專利名稱：：用于選擇顯示減少的損傷誘導的表面變色的植物的篩選方法和所獲得的植物及植物部分的制作方法用于選擇顯示減少的損傷誘導的表面變色的植物的篩選方法和所獲得的植物及植物部分發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于針對其中存在的個體(所述個體與對照植物相比，顯示減少的損傷誘導的表面變色)篩選植物或植物部分的群體的發(fā)明背景由于不斷增加的需要，新鮮產(chǎn)品特別是萵苣的加工近年來獲得長足的發(fā)展。萵苣的收獲和加工包括葉子的大量切割，這誘導了強烈的損傷反應(yīng)。該損傷反應(yīng)導致加工的產(chǎn)品的快速變質(zhì)。該變質(zhì)表現(xiàn)在由于損傷表面上和周圍的酶促褐變或變粉紅引起的變色、由于蒸騰作用引起的呼吸和脫水。特別地，酶促褐變或變粉紅被認為是非常重要的，其直接或間接決定了鮮切包裝的萵苣的總體質(zhì)量。此外，作為變質(zhì)的結(jié)果，微生物在數(shù)量上可顯著增加，這可危害食品安全。加工的萵苣的高度易腐壞的性質(zhì)導致消費者感覺到強烈的變色(off-colour)、變p未(off-odour)和質(zhì)地變化，這妨礙了比所謂的便利市場的流通增長更快速的增長。為了抑制變質(zhì)過程，已發(fā)展了可用于減緩加工的萵苣的變質(zhì)的許多化學或物理的收獲后處理。其中這些方法是在改良的大氣下包裝鮮切萵苣、使用可食用的涂層、熱激處理和加入抑制酶促褐變的化學物質(zhì)。當在低溫下在減少氧氣的大氣下包裝鮮切萵苣時，可顯著地減少酶促褐變。然而這樣的改良的、低氧的環(huán)境導致無氧呼吸，這產(chǎn)生了令人感覺非常不快的產(chǎn)品的臭味和變味。可食用的涂層是用作物理隔離屏障和有效保護產(chǎn)品免受各種變質(zhì)例如脫水和褐變侵害的材料的薄層。這些涂層可以例如由樹脂、多糖或蛋白質(zhì)構(gòu)成。已進一步證明，可通過在加工后即刻在45。C下使用90秒的短暫熱激來防止鮮切萵苣的褐變。熱激很可能使蛋白質(zhì)的生物合成從參與變色的酶轉(zhuǎn)向熱激蛋白，從而減少了酶促褐變的能力。可選擇地，可通過參與變色通路的酶的熱敏感性(thermosensitivity)來解釋熱激處理對褐變的作用?？墒褂玫幕瘜W物質(zhì)可以是例如還原劑如維生素C、螯合劑如EDTA、絡(luò)合劑如環(huán)糊精和酶抑制劑如L半胱氨酸?；瘜W物質(zhì)在新鮮食品中的應(yīng)用明顯地牽涉到食品安全性問題和要求法規(guī)批準(regulatoryapproval)。可以考慮上述收獲后技術(shù)的組合，最終，使用的方法是技術(shù)功效、成本和食品安全性之間的平衡結(jié)果。不論所使用何種技術(shù)，加工的萵苣的收獲后質(zhì)量的提高來之不易，從而在本領(lǐng)域存在提供可選擇的技術(shù)來消除或減少使用物理的或化學的收獲后技術(shù)的需要的明確需要。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供篩選方法，所述方法用于選擇顯示減少的損傷誘導的變色反應(yīng)的植物，從而提供對收獲后的加工障礙例如酶促褐變或變粉紅具有抗性的植物和從其產(chǎn)生的后代。本發(fā)明的進一步目的是提供在損傷后顯示顯著減少變粉紅色或褐變的變色的植物。損傷后的變色也可見于在植物的部分例如莖、種子、果實、葉、花、塊莖、枝。因此本發(fā)明的進一步目的是提供選擇在它們的植物部分顯示減少的損傷誘導的變色反應(yīng)的植物的篩選方法。因此本發(fā)明提供了用于針對其中存在的個體(所述個體與對照植物或植物部分相比，顯示減少的損傷誘導的表面變色)篩選植物或植物部分的群體的方法，所述方法包括a)提供植物群體或來自該群體的植物的部分；b)在待篩選的植物或植物部分以及對照植物或植物部分上產(chǎn)生損傷表面；c)溫育損傷表面以允許在其內(nèi)或其上發(fā)生變色；d)在植物或植物部分內(nèi)或上觀察損傷表面變色；e)將觀察到的待篩選的植物或植物部分內(nèi)或上的損傷表面變色與在對照植物或植物部分上或內(nèi)觀察到的變色進行比較，從而鑒定顯示沒有變色的或顯示與對照植物或植物部分相比變色減少的植物或植物部分。本發(fā)明的方法可用于可經(jīng)歷變色的任何植物，但特別適合用于產(chǎn)品，特別是用于蔬菜或果實或花。該方法尤其適合于用于葉類蔬菜例如萵苣，適合用于塊莖類，如馬鈴薯或甘薯(sweetpotato)，適合用于根類植物，例如塊根芽茱(celeriac)，適合用于枝類(shoots),例如witloof或適合用于蘑菇。此外方法可用于果實，例如蘋果、香蕉、鱘梨、桃子、梨子、杏子、芒果、茄子和適合用于花類或花莖類(flowerstem)，例如大丁草莖、菊花、朝鮮薊基部(artichokebottoms)等。本發(fā)明的篩選方法意欲用于鑒定在一個或多個它們的部分或組織中具有減少的損傷誘導的表面變色的植物。因此，為了進行篩選，使用易于變色的部分或組織是非常實用的。在萵苣中，這樣的部分或組織可以是葉或其部分例如打孔部分，在香蕉中，可合適地使用去皮果實的切片，在花類植物中，莖的切片是非常實用的受試載體(testvehicle)。在特定的實施方案中，方法特別適合用于選擇菊科(Asteraceae)的植物，特別是萵苣屬(lactuca)的植物和更特別地屬于萵苣種(Lactucasativa)的植物或?qū)儆诰哲膶?cichorium)的植物，和特另'J地屬于菊苣種(Cichoriumintybus)和苦苣(Cichoriumendivia)種的植物，所述植物顯示不存在或減少的損傷誘導的表面變色。使用本發(fā)明的方法篩選的植物群體可以是任何植物群體，但優(yōu)選是具有許多不同成員的變異植物群體，以增加發(fā)現(xiàn)顯示減少的損傷誘導的變色的植物的機會。可通過使用例如化學物質(zhì)和/或輻射的誘變處理產(chǎn)生這樣的變異群體，所述的變異群體在本文中被稱為突變體植物群體?？蛇x擇的群體是種質(zhì)集合體，所述集合體是顯示天然變異的植物的集合體。此外，還可使用轉(zhuǎn)基因植物的群體。合適地使用具有損傷表面的植物部分進行本發(fā)明的方法。非常有用的受試樣品是從葉子穿孔產(chǎn)生的盤，即所謂的葉盤(leafdiscs)。可選擇地，可使用有葉脈的葉類蔬菜的中脈組織。合適地，從此類葉脈切取葉盤。合適地在水性環(huán)境中進行溫育?？捎迷跐駶櫟臑V紙上或濾紙間溫育的葉盤很好地進行本發(fā)明的方法。然后在濾紙上可以非常清楚地看到圍繞損傷的邊緣的變色反應(yīng)。在萵苣屬和菊苣屬的植物的情況下，變色是變粉紅色的反應(yīng)?？蛇x擇地，水性環(huán)境包括水或溶液。在將在下面進一步說明的特定的實施方案中，溶液包含L-3，4-二羥基苯丙氨酸。該化合物通過多酚氧化酶轉(zhuǎn)化成黑色的色素黑色素?？捎糜谠摲矫娴目蛇x擇的化合物包括但不限于綠原酸、異綠原酸、L酪氨酸和兒茶酚。本發(fā)明還涉及顯示減少的損傷誘導的表面變色的植物，該植物可通過將植物群體經(jīng)歷本發(fā)明的篩選方法，從群體選擇在篩選中沒有顯示表面變色的或在篩選中顯示與對照植物相比減少的表面變色的植物來獲得。植物合適地是葉類蔬菜植物，更特別地是屬于萵苣屬，特別地屬于萵苣種的植物，或?qū)儆诰哲膶伲貏e地屬于菊苣和苦苣種的植物。優(yōu)選，在篩選中鑒定本發(fā)明的植物，然后選擇具有減少的或不存在的損傷誘導的表面變色的植物，但隨后對其進行檢測以確定其是否具有正常的習性。更特別地，植物優(yōu)選不應(yīng)當顯示負面的多效性。根據(jù)本發(fā)明，鑒定和選擇沒有顯示或顯示顯著減少的損傷誘導的表面變色的植物。通過NCIMB保藏這些植物的種子的后代，并為所述植物種子的后代提供了表1中所列的登錄號。在實施例4和實施例6中提供了關(guān)于保藏物的種子后代的詳細內(nèi)容。保藏這些種子后代，因為它們具有無損傷誘導的變色或具有顯著減少的損傷誘導的變色的單一的特異的特征。不針對用于品種注冊(varietyregistration)的DUS標準即關(guān)于所有注冊特征的可區(qū)別性、均一性、穩(wěn)定性對它們進行檢測，且不期望它們以任何方式滿足這些標準。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本發(fā)明還涉及具有減少的或不存在的損傷誘導的表面變色的植物，和通過將本發(fā)明的植物與相同種的另一植物雜交可獲得的植物。因此可將特征"減少的或不存在損傷誘導的表面變色"賦予原先不具有該特征的其他植物。通過該雜交產(chǎn)生的植物是否確實是本發(fā)明的植物，可通過將這些植物經(jīng)歷本發(fā)明的篩選方法來檢驗。優(yōu)選，然后還針對具有正常的習性來檢測被選擇作為本發(fā)明的植物的植物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的親本植物的后代，所述后代保持在親本植物中發(fā)現(xiàn)的不存在的或減少的損傷誘導的葉變色。這樣的后代可以離開親本許多代。只要保持特征"減少的或不存在損傷誘導的表面變色"，植物就是本發(fā)明的植物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物的部分。植物部分如萵苣或苦苣(endive)的頭或葉通常是具有可經(jīng)歷變色的切面的部分。本發(fā)明的植物部分可用于組織培養(yǎng)，從而再生植物，所述再生的的損傷誘導的葉變色。P所再生的植物t是本發(fā)明的部芬。、,、'本發(fā)明還涉及本發(fā)明的植物的種子。植物可從種子長成也具有特征"減少的或不存在損傷誘導的表面變色"的植物。可在本發(fā)明的篩選方法中檢測種子和從而從其長成的植物是否已保持該特征。本發(fā)明汰.更多代的種子。本發(fā)明對于加工的蔬菜的市場具有極大的商業(yè)吸收力。如上面所解釋的，產(chǎn)品特別是新鮮果實和蔬菜的變色被認為是不希望的，因為消費者拒絕變色的產(chǎn)品。因此本發(fā)明的特征"減少的或不存在的損傷誘導的表面變色"適合在加工的蔬菜產(chǎn)品如切開的萵苣、苦苣(endive)或witloof或其組合中發(fā)現(xiàn)。當使用本發(fā)明的方法篩選時，本發(fā)明的加工的蔬菜沒有顯示或顯示有限的損傷誘導的葉變色。滿足篩選的所有加工的蔬菜，特別是加工的萵苣、苦苣(endive)和witloof是本發(fā)明的部分，因為它們經(jīng)證明具有導致減少的PAL和/或PP0依賴性代謝流的改良。發(fā)明詳述當通過切割收荻和加工萵苣時，產(chǎn)生許多葉損傷表面，所述葉損傷表面導致植物或植物部分的顯著反應(yīng)，表現(xiàn)為損傷表面上或附近的褐色或粉紅色變色。還可在遠離葉的主脈以及柄(butt)上的損傷表面的位置上觀察到變粉紅色。有時還可在即將收獲前的階段觀察到變粉紅色，這據(jù)認為是由于農(nóng)作物的非生物脅迫或過度成熟造成的。不同形式的變色受到酶活性的影響，所述酶活性由于損傷而獲得強烈的增強且產(chǎn)生了幾種形式的多酚和從其衍生的反應(yīng)產(chǎn)物。參與褐變反應(yīng)的重要的酶活性是PPO。與酶促褐變相關(guān)的PP0活性不限定于萵苣，已描述了該PPO活性在許多其他植物種如蘋果、香蕉和馬鈴薯中與收獲后變質(zhì)有關(guān)。事實上，PP0被公認為與許多加工的新鮮果實和蔬菜的收獲后變質(zhì)有關(guān)的最重要的酶之一。因此，PP0—直是目的在于減少或預防其活性以增加食品的收獲后質(zhì)量的許多技術(shù)的靶標。PP0催化將存在于植物組織中的多酚氧化，從而引起鄰醌的形成的反應(yīng)。然后，酶促和非酶促反應(yīng)導致褐色或黑色色素的形成。在許多植物種類中，PP0由小的基因家族編碼，所述基因家族的個體成員可具有指示功能趨異的不同的時間和空間表達模式。例如已顯示，萵苣在葉的光合和維管組織中包含不同的ppo同種型(isoform)。PPO的天然底物在不同的物種之間可以不同。在萵苣中，咖啡酸衍生物如綠原酸和異綠原酸主要用作PPO的底物。PPO酶的水平不是在植物組織的損傷后特異性誘導的，而是無活性地存在于葉綠體中。受傷后，由于存在于液泡中的酚類底物因為組織的破裂而與PPO接觸的事實的原因，PPO被激活由此被表現(xiàn)出來。在萵苣中，作為PPO的底物的多酚的產(chǎn)生由損傷誘導。因此，萵苣組織的褐變潛能似乎不受葉組織中PPO的量的限制而是受到損傷后多酚生物合成速度的限制。在該方面，不同的農(nóng)作物之間情況可以不同。例如，在蘋果中，多酚的量足以在損傷后1小時內(nèi)產(chǎn)生果實的褐變反應(yīng)，然而在萵苣中，由于萵苣中多酚庫大部分需要在損傷后重新合成的事實，因而褐變反應(yīng)可花費數(shù)天時間。通過稱為苯基丙酸類通路(phenylpropanoidpathway)的詳盡表征的生物化學通路進行多酚類的合成。首先，該通路的關(guān)鍵步驟由苯丙氨酸解氨酶催化(PAL，Hahlbrock，K和Scheel，D(1989)A廳Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.40，347-369)。PAL將通過莽草酸酯通路合成的氨基酸苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成肉桂酸(cinnamicacid)。在萵苣，葉子的損傷導致PAL基因表達和PAL活性的強誘導。多酚的形成與該酶促活性相關(guān)，這表明由萵苣的損傷誘導的PAL活性是造成褐變的重要因素(Campos,R.等人(2004)PhysiologicaPlantarum121，429-438和其中的參考資料)。然而，哪一個其他因素決定損傷誘導的變色反應(yīng)的最終結(jié)果目前還不清楚。例如，據(jù)認為過氧化物酶(POD)的活性在建立變色的最終水平中同樣重要(FukumotoL.R.等人(2002)J.Agric.FoodChem.540，4503-4511;Martin-DianaA.等人(2005)Biosci.Biotechnol.Biochem.69，1677-1685)。由于酶活性依賴于內(nèi)部過氧化氫的可獲得性，因而POD對變色的貢獻可能是有限的。進一步明顯的是，植物以某種不為人知的方式感覺到損傷，隨后通過級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生信號，對于萵苣，該信號目前未被充分確定。似乎明顯的是，這些活性主要被靶向傷口愈合和抗病原體的防御。因而，許多遺傳因子可能參與發(fā)動損傷的萵苣組織的變色反應(yīng)，這些因子中的各因子是減少或消除損傷誘導的變色的遺傳修飾的潛在的靶標。這些遺傳因子的大部分目前是未知的，對于已知的涉及到的因子，不清楚這些因子在變色反應(yīng)中所起的特定作用達到何種程度，或這些因子可能具有與植物的損傷生理學相關(guān)的更一般的功能。例如，盡管認為損傷誘導的PAL活性確定萵苣的褐變水平，但苯基丙酸類通路的產(chǎn)物已知參與尤其細胞壁的生物合成或也參與防御反應(yīng)。因此為了減少褐變潛能而減少損傷誘導的PAL活性可削弱除了損傷誘導的褐變以外的與萵苣栽培的其他方面相關(guān)的其他功能，這可能是較不希望的。同樣地，PP0的活性據(jù)認為參與防御反應(yīng)，因此通過減少PPO水平來減少褐變潛能可增加對病原體的易感性(Thipyapong，P.等人(2004)Planta220，105-117)。因此，本發(fā)明者推論出，更加無偏性的方法可在該方面獲得更大的成功。這樣的方法包括下列步驟1.植物的變異體群體，特別是突變體群體的產(chǎn)生。可通過用誘變劑如乙基甲磺酸(ems)或X射線處理種子或植物組織來產(chǎn)生這樣的突變體群體。2.有效率的表型篩選的建立，在所述篩選中，選擇基于通過PAL和/或PPO介導的損傷反應(yīng)誘導的植物(特別是葉類蔬茱，更特別地萵苣、苦苣(endive)或witloof的變色。3.在它們的關(guān)于收獲后變色潛能的損傷反應(yīng)發(fā)生改良的和不存在所述改良的多效性的突變體的表征，根據(jù)一般實踐，所述多效性削弱植物特別是葉類蔬菜，更特別地萵苣、苦苣(endive)或witloof的生長和加工。本發(fā)明因而在一個實施方案中涉及用于鑒定、選擇和獲得顯示減少的損傷誘導的變色和收獲后加工障礙例如酶促褐變或變粉紅色的植物的無偏性篩選方法。本發(fā)明在另一個實施方案中涉及更加偏性的方法，該方法使用通過PPO轉(zhuǎn)化成色素的底物。在該測定中，篩選特異針對PP0突變體。合適的底物是可被轉(zhuǎn)化成黑色的色素黑色素的L-D0PA。本文通過引用葉類蔬菜如萵苣舉例說明本發(fā)明，但也可以以相同的方法用上面指出的其他植物實施本發(fā)明。例如可如下制備用于本發(fā)明的方法的突變體植物群體a)使用誘變劑處理待改良植物種的M0種子以獲得M1種子；b)栽培來自所獲得的Ml種子的植物以獲得Ml植物；c)任選地重復步驟b)和c)n次以獲得Ml+n種子，d)萌發(fā)所獲得的Ml+n種子，栽培來自這些種子的植物。根據(jù)本發(fā)明，隨后針對它們的損傷誘導的變色反應(yīng)測定這些植物。選擇不顯示或顯示減少的對損傷的變色反應(yīng)的植物。然后，栽培選擇的植物的后代，測量損傷誘導的變色反應(yīng)。為了產(chǎn)生遺傳變異性，可使用誘變?？捎糜谠谥参锓N如萵苣中誘的。，、、^、，、，例如，可在包含不同濃度的誘變劑如ems的溶液中處理萵苣的種子。Ems主要烷基化DNA鏈的G殘基，這在DM復制過程中引起與T配對而非與C配對。從而GC堿基配對以由有效劑量的ems和植物的錯配修復系統(tǒng)的活性確定的頻率改變成AT堿基配對。ems的有效劑量取決于所使用的濃度、種子大小和其他物理性質(zhì)以及種子在ems溶液中的溫育時間。已用ems處理的種子通常稱為Ml種子。作為處理的結(jié)果，Ml種子的組織在它們的細胞的基因組中包含隨機點突變，那些存在于將形成種系組織(生殖細胞)的細胞的亞群中的點突變將被傳遞至稱為M2的下一代。單倍不足從而引起不育或誘導胚胎致死現(xiàn)象的突變或其組合將不被傳遞至M2代。如上述使用ems的相似方法同樣可用于其他誘變劑。合適的i秀變劑在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。特別有用的是烷基化誘變劑，例如硫酸二乙酯(des)、乙烯亞胺(ei)、丙磺酸內(nèi)酯、N-甲基-N-亞硝基脲(nitrosourethane)(mnu)、N-亞硝基-N-曱脲(腸)、N-乙基-N-亞硝基脲(enu)、疊氮化納。可選擇地，通過輻射誘導突變，所述輻射選自例如X射線、快中子、紫外線照射。在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過基因工程例如通過使用嵌合寡核苷酸、同源重組、基因打靶、與內(nèi)源產(chǎn)物竟爭的經(jīng)修飾的靼基因的導入、通過RNA千擾進行的下調(diào)等來誘導突變?？蓪⒄T變處理的M2群體用于針對通過PAL和PPO介導的損傷反應(yīng)的篩選方法。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是攜帶遺傳變異的任何植物群體可用作該表型篩逸的起始材料。優(yōu)選，本發(fā)明還涉及疊加(pyramiding)引起減少的損傷誘導的變色反應(yīng)的pyramiding等位基因。合適地通過自體授粉產(chǎn)生Ml和Ml+n種子。本發(fā)明還涉及獲得具有改變的基因型的植物或植物部分，所述植物或植物部分顯示減少的對生理性收獲后加工障礙例如酶促褐變或變粉紅色的易感性。本發(fā)明涉及在它們的基因組中具有遺傳信息的植物或植物部分，所述遺傳信息負責減少的對收獲后加工障礙例如酶促褐變或變粉紅色的易感性，且發(fā)現(xiàn)于萵苣植物的基因組中。所述植物的后代也是本發(fā)明的部分。本文中所使用的"后代，，意工障礙特別是酶促褐變或變粉紅色的易感性的所有植物，以及以任何方式例如通過有性生殖如自體授精或與相同屬的另一種植物的異花受精、或營養(yǎng)繁殖例如扦插、組織培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、原生質(zhì)體融合或其他技術(shù)從其產(chǎn)生的植物。這樣的后代不僅是通過一種或多種此類技術(shù)產(chǎn)生的植物的第一代，而且也可以是通過一種或多種這些技術(shù)產(chǎn)生的植物的更多代，只要產(chǎn)生的植物具有減少的易感性。為了進行本發(fā)明的表型篩選，必須產(chǎn)生損傷表面，因為酶促變色反應(yīng)是由損傷誘導的。損傷是通過方法如切割、穿孔、切片、磨損、擠壓、破壞、剝皮、壓碎、壓迫、鞭打、碾磨、液體注射、滲透壓休克、分離(detaching)、割、撕碎(shredding)、摩擦(rubbing)和撕裂對天然植物、組織和/或細胞結(jié)構(gòu)的不可逆干擾。然后，用于診斷導致組織變色的通路和可非常有效地用于突變?nèi)后w的篩選的表型特征必須逐漸表現(xiàn)出來。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，可通過釆集萵苣植物的葉部分，然后在非常特殊的條件(所述條件有利于不同形式的損傷表面變色發(fā)生)下溫育它們來獲得這樣的表型特征。然后，這樣的測定可用于大量的突變植物以選擇顯示減少的損傷誘導的變色反應(yīng)的植物。本發(fā)明的一個實施方案基于令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即當采集來自葉子特別是萵苣葉的葉盤并且在5'C下在濕潤的濾紙之間溫育葉盤時，在大約4天后，葉盤邊緣的粉紅色染料的形成逐漸變得明顯。合適的濾紙是1450CV型濾紙，Ref.no.10313281，來自Schleier&Schuell，MicroscienceGmbH,Dassel，Germany。在進一步溫育后，信號增強，在大約一周后達到最大強度。粉紅色染料的形成特異性地在損傷表面發(fā)生?？赏ㄟ^在視覺標度(visualscale)上進行從0(其表示無褐變或變粉紅色)至10(其表示與標準萵苣品種(萵苣)相似的褐變和變粉紅)的評分來測量變色。在本實施例中，萵苣品種'Troubadour'用作10的標準。如果希望，可使用圖進行比較，從而給0和10之間的中間級別評分。此外，可由具有粉紅色染料的濾紙產(chǎn)生數(shù)字圖像，然后計算每葉盤位置具有強粉紅色的像素的數(shù)目。通過使用這些測量中的一種,可進行本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的簡單統(tǒng)計分析如t檢驗，從而確定植物或植物群體變粉紅色的程度是否比標準(如對'Troubadour')顯著更低。單測檢驗的所使用的顯著性水平是0.001。對于突變體，可在作為最佳的可獲得的標準的原始品種的粉紅色、'為了在代表不同i異樣品:現(xiàn)有植物中發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的性狀，可使用繁殖系(breedingline)和/或基因庫登錄號(genebankaccession)。然后可在處于研究的個體登錄號的變粉紅色的評分與群體的其余部分的變粉紅色的評分之間進行統(tǒng)計比較。當針對顯著減少的變粉紅色對個體進行統(tǒng)計檢測時，可能需要多重比較檢驗來保持適當?shù)目傮w顯著性水平，例如使用一個標準的Dunnett氏多重比較檢驗(D觀ettCW，J.Amer.Statist.Assoc.50:1096-1121(1955))。此外，據(jù)顯示可通過使用不同發(fā)育階段的葉子的許多不同類型的組織獲得損傷誘導的變色反應(yīng)。例如，還可誘導中脈組織產(chǎn)生該對損傷的反應(yīng)。當用于不同種類的萵苣，例如葉用萵苣(butterhead)、巻心萵苣、直立萵苣、荷蘭萵苣或櫟葉萵苣時，未發(fā)現(xiàn)顯示比被研究的群體的剩余部分顯著更少的變粉紅色的個體登錄號。根據(jù)本發(fā)明，進一步證明PPO的特異性抑制劑L半胱氨酸，當在反應(yīng)過程中使用時，強烈地抑制粉紅色染料的形成。此外，發(fā)現(xiàn)肉桂醛(其為PAL活性和鮮切萵苣的褐變的抑制劑)抑制粉紅色染料的形成(FujUa，N.等人(2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70，672—676)。這些發(fā)3見顯示萵苣的粉紅色變色反應(yīng)是PAL和PPO依賴性的。已知通過使用短暫的熱激可非常有效地防止鮮切萵苣的酶促褐從而減少朝向多酚形成的代謝流來解釋觀察到的效應(yīng)。可選擇地，可通過假定參與多酚氧化的酶例如PPO和POD被熱激處理失活來解釋效應(yīng)。當對隨后針對變粉紅色反應(yīng)進行測定的萵苣使用熱激時，顯示該反應(yīng)如酶促褐變4皮有效抑制。這證明了作為本發(fā)明的部分的萵苣的變粉紅色反應(yīng)在生理上與熟知的酶促褐變反應(yīng)非常相似。通過將L半胱氨酸用作還原劑來進一步驗證該發(fā)現(xiàn)。L半胱氨酸，除了是PP0的抑制劑外，還已知與有色的鄰醌(o-quinone)反應(yīng)并且在化學還原反應(yīng)中將它們轉(zhuǎn)化回無色的二酚。當用L半胱氨酸處理由萵苣葉盤形成的粉紅色染料時，證明粉紅色化合物被轉(zhuǎn)化成無色的化合物。因此粉紅色染料似乎可能是由PPO形成的鄰醌。這通過發(fā)現(xiàn)還原劑如抗壞血酸或谷胱甘肽也可將粉紅色染料轉(zhuǎn)化成無色化合物來確證。此外，當用L半胱氨酸處理采自田間的、顯示變粉紅色的植物時，也可消除粉紅色變色。這證明葉盤變粉紅色反應(yīng)代表了有時可在于田間條件下生長的植物中看到的天然發(fā)生的變粉紅色現(xiàn)象。本發(fā)明的其他實施方案基于下列實驗。通過切割產(chǎn)生頭部的萵苣葉的部分，將所述部分在16X:下在空氣中進行溫育。作為反應(yīng)，在大約4天后，損傷表面變成褐色。特別地在主脈的損傷表面上，可清楚地觀察到褐變。此外，還可通過切割或摩損損壞葉子后在整個植物水平上觀察到褐變反應(yīng)。L半胱氨酸(PP0的抑制劑)可完全抑制所有這些褐變反應(yīng)，這證明了這些表型是通過PPO的活性表現(xiàn)的，從而可被當作如在萵苣的加工和包裝過程中觀察到的收獲后褐變的診斷。這些損傷誘導的褐變反應(yīng)能夠以有效的方式產(chǎn)生，所述方式可在用于鑒定突變體植物的表型篩選方法中使用，所述突變體植物的損傷誘導的褐變潛能減少。本發(fā)明的其他實施方案基于通過使用底物誘導的萵苣組織的損傷表面上的變色，所述底物可被酚氧化酶轉(zhuǎn)化成有色的化合物。例如，當將萵苣葉盤與PP0底物L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)一起溫育時，在損傷表面上觀察到深褐色向黑色的變色，該變色是黑素形成(通過PP0)的表現(xiàn)。當同時使用L半胱氨酸，黑色變色被完全抑制，這確認了該變色是PPO介導的假設(shè)。盡管L-DOPA被認為不是萵苣PP0的天然底物，但其可用于目的在于突變體(所述突變體顯示減少的損傷誘導的變色)的鑒定的測定?？梢砸耘c對于L-D0PA所描述的相似的方式，使用其他底物以產(chǎn)生變色反應(yīng)。這些底物包括但不限于綠原酸、異綠原酸、L酪氨酸和兒茶酚。綜合起來，不同染料在植物中產(chǎn)生的損傷表面上的形成監(jiān)控始于損傷信號的誘導、通過PAL和PP0介導且導致變色的通路中的改變。如所描述的，可容易地通過目檢(所述目檢允許進行非常有效的突變體篩選方法)來評估這些損傷誘導的變色反應(yīng)。在圖1中圖解說明本發(fā)明描述的方法背后的原理。根據(jù)本發(fā)明，因而發(fā)現(xiàn)在體外，葉盤的損傷誘導的變色通路與以工業(yè)規(guī)模進行加工的萵苣的損傷誘導的變色大部分重疊，從而可被當作該過程的診斷。這受到這樣的概念支持，即PAL或PP0的抑制劑抑制在實際的、工業(yè)條件下加工的和包裝的萵苣的酶促褐變。重要地，由于該方法包括誘導步驟(即損傷和由PPO介導的一個最終的代謝轉(zhuǎn)換)，因而方法允許捕獲直接或間接參與該生理過程的所有遺傳因子。此外，由于可通過使用不同發(fā)育階段的葉子的整個葉組織產(chǎn)生該反應(yīng)，因此當考慮相關(guān)性時，可將突變體篩選靶向這些不同的階段或組織?？蛇M一步表征突變植物，基于一個或多個上述表型測定，所述突變植物已被鑒定為在從損傷導向PAL和PP0依賴性變色的生理過程方面發(fā)生改變?？稍诓煌乃嚼缭诜肿?、生物化學、生理學和表型水平上進行該表征。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員很明顯的是，可觀察到變色的可變水平(variablelevel)，其可反映影響原始群體中的變色性狀的不同的突變基因座或相同基因座的不同等位基因型的存在。在隱性突變的情況下，可通過進行等位性檢驗容易地區(qū)分這兩種可能性，所述檢驗包括將兩種突變植物雜交和確定雜種的表型。在突變的等位性的情況下，減少的變色性狀在F1中將是明顯的，然而在突變體中的表型由不同隱性基因座確定的情況下，情況則不是這樣。當將隨機誘變用于產(chǎn)生起始群體時，遺傳背景中的突變也可在實驗條件下促成表型的變異。為了區(qū)分不同強度的單突變和遺傳背景中的突變的組合效應(yīng)，應(yīng)當針對不同的減少的變色事件進行回交以產(chǎn)生均一的遺傳背景。為了確定參與損傷誘導的變色的特定基因座上的突變是否展示多效性，該方法也是適當?shù)摹Ｒ虼?，基于減少的變色反應(yīng)所選擇的M2植物用于生長M3種子。然后，針對它們減少的對損傷的反應(yīng)重新評估來源于減少的變色事件的近交系。此外，可在不同的遺傳背景中和在不同的農(nóng)作物栽培和加工條件下評估減少的褐變或變粉紅色?？蛇M行生物化學研究以闡明涉及受遺傳修飾影響的通路的問題?？蛇M行分子研究以確定假定的參與酶促褐變或變粉紅色反應(yīng)的候選基因如編碼PAL、PPO或過氧化物酶的基因是否被修飾。隨后進行遺傳分析以證明候選基因中發(fā)現(xiàn)的修飾是形成改變的表型的原因。盡管誘導的誘變是用于本發(fā)明的優(yōu)選方法，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已知的是，存在允許以特定的方式修飾存在于植物的基因組中的基因靶的技術(shù)。例如，已證明嵌合寡核苷酸是具有特定作用模式的有效請變劑。另一個方法是通過同源重組或基因打耙修飾基因靼。通過使用該方法，用導入的包含希望的修飾的DNA片段交換基因的片段。轉(zhuǎn)基因方法也是可行的，在所述方法中導入與內(nèi)源產(chǎn)物竟爭的修飾的靶基因。這可導致顯性負效應(yīng)。此外，通過RNA干擾特異性下調(diào)基因的表達是可行的。在誘變的寡核苷酸的情況下，基因打靶或轉(zhuǎn)基因方法用于修飾參與損傷誘導的變色反應(yīng)的遺傳因子，很明顯，相關(guān)基因的一級結(jié)構(gòu)應(yīng)當是已知的。本發(fā)明的其他部分涉及基于萵苣葉盤的損傷誘導的粉紅色變色鑒定的萵苣突變體和從其產(chǎn)生的后代。將該變粉紅色測定用于包含隨機的、ems誘導的突變的M2群體的植物導致許多突變體的鑒定，所述突變體顯示與對照植物(所述對照植物不包含ems誘導的突變)相比，顯著減少的變粉紅色反應(yīng)。大多數(shù)這樣的突變體顯示矮小的和通常萎黃病樣的表型。然而令人吃驚地發(fā)現(xiàn)一些具有減少的變粉紅色反應(yīng)的突變體顯示正常的生長習性(habitus)，即與對照植物非常相似的大小、形狀、生長和顏色。當針對變粉紅色測定從通過自體授精獲得的種子生長的該特定突變體的后代植物時，觀察到與對于原始鑒定的突變體發(fā)現(xiàn)的相似的減少。這證明減少的粉紅色變色反應(yīng)能夠遺傳且由基因組的修飾引起。進一步令人吃驚的發(fā)現(xiàn)是如下事實，即當將后代植物生長至成熟并且針對損傷的中脈組織的酶促褐變進行檢驗時，該反應(yīng)也被強烈抑制。及萵苣中的酶促褐變，以及顯示變粉紅色的測定可用于預測成熟萵苣植物的酶促褐變的水平。因此，可將葉盤變粉紅色的測定用作鑒定具有減少的酶促褐變潛能的萵苣植物的選擇工具。該工具可用于從任何類型的植物群體(無論遺傳變異的原因是什么)鑒定存在于該群體中的具有減少的酶促褐變潛能的萵苣植物。例如，除了eras群體外，可使用天然獲得的材料或繁殖種群。本發(fā)明提供的一種或多種篩選方法可用于其收獲后加工質(zhì)量需要提高的任何葉類蔬菜品種。因此，本發(fā)明除了栽培的萵苣外還可用于屬于菊科的其他植物種，例如萵苣屬的野生型種。此外，本發(fā)明可特別地用于屬于植物菊苣屬(所述屬是種如苦苣(Cichoriumendivia)、菊苣和witloof菊苣(Cichoriumintybus)屬于的屬)的植物。本發(fā)明涉及可通過進行本文中公開的一種篩選方法在植物中被檢測的表型特征。本發(fā)明的植物是與對照植物相比，顯示不存在或減少的損傷誘導的表面變色的植物。通過3個變色檢測(即變粉紅色或褐變的發(fā)生或?qū)⒌孜風-D0PA轉(zhuǎn)化成黑色素的能力)中的一個或多個檢測確定特征的存在。本發(fā)明的植物是在這些檢測的至少一個檢測中顯示至少與對照相比減少的變色的植物。本文中所使用的"對照"是已知其顯示變粉紅色、褐變和L-D0PA至黑色素的轉(zhuǎn)化中的一種或多種變色反應(yīng)的任何植物，所述反應(yīng)可被L半胱氨酸或肉桂醛抑制。合適地，使用植物，所述植物的其葉盤，當在5'C下在濕潤的濾紙之間溫育7天時，顯示圍繞盤的邊緣的粉紅色變色。將在下列的且不意欲以任何方式限定本發(fā)明的實施例中進一步舉例說明本發(fā)明。所述實施例涉及萵苣，但可使用其他產(chǎn)品植物或其部分特別是新鮮果實和蔬菜而不使用萵苣。在實施例中參考下列附圖。圖1:關(guān)于減少的收獲后酶促變色的萵苣群體的突變體篩選方法的設(shè)計背后的原理的概述。篩選的輸入信號是被植物感覺且產(chǎn)生導致許多生理過程(包括衰老、呼吸和組織變色)的不同信號傳輸反應(yīng)的葉組織的損傷。該植物信號可與酚類化合物作為PPO底物的應(yīng)用相結(jié)合。篩選的輸出信號是診斷收獲后褐變和變粉紅色的損傷表面診斷的褐色或粉紅色變色(取決于所使用的條件)。這可從輸出信號被肉桂醛和L半胱氨酸(其分別為PAL和PP0的特異性抑制劑)完全抑制的事實推斷出來。圖2:基于葉盤的粉紅色變色的篩選的輸出表型的代表性圖像。將萵苣植物的葉盤(每植物1個葉盤)排列在濕潤的濾紙之間并在5。C下溫育7天?？稍趽p傷表面清楚地觀察到圍繞各葉盤的粉紅色變色。圖3:在不同濃度的PAL抑制劑肉桂醛存在的情況下進行的葉盤變粉紅色測定(每皿4個葉盤)。各皿上面的數(shù)字顯示所使用的肉桂醛的百分比。圖4:PP0抑制劑L半胱氨酸對濕潤的濾紙之間溫育的萵苣葉盤(每皿4個葉盤)的粉紅色變色的抑制效應(yīng)。各皿上方的數(shù)字顯示所使用的L半胱氨酸的百分比。圖5:PP0抑制劑L半胱氨酸在1.5mML-D0PA存在的情況下對濕潤的濾紙之間溫育的萵苣葉盤(每皿4個葉盤)的黑色變色的抑制效應(yīng)。各皿上面的數(shù)目顯示所使用的L半胱氨酸的mM濃度。圖6:熱激預處理對萵苣葉盤變粉紅色的影響。在各皿上指定的溫度下對完整的葉子施用熱激，進行90秒。圖7:通過L半胱氨酸使通過萵苣的損傷反應(yīng)形成的粉紅色染料至無色化合物的轉(zhuǎn)化。皿的上行顯示L-DOPA測定，而皿的下行顯示變粉紅色的測定。在完成損傷反應(yīng)后，用L半胱氨酸進行處理各JHL中的兩個葉盤的下方葉盤。所使用的L半胱氨酸的濃度是上面指定的0、0.001、0.01、0.1、1和10mM。圖8:通過L半胱氨酸產(chǎn)生的田間生長的萵苣中變粉紅色的減少。上方的圖框(upperpanel)顯示采自被7jc浸(waterlogging)極端脅迫的植物的萵苣葉子的常見的變粉紅色癥狀。主脈顯示粉紅色染料的存在。下方右圖框顯示采自在室溫下用1mML-半胱氨處理30分鐘后顯示變粉紅色癥狀的葉子的葉盤。下方左圖框顯示在室溫下用水處理30分鐘后的相似的葉盤。圖9:圖框A:根據(jù)本發(fā)明描述的方法針對葉盤變色對個體萵苣M2植物(按庫分組的)進行的表型分析。12000個樣品中總共有138個樣品在該圖框中展示，其中箭頭所指的樣品顯示強烈減少的變粉紅色變色。圖框B:確認與顯示清楚的變色反應(yīng)的對照樣品相比，粉紅色變色的形成幾乎不存在(中間位置中的樣品)的圖框A中指出的選擇的個體的再檢測。圖10:M2萵苣植物的表型。通過使用根據(jù)本發(fā)明的測定法，標記l、2、4、5、7、10和12的植物顯示減少的粉紅色葉盤變色。植物3、6、8、9和11是顯示與野生型對照相當?shù)姆奂t色葉盤變色水平的植物。植物1是顯示粉紅色變色的強烈減少和正常生長習性的突變體的唯一例子。植物2、4、5、7、10和12顯示減少的粉紅色變色和矮小、變白的表型。圖ll:顯示減少的變色的萵苣的突變體的后代檢測。在左邊，展示25個顯示正常損傷誘導的變色反應(yīng)的樣品。在右邊，展示采自一系列來源于單個突變體的35個后代植物的樣品組，所述突變體在其損傷誘導的變色反應(yīng)方面強烈減少。圖12.基于采自成熟萵苣植物的葉子中脈部分的褐色變色的篩選的輸出表型的代表性圖像。圖像顯示在16。C下溫育3天后萵苣邊葉中脈組織盤?？稍趽p傷表面清楚地觀察到常見的褐色變色。各皿包含3個在中脈的不同位置(綠色、淡綠色和白色)采集的葉盤。皿上方的數(shù)字表示向濾器中加入的L半胱氨酸的mM濃度。圖13:萵苣葉表面的L-DOPA至黑色素的轉(zhuǎn)化。圖框A顯示1.5mML-DOPA溶液中的測定。上管是陰性對照，其他3個管相同。圖框B顯示在包含1.5mML-DOPA的濕潤濾紙之間的葉盤溫育的結(jié)果。圖14:在中脈褐變上顯示減少的損傷誘導的粉紅色變色的萵苣突變體的后代檢測。圖框A顯示減少的變粉紅的突變體的編號為l至8的8林后代植物的中脈葉盤(每植物3個葉盤)。圖框B顯示編號為9至16的顯示正常褐變反應(yīng)的8林對照植物的中脈葉盤(每植物3個葉盤)。圖15:在環(huán)境大氣下切割和包裝后，顯示減少的損傷誘導的粉紅色變色或褐變反應(yīng)的萵苣的突變體的評估。對照植物的頭部的葉碎片示于左邊，減少的變色的突變體的葉碎片示于右邊。將鮮切葉材料在4'C下貯存6天?？稍趯φ諛悠分星宄赜^察到褐色變色，然而突變體樣品保持不變。實施例實施例1使用ems對萵苣進行的遺傳修飾將萵苣品種Troubadour、Apache、Yorvik和Roderick的大約2000粒種子在室溫下在24小時期間于0.05%(w/v)或0.07%(w/v)的ems的充氣溶液中進行溫育。在ems處理后，用水漂洗M1種子，然后在20。C下在16小時光照、8小時黑暗的方案下種植在溫室中，讓其長成成熟的植物，誘導抽莒和開花以產(chǎn)生M2種子。在成熟后，收獲M2種子，聚集成堆，然后貯藏以待進一步使用?；诰哂凶儼椎谋硇偷膫€體植物(所述植物的葉綠素生物合成被擾亂)的相對數(shù)目估計突變頻率。實施例2基于粉紅色色素形成診斷萵苣的損傷誘導的變色的表型篩選的發(fā)展發(fā)展其中可容易地評估由損傷誘導的萵苣的葉變色的表型測定法。該方法允許針對變色進行幼小植物的篩選。從幼小或成熟的植物采集直徑5mm的葉盤并且將其置于皿中的濕潤的濾紙之間。將系統(tǒng)在5'C下溫育7天。在溫育過程中，變得如在濾紙上打印的圓一樣清楚可見的粉紅色染料在葉盤的損傷位置產(chǎn)生(圖2)。為了證明粉紅色染料的產(chǎn)生需要活性苯基丙酸類通路，在該測定中檢測PAL(肉桂醛，圖3)和PP0a半胱氨酸，圖4)的抑制劑的效應(yīng)。當在測定過程中使用肉桂醛時，粉紅色變色在0.01%或更高的濃度被完全抑制。使用L半胱氨酸，在0.001%和更高的濃度上獲得相似的結(jié)果，然而其他氨基酸如L亮氨酸或L丙氨酸不顯示任何效果。這證明L半胱氨酸可抑制萵苣葉盤的變粉紅色反應(yīng)且L半胱氨酸的抑制作用是特異性的。為了證明L半胱氨酸在該系統(tǒng)中確實用作PPO活性的抑制劑，將萵苣葉盤與PP0底物L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)—起溫育。盡管認為L-DOPA不是葛苣PPO的天然底物，但在損傷表面觀察到深褐色至黑色的變色，所述變色是通過PPO形成黑色素的表現(xiàn)。當同時使用1mM或更高濃度的L半胱氨酸時，如圖5中所示，變色被完全抑制。通過在誘導損傷反應(yīng)前使用熱激來進一步表征萵苣葉盤變粉紅色的反應(yīng)。在21、40、50和60'C的溫度下在90秒期間溫育分離的葉。在該處理后，采集葉盤，針對變粉紅色對其進行測定。當在50匸或更高的溫度下進行熱激時，變粉紅色反應(yīng)被完全抑制。該結(jié)果顯示于圖6中。由于已知L半胱氨酸與作為PPO產(chǎn)物的鄰醌反應(yīng)(通過將它們轉(zhuǎn)化回無色的二酚)，因此確定L半光氨酸對來自萵苣葉盤的粉紅色染料的影響。平行地確定L半胱氨酸對黑色素形成(與L-DOPA溫育后)的影響。根據(jù)上述方法采集和溫育葉盤。在完成損傷反應(yīng)后，向葉盤加入一系列濃度的L半胱氨酸，監(jiān)測顏色的變化。結(jié)果示于圖7中。該實驗清楚地證明L半胱氨酸將粉紅色染料轉(zhuǎn)化回無色化合物，然而L-D0PA測定中形成的黑色的黑色素不受L半胱氨酸影響。這證明粉紅色染料很可能是由萵苣多酚氧化系統(tǒng)形成的鄰醌。為證明體外觀察到的反應(yīng)反映生理上相關(guān)的反應(yīng)，將基于L半胱氨酸的變色用于田間生長的植物材料。這可通過從沿著葉脈顯示強烈的變粉紅色癥狀的田間生長的萵苣收獲葉子來進行。當例如通過嚴重水浸的條件脅迫植物時，通常觀察到該現(xiàn)象。葉子用于制備立即由1mML半胱氨酸溫育的葉盤。在室溫下在大約30分鐘的溫育后，如圖8中所示，粉紅色變色消失。綜合起來，這些實驗數(shù)據(jù)顯示，可通過損傷誘導萵苣葉盤以產(chǎn)生PAL和PPO依賴性的粉紅色變色。該表型允許針對萵苣突變體的有效率的和有效的篩選方法，所述萵苣突變體具有改良的、通過PAL、PPO或兩者介導的損傷反應(yīng)誘導的變色。實施例3篩選具有減少的損傷誘導的變色的突變體為了鑒定具有低損傷誘導的酶促褐變或變粉紅色潛能的萵苣突變體，將實施例2中描述的葉盤測定法用于萵苣突變體群體的植物。在溫室中栽培12000林植物(位置DeLier，theNetherlands;播種，3月28日；種植，4月18日；在常規(guī)的萵苣的生長條件下進行生長)，從各個個體植物采集葉盤(從5月15日開始采樣)，將葉盤作為(平均)25個樣品的庫在5'C下在濕潤的濾紙之間溫育7天。依賴于粉紅色變色的強度給每一個葉盤進行視覺評分。基于該評估，選擇其葉盤顯示沒有或顯示具有相對低程度的損傷表面變色的植物。將具有幾乎看不到的微量變色的植物編號為06D.210202。在12000林植物中，最終選擇1抹只顯示樣i量的幾乎看不見的變色的植物和11抹顯示相對低變色水平的植物。這些測定中的一個測定的結(jié)果示于圖9。對最初選擇的12個個體重復變色測定，對于大多數(shù)個體情況，確認了最初的結(jié)果。只選擇確認的個體進行進一步的分析和種子生產(chǎn)。實施例4篩選具有減少的損傷誘導的變色的突變體為了鑒定具有低損傷誘導的酶促褐變潛能的萵苣突變體，將實施例2中描述的葉盤測定法用于萵苣突變體群體的植物。將8500林植物種植在溫室中直至3周齡(6-8葉期)并且從各個體采集葉盤，將所述葉盤在5。C下于濕潤的濾紙之間溫育7天。依賴于粉紅色變色的強度給予各葉盤視覺評分。基于該評估，選擇其葉盤顯示沒有或顯示相對低程度的損傷表面變色的植物。在8500林植物中，選擇8抹不顯示任何可見變色的植物和IO林顯示相對低的變色的植物。對18個最初選擇的個體重復變色測定，對于大多數(shù)個體情況，確認了最初的結(jié)果。12個個體示于圖10。只選擇確認的個體用于進行進一步的分析和種子生產(chǎn)。給l林不具有多效副作用(例如，變白、變矮)的突變植物賦予編號05D.202539。通過該植物的自交產(chǎn)生的種子被編號為05D.810596。通過3林從05D.810596的種子生長而來的植物的自交產(chǎn)生的種子編號為07G.9979并且保藏在NCIMB。NCIMB號是41441(于2006年10月10日保藏)。實施例5選擇的顯示減少的損傷誘導的變色的突變體的表型分析在選自實施例3中提供的篩選的12個突變體中，6個顯示強烈減少的生長表型和變白。其他突變體發(fā)育正常，即與誘變實驗的起始群體的類型一致。變矮和變白的突變體的葉綠體功能可能被擾亂。由于PP0存在于這些細胞器中，這可以解釋葉盤測定中相對低的反應(yīng)。由于該多效突變是不希望的，因此這些突變體被認為是不太適切的。顯示最強的葉盤變色的減少的突變植物06D.210202顯示了正常表型，因此突變被認為對于變色是特異性的，不具有強多效性。實施例6后代中幾乎不存在變色表型的確認為了證明萵苣突變體如來自實施例3和5的植物06D.210202的通過自交產(chǎn)生種子。通過植物06D.210202的自交產(chǎn)生的種子編號為06D.819784。將種子在土壤中萌發(fā)，使用葉盤變粉紅色測定法針對變色檢測植物。實驗清楚地顯示改變的表型具有遺傳基礎(chǔ)，因為所有后代植物顯示相似的表型，即粉紅色變色的強烈減少，與用于產(chǎn)生種子的突變體相似。在圖11中說明該結(jié)果。通過3林從06D.819784的種子生長的植物的自交產(chǎn)生的種子編號為06D.863B2并且在NCIMB保藏。NCIMB號為41454(于2007年1月3日保藏)。實施例7基于褐色色素形成診斷萵苣的損傷誘導的變色的表型篩選的發(fā)展將萵苣生長至成熟，通過從葉脈組織切割葉盤來采集邊葉的部分。將葉盤在16。C下在濕潤的濾紙上進行溫育。在大約72小時后，損傷表面轉(zhuǎn)變成褐色。在1QmML半胱氨酸存在的情況下，褐變反應(yīng)被抑制，這表明觀察到的變色是PPO介導的。這樣的實驗的代表性結(jié)果顯示圖12中。由于如圖12中展示的反應(yīng)是PPO介導的褐變反應(yīng)，因此為了篩選顯示減少的在萵苣的加工過程中發(fā)生的褐色變色的突變體，如本實施例中描述的篩選方法可以認為是有效的和無偏性的。實施例8基于L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-D0PA)轉(zhuǎn)化回稱為黑色素的黑色色素診斷萵苣的損傷誘導的變色的表型篩選的發(fā)展除了在廣義上說明損傷誘導的變色的測定外，根據(jù)本發(fā)明的方法也允許以更特異的方式篩選具有減少的PPO活性的突變體。通過使用在1.5mML-DOPA存在的情況下溫育的葉盤來發(fā)展顯示PPO活性的表型測定法。由于黑色變色變得明顯，可推斷出，可通過多酚氧化系統(tǒng)在萵苣葉的損傷表面容易地將L-DOPA轉(zhuǎn)化成稱為黑色素的黑色色素。通過PPO將L-DOPA轉(zhuǎn)化成反應(yīng)性L-DOPA-醌，該L-DOPA-醌通過多巴色素和吲哚醌非酶促地轉(zhuǎn)化成黑色的黑色素。此外，顯示可在反應(yīng)期間通過加入1mML半胱氨酸來抑制反應(yīng)(圖5)。因此，該分析使得能夠鑒定突變體，所述突變體在葉的損傷表面產(chǎn)生PPO活性的能力發(fā)生改變。如圖13中所顯示的，可在溶液和濕潤的濾紙之間觀察到萵苣葉盤對L-DOPA的存在的反應(yīng)。實施例9使用葉脈葉盤褐變觀'J定法(ribdiscbrowningassay)針對減少的褐變反應(yīng)評估顯示幾乎不存在變色的突變體的后代為了證明萵苣突變體(如來自實施例3、5和6的、葉盤的損傷表面的粉紅色變色顯著減少的植物編號06D.210202)的減少的變色也在損傷誘導的褐變反應(yīng)中有效地減少，將許多后代植物生長至成熟。在發(fā)育的該階段，從許多后代植物的邊葉采集3個中脈葉盤。根據(jù)實施例7中描述的方法溫育這些葉脈葉盤。顯示，較早顯示強烈減少的損傷誘導的粉紅色變色的突變體的后代植物也強烈地減少損傷誘導的中脈褐變。該實驗的結(jié)果示于圖14。實施例10使用包裝在塑料袋中的鮮切萵苣頭針對減少的褐變反應(yīng)評估顯示幾乎不存在變色的突變體的后代使用刀將從來自實施例6的種子編號06D.819784生長而來的、葉盤的損傷表面的粉紅色變色顯著減少的萵苣植物的成熟頭部切成碎片，并且包裝在包含環(huán)境大氣的塑料袋中。以相同的方式處理顯示正常葉盤粉紅色變色反應(yīng)的對照植物。在6天期間，在4t:下貯存袋子之后，針對其褐變反應(yīng)評估葉材料。該實驗顯示較早顯示損傷誘導的粉紅色變色的強烈減少的突變體的后代植物，當使用環(huán)境大氣進行加工和貯藏在塑料袋中時，損傷誘導的中脈褐變也強烈減少。該實驗的結(jié)果示于圖15。權(quán)利要求1.一種方法，所述方法用于針對其中存在的與對照植物或植物部分相比顯示減少的損傷誘導的表面變色的個體而篩選植物或植物部分的群體，所述方法包括a)提供植物的群體或來自該群體的植物的部分；b)在待篩選的植物或植物部分以及對照植物或植物部分上產(chǎn)生損傷表面；c)溫育損傷表面以允許變色在其內(nèi)或其上發(fā)生；d)觀察植物或植物部分內(nèi)或其上的損傷表面變色；e)將在待篩選的植物或植物部分內(nèi)或上觀察到的損傷表面變色與在對照植物或植物部分內(nèi)或上觀察到的變色比較，從而鑒定顯示沒有變色或與對照植物或植物部分相比減少的變色的植物或植物部分。2.權(quán)利要求l中所述的方法，其中植物是蔬菜植物、結(jié)果的植物或開花植物。3.權(quán)利要求2中所述的方法，其中植物是選自萵苣、苦苣、witloof、馬鈴薯、甘薯、塊根芽菜、蘑菇、朝鮮薊和茄子的蔬菜植物。4.權(quán)利要求2中所述的方法，其中植物是選自蘋果、香蕉、聘梨、桃子、梨子、杏子和芒果的結(jié)果的植物。5.權(quán)利要求2中所述的方法，其中植物是選自大丁草和菊花的開花植物。6.權(quán)利要求l-3任一項中所述的方法，其中植物屬于菊科，特別地屬于萵苣屬，更特別地屬于萵苣種。7.權(quán)利要求l-3任一項中所述的方法，所述植物屬于菊苣屬，和特別地屬于菊苣和苦苣種。8.權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中植物部分選自葉、頭、枝、根、塊莖、莖、花、果實、種子或其碎片和細胞。9.權(quán)利要求6或7中所述的方法，其中植物部分是葉盤。10.權(quán)利要求6或7中所述的方法，其中植物部分是來自中脈組織的葉盤。11.權(quán)利要求l-10任一項中所述的方法，其中植物群體是突變體植物的群體、種質(zhì)集合體、轉(zhuǎn)基因植物的群體或突變的細胞懸浮物。12.權(quán)利要求11中所述的方法，其中通過使用化學物質(zhì)和/或輻射進行誘變處理獲得突變體植物的群體。13.權(quán)利要求l-12任一項中所述的方法，其中溫育在水性環(huán)境中發(fā)生。14.權(quán)利要求13中所述的方法，其中水性環(huán)境包括濕潤的濾紙。15，權(quán)利要求13中所述的方法，其中水性環(huán)境包括水或溶液。16.權(quán)利要求14或15中所述的方法，其中水性環(huán)境包含選自L-3，4-二羥基苯丙氨酸、綠原酸、異綠原酸、L酪氨酸和兒茶酚的化合物。17.權(quán)利要求l-16任一項中所述的方法，其中對照植物是當其葉盤在5'C下在兩張濕潤的濾紙間溫育7天時，顯示圍繞邊緣的粉紅色變色的植物。18.顯示減少的損傷誘導的表面變色的植物，所述植物可通過將植物群體經(jīng)歷權(quán)利要求1-17任一項中所述的篩選方法，然后從群體中選擇在篩選中沒有顯示表面變色的或在篩選中顯示與對照植物相比減少的表面變色的植物來獲得。19.權(quán)利要求18中所述的植物，其中植物是蔬菜植物、結(jié)果的植物或開花植物。20.權(quán)利要求19中所述的植物，其中植物是選自萵苣、菊苣、witloof、馬鈴薯、甘薯、塊根芽菜、蘑菇、朝鮮薊和茄子的蔬菜植物。21.權(quán)利要求19中所述的植物，其中植物是選自蘋果、香蕉、聘梨、桃子、梨子、杏子和芒果的結(jié)果的植物。22.權(quán)利要求19中所述的植物，其中植物是選自大丁草和菊花的開花植物。23.權(quán)利要求18中所述的植物，所述植物屬于菊科，特別地屬于萵苣屬和更特別地屬于萵苣種。24.權(quán)利要求18中所述的植物，所述植物屬于菊苣屬，特別地屬于菊苣和苦苣種。25.權(quán)利要求18-24任一項中所述的植物，其中植物顯示減少的損傷誘導的葉變色和沒有顯示負面的多效性。26.權(quán)利要求18-20和23任一項中所述的植物，所述植物是其種子按在表1中所列的日期和登錄號由NCIMB保藏的萵苣植物。27.權(quán)利要求18-25任一項中所述的植物，所述植物可通過將權(quán)利要求26中所述的植物與相同種的另一植物雜交來獲得。28.權(quán)利要求18-27任一項中所述的親本植物的后代，所述后代顯示如在親本植物中發(fā)現(xiàn)的損傷誘導的葉變色的不存在或減少。29.權(quán)利要求18-28任一項中所述的植物的部分。30.權(quán)利要求29中所述的部分，所述部分選自葉、頭、莖、枝、根、塊莖、果實、花、種子或其碎片和細胞。31.權(quán)利要求29或30所述的部分，所述部分可通過權(quán)利要求1-17任一項中所述的方法獲得。32.從權(quán)利要求29、30或31中所述的植物部分再生的植物，所述植物顯示如在親本中發(fā)現(xiàn)的損傷誘導的葉變色的不存在或減少。33.權(quán)利要求18-28以及32任一項中所述的植物的種子。34.來自于權(quán)利要求33中所述的種子的后代，所述后代顯示在親本中發(fā)現(xiàn)的不存在或減少的損傷誘導的葉變色。35.蔬菜產(chǎn)品，其包括權(quán)利要求18-20、23-34任一項中所述的蔬菜植物或其部分。36.權(quán)利要求35中所述的蔬菜產(chǎn)品，其中蔬菜是葉類蔬菜。37.權(quán)利要求36中所述的蔬菜產(chǎn)品，其中蔬菜選自萵苣、苦苣和菊苣。38.權(quán)利要求37中所述的蔬菜產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品是加工的萵苣、加工的菊苣、加工的苦苣或其組合。39.來源于權(quán)利要求18-19、21、28-34任一項中所述的植物的果實。40.來源于權(quán)利要求18-19、22、28-34任一項中所述的植物的花。41.權(quán)利要求38-41任一項中所述的產(chǎn)品，其中當在權(quán)利要求l-n任一項中所述的方法中進行篩選時，產(chǎn)品沒有顯示或顯示有限的損傷誘導的葉變色。全文摘要本發(fā)明涉及用于針對其中存在的個體篩選植物或植物部分的群體的方法，所述個體與對照植物或植物部分相比，顯示減少的損傷誘導的表面變色，所述方法包括提供植物群體或來自群體的植物的部分；在待篩選的植物或植物部分以及對照植物或植物部分上產(chǎn)生損傷表面；溫育損傷表面以允許在其內(nèi)或其上面發(fā)生變色；在植物或植物部分內(nèi)或上面觀察損傷表面變色；將觀察到的待篩選的植物或植物部分內(nèi)或上面的損傷表面變色與在對照植物或植物部分上或內(nèi)觀察到的變色進行比較。本發(fā)明還涉及所選擇的植物。文檔編號A01H1/04GK101404873SQ200780006117公開日2009年4月8日申請日期2007年1月8日優(yōu)先權(quán)日2006年1月6日發(fā)明者C·M·P·范登申請人:瑞克斯旺種苗集團公司