專利名稱：新型真菌病毒、植物病害真菌減毒菌株、植物病害防治劑、真菌病毒的生產(chǎn)方法、植物病害 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制植物病害真菌的新型真菌病毒，與此相關(guān)的基因、核酸、蛋白質(zhì)， 內(nèi)含該真菌病毒的植物病害真菌減毒菌株，含有它們的植物病害防治劑，真菌病毒的生產(chǎn) 方法，植物病害真菌減毒的方法，植物病害的防治方法等。
背景技術(shù)：
植物病害中有因氣象、土壤等環(huán)境的因素而引發(fā)的，有因病毒、細(xì)菌、真菌(絲狀 菌)等的感染性因素而引發(fā)的，有因生理性障礙而引發(fā)的，有因這些的綜合的因素而引發(fā) 的等。目前在植物病害之中，包含許多在食糧、花卉、花木、樹木等的生產(chǎn)中成為阻礙因素的 病害，也有很多造成了很大的經(jīng)濟(jì)影響。在植物病害中，真菌是最重要的病害因子之一。約80%的植物病害被認(rèn)為是由真 菌引起的。例如，稻瘟病是發(fā)生在世界各地的最重要的植物病害之一。病原菌是霉(絲狀菌) 的一種，稱為稻瘟病菌(學(xué)名“Magnaportheoryzae”)。稻瘟病菌在25°C左右是發(fā)育、孢子 形成、感染的適宜溫度，還喜歡濕潤的環(huán)境。因此，由于夏季的低溫、多雨、日照不足等的氣 象因素會(huì)導(dǎo)致大爆發(fā)，造成稻子的欠收、品質(zhì)下降，帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，紋枯病、銹病、白粉病、炭疽病、菌核病、霜霉病、灰霉病等以真菌為原因的經(jīng) 濟(jì)上影響也較大的植物病害還存在許多。因此，目前正在嘗試新農(nóng)藥的開發(fā)及品種改良等 (有關(guān)稻瘟病的防治，例如參照專利文獻(xiàn)1、2)。在此，對(duì)于與本發(fā)明有關(guān)的事項(xiàng)的真菌病毒進(jìn)行如下說明。感染真菌類(Fungi，下同)的病毒稱為真菌病毒(mycovirus)。其中，基因組為雙 鏈RNA的真菌病毒已有報(bào)道。這些真菌病毒潛在地感染宿主菌，大多對(duì)宿主的性狀幾乎不 生產(chǎn)影響?；蚪M為雙鏈RNA的真菌病毒，目前被分類為分體病毒科(學(xué)名 "Partitiviridae",下同)、全病毒科(學(xué)名"Totiviridae下同)、金色病毒科(學(xué)名 “Chrysoviridae”，下同)等5科。分體病毒科病毒在病毒顆粒中具有兩條大致相同大小的 直鏈狀雙鏈RNA，全基因劑量為4 6kbp。全病毒科病毒在病毒顆粒中具有4 7kb的一 條直鏈狀雙鏈RNA。此外，在栗疫病菌(學(xué)名“Cryphonectria parasitica")中，發(fā)現(xiàn)菌內(nèi) 在性存在，具有9 13kbp的雙鏈RNA的病毒(低毒性病毒(Hypoviridae)等)。金色病毒科病毒具有球形的病毒樣顆粒，具有四種成分的雙鏈RNA。此外，已知 金色病毒科病毒與分體病毒科和全病毒科的病毒一樣，具有編碼RdRP (RNA-directed RNA polymerase (以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶)；RNA依賴性RNA聚合酶，下同)的區(qū) 域。作為屬于金色病毒科的病毒，已知例如有Hvl45SV(“Helminthosprium victoriae 145S virus (維多利螺孢菌 H5S 病毒)”，下同)、PcV( "PencilIium chrysogenum virus (產(chǎn)毒青霉病毒)”，下同)、AbVl ( "Agaricus bisporus virus 1 (雙孢蘑菇病毒1) ”，下同)等 (參照非專利文獻(xiàn)1等)。近年來，對(duì)于特定的植物病害，研究了用真菌病毒等使該病原菌減毒，使用該減毒 菌來防治該病害的方法，其中一部分已經(jīng)實(shí)際應(yīng)用。例如，已經(jīng)公開了使用抑制栗疫病菌的 毒性的病毒性雙鏈RNA的全長cDNA使該菌減毒，應(yīng)用于栗疫病防治的方法(參照非專利文 獻(xiàn)2等)，以及發(fā)現(xiàn)抑制紫紋羽病菌(學(xué)名“Helicobasidium mompa")的雙鏈RNA病毒， 使用內(nèi)含該雙鏈RNA的紫紋羽病菌減毒菌株來防治紫紋羽病的方法(參照非專利文獻(xiàn)3、專 利文獻(xiàn)3等)等。專利文獻(xiàn)1 日本特開2004-143045號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開2003-250370號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本特開2001-78752號(hào)公報(bào)非專禾丨J 文獻(xiàn) 1 :C. Μ. Fauquet, Mary Ann Mayo, J. ManiIoff, U. Desselberger, L.A.Bal1,"Virus Taxonomy !Classification andNomenclature of Viruses ； EighthReport Of The International Committee On Taxonomy Of Viruses，，， ElsevierAcademic Press :591_595 頁2 :Gil H. Choi and Donald L. Nuss, "Hypovirulence ofchestnut blightfungus conferred by an infectious viral cDNA."Science.1992 Aug 7 ； 257(5071) 800-3非專利文獻(xiàn)3 :H. Osaki 等人，“Detection of Double-Stranded RNAVirus from a Strain of the Violet Root Rot Fungus Helicobasidium mompa Tanaka，，Virus Genes 25 :2,139-145，200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題如上所述，植物病害真菌對(duì)植物、作物的品質(zhì)和收獲量等產(chǎn)生重大的影響。另一方 面，很少發(fā)現(xiàn)抑制植物病原真菌的真菌病毒，使用這樣的真菌病毒的植物病害防治的嘗試 也幾乎沒有進(jìn)行過。因此，本發(fā)明的主要目的在于提供抑制植物病害真菌的新型真菌病毒 以及植物病害的新型防治方法等。解決課題的方法本發(fā)明人等單獨(dú)地采集天然存在的植物病害真菌，探索對(duì)這些真菌具有抑制性作 用的真菌病毒。其結(jié)果分離并鑒定了具有抑制植物病害真菌的作用、具有2.8 3. 6kbp 的四種類的雙鏈RNA的新型真菌病毒，并且得到了其全長序列。因此，本發(fā)明提供具有抑制植物病害真菌的作用、具有2. 8 3. 6kbp的四種類的 雙鏈RNA、天然存在的、由發(fā)明人等分離的新型真菌病毒，它們的基因，至少具有其核苷酸序 列、該序列中具有規(guī)定機(jī)能的特定部分的序列的核酸，該序列所編碼的單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)寸。該真菌病毒在雙鏈RNA的序列中含有RdRp (RNA依賴性RNA聚合酶)的保守基序， 且編碼該領(lǐng)域的RNA的核苷酸序列與已知的金色病毒科病毒具有同源性。因此，推測該真 菌病毒是分類為金色病毒科的新型病毒。
如上所述，該真菌病毒具有抑制植物病害真菌的生長等的作用。因此，可以通過例 如使該真菌病毒感染宿主菌等，使宿主菌內(nèi)含該真菌病毒，來制備植物病害真菌的減毒菌 株。此外，通過例如將至少含有本發(fā)明的真菌病毒和/或制備的植物病害真菌減毒菌 株的植物病害防治劑附加(散布，涂抹等)于植物(稻等)，有可能防治該植物病害。此外，本發(fā)明的真菌病毒具有如下所述的特征。以往，人們認(rèn)為真菌病毒通過菌絲融合從宿主菌的細(xì)胞垂直傳播到細(xì)胞，在真菌 病毒的生活環(huán)境中，不存在宿主菌的細(xì)胞外存在的階段。相對(duì)與此，本發(fā)明人等的研究表 明，本發(fā)明的真菌病毒也可以存在于細(xì)胞外。因此，由于可不依賴菌絲融合從細(xì)胞外感染宿主菌，因此也可在接合型的不同主 菌、菌株之間廣范圍地感染本發(fā)明的真菌病毒，且可對(duì)宿主菌高效率感染。也就是說，通過 這種方法，很有可能簡單且高效率進(jìn)行植物病害真菌的減毒及植物病害的防治。此外，由于本發(fā)明的真菌病毒也存在于細(xì)胞外，因此通過例如用液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 宿主菌，從該培養(yǎng)上清中回收真菌病毒，可以簡單且相對(duì)大量地生產(chǎn)真菌病毒。發(fā)明效果通過本發(fā)明，有可能簡單且高效率地防治植物病害。


[圖1]表示實(shí)施例1中的57株稻瘟病菌中的9株的雙鏈RNA檢測結(jié)果的電泳照 片。[圖2]表示實(shí)施例9中的接種了稻瘟病菌的葉上的病斑數(shù)的圖。[圖3]為實(shí)施例11中本發(fā)明的病毒顆粒的電子顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式〈關(guān)于本發(fā)明的病毒〉本發(fā)明包含全部具有抑制植物病害真菌的作用、具有2. 8 3. 6kb的4種類的雙 鏈RNA的真菌病毒。該真菌病毒的各病毒顆粒均具有2. 8 3. 6kb的4種類的雙鏈RNA，且該四種類的 病毒顆粒以同時(shí)存在的狀態(tài)生存、傳代。需要說明的是，上述栗疫病菌真菌病毒和紫紋羽病 菌真菌病毒均為由12kb以上的單一成分的雙鏈RNA構(gòu)成，與本發(fā)明的真菌病毒在結(jié)構(gòu)上有 很大差異。因此，很有可能是完全不同的病毒種類，此外，對(duì)宿主菌的減毒化作用的機(jī)制也 可能有很大差異。如上所述，該真菌病毒在雙鏈RNA的序列中含有RdRp (RNA依賴性RNA聚合酶)的 保守基序，且編碼該區(qū)域的RNA的核苷酸序列與金色病毒科病毒具有同源性。因此，推測該 真菌病毒是分類為金色病毒科的新型病毒。將該真菌病毒的四種類的雙鏈RNA的核苷酸序列分別以SEQID NO :1 4來表示， 將該核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別以SEQ ID NO :5 8來表示。需要說明的是，序列表記載的核苷酸序列全部以DNA序列來記載，但本發(fā)明的序 列包括這些序列，也包括全部RNA時(shí)的序列(胸腺嘧啶取代為尿嘧啶)(下同)。
序列分析的結(jié)果，關(guān)于編碼RdRp (RNA依賴性RNA聚合酶)的區(qū)域的核苷酸序列， 該真菌病毒與Hvl45SV的同源性為22%，相似性為39%，該真菌病毒與PcV的同源性為 23 %，相似性為38 %，該真菌病毒與AbVl的同源性為28 %，相似性為45 %。因此，本發(fā)明的真菌病毒包含全部的與金色病毒科病毒(例如Hvl45SV、PcV、AbVl 的任一種)的基因組中編碼RdRp (RNA依賴性RNA聚合酶)的區(qū)域的同源性為20 100% 的病毒，或者相似性為40 100%的病毒。此處，“同源性”是指核苷酸序列完全一致的情 況，“相似性”是指通過取代腺嘌呤和鳥嘌呤、或是取代胸腺嘧啶(尿嘧啶)和胞嘧啶核苷酸 序列完全一致的情況。本發(fā)明的真菌病毒是內(nèi)在性存在于規(guī)定的稻瘟病菌內(nèi)。因此，例如，通過從潛在地 感染該真菌病毒的稻瘟病菌株中分離、回收病毒等，可以獲得該真菌病毒。需要說明的是， 關(guān)于內(nèi)含本發(fā)明的真菌病毒的稻瘟病菌，可以在與一般的稻瘟病菌同樣的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條 件下進(jìn)行培養(yǎng)。作為本發(fā)明的真菌病毒，可列舉例如本發(fā)明人等鑒定并命名的 MoCVl (Magnaporthe oryzae chrysovirus 1)。該病毒至少存在于稻癌病菌(學(xué)名 "Magnaporthe oryzae")的“S-0412-II la”菌株內(nèi)。該稻瘟病菌的菌株，曾經(jīng)向獨(dú)立行政 法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心及獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)特許 微生物寄托中心申請(qǐng)保藏，但因內(nèi)在病毒的理由而拒絕受理。本菌株保存于國立大學(xué)法人 東京農(nóng)工大學(xué)農(nóng)學(xué)部植物病理學(xué)研究室，在遵守各法令的條件下，可分讓給第三方。此外，稻瘟病菌(學(xué)名“Magnaporthe oryzae”)的 “S-0412-II la” 株已國 際保藏于德國的國際保藏機(jī)構(gòu)· DMSZ(Deutsche Sammlung con Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,地 Jat Inhoffenstr. 7B D-38124 Braunschweig GERMANY)(保 藏日2008年3月25日，保藏號(hào)DSM21334)。同株也國際保藏于美國的國際保藏機(jī) I^J · ATCC(American Type Culture Collection, i也 tit 10801 University Boulevard Manassas,VA 20110-2209 USA)(保藏日:2008 年 4 月 9 日，保藏號(hào)PTA_9137)。需要說明 的是，本菌株的原產(chǎn)地為越南。作為病毒的分離、回收方法，可采用公知的方法。例如，可以用液氮等冷凍、破碎菌 體，用規(guī)定的緩沖液中混懸后，通過超離心分離等分離病毒，可回收病毒。此外，如上所述，該病毒也可存在于細(xì)胞外。因此，例如也可以用液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 含有真菌病毒的植物病害真菌(規(guī)定的稻瘟病菌等)，從該培養(yǎng)上清中分離、回收病毒。該 病毒本身也可時(shí)常在國立大學(xué)法人東京農(nóng)工大學(xué)農(nóng)學(xué)部植物病理學(xué)研究室調(diào)制，可時(shí)常分 讓給第三方。<關(guān)于本發(fā)明的基因、核酸、蛋白質(zhì)等>本發(fā)明人等對(duì)本發(fā)明的真菌病毒之一進(jìn)行了序列分析，得到了全長的核苷酸序列 (SEQ ID N0:1 4)。因此，本發(fā)明包含全部該真菌病毒基因、具有該核苷酸序列或其一部 分的核酸、這些核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)等。本發(fā)明包含具有SEQ ID NO :1 4的四種類的序列的真菌病毒基因。此外，本發(fā)明也包含全部具有這些核苷酸序列的全部或一部分的核酸。核酸可以 是雙鏈、單鏈的任意一種，此外，DNA、cDNA、RNA等也全部包括在內(nèi)。例如，SEQ ID NO :1 4的全部或任一序列、在序列中具有規(guī)定機(jī)能的特定部分的序列、與這些序列具有同等核苷酸序列的cDNA、插入了與這些序列有同等核苷酸序列的 重組載體(質(zhì)粒、病毒等)等，均包含在本發(fā)明中。序列解析的結(jié)果顯示，在SEQ ID NO 1的序列部分存在RdRp (RNA依賴性RNA聚合 酶)的保守基序，以及在SEQ ID NO 3的序列部分與La France病(勒法士郎病)病毒的 雙鏈RNA片段具有同源性。因此，依照目的、用途，例如也可制備、使用至少具有作為有規(guī)定 機(jī)能的特定部分的這些序列部分的核酸、重組載體等。需要說明的是，本發(fā)明的核酸(或基因)中也廣泛包含與上述核苷酸序列具有同 源性的核酸，例如，在嚴(yán)格的條件下與和該核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列組成的核酸雜交， 且具有稻瘟病菌抑制作用的核酸。在此，嚴(yán)格的條件、雙鏈核酸的Tm等，可以通過公知技術(shù)獲得。此外，本發(fā)明也包含上述的真菌病毒基因及核酸所編碼的全部蛋白質(zhì)。本發(fā)明的 蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于SEQ ID NO 5 8。SEQ ID NO :5為SEQ ID NO :1記載的核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列，SEQ ID NO 6為SEQ ID NO 2記載的核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列，SEQ ID NO 7為SEQ ID NO 3記載的核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列，SEQ ID NO 8為SEQ IDNO 4記載的 核苷酸序列中的可讀框的氨基酸序列。需要說明的是，本發(fā)明的蛋白質(zhì)，除了具有SEQ ID NO :5 8的任意一種的氨基酸 序列的蛋白質(zhì)之外，還包含全部與這些具有同源性且保持該機(jī)能的蛋白質(zhì)。例如，將上述核酸插入到重組載體中，并使其在宿主中強(qiáng)制表達(dá)，由此可大量調(diào)制 這些蛋白質(zhì)。宿主可以考慮利用大腸桿菌類、酵母類、培養(yǎng)細(xì)胞等公知的宿主?？紤]到真菌 病毒可以感染真菌，酵母類具有高增殖性且利用也比較方便等，作為宿主可能以酵母類最 適合。至于重組載體，也可以利用公知的載體。插入有SEQ ID NO :1 4的任一序列的多 個(gè)載體，通過使該四種類的基因的多個(gè)共表達(dá)，有可能再構(gòu)成真菌病毒。在這種情況下，也 可考慮利用公知的宿主及公知的重組載體，但是從可以同時(shí)導(dǎo)入多個(gè)載體的角度考慮，可 能以酵母類最為適合。<關(guān)于植物病害真菌的減毒菌株>本發(fā)明的植物病害真菌減毒菌株，包含全部內(nèi)含本發(fā)明的真菌病毒的菌株。S卩，例 如包含已經(jīng)內(nèi)含該真菌病毒的稻瘟病菌等的菌株以及感染了該真菌病毒的植物病害真菌 的菌株兩類。作為使真菌病毒感染植物病害真菌等的方法，例如有按照以往在菌絲融合時(shí)使宿 主菌感染的方法。此外，如上所述，本發(fā)明的真菌病毒也可存在于細(xì)胞外，因此例如也可以 從細(xì)胞外直接地感染宿主菌。作為該植物病害真菌減毒菌株的實(shí)例，可列舉上述的S-0412-IIla株。該菌株是 經(jīng)本發(fā)明的真菌病毒感染的稻瘟病菌的菌株。因此，有關(guān)形態(tài)的性質(zhì)、培養(yǎng)的性質(zhì)、孢子形 成、生理學(xué)的及化學(xué)分類學(xué)的性質(zhì)，基本上與公知的稻瘟病菌相同。但是，與一般的稻瘟病 菌相比其生長遲緩，菌絲呈非同心環(huán)狀生長，色素的沉淀也不均勻。此外，可見氣生菌絲異 常的發(fā)達(dá)，并觀察到扇形形成及溶菌。<關(guān)于植物病害防治劑>本發(fā)明的植物病害防治劑包含全部至少含有本發(fā)明的真菌病毒或本發(fā)明的植物病害真菌減毒菌株的任意一種的防治劑。此外，也可同時(shí)含有該真菌病毒和該植物病害真 菌減毒菌株，也可含有其它的成分。作為其它的成分，可含有例如規(guī)定的載體、粘結(jié)劑、增粘劑、固定劑、防腐防霉劑、 溶齊 、穩(wěn)定齊 、抗氧齊 、紫外線吸收劑、晶體析出防止劑、消泡齊 、物性改善齊 、著色劑等。此 外，也可以含有其它的農(nóng)藥成分，例如殺螨劑、殺線蟲劑、殺菌劑、抗病毒劑、引誘劑、除草 劑、植物生長調(diào)節(jié)劑、增效劑等。作為載體，例如可以使用固體載體和/或液體載體。作為固體載體，可列舉例如淀 粉、活性炭、大豆粉、小麥粉、木粉、魚粉、奶粉等動(dòng)植物性粉末，滑石、高嶺土、膨潤土、沸石、 硅藻土、白炭黑、粘土、氧化鋁、碳酸鈣、氯化鉀、硫酸銨等礦物性粉末。作為液體載體，可列 舉例如水、異丙醇、乙二醇等醇類，環(huán)己酮、甲基乙基酮等酮類，丙二醇單甲基醚、二甘醇單 正丁基醚等醚類，煤油、輕油等脂肪族烴類，二甲苯、三甲苯、四甲苯、甲基萘、溶劑粗汽油等 芳香族烴類，N-甲基-2-吡咯烷酮等酰胺類，脂肪酸的甘油酯類，大豆油、油菜籽油等植物 油。作為粘結(jié)劑、增粘劑、固定劑，可列舉例如淀粉、糊精、纖維素、甲基纖維素、乙基纖 維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥甲基淀粉、普魯 蘭、海藻酸鈉、海藻酸銨、海藻酸丙二醇酯、瓜爾膠、刺槐豆膠、阿拉伯膠、黃原膠、明膠、酪蛋 白、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙二醇、乙烯-丙烯嵌段聚合物、聚丙烯酸鈉、聚乙烯吡咯烷 酮等。對(duì)本防治劑的劑型無特殊限定。例如可適用乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、片劑、水 合劑、水溶劑、液劑、水懸劑P 口了 ΧΑ剤)、顆粒水合劑、氣溶膠劑、糊劑、油劑、乳濁劑等 形態(tài)。<關(guān)于植物病害真菌抑制性真菌病毒的生產(chǎn)方法>本發(fā)明的植物病害真菌抑制性真菌病毒的生產(chǎn)方法，包含全部的至少包括用液體 培養(yǎng)基等培養(yǎng)含有真菌病毒的植物病害真菌，從該培養(yǎng)上清中回收真菌病毒的步驟的方 法。如上所述，本發(fā)明的真菌病毒也可存在于宿主菌的細(xì)胞外。因此，例如可用液體培 養(yǎng)基等培養(yǎng)經(jīng)真菌病毒感染的植物病害真菌，通過離心分離法來分離菌體后，從該培養(yǎng)上 清中分離、回收病毒，從而可簡便且相對(duì)大量地回收病毒。但是，本發(fā)明的真菌病毒并不僅限于用這種生產(chǎn)方法獲得的病毒。即，例如從內(nèi)含 真菌病毒的稻瘟病菌中分離、回收所獲取的病毒，也廣義地包含在本發(fā)明中。<關(guān)于植物病害真菌減毒的方法>如上所述，例如通過使本發(fā)明的真菌病毒感染特定的植物病害真菌等，抑制該宿 主菌的生長等而可使該菌減毒。至于真菌病毒的感染方法，可以采用和上述相同的方法。<關(guān)于植物病害的防治方法>本發(fā)明的植物病害防治方法，包含全部的至少含有將上述的稻瘟病防治劑附加于 特定的植物(稻等)的步驟的方法。作為使防治劑附加于植物的方法，可列舉例如在葉的表面或里面涂抹防治劑的方 法、使用規(guī)定的載體等使防治劑附著于葉的表面或里面的方法、將防治劑散布或供應(yīng)于葉 上的方法等。
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防治劑的涂抹量或散布量，根據(jù)有效成分的濃度、制劑的形態(tài)、對(duì)象病害和作物的 種類、病害導(dǎo)致的受害程度、施用場所、施用方法、施用時(shí)期、混用、合用的藥劑和肥料等的 使用量、種類等種種條件，可進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。例如，通過向每葉噴霧或供應(yīng)1 IOOOmL的調(diào)整為1 X IO3 1 X IO7個(gè)/mL的稻 瘟病菌減毒菌株的分生孢子含有液，此外，通過使葉每Imm2涂抹或附著1 X IO3 1 X IO10個(gè) 稻瘟病菌減毒菌株的分生孢子于葉表面或里面，有可抑制植物病害的可能性。本發(fā)明可適用于以真菌為主要病因的所有的植物病害。作為有適用可能性的植物 病害，可列舉例如下述的病害(不限定于這些)。作為針對(duì)禾本科植物的植物病害，可列舉例如稻瘟病(病原菌“Magnaporthe oryzae (稻瘟病菌)”)、水稻胡麻葉斑病(病原菌“Cochliobolus miyabeanus (水稻胡麻葉 枯病菌)”)、紋枯病(病原菌“Thanat印horus cucumeris (水稻紋枯病菌)”)、惡苗病(病 原菌“Gibberella fujikuroi (藤倉赤霉菌)”)、苗立枯病(病原菌“Fusarium(鐮刀菌屬) 菌”、“Rhizopus 菌(根霉屬菌)”、“Pythium 菌(腐霉屬菌)”、“Trichoderma viride (綠色 木霉菌)”)、稻曲病(病原菌“Clavic印s virens(有性世代歸子囊菌亞門麥角菌屬)”)、 麥類赤霉病(病原菌"Gibberella zeae (玉蜀黍赤霉)，，、"Fusarium avenaceum(燕 麥鐮孢)”、“Fusarium culmorum(黃色鐮孢菌)","Monographella nivale”)、雪腐病 (病原菌“Pythium 菌(腐霉菌)”、“Typhula 菌(瑚菌)”、“Monographella nivalis，，、 "Myriosclerotinia borealis (核盤霉)”)、散黑穗病(病原菌 “Ustilago nuda(裸黑粉 菌)”)、矮腥黑穗病(病原菌“Tilletia controversa(小麥矮腥黑穗病菌)”)、眼斑病(眼 紋病)(病原菌"Pseudocercosporella herpotrichoides (小麥基腐病菌)，，)、葉斑病(葉 枯病)(病原菌“S印toria tritici (小麥殼針孢)”)、穎枯病(病原菌“Phaeosphaeria nodorum(穎枯殼針孢)”)、白粉病(病原菌“Blumeria graminis(白粉菌)”)。作為其它的植物病害，可列舉例如柑橘類黑點(diǎn)病(病原菌“Diaporthe citri (柑 橘間座殼菌)”)、黑腐病(病原菌“Diaporthe medusa, Alternaria citri(柑桔黑腐 病菌)”)、瘡痂病(病原菌“Elsinoe fawcettii (柑桔痂囊腔菌)”)、褐腐病(病原 ^"Phytophthora citrophthra，，)、綠霄病(病原菌“Penicillium digitatum(指狀青 霉)”)、青霉病(病原菌“Penicillium italicum(青霉病菌)”)、蘋果花腐病(病原菌 "Monilinia mali (蘋果花腐病菌)”)、黑星病(病原菌“Venturia inaequalis (蘋果黑 星病菌)”)、斑點(diǎn)落葉病(病原菌“Alternaria mali (輪斑病菌)”)、黑點(diǎn)病(病原菌 "Mycosphaerella pomi ( ^^H ^ ^ ) " ) >( HC^ "Gloeodes pomigena( ^ 果煤污病菌)”)、蠅斑病(病原菌“Zygophiala jamaicensis"),輪紋病(病原菌 "Botryosphaeria berengeriana( ) " ) > HSE^I ( J^ lif "Diplocarpon maliCH 雙冑胃)”)、$g_ ( J^ "Gymnosporangium yamadae ( H $ g _ 菌)”)、腐爛病(病原菌“Valsa ceratosperma(蘋果樹腐爛病菌)”)、梨黑星病(病原菌 "Venturia nashicola (梨黑星菌)，，)、赤星病(病原菌"Gymnosporangium asiaticum(梨 膠銹菌)”)、輪紋病(病原菌“Botryosphaeria berengeriana(貝倫格葡萄座腔菌)”)、 胴枯病(病原菌“Phomopsis fukushii(福士擬莖點(diǎn)霉)”)、桃縮葉病(病原菌“Taphrina deformans(畸形外囊菌)”)、褐腐病(病原菌“Monilinia fructicola(桃褐腐菌)、 Monilinia fructigena(桃褐腐病菌)，，)、黑星病(病原菌“Cladosporium carpophilum(嗜果枝孢菌)”)、擬莖點(diǎn)霉腐敗病(病原菌“Phomopsis sp.(擬莖點(diǎn)霉)”)、櫻桃褐腐病 (病原菌"Monilinia fructicola(桃褐腐菌)，，、"Monilinia fructigena(桃褐腐病 菌)”)、櫻桃核盤菌病(病原菌“Monilinia kusanoi (櫻桃核盤菌)”)、梅黑星病(病 原菌“Cladosporium carpophilum(嗜果枝孢菌)”)、葡萄黑痘病(病原菌“Elsinoe ampelina() " ) >( _ 帛胃 “Colletotrichum acutatum (胃 H _ 胃)”、
"Glomerella cingulata (炭疽病菌)”)、褐斑病(病原菌"Pseudocercospora vitis (葡萄 擬尾孢菌)”)、蔓割病(病原菌“Phomopsis viticola(葡萄生擬莖點(diǎn)菌)”)、柿角斑落葉 病(病原菌“Cercospora kaki (柿角斑病菌)”)、圓星落葉病(病原菌“Mycosphaerella nawae (柿葉球腔菌)，，)、茶輪斑病(病原菌“Pestalotiopsis Iongiseta (茶輪斑病菌)，，、 "Pestalotiopsis theae( J^ "Pseudocercospora
ocellata，，、“Cercospora chaae，，)、茶餅病(病原菌"Exobasidium vexans (壞損夕卜擔(dān) 菌)，，)、荼網(wǎng)餅病(病原菌“Exobasidium reticulatum(網(wǎng)狀外擔(dān)菌)，，)、瓜類蔓枯病(病 原菌“Mycosphaerella melonis (蔓枯病菌)”)、蔓割病(病原菌"Fusarium oxysporum(尖 孢鐮刀菌)”)、黑星病(病原菌“Cladosporium cucumerinunK黃瓜黑星病菌)”)、褐斑病 (病原菌“Corynespora cassiicola(棒孢菌)”)、番茄葉霉病(病原菌“Fulviafulva(番 茄葉霉病菌)”)、輪紋病(病原菌“Alternaria solani (番茄早疫病菌)”)、茄褐紋 病(病原菌“Phomopsis vexans(茄褐紋病病菌)”)、葉霉病(t tt/病)(病原菌 "Mycovellosiella nattrassii (灰毛茄菌絨孢)”)、十字花科蔬菜白銹病(病原菌“Albugo macrospora(大孢白銹菌)，，)、白斑病(病原菌"Cercosporella brassicae (蕪青白斑 病菌)”、“Pseudocercosporella capsellae (芥假小尾孢)”)、洋蔥灰色腐敗病(病原 菌“Botrytis allii (洋蔥灰色腐敗病菌)”)、草莓蛇眼病(病原菌“Mycosphaerella fragariae (草莓蛇眼小球殼菌)”)、馬鈴薯早疫病(病原菌“Alternaria solani (馬鈴薯 早疫病菌)”)、大豆疫霉根腐病(歹^ ^ O莖疫病)(病原菌“Phytophthora sojae (大豆 疫霉根腐病菌)”)、紫斑病(病原菌“Cercospora kikuchii (紫斑病菌)”)、豇豆疫霉頸腐 病(7 O莖疫病)(病原菌“Phytophthora vignae (豇豆疫霉)”)、花生褐斑病(病 原菌“Mycosphaerella arachidis (花生褐斑病菌)”)、甜菜褐斑病(病原菌“Cercospora beticola (甜菜尾孢菌)”)、葉腐病(病原菌“Thanat印horus cucumeris (瓜亡革菌)”)、 禾草彎孢葉枯病Wd 7 V 7葉枯病)(病原菌“Curvularia菌(彎孢菌)”)、 ( ^!!^^"Sclerotinia homoeocarpa (IHi^ ) " ) >Helminthosporium Bf ( ^f 原菌“Cochliobolus菌”)、薔薇黑星病(病原菌"Diplocarpon rosae (薔薇雙殼菌)”)、 菊花白銹病(病原菌“Puccinia horiana (堀氏菊柄銹菌)”)、各作物的霜霉病(病原菌 "Peronospora 菌(霜霉病菌)，，、"Pseudoperonospora 菌(假霜霉菌)，，、"Plasmopara 菌(軸 霜霉菌)，，、"Bremia菌(盤霜霉菌)”)、疫病(病原菌"Phytophthora菌(疫霉菌)”)、白 粉病(病原菌“Erysiphe菌(白粉菌)，，、"Blumeria菌(布氏白粉菌)”、“Sphaerotheca菌 (單囊殼菌)”、“Podosphaerea 菌”、“Phyllactinia (球針殼屬)菌”、“Uncinula (鉤絲殼屬) 菌”、“Oidiopsis (擬粉孢型)菌”)、銹病(病原菌“Puccinia (柄銹菌屬)菌”、“Uromyces (單 胞銹菌屬)菌”、“Physopella菌(殼銹菌)”)、黑斑病(病原菌“Alternaria(鏈格孢屬) 菌”)、灰霉病(病原菌“Botrytis cinerea(草莓灰霉菌)”)、菌核病(病原菌“Sclerotinia sclerotiorum(核盤菌)”)、白紋羽病(病原菌“Rosellinia necatrix(褐座堅(jiān)殼菌)”)、紫紋羽病(病原菌“Helicobasidium mompa (桑卷擔(dān)菌)”)、白絹病(病原菌“Sclerotium rolfsii(齊整小核菌)”)、其它的各種土傳病害(病原菌“Fusarium菌(鐮刀菌)”、 "Rhizoctonia 菌(絲核菌)”、“Pythium 菌(腐霉菌)”、“Aphanomyces (絲囊霉屬)菌”、 "Phoma 菌(蓮點(diǎn)菌)，，、“Verticillium 菌(輪枝孢菌)，，、“Plasmodiophora brassicae (蕓 苔根腫菌)等”)。實(shí)施例1在實(shí)施例1中，嘗試從57株稻瘟病菌中檢測內(nèi)在性雙鏈RNA。首先，磨碎單獨(dú)采集的57株稻瘟病菌的各菌體，用酚SDS法提取核酸后，通過 DNasel及Sl核酸酶選擇性地分解DNA和單鏈核酸，得到菌體內(nèi)在性的雙鏈RNA液。然后， 在瓊脂糖凝膠中于20V下電泳18小時(shí)，用溴化乙錠進(jìn)行染色。其結(jié)果57株中，有11株檢測到雙鏈RNA的譜帶。其中，7株檢測到2. 8 3. 6kb 的4種成分的譜帶，3株檢測到1. O 2. 6kb的3種成分的譜帶，1株檢測到1. O 3. 6kb 的8種成分的譜帶。需要說明的是，圖1是表示關(guān)于57株稻瘟病菌中的9株的雙鏈RNA檢測結(jié)果的電 泳照片。圖1中，泳道1是DNA標(biāo)記，泳道2至泳道10是從菌體制備的樣品。在圖1中，泳 道6和泳道8未檢測出雙鏈RNA的譜帶，相對(duì)與此，泳道2、泳道3、泳道4、泳道5和泳道10 檢測到2. 8 3. 6kb的4種成分的譜帶，泳道7檢測到1. O 2. 6kb的3種成分的譜帶，泳 道9檢測到1. O 3. 6kb的8種成分的譜帶。在上述的試驗(yàn)結(jié)果中，考慮到從一株中可以檢測到多條譜帶這一點(diǎn)以及雙鏈RNA 的長度，從11株稻瘟病菌中檢測出的雙鏈RNA很有可能就是構(gòu)成真菌病毒的雙鏈RNA。即， 本實(shí)施例的結(jié)果暗示這些稻瘟病菌株中內(nèi)含新型的真菌病毒。實(shí)施例2實(shí)施例2是根據(jù)實(shí)施例1的結(jié)果，比較了內(nèi)含雙鏈RNA的菌株和不含的菌株的生 長速度。在實(shí)施例1中，對(duì)于未檢測出內(nèi)在性雙鏈RNA的菌株和檢測出的菌株，分別用PDA 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)開始6天后和10天后觀察菌落。其結(jié)果，未檢測出內(nèi)在性雙鏈RNA的菌株其菌絲生長成同心環(huán)狀，色素的沉淀也 均勻。另一方面，檢測出內(nèi)在性雙鏈RNA的菌株和未檢測出的菌株相比較，其生長遲緩，菌 絲呈非同心環(huán)狀地生長，色素的沉淀也不均勻。此外，可見到氣生菌絲的異常發(fā)達(dá)，并觀察 到扇形形成和溶菌。S卩，內(nèi)含雙鏈RNA的菌株和不含的菌株相比較，可見到生長抑制。這些試驗(yàn)結(jié)果暗 示實(shí)施例1中所得的雙鏈RNA (真菌病毒)是稻瘟病菌的生長抑制因子(減毒化因子)。實(shí)施例3在實(shí)施例3中是用低濃度的放線菌酮(蛋白質(zhì)合成抑制劑)處理內(nèi)含雙鏈RNA的 菌株，嘗試制備真菌病毒治愈株。制備添加有0. 25 0. 50 μ g/ml放線菌酮的YG平皿培養(yǎng)基，并向其中移植實(shí)施例 2中培養(yǎng)的菌株(檢測出內(nèi)在性雙鏈RNA的菌株)。然后，所形成的菌落中，將回復(fù)正常生 長的部位進(jìn)一步移植到別的YG平皿培養(yǎng)基中，得到放線菌酮處理菌株。結(jié)果顯示放線菌酮 處理菌株比一般的稻瘟病菌株生長更好。
接著，從所得的放線菌酮處理菌株中，用與實(shí)施例1同樣的方法提取雙鏈RNA，通 過電泳來嘗試檢測雙鏈RNA的譜帶。其結(jié)果是來自放線菌酮處理菌株未檢測到雙鏈RNA的 譜帶。此外，也以別的方法制備真菌病毒治愈菌株，進(jìn)行同樣的試驗(yàn)。使在實(shí)施例2中培養(yǎng)的菌株在PDA培養(yǎng)基或燕麥片培養(yǎng)基上生長1 3周后，分 離分生孢子，將該分生孢子一個(gè)個(gè)移植到新的PDA培養(yǎng)基中，選拔真菌病毒脫落的菌落，以 此作為真菌病毒治愈菌株。其結(jié)果，即使是該治愈菌株，其生長也明顯比病毒保有菌株良好。此外，與上述同 樣，通過電泳嘗試檢測雙鏈RNA的譜帶，結(jié)果顯示從治愈菌株中未檢測出雙鏈RNA的譜帶。這些結(jié)果顯示，稻瘟病菌中內(nèi)含的雙鏈RNA為真菌病毒，以及該真菌病毒為稻瘟 病菌的生長抑制因子。實(shí)施例4在實(shí)施例4中，對(duì)本發(fā)明的真菌病毒是否也存在于稻瘟病菌的菌體外進(jìn)行了研允。在實(shí)施例1中檢測出2. 8 3. 6kb的4種成分的內(nèi)在性雙鏈RNA的譜帶的菌株中， 將3株移植于液體培養(yǎng)基中并進(jìn)行培養(yǎng)，離心培養(yǎng)液并回收該培養(yǎng)上清。接著，將所得培養(yǎng) 上清在瓊脂糖凝膠中于20V下電泳18小時(shí)后，用溴化乙錠進(jìn)行染色。其結(jié)果，在這些菌株的培養(yǎng)上清中，也在與菌內(nèi)在性雙鏈RNA相同的位置上檢測 出雙鏈RNA的譜帶。該結(jié)果顯示本發(fā)明的真菌病毒不僅存在于稻瘟病菌的菌體內(nèi)，也可存在于菌體 外。實(shí)施例5在實(shí)施例5中，對(duì)于菌體外存在的真菌病毒對(duì)正常的菌株(不保有真菌病毒的菌 株)是否具有感染能力進(jìn)行了研究。首先，將實(shí)施例1中檢測出2. 8 3. 6kb的4種成分以上的內(nèi)在性雙鏈RNA的譜 帶的菌株移植到液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4周后，離心培養(yǎng)液并回收該培養(yǎng)上清。對(duì)于該培養(yǎng) 上清，采用與實(shí)施例4同樣的步驟，在1 %的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，其結(jié)果可確認(rèn)雙鏈RNA 的譜帶。至于所得培養(yǎng)上清，使用0. 22 μ L的濾器進(jìn)行過濾滅菌。接著，在IOOml的燒瓶(kolben)中加入50ml YG培養(yǎng)基，并在其中接種稻瘟病菌 的正常菌株(不保有真菌病毒的菌株)，培養(yǎng)3天后，添加500 μ L所得的培養(yǎng)上清，觀察菌 體的生長。其結(jié)果，在觀察的第3天，未添加培養(yǎng)上清的菌株，其菌絲的前端筆直延伸，表現(xiàn) 出正常的生長，相對(duì)與此，添加了培養(yǎng)上清的菌株，其菌絲的前端基本未延伸，而呈纏繞狀 態(tài)?？紤]該結(jié)果的原因是，存在于培養(yǎng)上清中的真菌病毒感染了稻瘟病菌的正常菌 株，而抑制其生長。即，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示菌體外存在的真菌病毒對(duì)正常的菌株具有感染能 力。實(shí)施例6在實(shí)施例6中，對(duì)于已感染真菌病毒的稻瘟病菌株，測定了其分生孢子數(shù)。
將實(shí)施例1中檢測出2. 8 3. 6kb的4種成分以上的內(nèi)在性雙鏈RNA的譜帶的菌 株移植到Y(jié)G平皿培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周后，用直徑4mm的cork borer ( - >夕# 一，一)選 出菌體，進(jìn)行采集。接著，在1. 5ml的離心管內(nèi)加入5%甘油，再加入采集的菌體，混和、懸浮5分鐘。 然后使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來計(jì)算懸浮液中存在的分生孢子數(shù)。其結(jié)果是在稻瘟病菌的正常菌株(對(duì)照組，未保有真菌病毒的菌株)中分生孢子 數(shù)為33 X IO4個(gè)/mL，相對(duì)與此，內(nèi)含真菌病毒的稻瘟病菌中分生孢子數(shù)為1 X IO4個(gè)/mL以 下。該結(jié)果顯示本發(fā)明的真菌病毒抑制宿主菌的分生孢子形成。即，本發(fā)明暗示在抑 制植物病害菌增殖的同時(shí)，也很有可能會(huì)抑制其傳播、感染擴(kuò)大等。實(shí)施例7在實(shí)施例7中，對(duì)從稻瘟病菌中提取的雙鏈RNA的核苷酸序列進(jìn)行了分析。(1)雙鏈RNA的提取、純化首先，依照下述的步驟進(jìn)行雙鏈RNA的提取、純化。對(duì)于在實(shí)施例1中檢測出雙鏈RNA的一個(gè)菌株，用液氮冷凍后磨碎，在0. Ig菌體 中添加Iml提取緩沖液(2XSTE、1% SDSUOmM β-巰基乙醇)。在該溶液中，加入與提取 緩沖液等量的PCI (50%苯酚、48%氯仿，2%異戊醇)，在室溫下充分?jǐn)嚢?0分鐘，離心分 離(8，00011)111、20分鐘、室溫)后，采集其上清(水相)。然后，在采集的上清中加入等量的 100 %乙醇(終濃度為50 %乙醇/1 X STE溶液)，進(jìn)行乙醇沉淀。將所得的沉淀物(核酸)溶解于17. 5%乙醇/IXSTE溶液中，在65°C下加熱處理 10分鐘后放入冰中驟冷，離心分離(8，000rpm、10*#、4°C)后，采集其上清。在其上清中 加入纖維性纖維素填料(商品名“CF11”、Whatman公司生產(chǎn))中，在4°C下攪拌30 60分 鐘后，填充到柱(直徑1. 5cm、高12cm)中。其次，向柱中供給17. 5%乙醇/IXSTE溶液，除去非吸附組分后，供給1 X STE溶 液，將吸附組分洗脫并回收。為了除去洗脫組分中混入的DNA，在其中加入25U的DNase I (Takara生物株式會(huì)社生產(chǎn))，在37°C下反應(yīng)30分鐘后，進(jìn)行乙醇沉淀，得到目的雙鏈 RNA。(2)cDNA 克隆接著，以所得的雙鏈RNA為模板合成cDNA，然后進(jìn)行cDNA的殼隆。對(duì)于所得的雙鏈RNA，使用隨機(jī)引物、SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司 生產(chǎn)、下同)來合成第一鏈cDNA。接著用RNaseH處理后，使用DNA聚合酶合成cDNA第二鏈。 用T4DNA聚合酶將合成的雙鏈cDNA進(jìn)行末端平滑化后，再用QIAquick PCRPurification Kit (Qiagen公司生產(chǎn)、下同)進(jìn)行純化。其次，將其末端進(jìn)行磷酸化修飾后，將該cDNA插入到pUC19質(zhì)粒載體(Takara生 物株式公司生產(chǎn)，下同)中，使該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到各cDNA的克隆。然后對(duì)各 cDNA克隆進(jìn)行序列測定。根據(jù)所得的各核苷酸序列信息，制作疊連序列(contig sequence)，結(jié)果是，對(duì)于 菌體中存在的四種類的雙鏈RNA，均可獲得大體上為全長的核苷酸序列。(3)使用5’ RACE法進(jìn)行末端序列的分析
接著，根據(jù)這些序列信息，合成基因特異性的反義引物，按照與上述同樣的步驟從 菌體中提取、純化雙鏈RNA，使用SuperScriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶及其引物合成cDNA，用RNase H 處理，得到單鏈的第一鏈cDNA。然后，使用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) (Takara生物株式會(huì)社生產(chǎn))將脫氧胞嘧啶均聚物作為錨序列附加到該單鏈 cDNA上。接著合成附加有脫氧鳥嘌呤均聚物的接頭引物，合成基因特異性的反義引物，并通 過PCR法擴(kuò)增兩引物之間的部分，合成cDNA。然后，使用T4DNA聚合酶將該cDNA進(jìn)行末端平滑化，再用QIAquick PCR Purification Kit進(jìn)行純化，對(duì)其末端進(jìn)行磷酸化修飾后，將該cDNA插入到pUC19質(zhì)粒載 體中，使該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到各cDNA的克隆。然后對(duì)各cDNA克隆進(jìn)行序列測定。根據(jù)以上的步驟，得到新型真菌病毒的基因信息的全長序列。該真菌病毒由四種 類的雙鏈RNA構(gòu)成。各雙鏈RNA的序列示于SEQ ID N0:1 4。需要說明的是，為了將雙 鏈RNA取代為cDNA后進(jìn)行序列測定，在序列表中“尿嘧啶”被取代為“胸腺嘧啶”。需要說明的是，對(duì)所得的核苷酸序列進(jìn)行分析的結(jié)果，SEQID NO 1所示的RNA序 列中含有存在于全病毒及其近緣病毒等中的RdRp (RNA依賴性RNA合成酶)的保守基序。此 外，SEQ IDNO 3所示的RNA序列中含有與La France病(勒法士郎病)病毒的L3雙鏈RNA 片段具有同源性的區(qū)域。該結(jié)果顯示本發(fā)明的四種類的雙鏈RNA為新型真菌病毒的基因信息。實(shí)施例8在實(shí)施例8中，對(duì)本發(fā)明的真菌病毒的病毒顆粒進(jìn)行了生物化學(xué)特性的分析。用液氮冷凍稻瘟病菌S-0412-II Ia株，用乳缽磨碎。在該樣本中加入4 6倍容 量的0. IM的磷酸緩沖液(ρΗ7. 0)，用混合器進(jìn)行攪拌。然后相對(duì)于磷酸緩沖液加入40%容 積的丁醇、氯仿(體積比1 1)，攪拌30分鐘，離心(8，OOOXgUO分鐘)并回收其上清，并 反復(fù)進(jìn)行該操作數(shù)次。然后，在該上清中加入聚乙二醇(平均分子量6，000)使終濃度為8%，加入氯化鈉 使終濃度為1%，使其溶解后，在4°c下放置3小時(shí)而使病毒彼此凝集，離心(12，000Xg、20 分鐘)，得到通過聚乙二醇而凝集的病毒沉淀物。將該病毒沉淀物溶解于適量的0.05M磷酸緩沖液(pH7.0)中，離心(6，000Xg、5 分鐘)除去不溶的雜質(zhì)，回收該上清。然后，分注20%蔗糖使成為從離心管的底約Icm左右的高度作為緩沖，使回收 的上清分層后，超離心(100，000\8、2小時(shí))，將該沉淀物溶于少量的0.0511磷酸緩沖液 (PH7.0)中，以此作為部分純化病毒標(biāo)準(zhǔn)品。將該病毒標(biāo)準(zhǔn)品的一部分進(jìn)行SDS-PAGE (7. 5 %凝膠、Tri s_甘氨酸緩沖液 (pH8.8)、20mA、90分鐘)電泳，用CBB (考馬斯亮藍(lán))染色，進(jìn)行病毒蛋白質(zhì)的主要成分(外 殼蛋白)的分子量分析。其結(jié)果檢測到約70kDa大小來自病毒顆粒的蛋白質(zhì)的譜帶。因此，用SDS-苯酚法從檢測出該70kDa的蛋白質(zhì)的成分中進(jìn)行核酸提取。其結(jié)果 檢測出2. 8 3. 6kbp的4種成分的雙鏈RNA。
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以上，通過本實(shí)施例可以確認(rèn)存在本發(fā)明的真菌病毒的病毒顆粒。實(shí)施例9在實(shí)施例9中，使用噴霧接種法研究了本發(fā)明對(duì)植物病害真菌的防治是否有效。在燕麥片培養(yǎng)基平皿中接種稻瘟病菌S-0412-II Ia株，在25°C的室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。 如在接種后第15天未能充分產(chǎn)生分生孢子時(shí)，在平皿中注入滅菌蒸餾水約2mL左右，用筆 擦搓培養(yǎng)基表面以除去氣生菌絲，將該平皿置于黑光下3天以誘導(dǎo)分生孢子形成，注入滅 菌蒸餾水約ImL左右，再次用筆擦搓培養(yǎng)基表面以回收氣生菌絲及分生孢子，得到含有分 生孢子的液體。接種后第15天分生孢子充分產(chǎn)生時(shí)，在平皿中注入滅菌蒸餾水約2mL左右， 用筆擦搓培養(yǎng)基表面以回收氣生菌絲及分生孢子，得到含有分生孢子的液體。此外，作為對(duì) 照，用與實(shí)施例3同樣的步驟制作稻瘟病菌的真菌病毒完全治愈株，用同樣的步驟從該菌 得到含有分生孢子的液體。然后，使用擦拭紙(Kimwipe)或是紗布過濾這些含有分生孢子的液體，將分生孢 子濃度調(diào)整為2X IO6個(gè)/mL，在其中加入0. 02% (ν/ν)的吐溫20，作為分生孢子懸浮液。然后，使用噴嘴對(duì)稻苗(考慮稻瘟病真實(shí)的抗性基因型和菌的種類而適當(dāng)選擇 的品種，播種后的第2 3周的苗)平均地噴霧分生孢子懸浮液，將植物體置于26°C、相對(duì) 濕度為100%的接種箱內(nèi)靜置24小時(shí)后，將苗盆(￥7卜)移至溫室內(nèi)，并維持室溫在23 30°C，噴霧接種后培養(yǎng)7天。然后在噴霧接種后第7天計(jì)測每一定葉面積的3 4mm的患 病性病斑的數(shù)目。結(jié)果如圖2所示，圖2為顯示接種稻瘟病菌的葉中病斑數(shù)的圖。圖中縱軸表示接 種有稻瘟病菌的葉上的病斑數(shù)。圖中，“混合感染株”表示的是在噴霧了由感染本發(fā)明的真 菌病毒的稻瘟病菌制備的分生孢子懸浮液的情況下的病斑數(shù)，而“完全治療株”表示的是在 噴霧了由稻瘟病菌的真菌病毒完全治愈株制備的分生孢子懸浮液的情況下的病斑數(shù)(對(duì) 照)。如圖2所示，與對(duì)照相比，噴霧由感染了本發(fā)明的真菌病毒的稻瘟病菌制備的分 生孢子懸浮液的情況下，病斑數(shù)明顯減少。其結(jié)果顯示本發(fā)明在植物病害真菌的防治上是 有效的。實(shí)施例10在實(shí)施例10中，用打孔器付傷接種法研究了本發(fā)明對(duì)植物病害真菌的防治是否 有效。用與實(shí)施例9同樣的步驟來制備分生孢子懸浮液，將該液附著于3%的不含營 養(yǎng)成分的瓊脂膜上，切取約2mm方形的瓊脂膜，制成瓊脂片。用接種用打孔器剪在20 30°C的溫室培育的稻的第4葉，造成浸潤狀的傷，在該付傷部分覆蓋瓊脂片，將植物體置于 26°C、相對(duì)濕度為100%的接種箱中靜置24小時(shí)后，將苗盆移到溫室內(nèi)，并維持室溫在23 30°C，在接種后培養(yǎng)14天。然后計(jì)測接種后第14天的病斑的大小。其結(jié)果是，與對(duì)照相比，在接種由感染了本發(fā)明的真菌病毒的稻瘟病菌制備的分 生孢子懸浮液的情況下，病斑的大小顯著減小。該結(jié)果顯示與實(shí)施例9同樣，本發(fā)明對(duì)植 物病害真菌的防治是有效的。實(shí)施例11在實(shí)施例11中，通過電子顯微鏡鑒定菌體外存在的病毒顆粒。
將稻瘟病菌S-0412-II Ia株在YG培養(yǎng)基(0. 5%酵母提取物(Yeast Extract)、 2%葡萄糖)中培養(yǎng)，從該培養(yǎng)上清中分離病毒顆粒。將該培養(yǎng)上清離心(10，000Xg、5分 鐘)，然后超離心(100，000X g、30分鐘)該上清，可得含病毒顆粒的沉淀物。將該沉淀物 溶于0.05M磷酸緩沖液(pH7.0)中，使用磷鎢酸或醋酸鈾進(jìn)行負(fù)染色，用電子顯微鏡(倍 數(shù)X 20，000 40，000)觀察。結(jié)果如圖3所示。圖3為從稻瘟病菌S-0412-II Ia株的培養(yǎng)上清中所得的病毒 顆粒的電子顯微鏡照片。如圖3所示，通過電子顯微鏡，可鑒定本發(fā)明的真菌病毒的病毒顆 粒。該病毒顆粒為約30 40nm的正六角形狀，包在包膜樣的結(jié)構(gòu)中。
權(quán)利要求
1.真菌病毒，其具有抑制植物病害真菌的作用，且具有2.8 3. 6kb的四種類的雙鏈RNA。
2.權(quán)利要求1所述的真菌病毒，其抑制上述植物病害真菌的分生孢子形成。
3.權(quán)利要求1所述的真菌病毒，其具有與金色病毒科病毒基因組中編碼RdRp的區(qū)域有 同源性的雙鏈RNA，所述RdRp為RNA依賴性RNA合成酶。
4.權(quán)利要求1所述的真菌病毒，其對(duì)禾本科植物抑制植物病害真菌。
5.權(quán)利要求1所述的真菌病毒，其抑制稻瘟病菌。
6.權(quán)利要求1所述的真菌病毒，其具有SEQID NO :1 4的序列。
7.真菌病毒基因，其具有SEQID NO :1 4的四種類的序列。
8.核酸，其至少具有SEQID NO :1 4中的任一序列或該序列中具有規(guī)定功能的特定 部分的序列。
9.蛋白質(zhì)，其具有SEQID NO :5 8中的任一序列。
10.植物病害真菌的減毒菌株，其含有權(quán)利要求1所述的真菌病毒。
11.權(quán)利要求10所述的減毒菌株，其是保藏號(hào)為DSM21334的菌株。
12.植物病害防治劑，其至少含有權(quán)利要求1所述的真菌病毒和/或權(quán)利要求10所述 的植物病害真菌的減毒菌株。
13.植物病害真菌抑制性真菌病毒的生產(chǎn)方法，其至少包括用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)含有 權(quán)利要求1所述的真菌病毒的植物病害真菌，從該培養(yǎng)上清中回收上述真菌病毒的步驟。
14.植物病害真菌減毒的方法，其包括使權(quán)利要求1所述的真菌病毒感染植物病害真 菌的步驟。
15.植物病害真菌的防治方法，其包括將權(quán)利要求12所述的防治劑附加于植物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供抑制稻瘟病菌的新型真菌病毒(mycovirus)和植物病害的新型防治方法。新發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)在性存在于規(guī)定的稻瘟病菌株、具有2.8～3.6kb的四種類的雙鏈RNA、抑制植物病害真菌的新型真菌病毒。由于該病毒抑制稻瘟病菌等植物病害真菌，因此可適用于植物病害真菌的減毒、植物病害的防治等。此外，該真菌病毒與以往的不同，還可以在細(xì)胞外存在，因此具有可不依賴絲菌融合而從細(xì)胞外直接感染宿主菌的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/00GK102083973SQ20098010324
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月21日
發(fā)明者寺岡徹, 有江力, 森山裕充, 福原敏行 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人東京農(nóng)工大學(xué)