專利名稱:一種防治蔬菜真菌病害微生物農(nóng)藥的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物技術領域：
，特別是涉及生防放線菌一淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D的培養(yǎng)及其代謝產(chǎn)物的分離與應用。
背景技術：
放線菌(Actinomycetes)與人類的關系極為密切。據(jù)統(tǒng)計，在已發(fā)現(xiàn)的抗生素中，有70%約為放線菌所產(chǎn)生。土壤是放線菌棲居的重要場所，從土壤中獲得具有高效抗菌活性的放線菌產(chǎn)生抗生素是目前世界范圍內(nèi)研制開發(fā)新醫(yī)藥和新農(nóng)藥必不可少的基礎工作。
目前對植物病害的防治，主要采用化學農(nóng)藥防治的方法?；瘜W農(nóng)藥雖然對多種病害有較理想的防治效果，但長期使用會誘發(fā)病菌的抗藥性。另外，農(nóng)藥的頻繁使用不僅增加了農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，農(nóng)藥殘留問題也十分嚴重。利用放線菌產(chǎn)生的抗病原真菌的活性物質(zhì)進行植物真菌病害的生物防治，則具有周期短、易于研究、便于生產(chǎn)、無毒無害等優(yōu)點。
以往對豐加霉素活性的報道主要集中在抗腫瘤方面，但由于其對人正常細胞的毒性太大，無法應用于臨床。在抗菌活性的報道方面，豐加霉素主要抑制白假絲酵母，新隱球酵母，草分支桿菌和金黃色葡萄球菌等，幾乎沒有對植物病原菌(稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)除外)抑制作用的相關報道(陳伊，李舟，魏玉珍，等·根際放線菌106-03431產(chǎn)生的核苷類抗生素3431的研究.生物學雜志，2009,26(4) :17-20)。本研究通過對淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌抗菌活性成分豐加霉素的研究發(fā)現(xiàn)，豐加霉素在低濃度就能強烈抑制黃瓜枯萎病菌(FusariumOxysporum)、番爺灰霉病菌(Botrytis Cinerea)和番爺早疫病菌(Alternaria solani)孢子萌 發(fā)和菌絲生長。本發(fā)明正是填補了這項空白，拓寬了豐加霉素的應用。同時本發(fā)明中淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌產(chǎn)豐加霉素的發(fā)酵水平在105. 6mg/L,才目 t匕文獻(M. C. Flickinger, M. Greenstein, C. Bremmon, et al. Strain selection,medium development and scale-up of toyocamycin production byStreptomyceschrestomyceticus. Bioprocess Engineering, 5 (1990) 143-153)報道的產(chǎn)素水平約12mg/L要高出7.8倍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從杭州的土壤中分離到一株生防放線菌，經(jīng)微生物分類學鑒定為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes),并對此生防放線菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物中的抗菌成分進行分離，得到了活性成分，經(jīng)四大光譜分析，證明為已知核苷類抗生素，豐加霉素(Toyocamycin)。該發(fā)明為微生物源農(nóng)藥的進一步研制和開發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株和生物活性化合物。
本發(fā)明的目的是針對化學農(nóng)藥不安全與微生物源農(nóng)藥種類較少的不足，提供一種從杭州土壤中分離篩選出的放線菌-淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D ;本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株通過發(fā)酵提取其代謝產(chǎn)物制備成防治部分植物真菌病害的微生物農(nóng)藥及其制備方法。[0007]本發(fā)明淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的分離、篩選與鑒定
是于2006年8月在浙江杭州臨安天目山采集的土樣中，經(jīng)分離、培養(yǎng)、發(fā)酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的篩選等步驟獲得并保存；經(jīng)微生物分類學鑒定為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes),定名為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D0該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號CGMCC No. 2060。保藏文件參見專利ZL200710156833. 7的公開文本，公開號為CN101225368A。
淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯微形態(tài)特征孢子絲直、鉤狀、松散螺旋形，孢子長圓、橢圓或卵圓形。
本發(fā)明所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D，經(jīng)發(fā)酵提取可獲得對部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的活性化合物豐加霉素(Toyocamycin)。
本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)
一種防治番茄灰霉病、黃瓜枯萎病或番茄早疫病等植物真菌病害微生物農(nóng)藥的制備方法，按以下步驟進行
(I)菌種的活化培養(yǎng)將分離保存的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D菌種移至試管內(nèi)高氏一號斜面上，在28 °C ± I °C條件下，·培養(yǎng)至試管斜面長滿孢子；
(2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每IOOOmL中含有玉米粉21. 5g，可溶性淀粉10g，麩皮 5g，CaC032. 5g，NH4NO3L 5g，F(xiàn)eSO4O. 5g，KH2PO4L 5g，滅菌；待冷卻至 40°C，在無菌條件下接種淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28°C ±1°C條件下，培養(yǎng)5天；
(3)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢，收集發(fā)酵液，按常規(guī)化學方法提取、層析，分離純化獲得活性化合物Toyocamycin,該化合物分子式為C12H13N5O4,結構式見下式；
權利要求
1.一種防治黃瓜枯萎病、番爺早疫病或番爺灰霉病的微生物農(nóng)藥的制備方法，包括以下步驟 (1)菌種的活化培養(yǎng)將淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes) D菌種移至試管內(nèi)高氏一號斜面上，在28°C ±1°C條件下，培養(yǎng)至試管斜面長滿孢子，所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏登記號為 CGMCC No. 2060 ； (2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每IOOOmL中含有玉米粉21.5g，可溶性淀粉10g，麩皮5g，CaCO3 2. 5g，NH4NO31. 5g，F(xiàn)eSO4 0. 5g，KH2PO41. 5g，待冷卻至 40°C，在無菌條件下接種淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28°C ± I °C條件下，培養(yǎng)5天； (3)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢，收集發(fā)酵液，按常規(guī)化學方法提取、層析，分離純化獲得活性化合物豐加霉素；此活性化合物的結構式如下
2.根據(jù)權利要求
1的方法，其中在步驟(3)的發(fā)酵物提取中，具體步驟為發(fā)酵完畢后收集發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入等體積的正丁醇進行萃取，取上層，并在真空條件下濃縮至浸膏，再以蒸餾水溶解，離心取上清液，而后上S印hadex LH20柱層析，以體積比10% 90%的乙醇和蒸餾水梯度洗脫，分離純化得活性化合物。
3.根據(jù)權利要求
1的制備方法，其中在步驟(4)中，制備成可濕性粉劑或乳油的農(nóng)用藥物。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種防治蔬菜真菌病害微生物農(nóng)藥的制備方法，屬于微生物技術領域：
。該方法利用一種從浙江杭州臨安天目山采集的土樣中分離篩選出的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D，經(jīng)過菌種的活化培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵物提??；將所提純的活性化合物配以農(nóng)用藥物輔料等步驟，制備成多種劑型的農(nóng)用藥物。該微生物農(nóng)藥可用于防治黃瓜枯萎病、番茄灰霉病或番茄早疫病等蔬菜真菌病害，其防治效果較常規(guī)化學藥劑相當或略優(yōu)，且安全。
文檔編號A01N43/90GKCN101961014 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 201010127364
公開日2013年4月24日 申請日期2010年3月19日
發(fā)明者申屠旭萍, 俞曉平, 董勝張, 郝培應, 邊亞琳, 陳春 申請人:中國計量學院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3),