專利名稱：銀杏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及銀杏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
銀杏(Ginkgo biloba L.)又名白果，是我國特有的世界珍稀名貴樹種，是冰川運(yùn)動遺留的孑遺植物，被稱為活化石。屬銀杏科，是銀杏屬現(xiàn)存的唯一生存種。現(xiàn)為廣泛栽培樹種，具有極高的研究開發(fā)價值。銀杏各組織含有抑菌物質(zhì)，據(jù)報道，銀杏根、莖、葉、果肉(外種皮)及果仁的提取物對供試植物病原菌有抑制作用。但植物資源量是限制植物源殺菌劑發(fā)展規(guī)模的主要因素之一。根據(jù)宿主植物與其內(nèi)生微生物由于長期的共同生活而具有相同或相似的次生代謝產(chǎn)物合成途徑的“內(nèi)共生理論”，從銀杏中分離篩選到產(chǎn)黃酮的內(nèi)生真菌已有報道(王梅霞等，南京師大學(xué)報，2003，26(1))，這主要涉及醫(yī)藥方面的研究。但從銀杏中分離篩選內(nèi)生真菌，并將其代謝產(chǎn)物應(yīng)用于防治植物真菌病害，這在國內(nèi)外還未見有研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從銀杏中分離篩選出代謝產(chǎn)物有抑菌作用的內(nèi)生真菌，并將該菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物應(yīng)用于防治植物真菌病害。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)。
一種銀杏內(nèi)生真菌的分離篩選及其代謝產(chǎn)物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，具體包括以下步驟(1)銀杏組織的準(zhǔn)備采集銀杏根、莖、葉、果肉、果仁；(2)銀杏組織的表面消毒與無菌檢測；將步驟(1)銀杏組織經(jīng)表面消毒后，直接種植于PDA培養(yǎng)基平皿上，置26℃～28℃恒溫箱培養(yǎng)，從中選出表面無任何菌種生長的組織；(3)銀杏組織內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)將步驟(2)的無菌組織在無菌條件下切割成小片移植于PDA培養(yǎng)基上，置26℃～28℃恒溫箱培養(yǎng)，至樣品周圍長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，備用；(4)內(nèi)生真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制其各組分與每升所含的質(zhì)量為蛋白胨0-5.5g、玉米粉1-8g、麩皮0-10g、可溶性淀粉0-10g、葡萄糖1-8g、黃豆餅粉1-9g、CaCO30.5-2.5g、NH4NO30.1-1.2g、MgSO40.1-0.9g、KH2PO40.1-0.9g；(5)內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(4)液體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，用接種鉤挑取少許經(jīng)步驟(3)分離純化的內(nèi)生真菌菌絲于培養(yǎng)瓶中，置26℃～28℃搖床，200r/min，振蕩培養(yǎng)4～5天，發(fā)酵液經(jīng)5000r/min離心10min，取發(fā)酵上清液；(6)有效菌株篩選取步驟(5)各上清液與冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基按毫升體積1∶9混勻于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后在每個培養(yǎng)基平面放1個直徑為4mm的供試菌餅，置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，計算各菌株發(fā)酵液對供試病原菌的抑制率，從中篩選出高效抑制率的內(nèi)生真菌菌株，備用；(7)銀杏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用將步驟(6)篩選出的高效菌株，采用步驟(4)液體發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，以其上清液或發(fā)酵混合物，配以適量農(nóng)用藥物輔料，制備成多種劑型的農(nóng)用藥物。
所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其各組分與每升所含的質(zhì)量為蛋白胨2.5g、玉米粉3g、麩皮5g、葡萄糖4g、可溶性淀粉4g、黃豆餅粉4g、CaCO31g、NH4NO30.6g、MgSO40.1g、KH2PO40.6g；本發(fā)明步驟(2)和(3)所述培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)，其組分與含量為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1L。
本發(fā)明步驟(6)所述供試菌餅的植物病原菌為番茄早疫病菌(Alternariasolani)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、水稻紋枯病菌(Thanatephorus cucumeris)或黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)中的一種或一種以上(均系《病原植物真菌學(xué)》中描述的與農(nóng)業(yè)植物病害關(guān)系密切的病原菌)。
本發(fā)明的有益效果，一是本發(fā)明根據(jù)“內(nèi)共生理論”從銀杏中篩選出其代謝產(chǎn)物與宿主植物提取物相同或相似的，對植物真菌病害病原菌具有抑制作用的內(nèi)生真菌，這為實現(xiàn)由植物中提取殺菌活性物質(zhì)到微生物發(fā)酵法生產(chǎn)殺菌活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，提供了有效的菌種分離篩選方法；二是本發(fā)明跟蹤測定了分離到的各內(nèi)生真菌菌株代謝產(chǎn)物對供試植物病原菌的抑制作用，從而獲得有效菌株，為微生物農(nóng)藥的進(jìn)一步研制和開發(fā)提供了一批出發(fā)菌株；三是本發(fā)明重視了對植物組織的前期無菌檢測，并研制了銀杏內(nèi)生真菌適用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，提高了對內(nèi)生真菌分離篩選的成功率與效率；四是本發(fā)明首次將銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物應(yīng)用于植物真菌病害的防治，效果與常規(guī)化學(xué)藥劑相仿(見試驗例)，為農(nóng)用殺菌劑的開發(fā)增添了新的途徑。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本用途發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實施例1從浙江長興銀杏長廊采集銀杏莖組織，按下列程序進(jìn)行表面消毒自來水沖洗，75％酒精漂洗5min，無菌水沖洗5次，再用升汞浸泡4分鐘，無菌水沖洗3次；表面消毒后的莖組織直接種植于PDA培養(yǎng)基平皿上，置28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，從中選出表面無任何菌種生長的莖組織；將經(jīng)無菌檢測的莖(取韌皮部)組織，在超凈工作臺條件下切割成約0.5cm×0.5cm的小片，然后將小片種植于PDA培養(yǎng)基平板上，置28℃恒溫箱培養(yǎng)；當(dāng)樣品周圍明顯長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基備用；將上述分離得的銀杏內(nèi)生真菌各菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)基各組分與每升所含的質(zhì)量為蛋白胨2.5g、玉米粉3g、麩皮5g、葡萄糖4g、可溶性淀粉4g、黃豆餅粉4g、CaCO31g、NH4NO30.6g、MgSO40.1g、KH2PO40.6g；將500mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基分裝在300mL的三角瓶中，每瓶裝液量為50mL；用接種鉤挑取少許菌絲接種于培養(yǎng)瓶中，置于28℃搖床，200r/min，振蕩培養(yǎng)4天；發(fā)酵液5000r/min離心10min，取上清液，棄菌絲體；發(fā)酵液抑菌活性測定取上述各菌株發(fā)酵上清液1mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面放1個供試菌黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)的菌餅(直徑為4mm)，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)36h，以無菌水處理作為對照，重復(fù)3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率
結(jié)果表明編號為3、64、73、121、303、431、528、555、597、820、847、920、1012、1028菌株的代謝產(chǎn)物對黃瓜立枯病菌的抑制率分別為25％、36％、45％、26％、42％、47％、39％、41.5％、37.3％、54％、19.5％、59％、46％、68％。
實施例2取銀杏葉，按下列程序表面消毒自來水沖洗，75％酒精漂洗5min，無菌水沖洗5次，再用升汞浸泡4分鐘，無菌水沖洗3次；表面消毒后的葉片直接種植于PDA培養(yǎng)基平皿上，置27℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，從中選出表面無任何菌種生長的組織；將經(jīng)無菌檢測的葉片在超凈工作臺條件下切割成約0.5cm×0.5cm的小片，然后將小片種植于PDA平板上，置27℃恒溫箱培養(yǎng)；當(dāng)樣品周圍明顯長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，備用；將上述分離得的銀杏內(nèi)生真菌各菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基其各組分與每升所含的質(zhì)量為蛋白胨5.5g、玉米粉1g、麩皮10g、葡萄糖8g、黃豆餅粉1g、CaCO30.5g、NH4NO31.2g、MgSO40.4g、KH2PO40.1g；將培養(yǎng)基分裝在300mL的三角瓶中，每瓶裝液量為50mL；用接種鉤挑取少許菌絲接種于培養(yǎng)瓶中，置于27℃搖床，200r/min，振蕩培養(yǎng)5天；發(fā)酵液5000r/min離心10min，取上清液，棄菌絲體；發(fā)酵液抑菌活性測定取上述各菌株發(fā)酵液1mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面放1個供試菌番茄早疫病菌(Alternaria solani)的菌餅(直徑為4mm)，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置28℃培養(yǎng)72h，以無菌水處理作為對照，重復(fù)3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率，計算方法同實施例1。
結(jié)果表明編號為256、383、604、618、918菌株的代謝產(chǎn)物對番茄早疫病菌的抑制率分別為56％、38％、67％、20％、42％。
實施例3取銀杏果肉(外種皮)，按下列程序表面消毒自來水沖洗，75％酒精漂洗5min，無菌水沖洗5次，再用升汞浸泡4分鐘，無菌水沖洗3次；表面消毒后的果肉組織直接種植于PDA培養(yǎng)基平皿上，置26℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，從中選出表面無任何菌種生長的果實組織；將經(jīng)無菌檢測的果肉在超凈工作臺條件下切割成約0.5cm×0.5cm的小片，然后將小片種植于PDA平板上，置26℃恒溫箱培養(yǎng)；當(dāng)樣品周圍明顯長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基，備用。
將上述分離得的銀杏內(nèi)生真菌各菌株進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基其各組分與每升所含的質(zhì)量為玉米粉8g、葡萄糖1g、可溶性淀粉10g、黃豆餅粉9g、CaCO32.5g、NH4NO30.1g、MgSO40.9g、KH2PO40.9g；將500mL培養(yǎng)基分裝在300mL的三角瓶中，每瓶裝液量為50mL；用接種鉤挑取少許菌絲接種于培養(yǎng)瓶中，置于26℃搖床，200r/min，振蕩培養(yǎng)5天；發(fā)酵液5000r/min離心10min，取上清液，棄菌絲體；發(fā)酵液抑菌活性測定取上述菌株發(fā)酵液1mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面放1個供試菌葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的菌餅(直徑為4mm)，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置28℃培養(yǎng)72h，以無菌水處理作為對照，重復(fù)3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率，計算方法同實施例1；
結(jié)果表明編號為78、207、305、391、634、1002菌株的代謝產(chǎn)物對葡萄炭疽病菌的抑制率分別為25.3％、61％、64.6％、43.4％、50.9％、61.3％。
實施例4-6為本發(fā)明所述菌株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行殺菌劑產(chǎn)品的研制和在防治農(nóng)作物病害上應(yīng)用效果的說明；其中920菌株代謝產(chǎn)物為按實施例1的工藝和配方發(fā)酵4天所得上清液；604菌株代謝產(chǎn)物為按實施例2的工藝和配方發(fā)酵5天所得上清液；305菌株代謝產(chǎn)物為按實施例3的工藝和配方發(fā)酵5天所得上清液；實施例4產(chǎn)品含2％的920菌種代謝產(chǎn)物，加入3％的白炭黑作為吸附劑，并加入1％的農(nóng)乳0203-B和3％的木質(zhì)素磺酸鈉輔料，最后用輕質(zhì)碳酸鈣補(bǔ)足到100％，混勻后，經(jīng)氣流粉碎后制成可濕性粉劑(以下內(nèi)容中稱“產(chǎn)品A”)。
實施例5產(chǎn)品含1.5％的604菌種代謝產(chǎn)物，用5％的甲醇溶解，并加入2％農(nóng)乳601和0.5％十二烷基磺酸鈉作為分散助劑，加入1％尿素作為防凍劑，最后用水補(bǔ)足到100％，35℃下混勻，經(jīng)高剪切乳化器乳化分散后制成微乳劑(以下內(nèi)容中稱“產(chǎn)品B”)。
實施例6產(chǎn)品含3％的305菌種的代謝產(chǎn)物，用5％的乙醇溶解，加入6％農(nóng)乳0204-C作為乳化劑，最后用二甲苯補(bǔ)足到100％，攪拌混勻制成乳油(以下內(nèi)容中稱“產(chǎn)品C”)。
試驗例將實施例4-6試制的農(nóng)用殺菌劑對黃瓜立枯病、蕃茄早疫病和葡萄炭疽病等作物病害進(jìn)行防治試驗，以常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥、清水為對照，如表1所示，試制的農(nóng)用殺菌劑與常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥的防治效果相仿或略優(yōu)。
表1 產(chǎn)品A、B、C對幾種作物病害防效統(tǒng)計表(藥效試驗均于2004年5月-8月在杭州市郊試驗農(nóng)田進(jìn)行)

“-”為未試驗。
權(quán)利要求
1.銀杏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，其特征在于將菌株發(fā)酵培養(yǎng)后，以其上清液或發(fā)酵混合物，配以農(nóng)用藥物輔料，制備成多種劑型的農(nóng)用藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了銀杏內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物在防治植物真菌病害中的應(yīng)用，屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。該發(fā)明包括銀杏組織的準(zhǔn)備、表面消毒與無菌檢測，內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)，有效菌株的篩選、發(fā)酵及殺菌藥物的制備等步驟。本發(fā)明首次將銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物應(yīng)用于植物真菌病害的防治，為農(nóng)用殺菌劑的開發(fā)增添了一個新的途徑。
文檔編號A01N63/00GK1802925SQ200510062338
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者申屠旭萍, 陳列忠, 俞曉平 申請人:中國計量學(xué)院