解磷細(xì)菌及其分離和培養(yǎng)方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域；涉及一種解磷細(xì)菌及其分離和培養(yǎng)方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在我國(guó)南方，土壤酸化是一個(gè)突出而普遍的問(wèn)題，已成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境質(zhì) 量的主要因素之一。土壤酸化，實(shí)質(zhì)上是指土壤接受輸入其中的H+后，H+與土壤膠體上的鹽 基性陽(yáng)離子發(fā)生交換反應(yīng)，從而吸附在土粒表面，交換下來(lái)的鹽基性陽(yáng)離子則隨滲漏水淋 失；另一方面，土壤表面H+又自發(fā)地與礦物晶格表面的鋁反應(yīng)，迅速轉(zhuǎn)化為交換性鋁，導(dǎo)致 土壤鹽基性陽(yáng)離子減少，氫、鋁離子增加，土壤pH值降低，有毒金屬離子活性增大。結(jié)果是， 土壤酸化不僅導(dǎo)致鋁、錳和氫對(duì)植物的毒害；還造成土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化與釋放困難，尤 其表現(xiàn)在磷和鉀的缺乏上；土壤過(guò)酸還會(huì)明顯影響土壤中微生物的活動(dòng)、有機(jī)質(zhì)的合成和 分解、微量元素的有效性以及土壤保持養(yǎng)分的能力等，從而影響土壤生態(tài)環(huán)境質(zhì)量和作物 的生長(zhǎng)。
[0003] 缺磷是造成土壤酸化問(wèn)題的一個(gè)重要因素，因此增施磷肥可減少玉米、燕麥、三葉 草和大麥等植株體內(nèi)過(guò)量陽(yáng)離子的含量，減少土壤酸化程度?；瘜W(xué)磷肥的施用，雖然在一定 條件下增加了土壤有效磷的含量，但是施入的磷肥常因與土壤中的〇 &2+462+、？63+、41 3+結(jié)合 形成難溶性磷酸鹽而喪失其有效性，一般情況下只有5% -25%的磷肥能被當(dāng)季作物吸收。 磷肥施用過(guò)多時(shí)，則不僅增加農(nóng)業(yè)成本，還會(huì)使土壤中不能被作物吸收利用的無(wú)效磷因積 累過(guò)多引起土壤板結(jié)；過(guò)多的土壤磷素也容易隨水土流失迀移進(jìn)入水體，導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng) 化，造成環(huán)境污染。因此，尋求活化土壤中作物難利用磷的途徑或方法，提高磷肥利用率，不 僅對(duì)農(nóng)業(yè)的持續(xù)發(fā)展和生態(tài)系統(tǒng)的維護(hù)，都具有重要的意義，也為解決植物根際酸化問(wèn)題 提供了保障。
[0004]解磷微生物（Phosphate-solubilizingmicroorganism,PSM)是一類能夠?qū)⒅参?難以吸收的磷轉(zhuǎn)化為可利用狀態(tài)的微生物。解磷微生物在高效解磷的同時(shí)，不會(huì)造成生存 介質(zhì)pH值的降低，且由于解磷微生物不僅為根系提供磷素營(yíng)養(yǎng)，還促進(jìn)根系對(duì)N、K、Ca、 Mg、Fe、Zn等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，很大程度上減輕了由于營(yíng)養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的根際酸化作用。因 而，利用解磷微生物來(lái)提高土壤磷素的利用率，并通過(guò)微生物來(lái)影響根系分泌物的種類與 數(shù)量，有助于改善和緩解柱花草等植物根際土壤酸化問(wèn)題，是一條值得探索的途徑。
[0005] 解磷微生物包括細(xì)菌、真菌和放線菌。解磷微生物有強(qiáng)烈的根際效應(yīng)，即解磷微生 物的種類、數(shù)量、分布和菌種與根際環(huán)境間相互關(guān)系等均受根際微域環(huán)境的影響。一方面， 根系分泌物為微生物生長(zhǎng)繁殖提供了碳源等能源，有利于微生物生長(zhǎng)發(fā)育；另一方面，根際 微生物的活動(dòng)和代謝作用，又影響植物根系營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和根系分泌物的釋放。當(dāng)解磷微 生物作為菌肥施入作物根際后，一方面，其不斷地氧化根系分泌的葡萄糖和其他碳水化合 物以獲得能量，隨著解磷微生物在根際定殖、生長(zhǎng)繁殖，所需能量越多，就進(jìn)一步刺激根系 分泌更多的葡萄糖等能源物質(zhì)；另一方面，解磷微生物通過(guò)代謝活動(dòng)溶解根際的難溶性磷 化物，補(bǔ)充了植物的磷素營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)促進(jìn)N、K、Ca、Mg、Fe、Zn等其他營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，不僅刺 激植物快速生長(zhǎng)，充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，減少了根系有機(jī)酸、磷酸酶等物質(zhì)的分泌，在很大程度 上減輕了植物由于營(yíng)養(yǎng)缺乏而導(dǎo)致的根際酸化現(xiàn)象。
[0006] 從農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展來(lái)看，提高土壤磷庫(kù)中難溶性磷素資源的利用率是解決磷缺 乏問(wèn)題的最佳途徑，利用解磷微生物制成微生物肥料具有重大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值及強(qiáng)勁的市 場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。但是，由于解磷微生物的種類繁多，分解機(jī)制不盡相同且很復(fù)雜，解磷微生物做 成菌劑施入土壤后，其活動(dòng)規(guī)律和消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)以及解磷作用的發(fā)揮條件都不大了解，以致于 解磷微生物在我國(guó)的研宄近幾十年，所篩選的解磷菌株的解磷效果還是不太理想。例如，中 國(guó)專利申請(qǐng)CN201010590115. 2公開(kāi)了一種解磷真菌；然而在篩選解磷真菌時(shí)采集的樣品 來(lái)源范圍小，使得所篩選的真菌種類較少，且在進(jìn)一步純化過(guò)程中容易失去解磷能力。中國(guó) 專利申請(qǐng)CN201010532768. 5公開(kāi)了一種從田間土壤分離到的枯草芽孢桿菌，但該菌株僅 對(duì)土壤有機(jī)磷具有解磷作用，對(duì)難溶性無(wú)機(jī)磷則效果不佳。
[0007] 因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種新的具有高效解磷效果的解磷微生物及其分離和培養(yǎng)方 法和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的之一是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有高效解磷效果的解磷微生 物。
[0009] 本發(fā)明目的之二是提供一種上述解磷微生物的分離和培養(yǎng)方法。
[0010] 本發(fā)明目的之三是提供一種上述解磷微生物的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：一種解磷細(xì)菌，其為泛菌屬（Pantoea spp.)，wpm-03,已于2012年2月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址： 中國(guó)湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，郵編430072;保藏編號(hào)為CCTCC No:M2012017〇
[0012] 上述解磷細(xì)菌wpm-03為革蘭氏陰性桿菌；菌落呈圓形或橢圓形、表面光滑、凸透、 質(zhì)地松軟、不透明、邊緣完整、淡黃色；或有菌株呈假根狀、邊緣為絲狀。生長(zhǎng)速度快，接種 24小時(shí)后可在卵黃培養(yǎng)基上觀察到生長(zhǎng)。
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供了一種上述解磷細(xì)菌wpm-03的分離方法，其特征在于：采 集紅樹(shù)林根際土壤，加無(wú)菌水制成稀釋液，用卵黃平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選出溶磷圈最大的若 干菌株；繼續(xù)用蒙金娜液體有機(jī)磷培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選出培養(yǎng)基上清液中可溶性磷含量最高 的菌株；進(jìn)行鑒定，得到所述解磷細(xì)菌wpm-03。
[0014] 所述卵黃平板培養(yǎng)基為蛋白胨l〇g，牛肉膏3g，NaCl5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL， pH值 7.0。
[0015] 所述蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基為葡萄糖10g，（NH4)2S040. 5g，NaCl0? 3g，KC1 0? 3g， FeS04 ? 7H20 0? 03g，MnS04 ? 4H20 0? 03g，MgS04 ? 7H20 0? 3g，卵磷脂 1. 0g，CaC035g，酵母膏 〇? 4g，蒸餾水 1000mL，pH7. 0 ~7. 5。
[0016] 又一方面，本發(fā)明提供了上述解磷細(xì)菌wpm-03的培養(yǎng)方法，其特征在于：以蔗糖 作為碳源，以硝酸鉀為氮源，pH值6. 5~8. 5,溫度28~32°C。
[0017] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)方法為蔗糖5. 0g/l，KN031. 50g/l，pH為7. 0， 溫度為28°C
[0018] 最后，本發(fā)明還提供了上述解磷細(xì)菌wpm-03在制備生物肥料中的應(yīng)用。
[0019] 所述生物肥料用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)和/或溶解土壤中有機(jī)磷，從而減輕植物根際酸 化。
[0020] 所述生物肥料的制備方法如下：取保存的解磷細(xì)菌wpm-03,活化12小時(shí)后，涂布 于有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48小時(shí)，待長(zhǎng)出菌落后，刮入無(wú)菌水中，于 旋轉(zhuǎn)器上旋轉(zhuǎn)打散菌落，利用比濁法，通過(guò)測(cè)定菌懸液D044(l來(lái)進(jìn)行調(diào)制，調(diào)至含菌量達(dá)到 109個(gè) /mL〇
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明篩選出的解磷細(xì)菌wpm-03,對(duì)有機(jī)磷的降解能力高，同時(shí)能夠促進(jìn)植 物生長(zhǎng)，并且能夠明顯緩解柱花草根際酸化。
[0023] (2)該菌株擴(kuò)大培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，培養(yǎng)基成本低，可以大規(guī)模培養(yǎng)，制備成生物肥料。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1 :解磷細(xì)菌wpm-03的篩選及鑒定
[0025] 1按照下列方法步驟配制培養(yǎng)基和試劑
[0026] 1. 1培養(yǎng)基
[0027] 卵黃培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH7.0。分 裝滅菌，臨用時(shí)每50ml加入新鮮蛋黃液3mL(蛋黃與生理鹽水等比例混合），用無(wú)菌吸管吸 取3mL蛋黃液加入已融化的培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基溫度不宜過(guò)高，約在45°C左右加入蛋黃液較 為合適，加入蛋黃液時(shí)也應(yīng)緩緩加入，以免產(chǎn)生過(guò)多氣泡），充分混勻后，倒平板。
[0028] 牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL，pH7. 0。
[0029] 蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10g，（NH4)2S040. 5g，NaCl0? 3g，KC1 0? 3g， FeS04 ? 7H20 0? 03g，MnS04 ? 4H20 0? 03g，MgS04 ? 7H20 0? 3g，卵磷脂 1. 0g，CaC035g，酵母膏 〇? 4g，蒸餾水 1000ml，pH7. 0 ~7. 5。
[0030] 1. 2試劑
[0031] 鉬酸銨-硫酸溶液：18lmL濃硫酸加入800mL蒸餾水中，加細(xì)碎的鉬酸銨25克，攪 拌溶解加水至l〇〇〇mL(約6. 5NH2S04)。
[0032] 酒石酸銻鉀-阿拉伯樹(shù)膠溶液：阿拉伯樹(shù)膠2g，加水200mL，加熱溶解，注入800mL 水中，攪拌均勻，加酒石酸銻鉀〇. 63g，攪拌溶解，此液不宜久存，根據(jù)用量酌情少配。
[0033] 鉬銻抗顯色液：取試劑鉬酸銨-硫酸溶液100mL加蒸餾水800mL，再加試劑酒石酸 銻鉀-阿拉伯樹(shù)膠溶液l〇〇mL，配制成1000mL混合溶液，再在混合溶