血小板分析系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】診斷患者的血清或血漿樣品中的HIT(肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥)的方法以及包括進行該方法的試劑盒的系統(tǒng)。系統(tǒng)包括試劑，以設(shè)計用于特定血小板分析的診斷試劑盒的形式；系統(tǒng)可以進一步包括專用的、簡單和容易使用的儀器，諸如血細胞計數(shù)器，適合于進行所述分析。分析系統(tǒng)主要用于測試血小板或與血小板反應(yīng)的自身抗體或同種抗體，在與血小板功能障礙和流血傾向相關(guān)的特定和重要的臨床狀況、和導(dǎo)致血栓形成的高凝固性中。另外，血小板功能容量的測試包括對于興奮劑和抑制劑的應(yīng)答、和血小板激活標志物，其作為持續(xù)、體內(nèi)血栓形成前活性的指示物。
【專利說明】血小板分析系統(tǒng)
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及血小板分析系統(tǒng)，包括用于血小板相關(guān)的臨床癥狀的診斷的特定試劑盒，和任選地包括血小板分析儀。
【背景技術(shù)】
[0002]在普通人群中血液凝固障礙是最常見的臨床問題之一。稱為“高凝固性”或“血栓形成傾向”的凝固的增加趨勢是發(fā)病率和死亡率的主要原因。
[0003]在美國每年有大約500，000血栓形成事件，其中保守估計每年100，000死亡-大于AIDS、乳腺癌和交通事故合并相關(guān)的死亡發(fā)生。另外，毎年一百一十萬心肌梗死和多于150,000中風(fēng)死亡發(fā)生。
[0004]在癌癥患者中，血栓形成是在惡性腫瘤自身之后的第二致死的原因。然而，只有在血栓形成事件出現(xiàn)之后，才給予治療。
[0005]在女性中，高凝固性是妊娠血管并發(fā)癥的主要危險因素，妊娠血管并發(fā)癥包括:血栓形成，重度先兆子癇，子宮內(nèi)生長受限和胎兒死亡，和分娩后的血栓形成或激素治療后的血栓形成。根據(jù)最近的文獻，在發(fā)達國家，分娩后女性死亡的主要原因是急性肺血栓栓塞癥。
[0006]另ー個問題是與血小板相關(guān)的出血的增加趨勢，其在一般人群中也是常見的。大約25%的具有月經(jīng)過多-増加的月經(jīng)出血-的女性具有這種異常。
[0007]涉及血栓形成和出血的發(fā)病機制的主要因素是循環(huán)血液的血小板。
[0008]血小板的性質(zhì)可以通過流式細胞術(shù)測量。
[0009]流式細胞術(shù)(縮寫為:FCM)是計數(shù)和檢查微觀粒子的技術(shù)，諸如細胞，通過將細胞懸浮在流體的流中和通過電子檢測裝置使它們通過。它允許毎秒多至數(shù)千個顆粒的物理和/或化學(xué)特征的同時多參數(shù)的分析。流式細胞術(shù)在健康病癥諸如血癌的診斷中常規(guī)地使用。
[0010]單波長的光束(通常為激光)對準到液體的流體聚焦的流之上。多個檢測器瞄準在流通過光束的點:ー個與光束一致(正向散射或FSC)和數(shù)個垂直于它(側(cè)向散射或SSC)以及ー個或多個熒光檢測器。每個穿過光束的0.2-150微米的懸浮粒子散射光線，和顆粒中找到或附著于顆粒的熒光化學(xué)品可以激發(fā)成為比光源波長更長的發(fā)射光。散射和熒光的這種組合被檢測器獲得，和通過分析在每個檢測器(一個用于每個熒光發(fā)射峰)的光強度波動，然后可能得到關(guān)于每個單獨的顆粒的物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)的各種類型的信息。FSC與細胞體積相關(guān)和SSC取決于顆粒的內(nèi)部復(fù)雜性(即，細胞核的形狀，細胞質(zhì)顆粒的量和類型或細胞膜粗糙度)。這是因為散射掉細胞的內(nèi)部組分的光)。也參見:Tomer A [TomerA2004], [Tomer A 等人，1988], [Tomer A 等人，1989a]對于血液的 FCM 的一般介紹。
[0011]現(xiàn)代的流式細胞儀能夠分析“實時”地毎秒分析數(shù)千個顆粒，和可以主動分開和分離具有特定性質(zhì)的顆粒。流式細胞儀類似于顯微鏡，除了不產(chǎn)生細胞的圖像之外，流式細胞術(shù)提供設(shè)定參數(shù)的“高通量”(大數(shù)量的細胞)自動定量。對于細胞分離和分析的進ー步一般介紹，參見 Tomer A [Tomer A, 2002],.[Tomer A 等人，1987]。[0012]現(xiàn)代儀器常常具有多個激光和熒光檢測器。増加的激光和檢測器的數(shù)量允許多個抗體標記，和可以通過它們的表型標記可以更精確地識別目標群[Tomer A, 2004] 0
[0013]由流式細胞儀生成的數(shù)據(jù)可以ー維作圖產(chǎn)生直方圖，或以二維點圖作圖。通過產(chǎn)生一系列的子集提取，它們稱之為“門”，在這些圖上的區(qū)域基于熒光強度順序地分開。
[0014]以下出版物描述了在血小板上進行的試驗，涉及血細胞計數(shù)。
[0015]SCRIPPS RESEARCH INST[US]的US5656442描述了表征血小板聚集缺陷的方法。在一個實施例中，格蘭茨曼血小板無カ癥的CAM變體表征為具有配體結(jié)合缺陷。在另ー個實施例中，具有骨髓纖維化的患者確定為具有激活缺陷。通過熒光激活的流式細胞術(shù)進行分析。系統(tǒng)包括外殼，在分開容器中:(a)與激活血小板結(jié)合的激活特異性配體(ASL)；(b)在正常血小板上形成配體誘導(dǎo)的結(jié)合位點(LIBS)的激活獨立配體(AIL)，其中所述激活獨立配體包括選自以下的多肽序列:RGD，LGGAKQAGDV (SEQ ID NO:1),和KQAGDV (SEQ IDN04): (c)抗LIBS抗體；和(d)血小板激動劑。
[0016]BERG DAVID和BERG LOIS HILL [US]的W003028627描述了包括通過流式細胞術(shù)測定纖維蛋白原、凝血酶原組分1+2、凝血酶/抗凝血酶復(fù)合物、可溶纖維蛋白単體的激活水平的試驗的方法。在五次分析的任何兩次中偏離正常值用于診斷慢性疲勞綜合征、纖維肌痛、或與凝固應(yīng)答的激活相關(guān)的其它疾病。沒有提供關(guān)于血小板激活的測量的細節(jié)。
[0017]PPD BIOMARKER DISCOVERY SCIENCES, LLC 的 US2005214877 描述測量包括血小板的樣品中血小板表面蛋白質(zhì)的量的方法，包括以下的步驟:(a)將樣品與具有抗凝劑和至少ー種血小板激活抑制劑的血小板穩(wěn)定組合物接觸；(b)用對于血小板表面蛋白質(zhì)和血小板刺激因子具有特異親和力的標記化合物溫育樣品；和(c)通過血細胞計數(shù)(例如，微體積激光掃描血細胞計數(shù))檢測結(jié)合到血小板的標記化合物，由此可以測量血小板表面蛋白質(zhì)的量。?
[0018]HECHINGER MARK [US]的US2003194818描述利用流式細胞術(shù)、涂布乳膠微球、和熒光染料標記的抗體同時檢測樣品中的ー種或多種分析物的存在和量的免疫分析方法和裝置。通過結(jié)合FALS和熒光，使用數(shù)種不同尺寸、顔色或形狀的珠子，每種珠子涂布不同的分析物，用于同時檢測樣品中的ー種或多種分析物和細胞成分諸如血小板。
[0019]HECHINGER M ARK [US]的US2003032068描述類似方法和裝置，涉及血小板Ig陽性對照試劑和分析，其具有每個患者的熒光陽性區(qū)域的設(shè)置。血小板對照大小適合于安裝在血小板和紅細胞之間，目的是使得它作為真實的生物對照是理想的。
[0020]然而，盡管血小板異常的臨床重要性,仍然存在血小板分析系統(tǒng)和方法的沒有滿足的需求，其使得臨床醫(yī)生容易診斷與血小板相關(guān)的各種醫(yī)療狀況。這些狀況包括引起流血的血小板功能異常和持續(xù)的血液凝固性過高活性，其可以導(dǎo)致血管閉塞和血栓形成，和在孕婦中導(dǎo)致胎盤血管并發(fā)癥和胎兒死亡。目前使用的血小板分析方法具有某些方法學(xué)和實踐限制，因此通常提供如以下具體說明的不完整的臨床信息。
[0021]免疫性血小板減少癥(IT)是以抗體介導(dǎo)的加速血小板破壞為特征的病癥[George JN和Rizvi MA], [Tomer A等人1991]。盡管是臨床重要的癥狀，它的診斷由于缺少常規(guī)臨床使用的可行和可靠的分析目前被限制。因此，目前診斷通?；谥饕ㄟ^排除推斷的臨床印象，參見[Neunert C等人]，[Provan D等人],盡管患者表現(xiàn)有時是復(fù)雜的。
[0022]而且，疑似傳染病的患者可能接受經(jīng)驗療法諸如高劑量皮質(zhì)激素類，其可能就有明顯的副作用，或高劑量的靜脈注射免疫球蛋白，其是昂貴的治療選擇。
[0023]測定總的抗血小板或血小板結(jié)合抗體的方法-類似于紅細胞的抗球蛋白試驗ー已經(jīng)證明是沒用的，由于血小板不同于紅細胞表達Fe-受體和自然地結(jié)合循環(huán)的抗體。
[0024]可以用于確定自身免疫性血小板減小的現(xiàn)有方法，諸如ELISA型試驗(MAIPA)，具有顯著的方法學(xué)和實踐限制，具有有限的特異性，是人工密集型的(得到結(jié)果需要三天)和需要高度專業(yè)得到結(jié)果[Chong BH, Keng TB], [Cines DB, Blanchette VS], [McMillan R,等人2003]。因此，它們對于診斷常常不可用的。
[0025]而且，這些分析沒有批準用于自身免疫性血小板減小的診斷。
[0026]由于這些原因，美國血液學(xué)會沒用表明或推薦用于IT診斷的確認實驗室分析[Neunert C 等人],[Provan D 等人]。
[0027]重要需要說明的是，如由Chong和Keng表明，雖然不要求確認試驗(如，例如APS的診斷所要求的)的原因是還沒用足夠高靈敏和特異性的可靠試驗。而且，基于排除的診斷具有潛在的問題[Cines DB, Blanchette VS], [McMillan R,等人2003],針對血小板專一受體的循環(huán)抗體的存在的直接實驗室確認將是臨床有幫助的[Chong BH, Keng TB]、[CinesDB,Blanchette VS]、[McMillan R,等人 2003]。[0028]APS是影響年輕和中年個體的獲得性凝固性過高的狀態(tài)。綜合癥與動脈和靜脈血栓形成相關(guān)，和在婦女中與反復(fù)流產(chǎn)有夫。國際診斷標準需要臨床事件的出現(xiàn)，和證明在患者的血液中的自身免疫抗體與天然磷脂反應(yīng)[Miyakis S，等人]?，F(xiàn)在的診斷實驗室分析是不同程度的方法學(xué)和實踐限制的[Wong RC, Favaloro EJ]。如在這個文獻中說明“雖然過去和持續(xù)的努力，對于主要抗磷脂抗體(aPL)_即抗心磷脂(aCL)-、抗(62糖蛋白1、和狼瘡抗凝物(LA)的分析的結(jié)果存在顯著的變異”，和“然而，由于缺少高質(zhì)量的公開證據(jù)，存在對于專家意見的高度依賴性，并且因此現(xiàn)有的aPL試驗和報道的共識指南主要基于證明而不是基于證據(jù)”。
[0029]另ー個主要問題是實驗室發(fā)現(xiàn)與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性不是完全明顯。例如，根據(jù)數(shù)個研究，約15%_17%的具有病毒感染的兒童證明是APS假陽性試驗。在最近的報道研究[deGroot]中，世界專家報道>30%的APS樣品的誤診斷，APS樣品由他送給完善的臨床實驗室。關(guān)于假陽性和假陰性結(jié)果，也參見[Merriman E等人]、[Aboud M等人]、[Pellegrino NMand Caccavo D]、[Bizzaro N 等人]、[Martorell JR 等人]、[Koike T 等人]、[Rusnak 等人]、[Lakos G and Teodoescu M]、[Moore GW 等人]、[Pengo V 等人]、[de Larranaga G 等人]、[Asherson等人]、[Zhu WF等人]、[Uthman Iff等人]、[Bernard C等人]對于方法學(xué)的限制，包括假陽性和假陰性等等。重要的是需要說明的是因為常規(guī)使用的實驗室試驗的這些方法學(xué)的限制，當(dāng)它們結(jié)果是陽性吋，國際指南要求分開地重復(fù)12周的試驗[MiyakisS等人]。
[0030]肝素是用于處理和預(yù)防血栓形成的標準的抗凝血劑療法。肝素誘導(dǎo)的血小板減少和血栓形成(HIT)，是可以在對于肝素敏感的患者中形成的免疫介導(dǎo)的嚴重并發(fā)癥。用全劑量的肝素處理的約5%的患者形成HIT。顯示HIT的約50%的患者形成血栓形成,一半具有嚴重的發(fā)病率和死亡。診斷HIT具有嚴重的臨床困境。目前，需要快速臨床決定以立即停止肝素和開始可選的抗凝血劑療法，適合于具有HIT的患者[Sheridan D,等人]、[KeltonJG,等人]、[Chong BH.]、[Alving B.]、[Aster RH.]、[Thielmann M 等人]。[0031]基于檢測肝素-血小板-因子4種復(fù)合物的抗體的現(xiàn)在方法諸如ELISA和凝膠粒子分析(例如，PaGIA)具有某些方法學(xué)和實踐限制。
[0032]通過這些方法可以檢測抗體，然而，在多至30%的用肝素處理的患者僅5%顯示臨^ HIT [Sheridan D,等人]、[Kelton JG,等人]。另外，這些分析具有>10%范圍的假陰性[Alving B.]、[Arepally G,等人，]、[Hirsh J.等人]、[Visentin GP 等人]，它們僅檢測肝素血小板4種復(fù)合物，它們不是在所有患者中都形成。另外，多至80%的假陽性結(jié)果可能在具有自身免疫APS的患者中出現(xiàn)，即，患者在一方面將終生進行不必要治療，而在另一方面回避了需要的治療[Pauzner R,等人]。
[0033]功能性血小板聚集分析(HIPA)是復(fù)雜的，需要多個正常的供體(通常四個)，具有低的靈敏性[Thielmann M等人]、[Chong BH等人]、[Favoloro EJ等人]和低的重復(fù)性。而且，它包括血小板清洗步驟，已知引起血小板激活的操作因此不可避免地混淆分析結(jié)果。
[0034]功能、放射活性血清素-釋放分析(SRA)認為是金標準，然而，它是不切實際的，和在有限的研究實驗室之外是不可用的[Sheridan等人]、[Kelton JG等人]、[Alving B]、[Arepally G等人]、[Visentin GP等人]、[Favoloro EJ等人]。因此,為了克服這些上述限制，我們研發(fā)了實際、快速、靈敏和特異性功能流式細胞學(xué)方法用于診斷HIT。功能性方法測定了在肝素存在下誘導(dǎo)血小板激活的患者的血清/血小板的容量-類似于金標準放射活性SRA的概念。
[0035]15年前描述了使用流式細胞術(shù)的另ー個方法[Tomer A, 1997]。然而，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種方法需要高度的專門技術(shù)，它在常規(guī)臨床實驗室中是不可得的。
[0036]血小板的止血功能的缺陷導(dǎo)致流血傾向-這在普通人群中不是不常見的。因此，血小板功能的測試是重要的臨床評價。
[0037]濁度聚集血小板功能評價方法是測試血小板功能的經(jīng)典和最常見的方法，使用了約50年。它是基于懸浮液中血小板的刺激和用磁鐵攪拌以形成血小板聚集，與完全的懸浮液相比，它允許更多的光透視。更現(xiàn)代的儀器-雖然不是非常常見-是西門子公司的PFA100，它模擬讀數(shù)的方法中差別的這種反應(yīng)。PFA-100將血液樣品吸入一次性測試卡中，通過微小的孔徑切ロ進入在毛細管末端的生物活性膜?？ǖ哪ね坎寄z原和腺苷二磷酸(ADP)或者膠原和腎上腺素，誘導(dǎo)血小板塞形成，其關(guān)閉了孔。
[0038]通常應(yīng)用的方法使用相對高劑量的興奮劑以實現(xiàn)終點結(jié)果，因此不能夠測試血小板激活過程的三個階段，導(dǎo)致最后的聚集，如該方法在此描述那樣，這對于血小板功能紊亂的診斷是重要的。
[0039]另外，使用高劑量的刺激物去掉了檢測輕度到中度功能紊亂的可能性，諸如在血小板忙存庫疾病中出現(xiàn)[BS Coller和DL French], [Shattil SJ等人]，[FitzgeraldR, Pirmohamed M.]。這些方法也不能夠檢測ー些血小板功能病癥，諸如斯科特綜合癥和其它病癥[BS Coller 和 DL French], [Shattil SJ 等人]。
[0040]血小板在正常的止血中起到關(guān)鍵的作用。對于它們功能最重要的是膜糖蛋白(GPs)，它們指定涉及血小板粘附和聚集的關(guān)鍵的配體相互作用，對于正常止血是必要的。
[0041]先天的血小板功能障礙是遺傳性流血病癥，其可能產(chǎn)生于血小板糖蛋白-受體異常。因此，這些病癥與過量流血有夫，特別是從皮膚和粘膜流血。Berard-Soulier綜合征和血小板無カ癥是血小板-受體缺陷的主要先天性失常[BS Coller和DL French], [ShattilSJ 等人],[Fitzgerald R, Pirmohamed M.]。
[0042]Berard-Soulier綜合征產(chǎn)生于GP Ib-1X(CD42)復(fù)合物中的缺陷，其起到作為血管假性血友病因子(vWF)的結(jié)合位點的功能，它反過來介導(dǎo)血小板連接到內(nèi)皮下膜的組分，由于損傷暴露于血管壁[BS Coller 和 DL French]、[Nurden A, Nurden P.] > [Harold RRobert and Alice D Ma]、[Shattil SJ 等人]。
[0043]這種綜合征也與血小板減小相關(guān)。因此，它常常與免疫性血小板減少癥(IT)混淆，例如，當(dāng)與圖13-14中示出的源頭病人一起出現(xiàn)時，他計劃準備不必要的外科手術(shù)-脾切除木。在這里需要重點說明的是，像這種的ー些血小板病癥有時需要多于一次試驗來獲得正確的診斷-諸如在現(xiàn)有的情況中排除IT。因此，在這里建議的血小板分析系統(tǒng)僅是用于評估血小板病癥的的ー種系統(tǒng)。
[0044]血小板無カ癥產(chǎn)生于主要的血小板功能受體GPII/IIIa(⑶41a)的缺陷，其對于纖維蛋白原-介導(dǎo)的血小板聚集是必要的[BS Coller和DL French]、[Shattil SJ等人]、[Fitzgerald R, Pirmohamed M.」。
[0045]阿司匹林抑制花生四烯酸途徑酶環(huán)氧酶I，C0X-1)，其需要用于在凝固過程中形成血小板前列腺素興奮劑血栓素A2。
[0046]噻吩并吡啶作用劑特異性和不可逆地抑制ADP受體的P2Y12亞型，其對于血小板激活和聚集是重要的[Shattil SJ等人]。
[0047]目前的臨床指南對于以下推薦用血小板抑制劑慢性治療:所有的冠狀動脈疾病(CAD)、周圍性血管疾病(PVD)、包括腦循環(huán)限制的心腦血管疾病(CVD)的患者，短暫腦缺血發(fā)作(TIA)、或中風(fēng)的患者；眼睛中視網(wǎng)膜血管血栓形成，血管血管形成術(shù)(諸如通過導(dǎo)管的冠狀動脈擴張-具有或不具有支架)，和具有血管閉塞和血栓形成的風(fēng)險的其它種類的患者。
[0048]盡管如此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有復(fù)發(fā)性血栓形成的多種患者對于這些作用劑的應(yīng)答不具有足夠的應(yīng)答，綜合征稱之為〃阿司匹林抵抗〃 [Fitzgerald R, Pirmohamed M.]、或lopidogrel resistance [Qureshi Z, Hobson AR.」。
[0049]有對于包括儀器和診斷試劑盒的診斷的實際系統(tǒng)的需求。提出的系統(tǒng)應(yīng)該允許可行性和高度信息化的實驗室分析的性能。分析對于最常見的血小板相關(guān)的病癥應(yīng)該是高度可靠的和能夠提供有用的醫(yī)療信息。
[0050]在設(shè)計系統(tǒng)中特定的目標是提供測定循環(huán)的血小板激活標志物的高度需要的試驗，該標志物作為持續(xù)、體內(nèi)血栓形成前活性的指示物。這些試驗通過臨床凝固實驗室中的通常使用的血小板分析方法是不可得的。
[0051]所有提出的分析是對于臨床實驗室中日常使用的優(yōu)化、簡化、精確和調(diào)節(jié)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0052]根據(jù)一方面，提供循環(huán)血小板的綜合分析的系統(tǒng)和方法，用于診斷常規(guī)臨床實驗室中血小板相關(guān)的病癥。
[0053]該系統(tǒng)包括試劑，以設(shè)計用于特定血小板分析的診斷試劑盒的形式；該系統(tǒng)可以進ー步包括專用的、簡單和容易使用的儀器，諸如血細胞計數(shù)器，適合于進行所述分析。
[0054]分析系統(tǒng)主要用于測試血小板或與血小板反應(yīng)的自身抗體或同種抗體，在與血小板功能障礙和流血傾向相關(guān)的特定和重要的臨床狀況、和導(dǎo)致血栓形成的高凝固性中。另外，血小板功能容量的測試包括對于興奮劑和抑制劑的應(yīng)答、和血小板激活標志物，其作為持續(xù)、體內(nèi)血栓形成前活性的指示物。系統(tǒng)也能夠診斷與免疫和抗體介導(dǎo)的病癥諸如免疫性血小板減少癥相關(guān)的特定的醫(yī)療狀況。
[0055]使用該系統(tǒng)，試驗方法特別適合于測試以下的ー種或多種:
[0056]a.體內(nèi)的血小板激活狀態(tài)，作為持續(xù)血栓形成前活性的標志物(其可以導(dǎo)致血栓形成)，在包括心血管、腦血管和周圍血管疾病、糖尿病、癌癥和具有血管并發(fā)癥的懷孕的各種臨床狀況中。
[0057]b.特定的抗體介導(dǎo)的狀況，包括i)肝素誘導(dǎo)的血小板減少，ii)自身-免疫性血小板減少癥(ITP)，iii)同種免疫性血小板減少癥，例如，新生兒同種免疫性血小板減少癥-NAIT，iv)輸血后紫癜-PTP，和V)抗磷脂抗體綜合征(APS)中的抗血小板磷脂自身抗體的存在。
[0058]c.血小板功能容量:應(yīng)答各種興奮劑(激動劑)_定量評價抗血小板藥物的抑制作用，在心臟和血管疾病的患者的臨床護理中廣泛使用，包括阿司匹林和氯吡格雷-定量評價；
[0059]d.先天性血小板功能缺陷諸如Berard-Soulier綜合征和血小板無カ癥，以及與流血病癥(過量流血的傾向)相關(guān)的其它缺陷。
[0060]檢測方法:ー種基本診斷方法包括進行標準的流式細胞術(shù)-優(yōu)選地使用相對小、專用的儀器。然而，專用方法可以使用檢測抗體或蛋白質(zhì)(例如，膜聯(lián)蛋白A5)結(jié)合的其它技術(shù)，諸如化學(xué)發(fā)光、凝膠顆粒聚集分析和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)/在材料表面或在塑料顆粒上固定抗體或抗原的固相分析。
[0061]檢測信號可以表示為熒光、光`、顔色或者顆粒的聚集。
[0062]試驗的樣品可以是全血或者血小板，例如，血小板富集的血漿(PRP),所有固定和非固定的。
[0063]系統(tǒng)和方法包括以下的分析:
[0064]1.血小板免疫力，包括i)自身免疫性血小板減少癥(ITP)，ii)同種-免疫性血小板減少癥，例如新生兒-同種免疫性血小板減少癥-NAIT，和輸血后紫癜-PTP ；
[0065]2.抗血小板磷脂自身抗體的APLA/APS或休斯綜合征(抗磷脂抗體綜合征)；
[0066]3.HIT (肝素誘導(dǎo)的血小板減少)，用于患者的抗體的容量，在肝素存在下引起血小板激活；
[0067]4.血小板功能-包括標記血小板，表明:i)應(yīng)答血小板聚集GPIIb/IIIa(⑶41a)的主要血小板功能受體的刺激，ii)來自增強其活性的血小板顆粒的活性介質(zhì)的血小板釋放反應(yīng)(應(yīng)答激活)，和iii)促凝血活性的表達，即，凝血酶生成和血栓過程的增強；
[0068]5.血小板功能受體缺陷/異常-例如，血小板無カ癥Berard-Soulier綜合征，以及其它遺傳性血小板功能障礙；
[0069]6.血小板功能抑制-測量抗血小板藥物對于血小板功能的抑制作用，例如,檢測對于阿司匹林或氯吡格雷的抵抗-定量分析，和
[0070]7.循環(huán)中血小板激活標志物，作為持續(xù)、體外、血栓前活性的指示物。
[0071]分析特別可應(yīng)用于具有與血栓形成的高風(fēng)險相關(guān)的患者，包括:[0072]冠狀動脈疾病(CAD)諸如心絞痛-穩(wěn)定或不穩(wěn)定，急性冠脈綜合征(ACS)-或心肌梗塞后(MI);周圍血管疾病(PVD)，心腦血管病(CVD)，包括腦循環(huán)狀況諸如短暫腦缺血發(fā)作(TIA)、或中風(fēng)的患者；糖尿病-其與血管疾病高度相關(guān)；妊娠高血壓癥，包括與血栓形成、胎兒生長限制和胎兒死亡相關(guān)的先兆子癇；血栓易形成風(fēng)險-因素，包括:抗磷脂抗體綜合征(APS、APLA)、FV-萊頓突變、FII突變、抗凝血蛋白質(zhì)缺陷:蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S和ATIII ;在抗凝血療法諸如華法林的停止之前和之后的持續(xù)血栓前活性，和癌癥-用于預(yù)測血栓形成和提供預(yù)防措施。
[0073]需要重點說明的是，在基因型和表型的臨床表現(xiàn)之間可能存在高度的差異，因此需要活性高凝固態(tài)的功能測定。
[0074]這些分析的總的目的是臨床上能夠?qū)崿F(xiàn)處于風(fēng)險的患者的識別，和能夠使醫(yī)生根據(jù)試驗結(jié)果提供。
[0075]標志物:分析中的標志物例如適合于通過流式細胞術(shù)(FCM)或化學(xué)發(fā)光測量方法檢測。
[0076]可以使用血小板標志物，包括用于以下表達的血小板相關(guān)的顆粒:a)促凝血活性-使用膜聯(lián)蛋白A5探針；血小板反應(yīng)蛋白、和纖維蛋白原結(jié)合；b)釋放后反應(yīng)-例如，使用抗P-選擇素(CD62p)、抗CD63 ；c)激活血小板表面上的GPIIb/IIa(CD41a)受體。
[0077]可以形成血小板-單核細胞(PMC)、和血小板-粒細胞復(fù)合物，和使用用于診斷的特定單克隆抗體檢測。
[0078]化學(xué)發(fā)光測量的標志物-可以包括以下的標志物:血小板因子4(PF4)&血小板β-血小板球蛋白(P-TG)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、纖維蛋白D- 二聚體，和激活的血小板和血小板相關(guān)的顆粒。
[0079]根據(jù)一方面，提供診斷患者的血清或血小板樣品中的HIT(肝素誘導(dǎo)的血小板減少)的方法，該方法包括:
[0080]階段A，包括:
[0081]溫育由以下組成的第一PI (患者I)樣品:患者的樣品的第一等分試樣與第一健康個體的PRP，和生理相容緩沖液，條件是緩沖液既不含有鈣離子也不含有鎂離子；
[0082]溫育由以下組成的第一 PIH(使用肝素的患者I)樣品:患者的樣品的第二等分試樣與所述PRP，肝素和緩沖液；
[0083]溫育由以下組成的第一 NC(正常對照)樣品:健康個體的血漿或血清樣品的第一等分試樣與所述PRP，和緩沖液；
[0084]溫育由以下組成的第一 NCH(使用肝素的正常對照):健康個體的血漿或血清的第二等分試樣與所述PRP，肝素和緩沖液；
[0085]階段B，包括:
[0086]溫育由以下組成的第二 PI樣品:第一 PI樣品的等分試樣，由以下組成的第二 PIH樣品:第一PIH樣品的等分試樣，和由以下組成的第二NC樣品:第一NC樣品的等分試樣，和由以下組成的第二 NCH樣品:第一 NCH樣品的等分試樣,姆個具有:第一標記,第一標記能夠同時標記肝素激活和非肝素激活血小板，第二標記，第二標記能夠標記由肝素激活的血小板，和緩沖液；
[0087]階段C，包括:[0088]在每個第二樣品中，通過測量第一標記測量第二樣品中每ー個的類似量的血小板；
[0089]在每個所述類似量的血小板中，通過測量由肝素激活的血小板上的第二標記的量，測量肝素激活的血小板的量；
[0090]計算以下之間的差:來自第二 PIH樣品的激活的血小板的量和來自第二 PI樣品的激活血小板的量之間，和來自第二 NCH樣品的激活血小板的量和來自第二 NC樣品的激活血小板的量之間，和
[0091]比較所述第二 PIH和第二 PI樣品的所述差，和所述第二 NCH和所述第二 NC樣品的所述差，
[0092]其中當(dāng)所述第二 PIH和第二 PI樣品的所述差顯著大于所述第二 NCH和所述第二NC樣品的所述差時，患者的樣品中診斷為HIT。
[0093]選擇所述第二 PIH和第二 PI樣品的所述差是比所述NCH和所述第二 NC樣品的所述差顯著大的，例如，大至少2.5倍。
[0094]第一標記例如是血小板受體GPIIb/IIIa的標記。
[0095]在一些實施方式中，第二標記是由肝素激活的血小板表達的P-選擇素⑶62p的熒光標記的單克隆抗體，該方法包括通過結(jié)合到激活血小板的第二標記測量熒光的強度。
[0096]肝素激活的血 小板的量每個可以通過每個類似量的總血小板群的所述第二標記平均總熒光測量。
[0097]在一些實施方式中，方法進ー步包括:
[0098]通過設(shè)定標志物在2.5%(正態(tài)分布的2SD)的類似量的NC的熒光測量的高-CD62p-熒光端上，計算激活血小板％ ；
[0099]在所述高-⑶62p熒光端，計算PIH中激活血小板％和PI中激活血小板％之間的讀數(shù)差，和NCH中激活血小板％和NC中激活血小板之間的讀數(shù)差,和
[0100]比較PIH和PI與NCH和NC樣品的所述差，其中陽性結(jié)果是PIH和PI的差顯著大于NCH和NC差。
[0101]PIH和PI的差例如比NCH和NC差大超過2.5倍。
[0102]在優(yōu)選的實施方式中，血漿或血清樣品不多于IOiiし
[0103]階段B優(yōu)選地進ー步包括:溫育由以下組成的TRAP樣品:TRAP、第一標記、第二標記、和緩沖液，和階段C進ー步包括測量TRAP樣品中的激活血小板的量。
[0104]在一些實施方式中，階段A可以進ー步包括:
[0105]溫育由以下組成的第一 PC(陽性對照)樣品:具有HIT的個體的血漿或血清樣品與的第一等分試樣與所述PRP，和緩沖液；
[0106]溫育由以下組成的第一 PCH樣品:具有HIT的個體的血漿或血清樣品的第一等分試樣與肝素，所述PRP，和緩沖液；
[0107]和階段B進ー步包括:
[0108]溫育由以下組成的第二 PC樣品--第一 PC樣品的等分試樣，和由以下組成的第二PCH樣品:第一 PCH樣品的等分試樣,姆個具有:第一標記,第二標記,和緩沖液；
[0109]和階段C進ー步包括:
[0110]計算第二 PCH樣品中激活血小板％和第二 PC樣品中激活血小板％之間的差別，和[0111]比較所述第二 PIH和第二 PI樣品的所述差與所述第二 PCH和所述第二 PC樣品的所述差，
[0112]其中當(dāng)所述第二 PIH樣品和第二 PI樣品的所述差類似于所述第二 NCH和所述第二 NC樣品的所述差時，患者的樣品中進ー步診斷為HIT。
[0113]階段A中的溫育可以是約I小時和階段B中的溫育可以是約15分鐘。
[0114]第一 PIH和NCH樣品中的肝素的濃度典型地為0.1和0.5IU/mL之間。
[0115]優(yōu)選地，肝素的濃度為約0.3IU/mL。
[0116]優(yōu)選地，緩沖液沒有鈣和鎂的PBS。
[0117]在一些實施方式中,第一標記是突光標記的單克隆抗體抗血小板CD41a。
[0118]根據(jù)另ー方面，提供包括以下方法中的至少ー個的方法在測定患者的血小板相關(guān)的狀況中使用:
[0119]如上述診斷HIT;
[0120]患者的血清或血楽;樣品中APS診斷，APS診斷包括:
[0121]從不具有APS的個體的血液樣品中制備血小板懸浮液；
[0122]通過暴露血小板中膜磷脂，處理來自不具有APS的個體的血小板；
[0123]用所述處理的血小板溫育患者的樣品，以得到具有暴露的正常血小板的患者的樣品的懸浮液(SPEP)；
[0124]純化未標記的膜聯(lián)蛋白`；
[0125]在pH=9.2，將過量的FITC加入到純化的膜聯(lián)蛋白，形成高度標記的膜聯(lián)蛋白；
[0126]純化高度標記的膜聯(lián)蛋白；
[0127]用所述SPEP溫育純化高度標記的膜聯(lián)蛋白；
[0128]在用膜聯(lián)蛋白溫育的SPEP的子樣品中，測定子樣品中結(jié)合到血小板的高度標記的膜聯(lián)蛋白的量，由此低比例表明所述樣品中的APS ；
[0129]ITP (免疫性血小板減少癥)診斷樣品，ITP診斷包括:
[0130]制備:
[0131]A)患者的抗體:
[0132]將第一表面用MoAb抗血小板特異性受體覆蓋；隨后,用來自正常血小板的溶胞產(chǎn)物溫育覆蓋的第一表面；
[0133]隨后，用患者的樣品等分試樣溫育覆蓋的第一表面和溶胞產(chǎn)物；
[0134]隨后，加入人免疫球蛋白的第二熒光標記的Ab，或:
[0135]B)患者的抗體-血小板特異性抗原復(fù)合物:
[0136]用MoAb抗-血小板特異性抗體覆蓋第一表面；隨后,用來自患者的血小板的溶胞
產(chǎn)物溫育覆蓋的第一表面；
[0137]隨后，加入人免疫球蛋白的第二熒光標記的Ab ；
[0138]C)制備參照:
[0139]用MoAb抗血小板特異性受體覆蓋第二表面；
[0140]隨后，用來自正常血小板的溶胞產(chǎn)物覆蓋第二表面；
[0141]隨后，用正常的血清或血漿溫育覆蓋第二表面和溶胞產(chǎn)物；
[0142]隨后加入人免疫球蛋白的第二熒光標記的AbjP[0143]D)比較吸附到所述溫育第一表面上的第二標記的抗體的第一定量與吸附到所
[0144]述溫育第二表面上的第二標記抗體的第二定量，其中第一定量顯著地多于第
[0145]二定量表明所述樣品中的ITP ;
[0146]診斷樣品的血小板功能，該方法包括:
[0147]A)評估血小板刺激: [0148]I)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每個用血小板糖蛋白的兩個標記的MoAb，以提供患者的標記血小板和正常個體的血小板，第一所述標記的MoAb具有第一帶中的測量，和第二所述標記的MoAb具有第二帶中的測量；
[0149]2)隨后，將ADP或TRAP中每ー個加入到所述樣品，以提供患者和正常個體的刺激標記的血小板；
[0150]3)隨后，通過在所述第一帶中或所述第二帶中測量識別所述樣品中的標記血小板；
[0151]4)隨后，測量患者的所述識別的標記血小板和正常個體的所述識別的標記血小板，其中當(dāng)標記的血小板通過第一帶識別時，所述識別的標記血小板的測量是在所述第二帶中，當(dāng)標記的血小板通過第二帶識別時，所述識別的標記血小板的測量是在所述第一帯中；
[0152]5)其中所述患者的所述識別的標記的血小板的測量等于或大于平均數(shù)+2標準差(2SD)，正常個體的所述標記血小板的所述測量表明患者的所述樣品血小板激活；
[0153]B)評價血小板促凝固:
[0154]I)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每個用血小板糖蛋白標記的MoAb和膜聯(lián)蛋白V ；
[0155]2)隨后，用血小板離子載體溫育每個所述樣品；
[0156]3)隨后，通過測量血小板糖蛋白的標記的MoAb，識別所述樣品中類似量的標記血小板；
[0157]4)隨后，測量在所述類似量的血小板上的膜聯(lián)蛋白V的熒光；
[0158]5)其中患者的血小板的膜聯(lián)蛋白V熒光等于或大于平均數(shù)+2個標準偏差(2SD)，正常個體的血小板的膜聯(lián)蛋白V熒光表明患者的所述樣品中血小板促凝固；
[0159]所述樣品中的Berard-Soulier綜合征診斷，診斷包括:
[0160]I)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每ー個用排除⑶42的血小板特異糖蛋白的第一標記MoAb，和用⑶42的第二標記MoAb ；
[0161]2)隨后，通過測量第一標記MoAb識別所述樣品中的標記血小板，
[0162]3)隨后，由患者的所述識別的標記血小板測量所述第二 MoAb和由正常個體的所述識別的標記血小板測量所述第二 MoAb，
[0163]其中患者的親戚的所述識別的標記的血小板的所述第二 MoAb的測量比正常的小，但是比患者大，表明攜帯者狀態(tài)；
[0164]所述樣品中的血小板無カ癥綜合征診斷，該診斷包括:
[0165]I)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每個用排除⑶41a的血小板糖蛋白的標記MoAb，和用CD41a的MoAb ；
[0166]2)隨后，通過測量排除⑶41a的血小板糖蛋白的MoAb識別所述樣品中的標記的血小板，
[0167]3)隨后，測量患者的所述識別的標記血小板的⑶41a的MoAb和正常個體的所述識別標記血小板的⑶41a的MoAb，
[0168]4)其中⑶41a的MoAb的第一測量等于或小于所述標記的血小板的所述第二熒光的⑶41a的MoAb的測量的平均數(shù)_2個標準偏差(2SD)，表明患者的所述樣品中的血小板無力癥綜合征，以及在表明綜合征和表明正常個體之間中的第一測量表明血小板無カ癥攜帯者；
[0169]所述樣品的藥物抑制效果診斷，診斷包括:
[0170]A)
[0171]I)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每個用血小板糖蛋白⑶41a或CD61、CD62p 和激活 CD41a 的標記 MoAb ；
[0172]2)隨后，用選自以下的一種或多種的興奮劑溫育所述樣品:ADP、花生四烯酸和TRAP ；
[0173]3)通過測量血小板糖蛋白⑶41a的MoAb，識別所述樣品中的標記血小板；
[0174]4)隨后測量血小板糖蛋白⑶62p和患者的所述識別的標記血小板的激活⑶41a以及正常個體的所述識別標記的血小板，
[0175]5)中患者的血小板糖蛋白⑶62p的MoAb的測量等于或小于所述正常個體的血小板糖蛋白CD62p的MoAb的測量的平均數(shù)-2標準偏差(2SD)測量，或者患者的血小板糖蛋白激活⑶41a的MoAb的測量等于或小于所述正常個體的血小板糖蛋白激活⑶41a的MoAb的測量，表明患者的所述樣品中的藥物`抑制效果；
[0176]B).當(dāng)在血小板功能診斷中，測定評估血小板促凝固，其中血小板用鈣離子載體刺激，然后用標記的膜聯(lián)蛋白A5溫育；
[0177]測定循環(huán)血小板或血小板相關(guān)顆粒激活標記，作為持續(xù)、實時體內(nèi)、血栓前活性的指示物，包括:
[0178]I)用ー個或多個標記熒光溫育患者和正常對照血液的等分試樣或PRP樣品；
[0179]血小板和血小板相關(guān)顆粒的免疫檢測的受體特異性MoAb，受體特異性MoAb，排除抗激活CD41a(GPIIb/IIIA)抗體、抗-P-選擇素CD62p抗體的受體特異性MoAb ；
[0180]抗激活CD41a(GPIIb/IIIA)抗體；
[0181 ] 抗-P-選擇素CD62p抗體；
[0182]血小板陰離子-磷脂的膜聯(lián)蛋白A5蛋白用于檢測血小板促凝血活性；
[0183]2)隨后在室溫溫育15-30分鐘，用緩沖液稀釋所述樣品和分析，
[0184]其中患者的樣品的信號水平等于或大于正常的平均數(shù)+2個標準差表明循環(huán)血小板或血小板相關(guān)顆粒的激活。
[0185]根據(jù)還另一方面，提供包括用于進行上述HIT診斷的試劑盒的系統(tǒng)。
[0186]根據(jù)另一方面，提供包括進行上述一種或多種診斷的試劑盒的系統(tǒng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0187]為了更好理解本發(fā)明和顯示他如何可以實現(xiàn)血小板相關(guān)病癥的診斷的效果，現(xiàn)在參照附圖，僅舉例說明。[0188]現(xiàn)在具體詳細地參照附圖，需要強調(diào)的是示出的細節(jié)是只是舉例來說明和為了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的說明性討論的目的，并且為了提供相信是本發(fā)明的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述而提出。在這點上，除了本發(fā)明必要的基本理解，并未試圖更詳細地顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細節(jié)；參照附圖的描述使得本領(lǐng)域技術(shù)人員在實踐中可以以數(shù)種形式如何來具體化。在附圖中:
[0189]圖1.測定血小板特異受體的循環(huán)自身抗體和同種抗體的方法。聚苯乙烯涂布針對血小板特異糖蛋白的單克隆抗體。然后，特異糖蛋白從正常的人血小板提取和固定在微珠的表面。患者血清或血漿用糖蛋白涂布的珠子溫育。然后，洗滌珠子，用第二熒光標記的抗人免疫球蛋白溫育，和分析結(jié)合抗體的水平，與正常對照樣品比較。
[0190]圖2.血小板特異糖蛋白的小鼠單克隆抗體結(jié)合到聚苯乙烯微珠，如上述。在這個對照分析中，與用抗人抗體溫育的對照樣品相比，用抗小鼠抗體顯示高熒光水平。
[0191]圖3.測試ITP患者的實施例結(jié)果?；颊叩难寤蜓獫{育固定在微珠上的血小板CD41a(GPIIb/IIIa)反應(yīng)。特異性是高的，抗體與沒有其它血小板受體糖蛋白反應(yīng)。
[0192]圖4.具有ITP的不同患者的血清或血漿與固定在微珠上固定的血小板CD42b (GPIb)反應(yīng)的示例性結(jié)果。特異性是高的，抗體與沒有其它血小板受體糖蛋白反應(yīng)。
[0193]圖5.測定血小板特異受體的血小板結(jié)合的自身抗體和同種抗體的方法的示意圖。微珠涂布血小板特異糖蛋白的單克隆抗體。然后從患者的血小板提取體內(nèi)形成的抗體-血小板-抗原復(fù)合物和固定在微珠的表面上。然后洗滌珠子，用第二熒光標記的抗人免疫球蛋白溫育，和與正常對照血小板樣品比較，分析結(jié)合的人抗體的水平。
[0194]圖6.由具有ITP的患者的血小板上體內(nèi)形成的抗體-抗原復(fù)合物的分析，顯示結(jié)合到血小板⑶41a(GPIIb/IIIa)復(fù)合物的自身抗體。與正常對照樣品相比，顯示高水平的抗體結(jié)合。FLl表不突光I?！?br> [0195]圖7.血小板特異性受體的循環(huán)同種抗體的分析。來自具有輸血后紫癜-PTP的患者的血清或血漿與血小板⑶41a(GPIIb/IIIa)復(fù)合物和⑶61 (GPIIIa)糖蛋白亞單元反應(yīng)，CD61 (GPIIIa)糖蛋白亞單元是典型的PTP。特異性是高的，沒有抗體與其它血小板受體糖蛋白反應(yīng)。.[0196]圖8.新生兒同種免疫性血小板減少癥-NAIT中的循環(huán)同種抗體的分析:具有NAIT的孕婦顯示她的血清或血漿對小孩或丈夫人-血小板-抗原Ia(HPA-1a)等位基因的反應(yīng)。孕婦是HPA-1b等位基因的純合體。與正常對照相比，顯示非常高的免疫熒光信號。
[0197]圖9顯示具有抗-磷脂-抗體綜合征-APS(Pt)的患者的血清或血漿對于膜聯(lián)蛋白A5結(jié)合到血小板膜磷脂的抑制作用。對于來自正常對照(NC)的血漿沒有觀察到抑制作用。通過流式細胞術(shù)進行分析。
[0198]圖10顯示來自具有APS的患者的血清或血漿的流式細胞術(shù)檢測。與正常對照相比，觀察到患者的樣品的膜聯(lián)蛋白A5結(jié)合到血小板磷脂的顯著減小，與APS的診斷一致。
[0199]圖11描述與正常對照(NC)相比，在APS患者(Pt)中減少的膜聯(lián)蛋白A5結(jié)合到血小板磷脂。在患者和健康對照之間顯示高的分辨率。
[0200]圖12顯示具有肝素誘導(dǎo)的血小板減少(HIT)的患者的樣品的測試。血清/血漿樣品在肝素不存在(0.0)(上圖)和存在(0.3U/mL)(下圖)下用正常血小板溫育。
[0201]A-正常對照；B-陽性對照-HIT對照；C_臨床上疑為HIT的患者?；颊叩臉悠?C)顯示激活血小板的顯著增加，從沒有肝素的1.4%到具有肝素的24.7%。與正常對照相比，在陽性對照和測試的患者中都顯示高百分比的激活血小板(方框的右上方象限)。
[0202]圖13顯示通過流式細胞術(shù)的Bernard-Soulier綜合征的診斷。患者的血液血小板顯示正常的GPIIb/IIIa的表達，但是GPIb的缺陷表達，其是Bernard-Soulier病的特征。 患者的小孩顯示GPIb的中間表達，表明攜帶者狀態(tài)。
[0203]圖14顯示Bernard-Soulier綜合征的流式細胞術(shù)測定的精確性,具有FITC-標記和1251-標記的抗-GPIb結(jié)合到血小板之間具有高度相關(guān)性。識別三組，具有GPIb的嚴重缺陷(坐下角)的患者，具有GPIb的中間表達的三個親戚(圖的中間)代表攜帶者狀態(tài)， 和正常對照(右上)顯示GPIb的高度表達。
[0204]圖15顯示通過循環(huán)血小板增加的p-選擇素(⑶62p)的增加的表達，表明與健康的正常對照(NC)相比，在血栓形成風(fēng)險(Pt)中體內(nèi)激活狀態(tài)。P-選擇素是在血小板上表達的顆粒糖蛋白，然后激活和釋放反應(yīng)。因此，它是體內(nèi)血栓前活性的標志物。
[0205]圖16顯示在血栓形成的高度風(fēng)險的患者中，通過膜聯(lián)蛋白A5結(jié)合檢測的血小板促凝血活性的表達，顯示激活血小板群(空箭頭)和高度激活血小板顆粒(黑色箭頭)，表明體內(nèi)高度血小板激活狀態(tài)與患者的血液中的持續(xù)血栓前活性一致。
【具體實施方式】[0206]在詳細地說明本發(fā)明的至少一個實施方式之前，應(yīng)該理解本發(fā)明沒有必要限制其應(yīng)用到在以下說明書中說明的細節(jié)或通過實施例示例的細節(jié)。本發(fā)明能夠能夠是其它實施方式或者能夠以各種方式實施或?qū)嵺`。
[0207]術(shù)語“包括”("comprises","comprising", "includes", "including")和“具有”("having")連同它們的變化一起意味著“包括但不限于”。
[0208]術(shù)語“由......組成”具有與“包括但限制于”具有相同的含義。
[0209]術(shù)語“基本由......組成”意味著組合物、方法或結(jié)構(gòu)可以包括另外的成分、步驟
和/或部分，但前提是另外的成分、步驟和/或部分不實質(zhì)地改變要求保護的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新穎性特征。
[0210]如在本文使用，單數(shù)形式“一”(〃a〃、〃an〃和〃the〃)包括復(fù)數(shù)指示，除非在上下文清楚地以其它方式清楚地指示。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一種化合物”可以包括多種化合物，包括其混合物。
[0211]在整個本申請中，本發(fā)明的各種實施方式可以范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)該理解以范圍格式的描述僅是為了方便和簡潔，和不應(yīng)該解釋為本發(fā)明范圍的不變的限制。因此，范圍的描述應(yīng)該被認為具有具體公開的所有可能的子范圍以及在那個范圍內(nèi)的單獨數(shù)值。
[0212]意識到本發(fā)明的某些特征，它們在分開的實施方式的情況中清楚地進行描述，也可以在單個實施方式中組合地進行提供。相反地，本發(fā)明的各個特征，它們在單個實施方式的情況中簡潔地描述，也可以分開地提供或者以任何的子組合提供或以本發(fā)明的任何其它描述的實施方式如其所應(yīng)地提供。在各種實施方式的情況中描述的某些特征不應(yīng)該認為是那些實施方式的基本特征，除非該實施方式?jīng)]有那些元素是不工作的。
[0213]在以下描述的各個圖的討論中，類似數(shù)字指類似部件。附圖總體上是不成比例的。 為了清除，非基本元素從一些附圖中省略。[0214]在此以下描述的系統(tǒng)、試劑盒和方法有助于診斷血小板相關(guān)的醫(yī)療狀況。根據(jù)一方面，提供包括試驗板的系統(tǒng)，其可以允許進行數(shù)個分析。然而，所有這些分析集中于測試與血小板相關(guān)凝固病癥的對象。分析的總的目的是能夠識別具有流血或血栓形成傾向的患者，和允許基于理性的合適醫(yī)療介入。
[0215]需要重要說明的是根據(jù)一方面，系統(tǒng)代表一個單元，其設(shè)計提供可能起因于各種原因的血小板狀況的臨床應(yīng)答，因此需要多于一次測試以得到正確診斷。例如，低的血小板計數(shù)-血小板減少的狀態(tài)可能需要免疫性血小板減少癥-1T/ITP、APS (抗磷脂綜合征)的分析，如果患者也暴露于肝素，由于血小板減少、肝素-誘導(dǎo)的血小板減少-HIT，免疫性血小板減少癥-1T/ITP、APS可能是復(fù)雜的，和Bernard-Soulier病-也與血小板減小相關(guān)的血小板功能缺陷。因此，通過排除混雜狀態(tài)，可以做出正確的診斷，節(jié)省患者不必要或不合適的治療或外科手術(shù)，如例如，有時Benard-SouI ier病患者上所發(fā)生,他們錯誤地診斷為 ITP和給出脾切除術(shù)。例如，這是因為缺少合適的實驗室實驗以排除ITP，諸如以下描述，或者缺少合適的設(shè)施進行一些實驗，例如，非血液實驗室不配備進行多個目前已知的實驗。
[0216]根據(jù)一方面，提供包括專用儀器和一組試劑的系統(tǒng)，一組試劑以特定診斷試劑盒的形式。以下描述示例性流式細胞儀?？蛇x地，可以調(diào)節(jié)一些商業(yè)可用的儀器-諸如例如通過修改軟件-完成期望的實驗。
[0217]提供基于檢測血小板抗體-抗原反應(yīng)的測試方法。該方法可以都使用標準的熒光流式細胞術(shù)進行，其是非常常見的。然而，在一些實施方式中，可以使用檢測這種反應(yīng)的其它方法。一種方法是化學(xué)發(fā)光，而且固相型分析、ELISA、凝膠顆粒聚集分析和其它方法可能是合適的。
[0218]測試方法實施方式包括樣品制備，使用血液或血小板的新鮮樣品，但是可選地，在固定制劑上可以進行所有的分析。
[0219]典型地，以下描述的所有診斷試劑盒和方法使用特定的抗體-抗CD41a -作為血小板一般檢測的最佳探針。然而，根據(jù)特定實驗，檢測血小板的其它探針諸如抗-CD42或抗-⑶61也可以代替或另外地使用。
[0220]以下是診斷血小板相關(guān)狀況的示例性方法和試劑盒的描述。
[0221 ] 1.血小板免瘡件-1T或ITP (血小板免瘡件血小板減小癥I
[0222]為了克服現(xiàn)在可用方法的局限和促進IT的診斷，我們研發(fā)了可靠、可行、快速、敏感和特異性流式細胞術(shù)方法，該方法使用微珠技術(shù)用于測定與血小板特異性糖蛋白受體反應(yīng)或針對血小板特異性糖蛋白受體的循環(huán)自身抗體。該方法可應(yīng)用于自身免疫和同種免疫的臨床癥狀。
[0223]總之，該方法允許直接和積極識別具有IT的患者-區(qū)別IT與其它引起血小板減小的混淆狀況，混淆狀況諸如減小的血小板產(chǎn)生和APS(其可能與血小板減小相關(guān)，但是具有血栓形成的趨勢，而不是如在IT中的流血)。直接和可靠地分析將能夠使醫(yī)生直接確認診斷和提供具有IT患者、對于他/她的狀況的合適醫(yī)學(xué)治療。
[0224]通用的技術(shù):
[0225]已經(jīng)研發(fā)了用于測試患者的血漿中血小板-抗原-特異性自身抗體和同種抗體的方法和試劑，以及/或血小板特異性受體:體內(nèi)形成的抗體復(fù)合物，使用熒光微珠分析。
[0226]該方法可應(yīng)用于使用熒光微珠的任何技術(shù)，通過流式細胞術(shù)或通過直接的熒光微孔讀數(shù)。方法也可以使用化學(xué)發(fā)光的微顆粒、或者顯色(如在ELISA中)、或凝膠-顆粒聚集技術(shù)(例如用抗原涂布和在抗體存在下聚集的凝膠顆粒，如在血庫中通常使用)進行應(yīng)用，以及抗體或血小板的固定:在固體表面上的抗體復(fù)合物。
[0227]根據(jù)需要，該方法適合于測試單個樣品以及多個樣品，和適合于檢測與單個血小板糖蛋白反應(yīng)的抗體，或者通過多重分析檢測與多個血小板糖蛋白相互作用的抗體。
[0228]可以提供本技術(shù)的產(chǎn)品到臨床實驗室，以診斷試劑盒的形式，任選地與說明書-方案-用于進行測試，以幫助診斷臨床重要的病癥的診斷。
[0229]方法1:
[0230]根據(jù)一些實施方式，提供測定自身免疫性血小板減少癥(ITP)中血小板特異受體的循環(huán)自身抗體的試劑盒和方法。該方法基于檢測與塑料(或任何合適聚合物)微珠表面上固定(粘附)的血小板特異性糖蛋白反應(yīng)的患者自身抗體。微珠首先涂布針對血小板特異性糖蛋白的單克隆抗體，然后用提取的血小板糖蛋白溫育-如以下完整地說明。
[0231]方法使用患者血小板排除，患者血小板在嚴重的血小板減少中可能難于得到。
[0232]靶血小板糖蛋白包括但不限制于CD41a (GPIIb/IIIa)、CD42b (GPIb)、 CD61(GPIIIa)、CD41b(GPIIb)、CD42a(GPIX)和 CD51(aV)。
[0233]材料和方法
[0234]聚苯乙烯珠子(15Um 直徑，Polysciences, Inc.400Val Iey Road, Warrington, PA18976, USA)在 4°C和 pH=9.2 緩沖液，用 GPIIb/IIIa(20 u g/mL)終濃度的單克隆抗體(P2克隆，Immunotech, West Brook, ME, USA)通過輕輕混合涂布過夜。珠子然后用PBS緩沖液洗滌。
[0235]正常血小板樣品 用0.5%Triton X-100溶解和在1200xg離心5分鐘。所有的步驟
在室溫進行。
[0236]對于常規(guī)分析，2500個抗體涂布的珠子用血小板溶胞產(chǎn)物溫育2h，洗滌和在4°C 貯存直到分析。
[0237]對于分析，涂布的珠子用患者的血清或血漿在室溫輕輕搖動溫育2小時，然后在 PBS+2.5%BSA中洗滌和用熒光素標記的多克隆山羊抗人免疫球蛋白抗體(20ii g/mL)溫育I 小時；Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)。
[0238]在溫育之后，珠子懸浮液用PBS稀釋和通過流式細胞術(shù)分析(圖1_4、7)。
[0239]流式細胞分析:珠子通過光散射進行最初識別和電控。每個樣品收集一千個事件。 使用具有類似熒光素:蛋白質(zhì)比的山羊抗-兔抗體(載體)測量非特異抗體結(jié)合。陰性對照由來自健康個體得到的正常血清組成。測試珠子的平均熒光使用標準的流式細胞儀軟件測定。使用涂布的微珠的整個分析需要的時間是約4h(與研究MIPA方法通常需要3天完成相比)。多至12個分析可以在相同時間方便地運行。
[0240]統(tǒng)計分析:使用非參數(shù)Kruskal -Wallis檢驗，進行患者的樣品上完成的實驗的結(jié)果和在正常個體的樣品上完成的實驗的結(jié)果之間的比較。同時測試個體熒光水平和三個正常對照的熒光。患者樣品的熒光等于或大于正常樣品的平均熒光+2個標準偏差(2SD) 認為是陽性的。當(dāng)已經(jīng)建立正常范圍之后，可以僅使用一個正常樣品用于對照。
[0241 ] 研究具有ITP的臨床診斷的18個患者。14個患者顯示⑶41a的自身抗體 (平均熒光320±137vs.10個正常個體中的7±2)，和三個患者顯示⑶42b的循環(huán)抗體(323±147vs.正常個體中的10±3)。分析的特異性是高的，沒有檢測到血清和其它血小板受體的交叉反應(yīng)。參見圖1、2、3、4。
[0242]通過受試者工作特征(ROC)圖方式評估分析的區(qū)別性準確性，也就是，在來自ITP 患者的有差別的正常個體中敏感性的圖vs.(1-特異性)，當(dāng)分析的閾值在各處可能值變化時。在ROC曲線下的面積(AUC)是范圍從0.5 (沒有區(qū)別)到1.0 (完全區(qū)別)的準確性指數(shù)。結(jié)果顯示85%的靈敏性截斷，診斷的特異性是94%。準確性和靈敏性測量代表方法和不應(yīng)該在每個實驗室中必須分開測定。
[0243]方法2:
[0244]研發(fā)了檢測ITP中的血小板-抗原-特異性血小板-結(jié)合自身抗體復(fù)合物的第二種技術(shù)。在體內(nèi)形成的血小板特異性抗體-抗原復(fù)合物分離和固定在涂布在微珠之上的抗-血小板糖蛋白-特異性單克隆抗體。
[0245]分析方案的進一步描述
[0246]本實施方式提供在體內(nèi)形成的抗體-血小板抗原復(fù)合物的分析。
[0247]聚苯乙烯珠子(15Um 直徑；Polysciences, Inc.400Val Iey Road, Warrington, PA18976, USA)用終濃度的 GPIIb/IIIa 單克隆抗體(20 u g/mL)在 4°C溫育 2 小時；P2clone, Immunotech, West Brook, ME, USA)。珠子然后用 PBS 緩沖液洗漆。
[0248]患者的血小板樣品用0.5%Triton X-100溶解和1200xg離心5分鐘。所有的步驟在室溫進行。對于常規(guī)分析，2500抗體涂布的珠子用患者的血小板溶胞產(chǎn)物溫育2小時，洗滌和然后用熒光素標記的多克隆山羊抗人 免疫球蛋白抗體(20 ii g/mL)溫育I小時；Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA)。
[0249]然后，珠子用PBS懸浮和通過流式細胞術(shù)分析。使用具有類似熒光素:蛋白質(zhì)比的山羊抗兔抗體(載體)測量非特異抗體結(jié)合。陰性對照由從健康個體得到的正常血小板溶胞產(chǎn)物組成。使用單克隆抗體涂布的珠子整個分析需要的時間是大約4小時。同時可以方便地運行多至12個分析。
[0250]流式細胞分析:珠子通過光散射進行最初識別和電控。每個樣品收集一千個事件。 使用標準的流式細胞儀軟件測定測試珠子的平均熒光(圖5、6、7、8)。如上描述進行統(tǒng)計分析。在一些實施方式中，提供檢測患者的循環(huán)自身抗體的方法，抗原是結(jié)合的，然后與患者的血清接觸。在其它實施方式中，提供包括分離體內(nèi)形成的Ab-抗原復(fù)合物的方法，其中首先復(fù)合物自身被分離-需要患者的血小板-不是血清。在嚴重ITP中，難于得到用于這種分析的足夠的血小板，反而，方法首先需要患者的血清。
[0251]方法3:
[0252]研發(fā)了用于測定針對血小板特異性受體的循環(huán)同種抗體的第三種技術(shù)，即，抗體針對在患者的自身血小板上不存在的外源性血小板抗原形成(類似于在暴露于Rh-陽性紅細胞的Rh-陰性女性中形成抗-Rh抗體)。該技術(shù)基于檢測與、涂布針對血小板特異性糖蛋白的單克隆抗體的微珠反應(yīng)、男性生成的同種抗體。血小板糖蛋白然后固定在微珠表面上。
[0253]在臨床試驗中，來自具有與輸血后紫癒(PTP) —致的臨床表現(xiàn)的患者的樣品顯不抗體與⑶41復(fù)合物(GPIIb/IIIa)和⑶61 (GPIIIa)亞單元都反應(yīng)。參見圖7，平均熒光 420±59vs.正常個體中的18±9)。他們的同種抗體針對在GPIIIa亞單元上的表位，這些自然形成具有GPIIb的復(fù)合物。[0254]具有新生兒同種免疫性血小板減少癥(NAIT)的孕婦，一種涉及生成她胎兒血小板-糖蛋白的母親同種抗體的病癥,其導(dǎo)致胎兒血小板減小和流血-包括內(nèi)部顱內(nèi)出血。該技術(shù)對于這種嚴重的病癥顯示高度的靈敏性，如在圖8中示出。
[0255]實踐的方案如在方法I中描述。
[0256]方法4:
[0257]研發(fā)了檢測同種免疫性血小板減少癥中抗原-特異性血小板結(jié)合的患者的同種抗體的第四種技術(shù)。分離血小板特異性抗體-抗原復(fù)合物和固定在涂布糖蛋白特異性單克隆抗體的微珠上。
[0258]在具有PTP和NAIT的成人患者中進行體內(nèi)血小板結(jié)合抗體的抗原特異性分析，顯示患者的樣品超過正常個體的5-7倍的熒光強度增加，類似于在圖6中示出的結(jié)果。
[0259]實踐的方案如在方法2中描述。
[0260]研究臨床診斷為ITP的十八個患者。十四個患者顯示⑶41a的自身抗體(平均熒光320±137vs.正常個體中7±2)，和三個患者顯示⑶42b的循環(huán)抗體(323±147vs.正常個體中10±3)。分析的特異性是高的，沒有檢測到與其他血小板受體的血清的交叉反應(yīng)。 參見圖1、2、3和4。
[0261]結(jié)論，熒光免疫珠分析是實際的，具有相對高的靈敏性和特異性，和對于常規(guī)診斷可以是臨床有用的，和對于具有血小板特異性糖蛋白的抗體的患者的隨訪，針對如在TP中的自身抗原的自身抗體，或針對如在NAIT中的外源性抗原的同種抗體。
[0262]該分析可應(yīng)用于各種免疫檢測方法，包括熒光流式細胞術(shù)和化學(xué)發(fā)光微珠分析、 酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，也知道為酶免疫分析(EIA)，或者顏色微珠型的分析。它可以包括單個或多個類型的隨著尺寸變化的微珠/微球(多重分析)、內(nèi)部熒光標志物(例如， Quantiplex?珠子；Luminex’ s xMAP Technology,等等)、顏色標志物或與磁性材料有關(guān)的標志物。
[0263]2.APLA/APS或休斯綜合征(抗磷脂抗體綜合征)`[0264]為了克服診斷APS的現(xiàn)在可用方法的診斷限制，我們研發(fā)了測定抗磷脂抗體綜合征(APS)中針對血小板磷脂的自身抗體的快速、靈敏和特異的流式細胞分析。該分析是病理生理相關(guān)的，因為循環(huán)血小板是血管閉塞血栓形成事件中的主要成分。該方法基于APS 患者的自身抗體與血小板膜磷脂的明確的結(jié)合。這種結(jié)合通過用試劑熒光標記的膜聯(lián)蛋白 A5進一步溫育檢測，熒光標記的膜聯(lián)蛋白A5與在血小板磷脂上剩下的自由位點相互作用。
[0265]我們進一步假設(shè)由于這種天然試劑具有抗凝血劑活性(減少血小板表面上的有效的凝血劑凝血酶的生成)，通過患者的抗磷脂自身抗體占據(jù)其血小板結(jié)合位點產(chǎn)生增強的凝血酶生成，因此增加APS中臨床的血栓形成的風(fēng)險。
[0266]該方法是實際和快速的，使用容易得到的試劑，和包含標準設(shè)備。該分析對于單個和多個樣品是不昂貴和劃算的。從得到血液樣品在2個小時內(nèi)提供結(jié)果，由此支持臨床決定做出和患者管理。
[0267]總的說來，分析是高度特異的，允許病理生理相關(guān)的抗磷脂自身抗體的可靠地診斷。
[0268]因此，避免假陽性結(jié)果，例如從具有通常使用的抗心磷脂抗體實驗中得到，國際指南要求重復(fù)，在12周后排除偶發(fā)的傳染病，其可以引起假陽性結(jié)果。[0269]目前分析的結(jié)果允許可靠實時的診斷和沒有這種嚴重狀況的延遲，然后正確的醫(yī)
療管理。
[0270]需要重點說明的是，這種特別的技術(shù)已經(jīng)隨著修改和改變演進地發(fā)展，包括但不限制于:1)特定、穩(wěn)定和可靠診斷血小板產(chǎn)品的制備，其適合于在APS的診斷的常規(guī)臨床實驗室中常規(guī)使用，和2)用高熒光素標記技術(shù)的截短的人重組蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A5的特定的制備，用于生產(chǎn)涉及血小板、直徑1-2 U m的小顆粒的分析的靈敏試劑。
[0271]以下提供用于進行診斷分析的診斷試劑盒實施方式和相關(guān)方法實施方式的描述。
[0272]分析的原則:
[0273]-血小板試劑的制備:
[0274]對于常規(guī)的臨床實驗室使用，制備穩(wěn)定、可靠和方便地血小板試劑。穩(wěn)定的制劑避免用于實驗的新鮮血小板富集的血漿-PRP的需求，和增強其重復(fù)性。血小板懸浮液用緩沖液洗滌和用試劑Ca2+離子載體A23187(例如，Sigma)5iiM最終濃度溫育15分鐘，為了血小板膜磷脂的暴露。然而，血小板懸浮液用1%多聚甲醛在室溫溫育I小時，和用緩沖液洗滌。 血小板制劑最后凍干，即，冷凍干燥，然后在合適容器中包裝用于運輸和長期貯存。多聚甲醛隨后凍干穩(wěn)定懸浮液。對于分析，血小板重新懸浮在緩沖液中，到大約250，000/u L的濃度，使用等分試樣用于分析，和在冰箱中4°C貯存制劑用于將來使用。
[0275]抗凝血劑低分子量肝素的制備
[0276]肝素:制備濃度為100mg/mL的低分子量肝素鈉-Enoxaparin (Sanof1- Aventis Inc, France)。(有效期-非常長>3年)。
[0277]最終10mg/mL的儲備液:50 u L的肝素加入450PBS緩沖液=500 y L的10mg/mL。
·[0278]最終2.0mg/mL的工作液:100 ii L的肝素儲備液加入到400 U L緩沖液=500 ii L的
2.0mg/mLo
[0279]5u L最終濃度0.lmg/mL的肝素的工作液加入到100 U L終體積的反應(yīng)混合物。
[0280]-標記的重組人膜聯(lián)蛋白A5蛋白的制備
[0281]天然形式的蛋白質(zhì)從Koa Laboratories, Tokyo, Japan得到。為了得到適合于測試小顆粒的血小板(1-2微米直徑)的靈敏試劑，進行與熒光素-異硫氰酸酯分子的高度結(jié)合。為了得到具有標記與膜聯(lián)蛋白高比例的標記，例如蛋白質(zhì):熒光素比例為約1:6，用于這個步驟的技術(shù)如下:在無菌水中制備所有的溶液和試劑。
[0282]材料:
[0283]-0.5M碳酸鹽10X緩沖液如下:儲備液:
[0284]a.5.3% 碳酸鈉。制備 100ml
[0285]b.4.2% 碳酸氫鈉，pH 約 8.0。制備 100ml。
[0286]將58ml的(a)與100ml的(b)混合；pH將是約9.5。用醋酸調(diào)節(jié)pH至9.2。
[0287]工作透析緩沖液:
[0288]用無菌H2Ol = IO稀釋10X緩沖液和核對pH;如果必要，調(diào)節(jié)至pH9.2。制備至少 500ml-1000ml。
[0289]FITC溶液:(新鮮制備)。在DMSO中制備10mg/ml。從冰箱中取出和在稱出之前回到室溫。
[0290]-蛋白質(zhì)濃度應(yīng)該是l_2mg/ml開始。需要400的最小體積以從柱中得到0.5-lmg。為了得到蛋白質(zhì)的準確濃度(如果未知)，在0D280nm讀出洗脫液濃度，除以1.4， 這將給你抗體的蛋白質(zhì)濃度。
[0291]-用交聯(lián)葡聚糖凝膠裝填柱子,例如F1D-1OSephadexG-25柱，Pharmacia。
[0292]-PBS w/o Ca2+.[0293]-PBS 中 10% 疊氮鈉。
[0294]標記的方法:
[0295]第一天:膜聯(lián)蛋白抗體必須是沒有疊氮鈉(如果存在)和在PH9.2用于熒光素化 (f Iuoresceination)工作。純化抗體,例如,通過透析:使用蛋白質(zhì)純化盒，諸如最好結(jié)果的Peirce的Slide-A-Lyzer (根據(jù)制造商的用法說明)。放置在透析緩沖液中,透析至少4 小時，優(yōu)選地為過夜。
[0296]第二天:將抗體非常輕地從管中取出和非常仔細地測量體積。通過取50 U I等分試樣在Icm比色杯中讀取在0D280的吸收。存在的抗體的量是:
[0297]mg/ml 抗體=(0D280/1.4) x (ml 抗體)
[0298]如果抗體是2-10mg/ml，加入20 ii g (2 iU)的FITC結(jié)合物。
[0299]如果抗體<2mg/ml，加入 IOOii g(10iil)的 FITC 結(jié)合物。
[0300]在37°C溫育60分鐘，同時輕輕地搖動。
[0301 ] 制備PD-10柱，靜止放置，將頂部切掉和放置在燒杯上。在柱的頂部放置25cc移液管(頂部切掉)；這將作為需要用于清洗柱子的額外體積的擴大。用20ml的PBSw/o Ca2+ 洗滌，在柱的頂部加入500 u I的PBS中1%BSA和讓其通過，然后加入另外20ml的PBS緩沖液和使其流過。柱子現(xiàn)在準備好。
[0302]制備具有10-15個5ml聚苯乙烯管的支架(允許容易地看見級分的顏色)。
[0303]PBS流過柱子，直到在燒結(jié)玻璃的頂部沒有任何東西剩下。結(jié)合抗體到柱子頂部的層。使抗體進入柱子。在柱子的頂部加入2ml PBS和使其流過。在500 Ul級分開始收集洗脫液(第一級分是空白)。通過獨特的黃色，可以看見結(jié)合FITC的抗體，當(dāng)黃色級分出來，立刻收集所有的，確保收集大部分的級分，和分開收集更遲的稀釋的級分。這種方式抗體將集中在一個級分中。
[0304]使該級分免受直接光和在黃色級分的任一側(cè)上讀取約3個管。讀取整個的收集的級分。在雙波長280nm和495nm，使用第一級分作為空白讀數(shù)。如果讀數(shù)是>1.5，然后用 150 u I PBS稀釋50 u I和再次讀數(shù)。
[0305]計算結(jié)合抗體的濃度和F/P比例
[0306]抗體濃度mg/ml=0D280_(0.31x 0D495)
[0307]1.4
[0308]F/P 比例=(2.86x 0D495)
[0309]0D280-(0.31x 0D495)
[0310]將1%疊氮鈉加入到收集的部分和在4°C貯存。
[0311]測定結(jié)合到血小板制劑上自由位點的FITC-標記的膜聯(lián)蛋白A5的量，和與患者的自身抗體結(jié)合的量成反比例(圖9-11)，即，正常樣品發(fā)現(xiàn)高結(jié)合而APS患者樣品低結(jié)合，如在圖中示出(在散布圖上的所有點來自一個樣品，上面來自正常個體，下面來自具有狀況的患者)。[0312]材料:
[0313]-處理的血小板制劑-通過上述特定步驟制備。
[0314]-膜聯(lián)蛋白A5(KoaLaboratories, Tokyo, Japan),通過上述高標記的步驟標記突光。
[0315]-CD41PE (Immunotech, Westbrook, ME, USA,或等同物)
[0316]-緩沖液(正常鹽水中的0.02M HEPES、2.5mM CaC12、pH7.3)。
[0317]-檸檬酸鈉緩沖液3.8%，或ACD-A INH配方A。
[0318]-低分子量肝素:如在上述步驟中制備。
[0319]-通過標準離心從患者的血液中制備血清或血漿。
[0320]方案:
[0321]測試抗血小板磷脂自身抗體的患者的血清或血漿的步驟。
[0322]分析的原理:
[0323]APS患者的血清 或血漿用上述用于結(jié)合患者的抗磷脂自身抗體到血小板膜磷脂的特定血小板制劑溫育。類似地，正常對照樣品從健康個體得到的血清或血漿制備。
[0324]在第一次溫育后，血小板懸浮液用高FITC(熒光素)_標記的膜聯(lián)蛋白A5進一步溫育，高FITC (熒光素)-標記的膜聯(lián)蛋白A5占據(jù)在血小板膜磷脂上的剩下的結(jié)合位點。
[0325]測定結(jié)合到血小板制劑上自由位點的FITC-1abeled膜聯(lián)蛋白A5的量，和患者的自身抗體結(jié)合成反比例(圖9-11)，即，正常樣品中發(fā)現(xiàn)高結(jié)合的標記-膜聯(lián)蛋白和APS患者樣品發(fā)現(xiàn)低結(jié)合，如在圖中示出。
[0326]步驟1:
[0327]5uL的特定血小板懸浮液加入到50 ii L患者、陰性對照(NC)和陽性對照(PC)血清/血漿，進入具有45 ii L HEPES緩沖液中，含有最終濃度2.5mM的鈣。
[0328]加入5 ii L的低分子量肝素工作液。
[0329]-在室溫溫育60分鐘。
[0330]步驟2:
[0331]-將10ii L的藻紅蛋白-標記的抗-⑶41MoAb加入到每個管。
[0332]-將高-FITC-標記的膜聯(lián)蛋白(終濃度IU g/ml)加入到反應(yīng)管。
[0333]-在室溫溫育15分鐘。
[0334]-用400ii L HEPES緩沖液稀釋和通過流式細胞術(shù)分析。
[0335]圖9-11說明分析的示例性結(jié)果。顯示APS患者的樣品的結(jié)果和健康對照的結(jié)果之間的高分辨率。
[0336]該診斷技術(shù)具有用于可行、快速、準確和病生理相關(guān)診斷APS的高潛力。
[0337]3.HIT (肝素誘導(dǎo)的血小板減少)
[0338]為了得到可靠的結(jié)果，舊的方法[Tomer A，1997]已經(jīng)被本方法替代，提供用于常規(guī)臨床使用的更可行和可靠的方法。
[0339]方法不在包括檢測與血小板膜上陰離子磷脂暴露有關(guān)的血小板促凝血活性。試劑諸如膜聯(lián)蛋白V，其允許檢測血小板促凝血活性，已經(jīng)被一種新的試劑替代。使用的緩沖液，HEPES，其需要具有鈣的特定制劑，可以激活血小板自身的作用劑，被沒有鈣-鎂的磷酸緩沖鹽(PBS)替代。這種緩沖液也提供生化系統(tǒng)的穩(wěn)定性。可選地，可以使用生理流體或任何緩沖液，只要它不含有鈣或任何其它可以激活血小板的作用劑，和允許血小板繼續(xù)存在。實驗管的數(shù)量減少一半，每個樣品僅使用兩個，一個沒有和一個具有.3U/mL肝素，而不是使用四種不同濃度:0、0.1,0.3和100U/mL肝素。肝素的濃度可以是在0.1和0.5IU/mL 之間，優(yōu)選地約0.3IU/mL。同樣，在體外激活、確認試劑的性能的對照作為TRAP加入(凝血酶受體激動劑/激活多肽)。
[0340]然而，在老的方法中，為了可靠的結(jié)果，需要立即讀數(shù)，在本方法中，在兩個小時內(nèi)可以可以可靠地完成一次讀數(shù)。重復(fù)性高度增強。兩種血小板的需要體積從70 UL減少到 10 u L，當(dāng)必要時，允許隨后加倍和重復(fù)。因此，本方法基于血小板與肝素反應(yīng)的不同參數(shù)的檢測，使用完全不同試劑，和是高度優(yōu)化的，產(chǎn)生顯著更可行、可靠和可重復(fù)的技術(shù)，其可以通過任何常規(guī)的實驗室技術(shù)人員進行，因此使得它對于廣泛范圍的常規(guī)臨床診斷是合適和可用的。本方法已經(jīng)在多于200個患者的樣品上測試和發(fā)現(xiàn)與HIT的臨床表現(xiàn)是高度相關(guān)的，如以下進一步說明。
[0341]另外，該方法能夠測定肝素替代療法的任何交叉反應(yīng)性，在診斷HIT的情況下，其可以給予[Alving B], [Hirsh J 等人]。
[0342]因此，本分析是高度特異和靈敏的，允許高度可靠診斷HIT，不論體內(nèi)形成的肝素復(fù)合物的性質(zhì)如何。根據(jù)陽性實驗結(jié)果，用肝素治療需要被立即中斷，和需要被替代、非免疫交叉反應(yīng)的抗凝血劑藥物替代。
[0343]方法:方法對于臨床實驗室中可行的常規(guī)應(yīng)用的優(yōu)化，應(yīng)用諸如在此描述的診斷試劑盒實施方式與簡單的說明書。
[0344]這種優(yōu)化包括使用不貴和穩(wěn)定的試劑，測定最佳結(jié)果的混合物中每個試劑的相對體積，和最小化體積至微體積(10 u L血小板懸浮液&10 y L患者的血清)，以允許加倍、重復(fù)和保存患者材料用于將來測試和監(jiān)測。
[0345]反應(yīng)混合物是穩(wěn)定的，允許方便時間進行讀數(shù)，并且完成步驟是簡單的，在小于2 個小時可以得到結(jié)果。
[0346]與專業(yè)的生物統(tǒng)計學(xué)家合作，徹底地分析最初結(jié)果，以確定用于診斷的最可行和可靠的參數(shù)。
[0347]已經(jīng)在大量患者(>200)中測試了優(yōu)化的方法，同時用其它免疫檢測應(yīng)用于分析， 顯示在臨床實驗室是高度可行以及用于診斷是高度可靠和可重復(fù)的。因此，對于以下描述的試劑技術(shù)的診斷試劑盒材料對于可行、快速和可靠地HIT診斷是高度有用的。對于分析的總體性能，使用ROC圖分析以區(qū)別患者和正常個體之間，發(fā)現(xiàn)準確性的高指數(shù)。在曲線下的面積是0.86，與商業(yè)可用的分析顯示0`.62的參數(shù)相比，這翻譯為本分析的約兩倍的靈敏性和更高的特異性。
[0348]本方法基于正常血小板的體外激活的證明，然后在肝素存在下用患者的血清溫育，模仿病癥的體內(nèi)病理生理的過程。血小板應(yīng)答通過測量針對血小板CD62的抗體的特異結(jié)合，血小板CD62是在激活后外血小板膜上暴露的抗原。
[0349]該技術(shù)使用標準的緩沖液諸如沒有添加物的PBS和兩色流式細胞術(shù)來幫助臨床實驗室中的常規(guī)診斷。該程序由兩個主要步驟組成。第一個步驟包括用正常的血小板溫育患者血清/血漿60分鐘，在不存在和存在肝素的藥理學(xué)濃度時(分別是0.0 ；0.3IU/ml (然而，使用高劑量的100U/mL作為另一個對照保留對于實驗室是可選的)。第二個步驟包括針對-⑶41a的MoAb溫育來自第一個步驟的等分試樣15分鐘用于血小板識別，和抗血小板 CD62抗體溫育來自第一個步驟的等分試樣15分鐘用于血小板反應(yīng)的檢測。
[0350]結(jié)果從流式細胞分析得到，和沒有進一步操作或計算直接確定血小板激活的程度 (參見圖12)。
[0351]以下是建議試劑盒的方案和HIT診斷分析的方法實施方式。
[0352]進行HIT的診斷分析的診斷試劑盒、材料和技術(shù)的描述。
[0353]材料:
[0354]a.PBS -磷酸鹽緩沖鹽水(Ca2+/Mg2+free)，(標準緩沖液)
[0355]b.TRAP -凝血酶-受體激活/激動劑肽。[例如，Calbiochem或Tocris Bioscience - MW-1739.500mg,溶解入 0.5mL 去離子水 /DDW=lmg/mL。PBS 中稀釋的等分試樣1:1。加入8iiL(2iiL，終濃度)到50 ii L終體積的反應(yīng)混合物]。
[0356]c.單克隆抗體抗-p-選擇素(⑶62p)-熒光標記的(例如，F(xiàn)ITC-熒光素-異-硫氰酸酯-綠色突光,例如，Biogen, Cambridge, MA;或 Serotec, UK)。
[0357]d.單克隆抗體抗血小板CD41a(GPIIb/IIIa)-熒光標記的(例如，PE-藻紅蛋白-澄色突光)(例如，Immunoteck, Westbrook, ME)。
[0358]?可以應(yīng)用可以光學(xué)可分辨的兩個熒光探針的任何組合，(例如在以下發(fā)出的熒光染料:530/30nm(FITC) ；585/40nm(PE, PI) ；675nm LP (PE-Cy5, PE-Cy5.5, PerCP, PerCP-Cy5.5，PE-Cy7);675/25nm(APC)。
[0359]血液樣品。來自正常個體和患者的五毫升血液樣品收集入含有1/10體積的3.8% 檸檬酸鈉緩沖液(0.129M)(標準真空管)或ACD (枸櫞酸緩沖液-NIH式A)的注射器中。血液樣品輕輕地混合和沒有延遲地處理。
·[0360]血小板富集血衆(zhòng)(PRP)通過緩慢離心(150x g, 5min)制備和血小板計數(shù)調(diào)整至 250，000血小板/1^(?1^通常在360和400\1091-1之間)?？蛇x地，PRP可以從血庫去除術(shù)或隨機血小板單位中得到。
[0361]PRP-1O ii L& 血小板-10 ii L
[0362]-制備以下的管(12x75mmBD Falcon聚丙烯或等同物)。
[0363]-終反應(yīng)體積50ii L -塞子塞緊的帽管。
[0364]-陽性對照/冷凍樣品-高速度旋轉(zhuǎn)20min，4°C，去除聚集體。將樣品保留在冰上。
[0365]-正常對照:貧血小板血漿(PPP)通過從PRP通過較高的離心(2500xg，15min)制備。
[0366]表1
[0367]1.第一溫育步驟:
[0368]制備以下管:[0369]
【權(quán)利要求】
1.診斷患者的血清或血漿樣品中HIT(肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥)的方法，所述方法包括: 階段A,包括: 溫育由以下組成的第一PI (患者I)樣品:患者的樣品的第一等分試樣與第一健康個體的PRP，和生理相容緩沖液，條件是緩沖液既不含有鈣也不含有鎂離子； 溫育由以下組成的第一 PIH(使用肝素的患者I)樣品:患者的樣品的第二等分試樣與所述PRP，肝素和緩沖液； 溫育由以下組成的第一 NC(正常對照)樣品:健康個體的血漿或血清樣品的第一等分試樣與所述PRP，和緩沖液； 溫育由以下組成的第一NCH(使用肝素的正常対照):健康個體的血漿或血清的第二等分試樣與所述PRP，肝素和緩沖液； 階段B，包括: 溫育由以下組成的第二 PI樣品:第一 PI樣品的等分試樣，由以下組成的第二 PIH樣品:第一PIH樣品的等分試樣，和由以下組成的第二NC樣品:第一NC樣品的等分試樣，和由以下組成的第二 NCH樣品:第一 NCH樣品的等分試樣,姆個具有:第一標記,第一標記能夠同時標記肝素激活和非肝素激活血小板，第二標記，第二標記能夠標記由肝素激活的血小板，和緩沖液； 階段C，包括: 在每個第二樣品中，通過測量第一標記測量第二樣品中每ー個的類似量的血小板； 在每個所述類似量的血小板中，通過測量由肝素激活的血小板上的第二標記的量，測量肝素激活的血小板的量； 計算以下之間的差:來自第二 PIH樣品的激活的血小板的量和來自第二 PI樣品的激活血小板的量之間，和來自第二 NCH樣品的激活血小板的量和來自第二NC樣品的激活血小板的量之間，和 比較所述第二 PIH和第二 PI樣品的所述差，和所述第二 NCH和所述第二 NC樣品的所述差， 其中當(dāng)所述第二 PIH和第二 PI樣品的所述差顯著大于所述第二 NCH和所述第二 NC樣品的所述差時，患者的樣品中診斷為HIT。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，選擇所述第二PIH和第二 PI樣品的所述差是比所述NCH和所述第二 NC樣品的所述差大至少2.5倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中第一標記是血小板受體GPIIb/IIIa的標記。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中第二標記是由肝素激活的血小板表達的P-選擇素CD62p的熒光標記的單克隆抗體，該方法包括通過結(jié)合到激活血小板的第二標記測量熒光的強度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中肝素激活的血小板的量每個通過每個類似量的總血小板群的所述第二標記平均總熒光測量。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，進ー步包括: 通過設(shè)定標志物在2.5%(正態(tài)分布的2SD)的類似量的NC的熒光測量的高-CD62p-熒光端上,計算激活血小板％ ；在所述高-⑶62p熒光端，計算PIH中激活血小板％和PI中激活血小板％之間的讀數(shù)差，和NCH中激活血小板％和NC中激活血小板％之間的讀數(shù)差，和 比較PIH和PI與NCH和NC樣品的所述差，其中陽性結(jié)果是PIH和PI的差顯著大于NCH和NC差。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中PIH和PI的差比NCH和NC差大超過2.5倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中血漿或血清樣品不多于IOyし
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中階段B進ー步包括:溫育由以下組成的TRAP樣品:TRAP、第一標記、第二標記、和緩沖液，和階段C進ー步包括測量TRAP樣品中的激活血小板的量。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中: 階段A可以進一歩包括: 溫育由以下組成的第一 PC(陽性對照)樣品:具有HIT的個體的血漿或血清樣品的第一等分試樣與所述PRP，和緩沖液； 溫育由以下組成的第一 PCH樣品:具有HIT的個體的血漿或血清樣品的第一等分試樣與肝素，所述PRP，和緩沖液； 和階段B進ー步包括: 溫育由以下組成的第二PC樣品:第一· PC樣品的等分試樣，和由以下組成的第二PCH樣品:第一 PCH樣品的等分試樣，每個具有:第一標記，第二標記，和緩沖液； 和階段C進ー步包括: 計算第二 PCH樣品中激活血小板％和第二 PC樣品中激活血小板％之間的差別，和比較所述第二 PIH樣品和第二 PI樣品的所述差與所述第二 PCH和所述第二 PC樣品的所述差， 其中當(dāng)所述第二 PIH樣品和第二 PI樣品的所述差類似于所述第二 NCH和所述第二 NC樣品的所述差時，患者的樣品中進ー步診斷為HIT。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，階段A中的溫育是約I小時和階段B中的溫育是約15分鐘。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，第一PIH和NCH樣品中的肝素的濃度為0.1和0.5IU/mL 之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中肝素的濃度為約0.3IU/mL。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中緩沖液是沒有鈣和鎂的PBS。
15.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中第一標記是熒光標記的單克隆抗體抗血小板CD41a。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括以下方法中的至少ー個: 權(quán)利要求1所述的方法； 患者的血清或血衆(zhòng)樣品中APS診斷，APS診斷包括: 從不具有APS的個體的血液樣品中制備血小板懸浮液； 通過暴露血小板中膜磷脂,處理來自不具有APS的個體的血小板； 用所述處理的血小板溫育患者的樣品，以得到具有暴露的正常血小板的患者的樣品的懸浮液(SPEP)；純化未標記的膜聯(lián)蛋白； 在pH=9.2，將過量的FITC加入到純化的膜聯(lián)蛋白，形成高度標記的膜聯(lián)蛋白； 純化高度標記的膜聯(lián)蛋白； 用所述SPEP溫育純化高度標記的膜聯(lián)蛋白； 在用膜聯(lián)蛋白溫育的SPEP的子樣品中，測定子樣品中結(jié)合到血小板的高度標記的膜聯(lián)蛋白的量，由此低比例表明所述樣品中的APS ； ITP (免疫性血小板減少癥)診斷樣品，ITP診斷包括: 制備: A)患者的抗體: 將第一表面用MoAb抗血小板特異性受體覆蓋；隨后，用來自正常血小板的溶胞產(chǎn)物溫育覆蓋的第一表面； 隨后，用患者的樣品等分試樣溫育覆蓋的第一表面和溶胞產(chǎn)物； 隨后，加入人免疫球蛋白的第二熒光標記的Ab，或: B)患者的抗體-血 小板特異性抗原復(fù)合物: 用MoAb抗-血小板特異性受體覆蓋第一表面；隨后,用來自患者的血小板的溶胞產(chǎn)物溫育覆蓋的第一表面； 隨后，加入人免疫球蛋白的第二熒光標記的Ab ； C)制備參照: 用MoAb抗血小板特異性受體覆蓋第二表面； 隨后，用來自正常血小板的溶胞產(chǎn)物覆蓋第二表面； 隨后，用正常的血清或血漿溫育覆蓋的第二表面和溶胞產(chǎn)物； 隨后加入人免疫球蛋白的第二熒光標記的AbjP D)比較吸附到所述溫育第一表面上的第二標記的抗體的第一定量與吸附到所述溫育第二表面上的第二標記抗體的第二定量，其中第一定量顯著地多于第二定量表明所述樣品中的ITP ； 診斷樣品的血小板功能，該方法包括: A)評估血小板刺激: 1)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每個用血小板糖蛋白的兩個標記的MoAb,以提供患者的標記血小板和正常個體的血小板，第一所述標記的MoAb具有第一帶中的測量和第二所述標記的MoAb具有第二帶中的測量； 2)隨后，將ADP或TRAP中每ー個加入到所述樣品，以提供患者和正常個體的刺激標記的血小板； 3)隨后，通過在所述第一帶中或所述第二帶中測量識別所述樣品中的標記血小板； 4)隨后，測量患者的所述識別的標記血小板和正常個體的所述識別的標記血小板，其中當(dāng)標記的血小板通過第一帶識別時，所述識別的標記血小板的測量是在所述第二帶中，當(dāng)標記的血小板通過第二帶識別時，所述識別的標記血小板的測量是在所述第一帶中； 5)其中所述患者的所述識別的標記的血小板的測量等于或大于平均數(shù)+2標準差(2SD)，正常個體的所述標記血小板的所述測量表明患者的所述樣品血小板激活； B)評價血小板促凝固:1)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每個用血小板糖蛋白標記的MoAb和膜聯(lián)蛋白V; 2)隨后，用血小板離子載體溫育每個所述樣品； 3)隨后，通過測量血小板糖蛋白的標記的MoAb，識別所述樣品中類似量的標記血小板； 4)隨后，測量在所述類似量的血小板上的膜聯(lián)蛋白V的熒光； 5)其中患者的血小板的膜聯(lián)蛋白V熒光等于或大于平均數(shù)+2個標準偏差(2SD)，正常個體的血小板的膜聯(lián)蛋白V熒光表明患者的所述樣品中血小板促凝固； 所述樣品中的Berard-Soulier綜合征診斷,診斷包括: 1)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每ー個用排除⑶42的血小板特異糖蛋白的第一標記MoAb，和用⑶42的第二標記MoAb ； 2)隨后，通過測量第一標記MoAb識別所述樣品中的標記血小板， 3)隨后，由患者的所述識別的標記血小板測量所述第二MoAb和由正常個體的所述識別的標記血小板測量所述第二 MoAb, 其中患者的親戚的所述識別的標記的血小板的所述第二 MoAb的測量比正常的小，但是比患者大，表明攜帯者狀態(tài)； 所述樣品中的血小板無カ癥綜合征診斷，該診斷包括: 1)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每個用排除⑶41a的血小板糖蛋白的標記MoAb,和用OMla的MoAb ； 2)隨后，通過測量排除⑶41a的血小板糖蛋白的MoAb識別所述樣品中的標記的血小板， 3)隨后，測量患者的所述識別的標記血小板的CD41a的MoAb和正常個體的所述識別標記血小板的CD41a的MoAb， 4)其中CD41a的MoAb的第一測量等于或小于所述標記的血小板的所述第二熒光的⑶41a的MoAb的測量的平均數(shù)_2個標準偏差(2SD)，表明患者的所述樣品中的血小板無力癥綜合征，以及在表明綜合征和表明正常個體之間中的第一測量表明血小板無カ癥攜帯者； 所述樣品的藥物抑制效果診斷，診斷包括:
A) 1)同時溫育患者和正常個體的含有血小板的樣品，每個用血小板糖蛋白⑶41a或CD61、CD62p 和激活 CD41a 的標記 MoAb ； 2)隨后，用選自以下的一種或多種的興奮劑溫育所述樣品:ADP、花生四烯酸和TRAP; 3)通過測量血小板糖蛋白⑶41a的MoAb，識別所述樣品中的標記血小板； 4)隨后測量血小板糖蛋白⑶62p和患者的所述識別的標記血小板的激活⑶41a以及正常個體的所述識別標記的血小板， 5)其中患者的血小板糖蛋白CD62p的MoAb的測量等于或小于所述正常個體的血小板糖蛋白CD62p的MoAb的測量的平均數(shù)-2標準偏差(2SD)測量，或者患者的血小板糖蛋白激活⑶41a的MoAb的測量等于或小于所述正常個體的血小板糖蛋白激活⑶41a的MoAb的測量，表明患者的所述樣品中的藥物抑制效果；B)當(dāng)在血小板功能診斷中，測定評估血小板促凝固，其中血小板用鈣離子載體刺激，然后用標記的膜聯(lián)蛋白A5溫育； 測定循環(huán)血小板或血小板相關(guān)顆粒激活標記，作為持續(xù)、實時體內(nèi)、血栓前活性的指示物，包括: 1)用ー個或多個標記熒光溫育患者和正常對照血液的等分試樣或PRP樣品； 血小板和血小板相關(guān)顆粒的免疫檢測的受體特異性MoAb，受體特異性MoAb，排除抗激活CD41a(GPIIb/IIIA)抗體、抗-P-選擇素CD62p抗體的受體特異性MoAb ； 抗激活 CD41a(GPIIb/IIIA)抗體； 抗-P-選擇素⑶62p抗體； 血小板陰離子-磷脂的膜聯(lián)蛋白A5蛋白用于檢測血小板促凝血活性； 2)隨后在室溫溫育15-30分鐘，用緩沖液稀釋所述樣品和分析， 其中患者的樣品的信號水平等于或大于正常的平均數(shù)+2個標準差表明循環(huán)血小板或血小板相關(guān)顆粒的激活。
17.系統(tǒng)，其包括用于進行權(quán)利要求1或2所述的方法的試劑盒。
18.系統(tǒng)，其包括用于進行權(quán)利要求16所述的方法的試劑盒。
19.系統(tǒng)，其包 括用于進行權(quán)利要求1-16任一所述的方法的試劑盒。
【文檔編號】A61K31/727GK103596576SQ201280014196
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月20日
【發(fā)明者】阿龍·托梅 申請人:阿龍·托梅