專利名稱：：一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)繁殖和種類保存的方法，具體是一種對植物主要根結線蟲適用的脫離寄主植物的實驗室繁殖和保存方法。屬于植物根結線蟲繁殖與保存的應用領域。
背景技術：
：根結線蟲(il^/o^ogy加spp.)是線蟲中一類廣泛分布于世界各地的植物根系定居性內(nèi)寄生物，在分類上屬于線形動物門、線蟲綱、根結線蟲屬，是世界上十大最重要的植物寄生線蟲屬之一。己報道的根結線蟲有卯多個種，其中分布普遍危害最廣的主要有南方根結線蟲(M/ncog"/to)、花生根結線蟲(Mfl""an》)、爪哇根結線蟲(M>va"/ca)和北方根結線蟲(MAa;7/fl)等四大優(yōu)勢種群。根結線蟲屬寄生范圍廣范，可侵染的植物超過3000種，分屬114科，包括單子葉植物、雙子葉植物，草本植物和木本植物等，蔬菜、糧食、經(jīng)濟和果樹作物、觀賞植物以及雜草等都可侵染，被喻為植物的隱蔽敵害。根結線蟲的生活周期分為卵、幼蟲和成蟲三個不同的階段。受精卵經(jīng)過有絲分裂發(fā)育成一齡幼蟲(Jl)，蛻皮后形成二齡幼蟲(J2)，然后脫離卵殼進入土壤，開始侵染植物幼根；侵入根內(nèi)的二齡幼蟲第二次蛻皮后形成三齡幼蟲(J3)，接著雌雄性生殖腺膨大伸長，植物根部出現(xiàn)明顯"根結"；第三次蛻皮后四齡線蟲開始性成熟，成熟雌蟲蟲體白色呈鴨梨形，雌雄線蟲交尾后，雄蟲在土壤中死亡；根內(nèi)雌蟲將卵粒產(chǎn)于蟲體末端的膠質(zhì)卵囊中，部分或全部暴露于根表面，在合適條件下不斷繁殖生長。整個世代發(fā)育過程中，除卵粒、J1和J2可存在于土壤中外，J3、四齡線蟲與雌、雄成蟲必須在寄主植物根內(nèi)才能完成其生長與分化。自然情況下，土壤與植物根系是根結線蟲完成其生活周期的兩個必要條件。侵入植物根系的根結線蟲取食于根內(nèi)，阻止根部軟組織原漿細胞有絲分裂時染色體的解開而誘導形成合胞體，破壞輸導組織，改變寄主生理；在對寄主植物造成機械損傷的同時，分泌有毒物質(zhì)，誘發(fā)其它病原物的入侵，致使植株生長遲緩，發(fā)育不良，嚴重時整株枯萎死亡，已被列為危害大、難防治的重要植物病原物。對根結線蟲進行基礎理論和危害防治的研究，長期以來一直受到世界各國的重視。在許多研究場合,如線蟲種類鑒定、寄主的抗線蟲性鑒定、抗線蟲指標的研究、線蟲的為害損失測定以及線蟲拮抗生防菌的篩選等工作中，獲得大量幼蟲甚至生育階段一致的線蟲，是一個不可缺少的實驗環(huán)節(jié)，根結線蟲的繁殖和保存是一項需要周期性進行的重要任務。由于根結線蟲是一種專性寄生物,在自然條件下生長與繁殖離不開植物根系和土壤，其種群培養(yǎng)和保存一直是困擾研究工作深入進行的主要問題之一，常規(guī)繁殖與培養(yǎng)一直依賴于活體寄主植物，需要溫室、土壤及易感植物品種，涉及實驗材料多，操作繁瑣，周期長,不易管理。目前，根結線蟲的種類研究已十分深入，生物防治研究也在世界各國廣泛開展，而關于根結線蟲培養(yǎng)繁殖的研究、應用報道卻相對較少，國外的研究報道主要有以下幾種(1)寄主根系外植體培養(yǎng)法，Huettel，R.N.&1^1)015，1.^(1985)提出，選擇敏感寄主根系片斷，無菌條件下植入特定培養(yǎng)基，適時感染根結線蟲卵粒或二齡幼蟲，25T:恒溫培養(yǎng)，40天后能從根表和根際培養(yǎng)基內(nèi)收獲第二代蟲卵和二齡幼蟲，避免了寄主植物及寄生線蟲在溫室土壤內(nèi)的培育繁殖過程；Ko，M.P.，Schmitt，D.P&Sipes，B.S.(1996)報道，將已侵染根結線蟲二齡幼蟲的番茄根外植體和苜蓿愈傷組織植于PluronicF127(—種聚醇凝膠培養(yǎng)基)上培養(yǎng)，既可正常繁殖根結線蟲，還能保持培養(yǎng)過程的無菌狀態(tài)。(2)寄主轉化根系外植體培養(yǎng)法，S.Verdejo(1988)研究報道，經(jīng)毛根農(nóng)桿菌"gw6acfen'wwA/zoge"e:y)轉化后的植株具有側根增多、易于次培養(yǎng)等特點，將毛根農(nóng)桿菌轉入番茄(Z^ycopewico"eyc"/e""m)、馬鈴薯(5WGm^^6"ay"m))等植株根系于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取轉化根斷接入特定培養(yǎng)基，2_10天內(nèi)分別感染Me/ozWogF7e/mw7/ca(爪哇根結線蟲)卵粒與二齡幼蟲，25。C培養(yǎng)42天后成功獲得了大量蟲卵和二齡幼蟲；用同一方法繁殖A/e/o/ctogy"e/"cogm'to(南方根結線蟲)和Me/oWogyweccW/wood(奇得伍根結線蟲)也得到一致結果，并提出，與常規(guī)寄主根系外植體培養(yǎng)法相比，轉化根系外植體更有利于根結線蟲的侵染繁殖，更適合進行根結線蟲與土壤微生物相互關系的研究。(3)以擬南芥"m6Wo/w!'sAa/!'朋a)作寄主培養(yǎng)，Sijmons，PeterC.(1991)在無菌條件下用組培法對74種不同生態(tài)型的擬南芥植株進行了南方和花生根結線蟲的侵染試驗，獲得了100%的感染率，提出擬南芥可作為一種新的植物寄生線蟲培養(yǎng)繁殖的模式寄主植物。(4)水培法，Lambert，K.N.(1992)報道了一種能在2個月內(nèi)連續(xù)獲得根結線蟲二齡幼蟲的營養(yǎng)液培植方法，無菌條件下先在溫室內(nèi)用馬鈴薯塊莖盆栽培育幼苗，5-7周后重復接種爪哇根結線蟲二齡幼蟲3-5次，最后一次接種5-6天后，將染蟲植株去土洗凈轉入盛有營養(yǎng)液的水培容器中，容器主體結構為一3升容量的布氏漏斗，漏斗頂部加有帶孔蓋，孔口用于加樣、移放并固定植株，底部接上T形管，一端用于空氣注入，一端用作流放液體；每3-4天補加一次因蒸騰作用而消耗的營養(yǎng)液，2周后開始從底端管口釋放液體，孔篩過濾收獲二齡幼蟲，每24小時可收獲一次，直至移植后的第9周。(5)番茄離體苗培養(yǎng)法，P.Hutangura(1998)研究報道，用番茄莖尖在穆拉希格(Murashige)和斯庫克(Skoog)培養(yǎng)基上培養(yǎng)離體苗，一周后接種無菌根結線蟲卵，5-7周后收獲第二代卵塊，卵粒在無菌水中溫育孵化出的二齡幼蟲可用于繼續(xù)感染番茄離體苗或別的實驗所需；經(jīng)優(yōu)化實驗后報道，在培養(yǎng)基內(nèi)添加0.5%的蔗糖、0.6%的植物膠，在pH6.4的條件下恒溫培養(yǎng)，對南方、花生、爪哇和北方4種主要根結線蟲，都能在番茄離體苗內(nèi)形成最高的根結指數(shù)，從而獲得數(shù)量最多的雌蟲和卵粒。在國內(nèi)，黃翔研究報道，南方根結線蟲在"龍溪8號"香蕉離體苗根內(nèi)發(fā)育遲緩，不能正常完成生活周期，但在盆栽香蕉苗內(nèi)能良好繁殖(黃翔，1995);王汝賢研究報道了一種在Lambert，K.N.設計基礎上有所改進的根結線蟲水培繁殖方法(王汝賢，1999);吳慶麗研究報道了用馬鈴薯作寄主盆栽培養(yǎng)根結線蟲的效果(吳慶麗，2006)，并對易感馬鈴薯品種以及光溫條件的影響作了深入研究，提出，與常用番茄培養(yǎng)法相比，用馬鈴薯塊莖繁殖時，能形成具有強大分枝的須根系，有利于根結線蟲的培養(yǎng)，而且由于植株所占空間相對較小，可以在培養(yǎng)箱中控制培養(yǎng)條件,從而達到保存或者大量繁殖根結線蟲的目的。根結線蟲是一大類廣泛存在的植物病原線蟲，自然條件下其生活周期都要經(jīng)歷從土壤至寄主根內(nèi)這兩個統(tǒng)一而又不同的微環(huán)境，從而完成一次侵染過程，條件適宜時一個侵染周期需要30天左右的時間，這便構成了人工繁殖根結線蟲的不便因素。迄今為止，國內(nèi)外所報道的相關研究中，培養(yǎng)方法逐漸趨向于離開溫室園地、離開土壤而在實驗室內(nèi)用營養(yǎng)液或者培養(yǎng)基的方法進行，但無論如何，根結線蟲的取食寄生對象——土壤培育的寄主植株、組織培養(yǎng)的離體苗或一個根段外植體，其中之一是不可或缺的，而無菌培養(yǎng)這類植株或外植體，需要投入大量的時間和精力。如果只是給根結線蟲提供一種食物源而不是寄主植物使其完成生長繁殖周期，將大大簡化培養(yǎng)實驗程序并縮短世代完成時間，進而為根結線蟲的繁殖保存、為線蟲相關理論及防治研究帶來極大的便利。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所鮑時翔課題組在根結線蟲生物防治研究工作中發(fā)現(xiàn)，在海南所處的熱帶、亞熱帶氣候條件下，土壤環(huán)境中的根結線蟲二齡幼蟲能存活很長時間，而且從病根土壤分離到的部分二齡幼蟲其形體遠比剛從卵內(nèi)破殼出來時要大，于是推測，除寄主植物根系外，根結線蟲，至少是二齡幼蟲，應該還存在另外一類食物源。通過反復試驗和篩選，最終找到了這種適于根結線蟲生長繁殖的另類食物，并對以該種食物源培養(yǎng)根結線蟲的相關條件進行了對比實驗，獲得了系統(tǒng)優(yōu)化方案，經(jīng)用分離自香蕉和蔬菜病根的三種主要根結線蟲卵粒及孵化出的二齡幼蟲接種培養(yǎng)試驗，證明為一種不依賴寄主植物的根結線蟲實驗室人工培養(yǎng)與繁殖保存的有效方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對植物根結線蟲尚不能人工培養(yǎng)，依賴寄主植物繁殖周期長，需要園地、溫室、盆栽或水培裝置等配套設施，操作程序復雜，實驗工作量大等特點，提出脫5離寄主植物培養(yǎng)根結線蟲，縮短繁殖周期，簡化培養(yǎng)過程，并在短期內(nèi)持續(xù)獲得大量蟲體，實現(xiàn)培養(yǎng)繁殖及種群保存過程實驗室內(nèi)的一體化。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于將根結線蟲卵?；蚨g幼蟲以較少數(shù)量無菌條件下接入特定的二重培養(yǎng)基而不是寄主根系，恒溫密閉狀態(tài)下倒置培養(yǎng)，根結線蟲在培養(yǎng)基內(nèi)不停取食并快速生長和繁殖，繁殖高峰期時可以分離獲得大量實驗所需的線形蟲體；另將培養(yǎng)平板適時轉入冷涼條件下存放，半年后分離板內(nèi)的二齡幼蟲，接入新的二重培養(yǎng)基進行更新?lián)Q皿傳代培養(yǎng)，使培養(yǎng)過程脫離寄主植物，實現(xiàn)實驗室內(nèi)根結線蟲繁殖與保存的人工一體化運行。所述的根結線蟲卵粒或二齡幼蟲是這樣獲得的將受根結線蟲侵害并有明顯根結的作物病根自來水沖凈泥土，蒸餾水浸洗三次，雙目解剖顯微鏡下分別挑取單一純種卵囊，放入1.5ml滅菌Eppendorf管中，加0.5ml1.0%NaOCl消毒3分鐘，蒸餾水洗三次，最后加入0.5-lml無菌水搖勻，解剖鏡下計數(shù)器計數(shù)，稀釋或濃縮成1000粒/ml的根結線蟲卵粒懸浮液；將按所述方法挑出并消毒清洗后的純種卵囊放在雙層濾紙上，置于淺盆中，2『C恒溫箱中遮光孵化5天，每天加入適量蒸餾水以保持水面恒定，3-5天后收集已大量孵化的二齡幼蟲水溶液，雙目解剖鏡下計數(shù)器計數(shù)，配制成1000條J2/ml的濃度，獲得待接種的二齡幼蟲液。所述用于培養(yǎng)根結線蟲的二重培養(yǎng)基是這樣獲得的首先配制平板固體培養(yǎng)基，稱取馬鈴薯200克，去皮，切成碎塊煮沸半小時，兩層紗布過濾，加葡萄糖20克，瓊脂15-16克，溶化后補足水至1000毫升，pH自然，12rc高壓滅菌20分鐘，趁熱倒入滅菌培養(yǎng)皿，每個9cm培養(yǎng)皿15-20ml的倒入量，無菌風吹干；在制得的培養(yǎng)平板內(nèi)，每皿接入0.1ml的鐮刀菌i^Kw/wwo;c》邵orwwf.sp,cw6mye孢子懸浮液，涂布平板，28。C恒溫倒置培養(yǎng)，3-5天后白色菌絲長滿整個平板，即得培養(yǎng)根結線蟲的二重培養(yǎng)基。在制備根結線蟲二重培養(yǎng)基的過程中，所述的鐮刀菌i^rar/w7wo;c";on^nf.sp.cw6erae孢子懸浮液是這樣獲得的將鐮刀菌F^an'wwo;q^poA""附f.sp.cw6mye的保藏菌種接入試管斜面培養(yǎng)基中進行斜面活化后，再置入裝有液體種子培養(yǎng)基的容量為100ml的三角瓶，裝液量為20-30ml/100ml;搖床轉速180r/min，培養(yǎng)期的環(huán)境溫度為28士2'C;將三角瓶置于搖床培養(yǎng)2-3天后，取0.1ml接入平板固體培養(yǎng)基，均勻涂布，3-5天菌絲長滿平板后，用無菌水沖洗，轉入100ml三角瓶中，4'C保存?zhèn)溆?。在獲得鐮刀菌oxw/wn/wf.sp.cw6erae孢子懸浮液的過程中，所述的試管斜面培養(yǎng)基為葡萄糖10克，蛋白月東5克，KH2P04l克，MgSO4'7H2O0.5克，瓊脂15-20克，pH自然，水IOOO毫升；所述的液體種子培養(yǎng)基為葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH2P04l克，MgS047H200.5克，pH自然，水1000毫升。所述根結線蟲卵粒或二齡幼蟲較少的接種量，是指取濃度為1000粒/ml的卵粒懸浮液或1000條J2/ml的幼蟲液O.lml，每個9cm的二重培養(yǎng)基平板100個卵粒或100條J2的接入量，即能滿足繁殖所需；懸浮液整體接入二重培養(yǎng)板中央，無需搖動或涂布，靜置2-3個小時后再倒放；所述的恒溫密閉狀態(tài)，是將接種好的培養(yǎng)平板用風口膜密封后，放入28'C培養(yǎng)箱內(nèi)倒放靜置培養(yǎng)。接入100個卵粒，1周后卵粒開始孵化出二齡幼蟲，幼蟲取食培養(yǎng)板內(nèi)的菌絲體并不斷生長，從第2周開始，白色菌絲體從中央接種處至周圍方向逐漸減少，第3周后菌絲體被取食完畢，只剩下粘濕的固體培養(yǎng)基，每平方厘米的培養(yǎng)基內(nèi)已有約200條的線形活蟲體，蟲體繼續(xù)取食培養(yǎng)基內(nèi)的鐮刀菌孢子，至第6周時繁殖數(shù)量到達頂峰，培養(yǎng)基內(nèi)蟲體數(shù)目平均可達600-800條/cm2;接入100條已孵化好的二齡幼蟲，幼蟲立即開始取食菌絲，在培養(yǎng)板內(nèi)的整體生長繁殖過程比接種卵粒的提前l(fā)-2周，即在第4周時繁殖數(shù)量可抵達高峰，此時，每個9cm培養(yǎng)皿內(nèi)可平均收獲1.5X104條線蟲。所述的轉入冷涼條件下存放，是將已進入繁殖高峰期的根結線蟲培養(yǎng)平板，倒置于12士2'C的恒溫箱內(nèi)，4-6個月后培養(yǎng)基內(nèi)仍有可供繼代繁殖的活蟲體，用貝曼氏漏斗法分離培養(yǎng)基中的線蟲，或者取適量培養(yǎng)基，消毒小匙搗碎后放入無菌三角瓶中，加入10倍體積的蒸餾6水，160r/min搖動15-20分鐘，300目篩網(wǎng)過濾，獲得二齡線蟲液，又可繼續(xù)接種繁殖。本發(fā)明的優(yōu)點在于由于采用二重培養(yǎng)基，瓊脂含量適中的固體培養(yǎng)基一方面培養(yǎng)出豐富的鐮刀菌菌絲體與鐮刀菌孢子，為根結線蟲提供非寄主植物的食物來源，另一方面又為根結線蟲構建了一個適于生長繁殖的微域環(huán)境，使根結線蟲從受精卵有絲分裂孵化出一齡幼蟲直至成熟雌蟲產(chǎn)出膠質(zhì)卵塊的整個生活周期都處于同一固定環(huán)境中，既省去了寄主植株培育的繁雜程序，又成倍縮短了線蟲一個世代完成的時間，短期內(nèi)便能獲得實驗所需的大量蟲體;蟲種保存只需將培養(yǎng)平板轉入12'C的冷涼環(huán)境中，4-6個月后再換板傳培；該培養(yǎng)方法將根結線蟲的全部繁殖保存過程簡化在單純的實驗室內(nèi)，同時又能與特定蟲種對作物的侵害研究有機的結合起來，滅菌土盆栽苗回接感染試驗表明，無論換代培養(yǎng)多少次，從培養(yǎng)基內(nèi)分離出的二齡幼蟲對敏感寄主作物均保持侵染能力，都能在寄主根系形成明顯的"根結"；根結線蟲實驗室人工培養(yǎng)所采用的二重培養(yǎng)基組分均屬常規(guī)材料，成本低廉，制作方法簡單，可操作性強；本發(fā)明為根結線蟲的種類保存，特別為根結線蟲相關理論及防治研究中所需的大量蟲體，提供了一種簡便、快捷的繁殖方法，同時也為根結線蟲雌蟲發(fā)育行為因環(huán)境改變而變化的特別現(xiàn)象，提出了一個尚待深入研究的嶄新課題。具體實施例方式實施例1:培植鐮刀菌F^an'wwox:";on/wf.sp.cw6erae的培養(yǎng)基的配制試管斜面培養(yǎng)基的配制稱取葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH2P041克，MgS04*7H200.5克，溶解在1000毫升水中，加入瓊脂15-18克，加熱煮沸至瓊脂溶化，補足體積至1000毫升，適當冷卻后分裝到試管中，裝量為試管高度的1/5-1/6，用試管塞塞好試管口，12rc高壓滅菌25min，趁熱取出后擺斜面至冷卻備用，斜面高度不超過試管高度的1/3。液體種子培養(yǎng)基的配制稱取葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH2P041克，MgS04，7H200.5克，溶解在1000毫升水中，然后分裝，裝液量為20-30ml/100ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121'C高壓滅菌25min，冷卻后備用。固體培養(yǎng)基的配制稱取馬鈴薯200克，去皮，切碎煮沸半小時，用兩層紗布過濾，加葡萄糖20克，瓊脂粉15-16克(為了適于后來線蟲的活動與繁殖，瓊脂含量以1.5%-1.6%為宜)，溶化后補足水至1000毫升，12rC高壓滅菌20分鐘備用。實施例2:鐮刀菌Fwsw/wwox少5pora附f.sp.a/6erae孢子液的第!j備本發(fā)明中所述的鐮刀菌F^an'wwowon/wf.sp.cw6erae是由本實驗室采用斜面冷藏法保藏的菌種。a)鐮刀菌尸wran'wwoworw附f.sp.cw6e"je菌禾中的活化采用斜面保藏菌種的活化方法從斜面保藏的菌種中挑取一塊直徑約8mm的菌種接種到試管斜面培養(yǎng)基中活化，在28士2'C的環(huán)境中培養(yǎng)3-5天后備用。b)種子液的培養(yǎng)從試管活化好的鐮刀菌中挑取三個菌塊分別接種在三個容積為100ml的裝有25ml液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床，搖床的轉速180r/min，在28士2。C的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天后備用。c)孢子液的制備取0.1ml培養(yǎng)好的鐮刀菌種子液，分別接入三個直徑為9cm的固體培養(yǎng)平板中，均勻涂布，在28士2'C的條件下倒置培養(yǎng)3-5天，選擇菌絲生長豐滿且純凈的平板，每板用30ml無菌水，分三次加入平板菌絲上，涂布棒輕輕刮動，用移液槍將孢子液移入100ml滅菌三角瓶中，密封，4'C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。以上所有接種及孢子液的制備過程必須在無菌條件下，即在經(jīng)紫外線滅菌半小時的超凈工作臺的酒精燈旁無菌操作。實施例3:二重培養(yǎng)基的制備將配制好的固體培養(yǎng)基趁熱或加熱溶化后，于滅好菌的超凈工作臺內(nèi)倒入9cm無菌培養(yǎng)皿中，倒入量以培養(yǎng)基盛滿皿底的1/4厚度為宜，太少會限制線蟲的生存活動空間，過多則不利于線蟲的分離。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，每板接入O.l-0.2ml的鐮刀菌i^m7'柳ox";w謂f.sp.cW^"w孢子液，涂布均勻，封口膜密封，28。C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3-5天，白色菌絲長滿整個平板后即為二重培養(yǎng)基。實施例4:根結線蟲卵粒懸浮液的制備從海南省?？谑行阌^(qū)永莊村蔬菜地采集受根結線蟲侵害并有明顯根結的番茄病根，裝入塑料樣品袋，帶回實驗室自來水沖凈泥土，蒸餾水浸洗三次，雙目解剖顯微鏡下各挑取三塊較大的單一純種卵囊，分別放入1.5ml滅菌Eppendorf管中，加0.5ml1.0%Na0Cl消毒3分鐘，2000r/min離心3分鐘，吸棄上半層液體，向管內(nèi)下部液體加入0.5ml蒸餾水混勻，同法離心洗三次，最后加入0.5ml無菌水搖勻，解剖鏡下計數(shù)器計數(shù)，配制成濃度為1000粒/毫升的根結線蟲卵粒懸浮液，備用。實施例5:根結線蟲二齡幼蟲懸浮液的制備從海南省?？谑懈擎?zhèn)那央村香蕉園采集受根結線蟲侵害并有明顯根結的香蕉病根，采用與實施例4所述的相同方法挑取并消毒大塊純種卵囊，轉至雙層濾紙上，擱置于淺盆中，28'C恒溫箱中遮光孵化5天，每天加入適量蒸餾水以保持水面恒定，3-5天內(nèi)收集已大量孵化的二齡幼蟲水溶液，雙目解剖鏡下計數(shù)器計數(shù)，2000r/min離心3分鐘，吸棄上層液體，濃縮至約1000條J2/ml的濃度，獲得待接種的二齡幼蟲液。實施例6:用卵粒懸浮液接種二重培養(yǎng)基培養(yǎng)繁殖根結線蟲在無菌超凈工作臺內(nèi)，取0.1ml制備好的根結線蟲卵粒懸浮液(IOO個卵粒)，接入二重培養(yǎng)基平板正中央，蓋好靜置1小時，液滴在原處浸入菌絲間隙后，封口膜封閉平板，放入28。C十百溫箱中倒置培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，一周內(nèi)平板菌絲保持不變，十天后中央接種處的菌絲開始消退，并逐漸向四周延伸，兩周時菌絲消退圈的直徑達4厘米左右，至第三周時菌絲完全消失，剩下暗黃潮濕的培養(yǎng)基。定期從平板內(nèi)菌絲消失區(qū)域取出10mm3(5X2X5mm)的培養(yǎng)基放入24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入lml蒸餾水攪勻，倒置顯微鏡下統(tǒng)計所含線蟲蟲體的數(shù)目，并換算成每平方厘米培養(yǎng)基下所含的蟲口數(shù)(表l)。結果表明，根結線蟲卵粒在二重培養(yǎng)基上于28'C條件下，一周后孵化出二齡幼蟲并取食菌絲開始生長，三周后蟲體以培養(yǎng)基內(nèi)的鐮刀菌孢子為食，數(shù)量開始增加并持續(xù)繁殖，至第六周時培養(yǎng)基內(nèi)蟲體數(shù)量達到頂峰(每平方厘米培養(yǎng)基下含600條各齡蟲體)，以后數(shù)量略有減少，直至第九周后，蟲口密度才不斷下降。表l接種100個卵粒后不同時期平板內(nèi)線蟲密度統(tǒng)計數(shù)量(單位線蟲條數(shù)/0112培養(yǎng)基)培養(yǎng)時間接種區(qū)菌絲消失邊緣區(qū)1培養(yǎng)時間平板內(nèi)任意區(qū)域一周時0六周時620二周時5030七周時540三周時210120八周時460四周時320210九周時420五周時5405301十周時310實施例7:用孵化的二齡幼蟲接種二重培養(yǎng)基培養(yǎng)繁殖根結線蟲在無菌超凈工作臺內(nèi)，取0.1ml制備好的根結線蟲二齡幼蟲懸浮液(100條J2)，接入二重培養(yǎng)基平板圓心處，合上蓋靜置1小時，液滴在原處浸潤下沉后，封口膜封閉培養(yǎng)皿，放入28'C恒溫箱中倒置培養(yǎng)。-觀察表明，一周后中心接種處的菌絲即開始消退，消退圈不斷向四周擴展，兩周時平板菌絲消失完畢，剩下潮濕裸露的培養(yǎng)基。采用與實施例6所述的方法統(tǒng)計平板內(nèi)不同時期線蟲蟲體的繁殖數(shù)量，結果見表2。實驗表明，28'C條件下，根結線蟲二齡幼蟲在二重培養(yǎng)基內(nèi)能立即取食菌絲并開始生長分化，兩周后蟲體繼續(xù)以培養(yǎng)基內(nèi)的鐮刀菌孢子為食，并繁殖出下一代幼蟲，數(shù)量不斷增加，至第四周時培養(yǎng)基內(nèi)蟲體繁殖數(shù)量達到高峰(每平方厘米培養(yǎng)基下含800條混合蟲體)，第五周后數(shù)量開始緩慢減少，至第九周時，蟲口密度為高峰值時的37%。表2接種100條J2后不同時期平板內(nèi)線蟲密度統(tǒng)計數(shù)量(單位線蟲條數(shù)/cn^培養(yǎng)基)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例8:換板傳代培養(yǎng)繁殖分別用實施例6中所述的培養(yǎng)至第6周和實施例7中所述的培養(yǎng)至第9周的培養(yǎng)平板，超凈工作臺內(nèi)各取10ml培養(yǎng)基于50ml三角瓶內(nèi)，每瓶加入10ml蒸餾水，封口，搖床里160r/min振動20分鐘，用100目和300目孔篩重疊套架在小燒杯上(100目在上，300目在下)，攪拌過濾，燒杯里的濾液即為二齡線蟲液體；取濾液0.2ml鏡檢計數(shù)，配制成1000條J2/ml的線蟲液，各取0.1ml分別接種在新制成的二重培養(yǎng)基平板中心處，按與實施例7所述的相同方法放入28"恒溫箱中倒置培養(yǎng)。觀察記錄表明，盡管分離蟲種時，第一次平板培養(yǎng)時間有所不同，但二次接種后，培養(yǎng)板內(nèi)菌絲及孢子被食取的快慢、線蟲增殖的速度皆與實施例7中所統(tǒng)計的結果相一致。進一步的換板培養(yǎng)試驗證明，根結線蟲的換板傳代培養(yǎng)繁殖可以不受限制的進行下去。實施例9:培養(yǎng)板的冷涼保存選擇實施例8中制得的兩種培養(yǎng)平板，在培養(yǎng)的第四周即板內(nèi)線蟲繁殖密度到達高峰值時，轉入12士2。C的恒溫箱內(nèi)倒置存放，4個月后隨機打取板內(nèi)10mm3的培養(yǎng)基，按實施例6所述方法鏡檢計數(shù)，發(fā)現(xiàn)板內(nèi)的平均活蟲密度分別為轉存時的46%和50%，采用相同方法，在冷藏第6個月后再一次鏡檢計數(shù)，板內(nèi)平均活蟲密度分別為轉存時的25%和30%;按實施例8所述方法分離培養(yǎng)基內(nèi)的二齡幼蟲活蟲體，轉入新制成的二重培養(yǎng)基中換板培養(yǎng)，獲得了與實施例8所述的相同結果，證明在12士2'C的恒溫條件下，換板培養(yǎng)時間可以長達6個月，如果僅僅為了根結線蟲的種群保存，一年內(nèi)只需換板培養(yǎng)兩次。實施例10:培養(yǎng)板內(nèi)繁出線蟲的分子鑒定無論采用挑自病根內(nèi)的根結線蟲卵囊，還是卵粒孵化出的二齡幼蟲，接種二重培養(yǎng)基后，二三齡幼蟲、雄成蟲、卵粒的形態(tài)，以及卵粒的分裂孵化過程，與在寄主根內(nèi)和土壤環(huán)境中的情形完全相同，所不同的是，植物根內(nèi)發(fā)育的雌成蟲為靜止不動的鴨梨形，而培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)育的雌成蟲是能游動的寬帶蠕蟲型，為了檢測這種變態(tài)發(fā)育了的雌蟲是否屬于根結線蟲，選擇了mtDNA-PCR(線粒體DNA限制性片段擴增)法對所培養(yǎng)的線蟲進行種類鑒定。采用Powers等(1993)設計的引物tfC2F3和#1108擴增提取自寬帶雌蟲mtDNA中COII基因禾口LrRNA基因之間的保守區(qū)段，分別擴出了l.lkb和1.7kb的特異條帶，參閱海南省果樹與蔬菜根結線蟲分子鑒定的相關文獻，證實采自永莊村番茄根結蟲卵培養(yǎng)出的線蟲為南方根結線蟲，采自那央村香蕉根結蟲卵培養(yǎng)出的線蟲是花生根結線蟲，表明培養(yǎng)板內(nèi)的線蟲屬于根結線蟲。實施例lh培養(yǎng)線蟲對寄主植物的回接侵染采集砂壤土，12rC濕熱滅菌120分鐘，室內(nèi)露置兩天，多次翻動；取部分滅菌土，溫室內(nèi)苗床培育番茄幼苗(番茄品種亞蔬12，種子由海南省亞蔬科技有限公司提供)，兩周后將具有三片以上真葉的幼苗移栽至盛有滅菌土的花缽中，另購香蕉組培苗(品種名巴西蕉)，同時移栽于花缽無菌土中，置于大棚溫室內(nèi)，每天適量澆水；移栽30天后選擇生長健壯的植株，在根部接種已分別換板培養(yǎng)6次和9次的南方根結線蟲與花生根結線蟲液，接種量1000條各齡線形蟲體/株，每種線蟲各接種3株番茄與3株香蕉，另設3株番茄與3株香蕉清水處理作對照，共計18個盆栽處理，每天少量澆水。線蟲接種40天后，輕輕從花缽內(nèi)連土取出各處理植株，清水洗凈根部泥土，統(tǒng)計根結指數(shù)(結果見表3和表4)。根結指數(shù)采用五級分類法，0級根部無根結，一級微量根結(1%-10%)，二級少量根結(11%-30%)，三級中量根結(31%-50%)，四級根結嚴重(51%-70%)，五級根結很嚴重(71%-100%)。統(tǒng)計結果表明，無論換板培養(yǎng)多少次，所培養(yǎng)的根結線蟲均保持著對寄主植物的侵染能力，都能在寄主根內(nèi)重新形成鴨梨形雌蟲。解剖顯微鏡下從形成的根結內(nèi)挑取雌蟲，制作會陰花紋切片，花紋形狀也分別符合南方根結線蟲和花生根結線蟲的基本特征。表3盆栽番茄苗接種培養(yǎng)線蟲后根結指數(shù)調(diào)查(單位級)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>此外，從?？谑懈擎?zhèn)7紅星村采集受根結線蟲危害的茄子病根，按實施例4所述方法清洗消毒后，在同一植株根內(nèi)挑出10頭雌蟲直接放入新制成的二重培養(yǎng)基中心，28'C倒置培養(yǎng)，兩周后雌蟲解裂，體內(nèi)釋出的卵粒開始孵化，至第三周時平板菌絲開始消失，五周后培養(yǎng)基內(nèi)充斥著高密度的線形蟲體；用采自海南省定安縣雷鳴鎮(zhèn)田芳嶺村受侵害的胡椒病根，同法清洗消毒后，將一小塊卵囊直接挑入二重培養(yǎng)基平板中心，28'C倒置培養(yǎng)，也獲得了與實施例4所述的相同的培養(yǎng)繁殖結果，說明用本發(fā)明所涉及的技術方案培養(yǎng)繁殖根結線蟲是可行的，根結線蟲能夠進行人工培養(yǎng)并在實驗室內(nèi)保存。權利要求1、一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于將根結線蟲卵?；蚨g幼蟲以較少數(shù)量無菌條件下接入特定的二重培養(yǎng)基而不是寄主根系，恒溫密閉狀態(tài)下倒置培養(yǎng)，根結線蟲在培養(yǎng)基內(nèi)不停取食并快速生長和繁殖，繁殖高峰期時可以分離獲得大量實驗所需的線形蟲體；另將培養(yǎng)平板適時轉入冷涼條件下存放，半年后分離板內(nèi)的二齡幼蟲，接入新的二重培養(yǎng)基進行更新?lián)Q皿傳代培養(yǎng)，使培養(yǎng)過程脫離寄主植物，實現(xiàn)實驗室內(nèi)根結線蟲繁殖與保存的人工一體化運行。2、根據(jù)權利要求1所述的一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于-所述根結線蟲卵?；蚨g幼蟲是這樣獲得的將受根結線蟲侵害并有明顯根結的作物病根自來水沖凈泥土，蒸餾水浸洗三次，雙目解剖顯微鏡下分別挑取單一純種卵囊，放入1.5ml滅菌Eppendorf管中，加0.5ml1.0%NaOCI消毒3分鐘，蒸餾水洗三次，最后加入0.5-lml無菌水搖勻，解剖鏡下計數(shù)器計數(shù)，稀釋或濃縮成1000粒/ml的根結線蟲卵粒懸浮液；將按所述方法挑出并消毒清洗后的純種卵囊放在雙層濾紙上，置于淺盆中，28'C恒溫箱中遮光孵化5天，每天加入適量蒸餾水以保持水面恒定(淹過淺盆篩孔正面)，3-5天后收集已大量孵化的二齡幼蟲水溶液，雙目解剖鏡下計數(shù)器計數(shù)，配制成1000條J2/ml的濃度，獲得待接種的二齡幼蟲液。3、根據(jù)權利要求1所述的一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于所述用于培養(yǎng)根結線蟲的二重培養(yǎng)基是這樣獲得的首先配制平板固體培養(yǎng)基，稱取馬鈴薯200克，去皮，切成碎塊煮沸半小時，兩層紗布過濾，加葡萄糖20克，瓊脂15-16克，溶化后補足水至IOOO毫升，pH自然，12rC高壓滅菌20分鐘，趁熱倒入滅菌培養(yǎng)皿，每個9cm培養(yǎng)皿15-20ml的倒入量，無菌風吹干；在制得的培養(yǎng)平板內(nèi)，每皿接入O.lml的鐮刀菌F^an'wmoworwwf.sp.cw6erae孢子懸浮液，涂布平板，28。C恒溫倒置培養(yǎng)，3-5天后白色菌絲長滿整個平板，獲得培養(yǎng)根結線蟲的二重培養(yǎng)基。4、根據(jù)權利要求3所述的一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于所述的在制備根結線蟲二重培養(yǎng)基的過程中，所用鐮刀菌F^an'wmm^po/"MWf.sp.c^e"se孢子懸浮液是這樣獲得的將鐮刀菌F^w/wwm^pon/wf.sp.c"6erae的保藏菌種接入試管斜面培養(yǎng)基中進行斜面活化后，再置入裝有液體種子培養(yǎng)基的容量為100ml的三角瓶，裝液量為20-30ml/100ml;搖床轉速180r/min，培養(yǎng)期的環(huán)境溫度為28士2'C;將三角瓶置于搖床培養(yǎng)2-3天后，取0.1ml接入平板固體培養(yǎng)基，均勻涂布，3-5天菌絲長滿平板后，用無菌水沖洗，轉入100ml三角瓶中，4'C保存?zhèn)溆谩?、根據(jù)權利要求4所述的一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于在制備鐮刀菌Fw;^n'wwo;g^oramf.sp.cw6e似e孢子懸浮液的過程中，所述的試管斜面培養(yǎng)基為葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH2P04l克，MgS(V7H2O0.5克，瓊脂15-20克，pH自然，水1000毫升;所述的液體種子培養(yǎng)基為葡萄糖10克，蛋白胨5克，KH2P041克，MgSCV7H200.5克，pH自然，水1000毫升。6、根據(jù)權利要求1所述的一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于所述根結線蟲卵?；蚨g幼蟲較少的接種量，是指取濃度為1000粒/ml的卵粒懸浮液或1000條J2/ml的幼蟲液0.1ml，每個9cm的二重培養(yǎng)基平板IOO個卵?；?00條J2的接入量，即能滿足繁殖所需；懸浮液整體接入二重培養(yǎng)板中央，無需搖動或涂布，靜置2-3個小時后再倒放；所述的恒溫密閉狀態(tài)，是將接種好的培養(yǎng)平板用風口膜密封后，放入28'C培養(yǎng)箱內(nèi)倒放靜置培養(yǎng)。7、根據(jù)權利要求1所述的一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于所述根結線蟲在培養(yǎng)基內(nèi)不停取食并快速生長和繁殖，繁殖高峰期時可以分離獲得大量實驗所需的線形蟲體，是指在二重培養(yǎng)基中接入100個卵粒，1周后卵粒開始孵化出二齡幼蟲，幼蟲取食培養(yǎng)板內(nèi)的菌絲體并不斷生長，從第2周開始，白色菌絲體從中央接種處至周圍方向逐漸減少，第3周后菌絲體被取食完畢，只剩下粘濕的固體培養(yǎng)基，每平方厘米的培養(yǎng)基內(nèi)已有約200條的線形活蟲體，蟲體繼續(xù)取食培養(yǎng)基內(nèi)的鐮刀菌孢子，至第6周時繁殖數(shù)量到達頂峰，培養(yǎng)基內(nèi)蟲體數(shù)目平均可達600-800條/cm2;接入100條已孵化好的二齡幼蟲，幼蟲立即開始取食菌絲，在培養(yǎng)板內(nèi)的整體生長繁殖過程比接種卵粒的提前l(fā)-2周，即在第4周時繁殖數(shù)量可抵達高峰，此時，每個9cm培養(yǎng)皿內(nèi)平均可收獲1.5xl0"條線蟲。8、根據(jù)權利要求1所述的一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)及繁殖保存的方法，其特征在于.-所述的轉入冷涼條件下存放，是將已進入繁殖高峰期的根結線蟲培養(yǎng)平板，倒置于12士2t:的恒溫箱內(nèi)，4-6個月后培養(yǎng)基內(nèi)仍有可供繼代繁殖的活蟲體，用貝曼氏漏斗法分離培養(yǎng)基中的線蟲，或者取適量培養(yǎng)基，消毒小匙搗碎后放入無菌三角瓶中，加入10倍體積的蒸餾水，160r/min搖動15-20分鐘，300目篩網(wǎng)過濾，獲得二齡線蟲液，又可繼續(xù)接種繁殖。全文摘要本發(fā)明涉及一種植物根結線蟲人工培養(yǎng)繁殖和種類保存的方法。實驗室根結線蟲的繁殖與保存一直依賴于寄主植物，本發(fā)明將根結線蟲卵?；蚨g幼蟲以較少數(shù)量接入特定的二重培養(yǎng)基而不是寄主根系，恒溫密閉狀態(tài)下倒置培養(yǎng)，根結線蟲在培養(yǎng)基內(nèi)取食、生長和繁殖，短期內(nèi)即可獲得大量線形蟲體；另將培養(yǎng)平板適時轉入冷涼條件下存放，半年內(nèi)換皿傳代培養(yǎng)一次，讓根結線蟲的繁殖與保存過程脫離寄主植物。本發(fā)明的優(yōu)點在于省去了根結線蟲寄主植株的培育程序，同時又不喪失培養(yǎng)線蟲對敏感寄主植物的侵染能力；所用材料成本低廉，實驗方法易于操作；本發(fā)明為根結線蟲的種類保存，特別為根結線蟲相關研究中所需的大量蟲體，提供了一種簡便、快捷的繁殖方法。文檔編號A01K67/00GK101473808SQ200910009790公開日2009年7月8日申請日期2009年1月22日優(yōu)先權日2009年1月22日發(fā)明者吳曉鵬,孫前光,哲方,曾慶飛,軍朱,鮑時翔,黃惠琴申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所