專利名稱：：一種防治植物土傳真菌病害的微生物制劑及其應用的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種放線菌在植物土傳真菌病害防治中的應用，具體是一種對鐮刀菌屬、疫霉屬等病原真菌有強烈拮抗作用的放線菌在植物土傳真菌病害防治中的應用，同時可剌激植物根系生長及促進植物幼苗生長。屬于利用微生物對農(nóng)作物病害進行生物防治領域。
背景技術(shù)：
：植物土傳真菌病害是一類較難防治的重要植物病害,其病原真菌種類繁多，分別屬于疫霉屬、鐮刀菌屬、核盤菌屬、絲核菌屬、腐霉屬等，它們生活在土壤中，條件適宜時從植物根部或莖部侵染植物，并以土壤等為媒介進行傳播,進而引發(fā)枯萎病、黃萎病、根腐病、灰霉病、立枯病、疫病及苗期猝倒病等植物病害。這些土傳真菌病害一直困擾著人們，特別是枯蔞病、黃萎病、根腐病等病害，經(jīng)常引起大面積幼苗死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。目前植物土傳真菌病害的防治措施主要是土壤熏蒸、抗性品種的培育和化學農(nóng)藥。但這些方法存在不足。土壤熏蒸在殺滅病原菌的同時也殺滅了土壤中的有益微生物進而破壞了微生態(tài)平衡；而培育抗性品種因存在抗性基因單一和種質(zhì)資源材料匱乏等問題而進展緩慢；長期使用化學農(nóng)藥容易引起抗藥性，影響生態(tài)環(huán)境，對農(nóng)作物的品質(zhì)、生產(chǎn)、出口等方面也不利。因此，在農(nóng)業(yè)防治、化學防治和抗病品種方面尚未取得理想效果的情況下，生物防治因無公害、無環(huán)境污染和防治作用專化性等優(yōu)點而成為防治植物土傳真菌病害的一種有效方法。在植物病害的生物防治中研究和使用較多的微生物主要有細菌類，如芽孢桿菌、假單胞菌、歐氏桿菌和無致病力土壤桿菌等；真菌類有腐霉菌、厚孢輪枝菌、絲核菌、無致病力的鐮刀菌以及木霉屬的哈茨木霉、康寧木霉等。與其他微生物在植物病害防治的應用上相比，關(guān)于放線菌在植物病害特別是土傳真菌病害生物防治的研究和應用相對較少。因此，本發(fā)明填補了放線菌在土傳真菌病害生物防治中應用方面的空白。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對植物的土傳真菌病害防治難度較大，目前使用的化學農(nóng)藥在田間試驗效果不理想，長期使用易引起抗藥性，影響生態(tài)環(huán)境。提出將一種抗菌譜較廣，易于培養(yǎng)，根際定植能力強的放線菌應用于植物的土傳真菌病害防治中。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種放線菌在植物土傳真菌病害防治上的應用，其特征在于將放線菌Da07210以液體菌劑或固體菌劑形式防治植物土傳真菌病害。本發(fā)明中的生防菌Da07210是從海南島鸚哥嶺原始森林土壤中篩選分離到一株放線菌，該菌株對土傳病害的病原真菌有強烈的抑制作用。2008年6月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路；保藏號為CGMCCNo.2561;分類命名為諾爾斯鏈霉菌(&w/^owyceswoi^eO。菌株Da07210系本發(fā)明人于2005年在海南島鸚哥嶺原始森林土壤中發(fā)現(xiàn)的可用于植物土傳真菌病害的放線菌。經(jīng)形態(tài)學、培養(yǎng)特征、生理生化特性以及16SrDNA序列分析表明該菌株為諾爾斯鏈霉菌(5V"Wow少cm"ow/^e/)，將其命名為諾爾斯鏈霉菌Da07210(iS^re/^o附^yceswow^y"'Da07210)。菌株Da07210的16SrDNA序列部分基因序列(1439bp)已向美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的Genbank基因序列數(shù)據(jù)庫提交，登錄號為EU341330。該菌具有下列特征有豐富的氣生菌絲和基內(nèi)菌絲，氣絲白色至灰色，基絲淺黃至深褐色，無可溶性色素生成，能利用D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-肌醇、L-鼠李糖、蔗糖和L-阿拉伯糖，不利用D-木糖和棉子糖，明膠液化，牛奶凝固、胨化，淀粉水解，硝酸鹽還原都呈陽性，不產(chǎn)生類黑色素、H2S，可在纖維素上生長。該菌株抑菌能力和根際定殖能力強，可在植物(如香蕉、西瓜、辣椒等)的根際定殖。對古巴尖孢鐮刀菌Fwww/wmoxyspon^wf.sp.cw6e"se、辣椒疫霉/^_yfop/ifAorarca/w'dLeonian、立枯絲核菌/^/zo"ow/aw/am'Kuhn、瓜果腐霉/yWwnap/awWerwatow等重要作物的病原菌有顯著抑制作用，抑菌圈直徑平均為16.0-19.0mm。本發(fā)明中的菌株Da07210液體菌劑是通過以下工藝流程獲得的一級種子一~^二級種子~~^發(fā)酵罐(無菌空氣，培養(yǎng)液)~~^發(fā)酵液。發(fā)酵罐培養(yǎng)基為葡萄糖1.0%，甘油1.0%,黃豆餅粉1.5%,硫酸銨0.5%，K2HPO40.05%，消泡劑0.01%。培養(yǎng)條件沒有特別嚴格的限制，只要該條件適合菌株Da07210的生長即可。本發(fā)明中的菌株DaO721O固體菌劑是這樣獲得的:將菌株Da07210進行液體發(fā)酵生產(chǎn)(與液體菌劑工藝相同)，發(fā)酵液與吸附載體按以下公式混合填充劑硅藻土(輕質(zhì)碳酸鈣)的加入量(公斤)呵發(fā)酵液菌數(shù)(億/毫升)x放罐體積(升)x收率]/成品菌數(shù)一發(fā)酵液中的殘存物(公斤)，然后適當干燥，制成可濕性粉劑。本發(fā)明中的固體菌劑防治植物土傳真菌病害是將可濕性粉劑用100-300倍清水稀釋澆灌于農(nóng)作物根部或?qū)⒐腆w菌劑與育苗土重量配比為1:200-400混合育苗；所述的液體菌劑防治植物土傳真菌病害是將發(fā)酵液稀釋100-300倍后用于根部澆灌或噴灑于植株，或播種時浸種，移栽前浸根。土傳真菌病害指通過土壤傳播的鐮刀菌屬、疫霉屬、絲核菌屬、腐霉屬病原真菌引起的香蕉枯萎病、疫病、立枯病、猝倒病等。此外，本發(fā)明的微生物制劑還可刺激植物根系生長并促進植物幼苗生長。該微生物制劑具備了工業(yè)化生產(chǎn)的基本性狀。.具體實施例方式實例1液體發(fā)酵制劑生產(chǎn)1、菌種活化將菌株Da07210接種到固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為可溶性淀粉20.0g，KN03l.Og，K2HPO40.5g,MgS04'7H200.5g,FeS04.7H20O.Olg，瓊脂20.0g，(補足1000ml),pH7.2，在25'C28'C下培養(yǎng)4-5天。2、一級種子培養(yǎng)將活化菌種接種到液體培養(yǎng)基，配方為葡萄糖10.0g，大豆粉10.0g，酵母膏10.0g，可溶性淀粉5.0g，KH2P040.5g，蒸餾水(補足lOOOml)，pH7.2,在25。C28。C下?lián)u瓶培養(yǎng)48小時，獲得一級種子液。3、二級種子培養(yǎng)將一級種子液接種到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方與前述的一級種子培養(yǎng)(2)相同。在26°C28'C下培養(yǎng)48小時，獲得二級種子液，供發(fā)酵生產(chǎn)用。'4、發(fā)酵罐生產(chǎn)將二級種子液通過接種口接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐培養(yǎng)基為葡萄糖1.0%，甘油1.0%，黃豆餅粉1.5%,硫酸銨0.5%,K2HP040.05%，消泡劑0.01%,pH7.2，罐溫28土1'C，罐壓0.07Mpa，拌樣速度200rpm，送風量1018m3/h，每2小時取樣1次，測定pH值，檢查有無雜菌的污染，培養(yǎng)約144-156小時，獲得液體發(fā)酵制劑，供田間防治病害用。實例2固體生物制劑的生產(chǎn)首先菌株Da07210進行液體發(fā)酵生產(chǎn)(與實例1相同)。然后加入填充劑，板框過濾、打漿、干燥、粉碎，制成可溶性粉劑，具體過程如下具體加入填充物將發(fā)酵液壓入貯罐，根據(jù)以下計算公式加入硅藻土(輕質(zhì)碳酸鈣)作為填充劑，加入后攪拌30分鐘，填充劑硅藻土(輕質(zhì)碳酸鈣)的加入量(公斤)-[發(fā)酵液菌數(shù)(^V毫升)x放罐體積(升)x收率]/成品菌數(shù)一發(fā)酵液中的殘存物(公斤)。板框過濾用2公斤/平方厘米的壓力，將物料由貯罐壓入板框，通過7號濾布過濾。打裝將濾餅卸入打漿灌，按加入碳酸鈣量的8%加入濃乳100號，加入適量的濾液均勻攪拌30分鐘。干燥在50'C下通風干燥至含水量710%。粉碎粉碎時出料溫度不能超過6ox:，以防止菌體失活。成品質(zhì)量指標測定含菌量、含水量、懸浮率、細度的測定均參照國家企業(yè)標準(Q/KWL02-2003)進行，含菌量23億個/克，其余各項指標均符合標準。實例3固體制劑對香蕉枯萎病大田防治作用1、試驗用藥劑生防菌Da07210，可濕性粉劑(固體制劑)，對照殺菌劑為30%惡霉靈水劑。2、香蕉枯萎病病原菌制備將F0C4接種于PDA固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7天后，用滅菌水配制孢子懸浮液，濃度為106個/1111。3、試驗地點海南省金江香蕉基地。4、施藥方法將固體制劑用清水稀釋300倍，進行灌根處理，3天后再用香蕉枯萎病病原菌孢子懸浮液灌根，并設清水處理和病原菌處理。在病原菌灌根后3個月后進行調(diào)查，記載各個處理的病情指數(shù)、發(fā)病率，并計算防效。發(fā)病率％=發(fā)病株(葉)數(shù)"00/調(diào)査總株(葉)數(shù)病情指數(shù)％=1:(各級病株(葉)數(shù)x該病級值)xioo/調(diào)查總株(葉)數(shù)x最高級值防效％=(對照病情指數(shù)一處理病情指數(shù))xlOO/對照病情指數(shù)香蕉枯萎病病情調(diào)查分級標準(病情分為5級)0級外觀無可見癥狀，解剖假莖維管束組織未見變褐；l級外觀無可見癥狀，解剖假莖維管束組織變褐；2級葉片黃化或倒垂；3級假莖基部開裂，但病株尚未枯死；4級病株枯死o5、試驗結(jié)果從表l可以看出生防菌Da07210可濕性粉劑對香蕉枯萎病防治效果明顯，防效可達95.2%。與稀釋1000倍30%惡霉靈水劑相比，施用生防菌Da07210的發(fā)病率和病情指數(shù)分別比其低8.8%和4.95%，防治效果比其高28.1%,顯示了該生防制劑具有較好的防效，具備了生產(chǎn)上大量推廣的基本條件。表1Da07210可濕性粉劑對香蕉枯萎病防治效果處理病情指數(shù)(％)發(fā)病率(％)防效00CK17.631.3扁可濕性粉劑(300x〉0.841.595.230%惡霉靈水劑(1000x)5.7910.367.1實例4固體制劑對大豆根腐病、番茄立枯病、黃瓜枯萎病大田防治作用1、試驗用藥劑生防菌Da07210，可濕性粉劑(固體制劑)。2、試驗地點海南省澄邁基地。3、施藥方法大田定植后30天，將固體制劑用清水稀釋300倍，進行灌根處理(每棵灌藥液量200250毫升)。藥劑處理30天后進行調(diào)査，記載發(fā)病率，并計算防效。發(fā)病率％=發(fā)病株(葉)數(shù)xlOO/調(diào)查總株(葉)數(shù)防效％=(對照發(fā)病率一處理發(fā)病率)一xlOO/對照發(fā)病率4、試驗結(jié)果在海南省澄邁的大田試驗發(fā)現(xiàn)本生物制劑可防治大豆根腐病、番茄立枯病、黃瓜枯萎病，防效達85%以上。結(jié)果如下表2所示。表2Da07210可濕性粉劑對大豆根腐病、番茄立枯病、黃瓜枯萎病防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實例5液體發(fā)酵制劑刺激香蕉苗根系生長及促進香蕉生長作用1、試驗時間2006年4月27日至2006年5月26日。2、試驗地點海南省樂東抱羅基地苗圃。3、試驗用藥劑生防菌Da07210(液體制劑)；寶卡有機液肥由海南洋浦生物科技有限公司提供；高氮復合肥由萬鐘公司提供。4、試驗方法直接對比法，二組處理，一組對照，三次重復；隨機選取3株小苗調(diào)查根系和生長勢。處理1:生防菌Da07210(液體制劑)1公斤，稀釋300倍分兩次(15天1次)噴施1000株蕉苗；處理2:寶卡有機液肥稀釋500倍分兩次(15天1次)噴施1000株蕉苗對照高氮復合肥稀釋1000倍分兩次(15天1次)噴施1000株蕉苗。5、試驗結(jié)果處理1根數(shù)明顯比處理2及對照多，根系發(fā)達(表3)。處理1的假假莖粗度、葉片數(shù)、原生根系數(shù)、最長原生根長度均高于處理2，表明處理1小苗長勢比處理2好。表3液體發(fā)酵制劑對香蕉小苗促生長作用結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.一種防治植物土傳真菌病害的微生物制劑，其特征在于，該微生物制劑由放線菌液體發(fā)酵生產(chǎn)或加入吸附載體方法制備，其中所述生產(chǎn)菌是放線菌Da07210，其保藏號為CGMCCNo.2561。2.權(quán)利要求1所述微生物制劑的應用，其特征在于該微生物制劑用于鐮刀菌屬、疫霉屬、絲核菌屬、腐霉屬病原真菌引起的香蕉枯萎病、疫病、立枯病、猝倒病等的生物防治。3.權(quán)利要求1所述微生物制劑在刺激植物根系生長及促進植物幼苗生長的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種防治植物土壤真菌病害的微生物制劑及其應用，屬于微生物農(nóng)藥領域。該微生物制劑按常規(guī)方法制備。其生產(chǎn)菌株為放線菌Da07210，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.2561。本發(fā)明將該菌株通過液體發(fā)酵制備成液劑，或與吸附載體按一定比例混合后，經(jīng)過濾、濃縮、粉碎和涼干，制備成可濕性粉劑。本發(fā)明的微生物制劑可防治鐮刀菌屬、疫霉屬、絲核菌屬、腐霉屬病原真菌引起的香蕉枯萎病、疫病、立枯病、猝倒病等，同時還可刺激植物根系生長，同時促進植物幼苗生長。文檔編號A01P3/00GK101518264SQ20091000979公開日2009年9月2日申請日期2009年1月22日優(yōu)先權(quán)日2009年1月22日發(fā)明者吳曉鵬,孫前光,哲方,軍朱,鄭業(yè)輝,鮑時翔,黃惠琴申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所;海南正維爾生物科技有限公司