代謝產(chǎn)物；第三步銀白色菌絲體再經(jīng)過15-20天后逐步形成菌索，5-8天后，打開容器，讓自然空氣流入容器中，降低容器中的二氧化碳含量，采用開放式培養(yǎng)方法，菌索逐步形成成熟子實體；第四步將成熟子實體，用無菌水沖洗2-5次，再用70%濃度的酒精在成熟子實體表面進行滅菌后，用刀片將其切成3mm長的塊狀斜面體，接種在改良培養(yǎng)基上面；所述的改良培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉5-10克/升、磷酸二氫鉀1-2克/升、磷酸氫二鉀0. 5-1克/升、瓊脂20克/升；第五步將上步的塊狀成熟子實體，放在20-25匯下培養(yǎng)8天，當(dāng)接種處周圍長出薄薄的一層灰白色的菌絲后，再培養(yǎng)1-2天，當(dāng)菌絲布滿整個改良培養(yǎng)基表面時，即得纖細炭角菌菌絲體，纖細炭角菌菌絲體再慢慢生長發(fā)育形成纖細炭角菌菌索，最終成纖細炭角菌。
4.權(quán)利要求1或2所述的纖細炭角菌的保存復(fù)壯方法，其特征在于所述的纖細炭角菌保存在醫(yī)用低溫冰箱中，經(jīng)30分鐘復(fù)蘇后，在無菌室中，用接種刀切成邊長為2毫米的正方體方塊，接入新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在25X:下靜止暗培養(yǎng)5天，等到纖細炭角菌菌絲長滿斜面后，放入溫度保持在4。C的冰箱中保存；所述的斜面培養(yǎng)基配方為馬鈴薯100克/升、天然白蟻巢組織200克/升、葡萄糖20克/升、蠶蛹粉5-10克/升、磷酸二氫鉀1-2克/升、磷酸氫二鉀0.5-1克/升、瓊脂20克/升、pH為5-6。
全文摘要
本發(fā)明涉及菌及其分離培養(yǎng)、保存復(fù)壯方法，公開了纖細炭角菌及其分離培養(yǎng)、保存復(fù)壯方法，纖細炭角菌(Xylaria gracillima)，CGMCC No.1625；分離培養(yǎng)法是取出自然界土層下成巢三年以上的黑翅土活白蚊主巢裝入無菌容器中，全封閉后再分離出纖細炭角菌成熟子實體，再將其接種在改良培養(yǎng)基上面分離培養(yǎng)出纖細炭角菌；保存復(fù)壯方法是將纖細炭角菌保存在醫(yī)用低溫冰箱中復(fù)蘇后，在無菌室中接入新鮮的斜面培養(yǎng)基上，等到纖細炭角菌菌絲長滿斜面后放入4℃冰箱保存；本發(fā)明導(dǎo)致目前的炭角菌種類增加，并解決了纖細炭角菌很難分離提取及難運用于大批量工業(yè)生產(chǎn)的難題。
文檔編號A01H15/00GK101653097SQ20091009995
公開日2010年2月24日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日
發(fā)明者朱志熊 申請人:浙江三禾生物工程有限公司;朱志熊