專利名稱：用于分子治療的生物降解連接劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表面修飾，更具體而言涉及分子與表面的交聯(lián)并當(dāng)交 聯(lián)生物降解時釋放分子。
背景技術(shù)：
多種生物材料，包括核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、藥物(pharmaceutical agent)和診斷劑的遞送已經(jīng)是廣泛研究的焦點(diǎn)。基因治療通常被理解 為是指設(shè)計(jì)用于將核酸包括反義DNA和RNA、核酶、病毒基因組片 段和功能性活性治療基因遞送至靶細(xì)胞的技術(shù)(Culver, 1994, Gene Therapy: A Handbook for Physicians, Mary Ann Liebert， Inc., New York: NY)。這些核酸本身可具有治療活性，例如抑制mRNA翻譯的反義 DNA，或者它們能夠編碼例如促進(jìn)、抑制、擴(kuò)大或代替細(xì)胞功能的治 療性蛋白?；蛑委煹某晒捎刹僮飨蛴行枰纳锏幕蜻f送率和 量的能力來衡量。
目前包括離體和體內(nèi)基因治療方法在內(nèi)的基因治療策略的嚴(yán)重 缺點(diǎn)是以前描述的載體和遞送系統(tǒng)的組合不能有效地將核酸遞送至
目標(biāo)群體的細(xì)胞內(nèi)部。
通常認(rèn)為病毒載體是最有效的核酸遞送載體。重組復(fù)制缺陷病毒 載體已用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)(即感染或轉(zhuǎn)染)動物細(xì)胞。這些載體包括 逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和皰疹病毒載體。雖然它們對于基 因轉(zhuǎn)移是高效的，但是與使用病毒載體相關(guān)的一個主要缺點(diǎn)是許多病 毒載體不能感染非分裂細(xì)胞。與使用病毒基因載體相關(guān)的另一個嚴(yán)重 問題是這些載體在將它們給予的患者中有引發(fā)免疫反應(yīng)的可能。該免 疫反應(yīng)限制病毒載體的效力，因?yàn)楫?dāng)重復(fù)或長時間給予載體時，患者 的免疫系統(tǒng)迅速清除載體。此外，通過病毒載體向細(xì)胞的基因組中插 入基因可能在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)不期望的突變。與病毒基因載體相關(guān)的其它 問題包括不能隨時間在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)基因表達(dá)、具有毒性和 其它由向人組織遞送病毒載體引起的副作用(例如肝損傷和心肌炎)， 以及有可能產(chǎn)生和向其它人傳播有害病毒顆粒。
此外，如現(xiàn)有技術(shù)方法中使用的那些，病毒基因載體通常不能以 特定的、定位的方式遞送至所選擇的組織。相反，很多現(xiàn)有技術(shù)給予 病毒載體的方法導(dǎo)致載體系統(tǒng)地分散至與期望的靶組織毗鄰的組織 或有液體交換的組織中。這些方法不能定位病毒載體減少了這些方法 的使用，因?yàn)榉嵌ㄎ徊《据d體可能轉(zhuǎn)染非目標(biāo)組織、引發(fā)免疫反應(yīng)、 被迅速從體內(nèi)清除或具有下降的轉(zhuǎn)染能力。非常需要存在以定位方式 遞送病毒載體的方法。
病毒載體可用作載體將蛋白質(zhì)和其它治療分子遞送至該病毒載 體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中。這些蛋白質(zhì)和其它治療分子可以被被動地、非特異 性地引入病毒載體顆粒中?；蛘?，病毒載體特異性引入融合蛋白，所 述融合蛋白具有融合于其中的多肽病毒包裝信號的蛋白質(zhì)。
雖然病毒載體已被廣泛地用于實(shí)驗(yàn)性基因治療方案和人研究
(Feldman等，1997, Cardiovasc. Res. 35:391-404; Roth等，1997， J. Natl. Cancer Inst. 89:21-39)，但是這些載體中尚無任何一種被證明在病毒載
體介導(dǎo)的基因治療中有效。假設(shè)腺病毒載體的缺點(diǎn)至少部分是由于宿 主個體的免疫反應(yīng)導(dǎo)致的有限的轉(zhuǎn)基因表達(dá)及其對宿主個體器官的
細(xì)胞毒作用引起(Sm他等，1996, Gene Ther. 3: 190-200; Tripathy等， 1996， Nat. Med. 2:545-549; Nabel等，1995, Gene Ther, Cardiovasc. Dis. 91 :541-548)。其他研究者已致力于使腺病毒載體突變以使它們具有 相對低的免疫原性和毒性。
除了多數(shù)細(xì)胞類型表現(xiàn)對病毒載體低的攝取效率以及低的由病 毒載體遞送的基因構(gòu)建體表達(dá)水平之外，許多靶細(xì)胞群還以低的數(shù)量 在體內(nèi)存在使得對這些特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染效率甚至被進(jìn)一步降低。 因此，需要可用于有效地將病毒載體遞送至靶細(xì)胞群的基因治療方 法。本領(lǐng)域的其它工作己致力于試圖例如通過將特異性受體配體連接 在載體上而將腺病毒載體特異地靶向具體的細(xì)胞類型(Tzimagiorgis 等，1996, Nucl. Acids 24:3476-3477)。
為用于基因遞送，病毒載體必須以病毒載體中的生物化學(xué)組分保 留它們功能的方式遞送至靶細(xì)胞。具體而言，病毒載體必須保留與耙 細(xì)胞結(jié)合的能力、將載體攜帶的核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部的能力，而且在 一些情況下還有在細(xì)胞內(nèi)催化核酸參與的化學(xué)反應(yīng)(例如反轉(zhuǎn)錄、整 合至宿主細(xì)胞基因組中或促進(jìn)核酸上的基因元件的轉(zhuǎn)錄)的能力。因 此，將病毒載體給予患者而不接觸化學(xué)上嚴(yán)酷或生化上滅活的條件是 重要。此外，許多介質(zhì)都不與同病毒載體接觸相容。理想地，病毒載 體適合用于其中或其上的介質(zhì)應(yīng)該是可生物降解的，且其形式適合用 于手術(shù)介入和治療介入中。
其它研究者證明通過將腺病毒載體與聚賴氨酸或陽離子脂質(zhì)結(jié) 合形成可溶性病毒載體復(fù)合物增強(qiáng)轉(zhuǎn)染(Fasbender等，1997, J. Biol. Chem. 272:6479-6489)。但是這些病毒復(fù)合物仍然具有本文描述的病 毒載體特征性缺點(diǎn)中的許多，包括病毒載體可以被利用與期望的組織 接觸的持續(xù)時間短。
生物材料遞送的一種方法是用含有所述生物材料的組合物包衣
醫(yī)學(xué)器件，所述生物材料從中釋放(例如Goldstein等的美國專利 6,143,037及其中的參考文獻(xiàn))。該包衣的問題在于由于包衣劑的性質(zhì)， 它們可能引起急性或慢性炎癥反應(yīng)(參見Lincoff等，J. Am. Coll. Cardiol.， 29, 808.16 (1997))。由于有限的將核酸有效地轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞 群中以及獲得基因產(chǎn)物體內(nèi)高水平表達(dá)的能力，因此從包衣遞送核酸 也有問題。
此外，目前的方法不提供生物材料與遞送載體之間的足夠強(qiáng)的連 接。例如，將質(zhì)粒DNA引入膠原海綿中并將其植入物骨中可成功地 遞送核酸，但大部分DNA在很短的時間(例如小于1小時)就流失了(參 見Bonadio等，Nat. Med. 1999， 5(7):753-9)。其它已知的方法通過基質(zhì) 生物降解之外的方式不提供生物材料足夠的釋放，而基質(zhì)的生物降解 可能太低效。
己嘗試通過在包衣劑中弓I入生物降解區(qū)來解決這些問題。參見例 如Pathak等的美國專利6,639,014，其公開引入生物降解水凝膠中的 生物學(xué)活性材料的控釋遞送。但是，該方法沒有解決包衣劑與被包衣 表面之間連接不夠緊密的問題。
本發(fā)明的發(fā)明人以前已經(jīng)證明可使用親和接合體(或連接體)例如 特異性抗體或重組蛋白(如受體片段)將基因治療載體與其它遞送系統(tǒng) 的表面連接或包含于其它遞送系統(tǒng)中(參見Levy等的美國專利申請 09/487,949、 Levy等的美國專利申請公開2003/0044408A 1和Levy 等的美國專利6,333,194)。
其它研究者嘗試通過以下方法將帶電荷的生物劑遞送至生物系 統(tǒng)使帶電荷的生物劑與帶有相反電荷的電極表面可逆地結(jié)合，使電 極與生物系統(tǒng)接觸，然后釋放電極表面的電荷(例如美國專利 4,585,652和5,208,154)。由于必須有電導(dǎo)線將電極與電源連接以及從 實(shí)現(xiàn)從電極表面緩釋生物劑的難度，該方法嚴(yán)重受限。因此，這些組
合物用于將病毒載體遞送至特定組織的有用性受限。
仍然非常需要這樣的組合物，其適合于以使生物材料被給予的時 間延長且與該給予相關(guān)的免疫原性降至最低的方式將生物材料遞送 至期望組織。同時，這些組合物不應(yīng)該不利地影響要遞送的生物材料 的生物學(xué)活性(例如載體的轉(zhuǎn)染效率)。本文描述的本發(fā)明的組合物和 方法滿足該需要。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)均以其全部內(nèi)容引入本文作為參考。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供用于將生物材料遞送至動物細(xì)胞或組織的組合 物，所述組合物包含(a)生物材料；(b)具有水解鍵的生物降解交 聯(lián)劑部分，其中所述生物降解交聯(lián)劑部分與所述生物材料共價結(jié)合； 和(c)基質(zhì)，其中所述基質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑部分共價結(jié)合，條 件是通過斷裂所述水解鍵，所述生物降解交聯(lián)劑適于水解，從而釋放 并遞送所述生物材料。
在某些實(shí)施方案中，所述生物材料是選自核酸、基因載體、蛋白 質(zhì)、肽和細(xì)胞的成員。在某些實(shí)施方案中，所述生物材料包括藥物。
在某些實(shí)施方案中，所述水解鍵包括酰氧鍵。
在某些實(shí)施方案中，所述生物降解交聯(lián)劑部分是選自以下的成
員
和
在某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是選自金屬、金屬氧化物、礦物質(zhì)、
陶瓷、聚合物、碳、有機(jī)化材料(organosylatedmaterial)和金屬有機(jī)材
料的成員。
在某些實(shí)施方案中，選擇的所述生物降解交聯(lián)劑部分影響足以釋 放并遞送生物材料的時間。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的組合物的使用方法，所述方法包括使所 述組合物與動物細(xì)胞或組織接觸一段時間，所述時間足以使所述水解 鍵水解并釋放所述生物材料，從而將所述生物材料遞送至動物細(xì)胞或 組織。在該方法的某些實(shí)施方案中，選擇所述組合物的生物降解交聯(lián) 劑部分以影響所述時間。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的組合物的制備方法，所述方法包括提供 生物降解交聯(lián)劑，其具有(a)含有水解鍵的生物降解交聯(lián)劑部分，(b) 生物材料反應(yīng)端基，和(C)基質(zhì)反應(yīng)端基；提供具有至少一個反應(yīng)基
的基質(zhì)；提供生物材料；使所述基質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑的基質(zhì)反 應(yīng)端基反應(yīng)以使所述生物降解交聯(lián)劑部分與所述基質(zhì)共價連接；和使 所述生物材料與所述生物降解交聯(lián)劑的生物材料反應(yīng)端基反應(yīng)，從而 使所述生物材料與所述生物降解交聯(lián)劑部分共價連接以制備所述組 合物。在該方法的某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)反應(yīng)端基是硫醇反應(yīng)基。 在該方法的某些實(shí)施方案中，所述生物材料反應(yīng)端基是磺基琥珀酰亞 胺基酯基團(tuán)、三氟乙磺酸酯(tresylate庫團(tuán)和環(huán)氧基團(tuán)中的至少一種。 在該方法的某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)的至少一個反應(yīng)基是硫醇基。 在該方法的某些實(shí)施方案中，所述生物降解交聯(lián)劑是選自以下的 成員
<formula>formula see original document page 13</formula>(a) (C)
(d)
02
在該方法的某些實(shí)施方案中，所述生物材料是選自核酸、基因載 體、蛋白質(zhì)、肽和細(xì)胞的成員。在該方法的某些實(shí)施方案中，所述生 物材料包括藥物。
在該方法的某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)是選自金屬、金屬氧化物、 礦物質(zhì)、陶瓷、聚合物、碳、有機(jī)化材料和金屬有機(jī)材料的成員。
在該方法的某些實(shí)施方案中，所述生物材料與所述生物材料反應(yīng) 端基在所述基質(zhì)與所述基質(zhì)反應(yīng)端基反應(yīng)之前反應(yīng)，形成生物降解交 聯(lián)劑修飾的生物材料。
在該方法的某些實(shí)施方案中，提供生物降解交聯(lián)劑并與生物材料 反應(yīng)包括提供(i)第一反應(yīng)物，其具有生物材料反應(yīng)端基和第一官
能端基，和(ii)第二反應(yīng)物，其包含(a)含有水解鍵的生物降解交聯(lián) 劑部分、(b)能夠與第一官能端基反應(yīng)的第二官能端基和(c)基質(zhì)反 應(yīng)端基；使生物材料與第一反應(yīng)物的生物材料反應(yīng)端基反應(yīng)；使第一 官能基與第二官能基反應(yīng)，形成所述生物降解交聯(lián)劑修飾的生物材
料。
在該實(shí)施方案的一個變體中，所述第一反應(yīng)物是馬來酰亞胺-(磺 基)琥珀酰亞胺基酯、馬來酰亞胺-三氟乙磺酸酯或吡啶二硫基-(磺基) 琥珀酰亞胺基酯，而所述第二反應(yīng)物是二硫酚、硫醇-二甲硫或雙(二 甲硫)。
本發(fā)明還提供將生物材料遞送至動物細(xì)胞或組織的方法，所述方
法包括提供一種組合物，其包含(a)生物材料；(b)具有水解鍵的生 物降解交聯(lián)劑部分，其中所述生物降解交聯(lián)劑部分與所述生物材料共 價結(jié)合；和(c)基質(zhì)，其中所述基質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑部分共價 結(jié)合，條件是通過斷裂所述水解鍵，所述生物降解交聯(lián)劑適于水解， 從而釋放所述生物材料；和使所述組合物與動物細(xì)胞或組織接觸一段 時間，所述時間足以使所述水解鍵水解并釋放所述生物材料，并從而 將所述生物材料遞送至所述動物細(xì)胞或所述組織。
附圖簡述
將結(jié)合以下附圖描述本發(fā)明，附圖中同樣的參考數(shù)字表示同樣的 元素，其中


圖1A是描述具有蛋白反應(yīng)磺基琥珀酰亞胺基酯基和表面反應(yīng)吡 啶二硫基的生物降解交聯(lián)劑1的圖。
圖1B是描述生物降解交聯(lián)劑2的圖。
圖1C是描述具有三氟乙磺酸酯(蛋白反應(yīng))基和馬來酰亞胺(硫醇 反應(yīng))基的生物降解連接劑的圖。
圖1D是描述具有環(huán)氧(蛋白反應(yīng))基和乙烯砜(硫醇反應(yīng))基的生 物降解連接劑的圖。
圖1E是描述具有五氟苯基酯(蛋白反應(yīng))基和碘乙酰氨基(硫醇反 應(yīng))基的生物降解連接劑的圖。
圖2是描述生物降解交聯(lián)劑1的合成的圖。 圖3是描述生物降解交聯(lián)劑2的合成的圖。
圖4A是描述使用生物降解連接劑2將腺病毒(AdV或Ad)共價固 定于固相支持體上的圖。
圖4B是描述通過水解使橋裂解以釋放固定腺病毒的圖。
圖5是描述任意熒光單位的直方圖，其中區(qū)I代表20小時后的 GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)，區(qū)II代表72小時后的GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)，如實(shí)施例4中所述。
圖6是描述經(jīng)慢速水解的交聯(lián)劑1 (SHC)和快速水解的交聯(lián)劑2 (RHC)連接的Ad的累積等分部分的釋放率的曲線圖。
圖7是描述經(jīng)慢速水解的交聯(lián)劑1 (SHC)和快速水解的交聯(lián)劑2 (RHC)連接的Ad的釋放的曲線圖，其通過在約25天的時間內(nèi)測量表 面熒光強(qiáng)度來獲得。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明被期望開發(fā)這樣的組合物和方法所驅(qū)動，所述組合物和方 法用于使生物材料(如基因載體、重組蛋白質(zhì)、細(xì)胞和藥物)與表面共 價連接以使得當(dāng)所述組合物水解時所述生物材料可以經(jīng)所選擇的生 物降解交聯(lián)劑中鍵的斷裂而從表面受控的釋放。本發(fā)明可用于各種用 于將生物材料遞送至機(jī)體或細(xì)胞的應(yīng)用中。例如，將治療性病毒載體 與冠脈支架共價連接代表抗再狹窄基因治療中的新方法。
當(dāng)研究將基因載體與各種表面連接的方法時，本發(fā)明的發(fā)明人觀 察到當(dāng)使用可商購的雙功能交聯(lián)劑如磺基琥珀酰亞胺基6-(3'-[2-妣啶 二硫基]-丙酰胺基)己酸酯將基因載體與表面共價結(jié)合時，由于載體不 能與表面分離因而不能成功地遞送基因。該觀察將本發(fā)明的發(fā)明人引 領(lǐng)至本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，其中使用生物降解水解的雙功能交聯(lián)劑提供基因 載體與表面的期望的共價連接，并且實(shí)現(xiàn)載體功能的保留、連接劑的 水解以及之后的定位基因轉(zhuǎn)移。
因此，本發(fā)明提供用于將生物材料遞送至動物細(xì)胞或組織的組合
物，所述組合物包含(a)生物材料；(b)具有水解鍵的生物降解交
聯(lián)劑部分，其中所述生物降解交聯(lián)劑部分與所述生物材料共價結(jié)合；
和(c)基質(zhì)，其中所述基質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑部分共價結(jié)合，條
件是通過斷裂所述水解鍵，所述生物降解交聯(lián)劑適于水解，從而釋放 并遞送所述生物材料。在某些實(shí)施方案中，所述生物材料為核酸、基 因載體、蛋白質(zhì)、肽或細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述生物材料包括 藥物。
本發(fā)明基于可經(jīng)可裂解的交聯(lián)劑將腺病毒(Ad)與支架共價連接， 由于交聯(lián)劑的水解使得緩釋功能性Ad來成功地實(shí)現(xiàn)將基因轉(zhuǎn)移至動 脈壁的發(fā)現(xiàn)。制定合成引入水解酯鍵的胺-硫醇-反應(yīng)雙功能交聯(lián)劑1 (
圖1A)和2 (
圖1B)。模型實(shí)驗(yàn)證明化合物1中酯鍵水解的11/2在37 "下為約幾星期，而化合物2的水解則快一個數(shù)量級(t^在同樣條件 下約為幾天)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過選擇適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑， 可以控制生物材料的釋放時間。
將用可水解的交聯(lián)劑2以摩爾比1:30修飾的重組腺病毒構(gòu)建體 Ad-GFP與用單層硫醇化聚烯丙胺雙膦酸酯(thiolated polyallylamine bisphosphonate)包衣的不銹鋼柵偶聯(lián)。使用熒光染料Cy3標(biāo)記的病毒 載體視覺上可見于活化的不銹鋼表面上的物理上結(jié)實(shí)(robust)、抗摩擦 (磨損)的Ad層。在SMC培養(yǎng)物(AIO細(xì)胞)中，帶有共價結(jié)合的Ad-GFP 的不銹鋼柵驅(qū)使嚴(yán)格定位的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，其在轉(zhuǎn)導(dǎo)開始之后20至72 小時內(nèi)增加了X倍，反映了由于交聯(lián)劑水解引起Ad的指數(shù)釋放。熒 光顯微鏡和免疫組化表明，將用共價連接的Ad-GFP類似修飾的不銹 鋼支架在大鼠頸動脈模型(11=6)形成后4天，導(dǎo)致大量的中膜和外膜 轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些結(jié)果證實(shí)了通過本發(fā)明的組合物可成功地在體外和在體內(nèi) 遞送生物材料。
現(xiàn)在將詳細(xì)描述本發(fā)明的組合物的各組分。 生物降解交聯(lián)劑
本發(fā)明的生物降解交聯(lián)劑包含(a)含有水解鍵的生物降解交聯(lián)劑 部分，(b)生物材料反應(yīng)端基，和(c)基質(zhì)反應(yīng)端基。所述生物降解 交聯(lián)劑可以用以下通式描述-
Ft-A、D-A2-Fp
其中Fp是生物材料反應(yīng)端基，其使連接劑的其余部分(Ft-ALD-A、)與 氨基酸(賴氨酸、甲硫氨酸等)殘基共價結(jié)合；A'和AZ是脂族或芳族 橋或基團(tuán)，其也可以含有雜原子(如O、 S、 NH等)；D是在生理?xiàng)l件 下可降解的橋或基團(tuán)，其包含羧酸酯或氨基甲酸酯，或其它在含水介 質(zhì)中能夠逐漸非酶性裂解的橋；Ft是基質(zhì)反應(yīng)端基，優(yōu)選是硫醇反應(yīng) 基(吡啶二硫、馬來酰亞胺、乙烯砜、碘乙酰胺等)。
在某些實(shí)施方案中，所述水解鍵包括酰氧鍵。本發(fā)明的生物降解 交聯(lián)劑的非限制性實(shí)例顯示在
圖1A-E中，它們具有以下式(a)-(e):<formula>formula see original document page 19</formula>(a)
優(yōu)選的交聯(lián)劑是式(a)和(b)的交聯(lián)劑，最優(yōu)選的交聯(lián)劑是式(b)的 交聯(lián)劑。
在某些實(shí)施方案中，所述基質(zhì)反應(yīng)端基是硫醇反應(yīng)基。在某些實(shí) 施方案中，所述生物材料反應(yīng)端基是磺基琥珀酰亞胺基酯基團(tuán)、三氟 乙磺酸酯基團(tuán)和環(huán)氧基團(tuán)中的至少一個。所述基質(zhì)反應(yīng)端基和所述生 物材料反應(yīng)端基的選擇將取決于所選擇的表面和生物材料上的反應(yīng) 基的選擇。例如，如果所述表面的反應(yīng)基是硫醇基，則所述基質(zhì)反應(yīng)
端基是硫醇反應(yīng)基如吡啶二硫基、馬來酰亞氨基、乙烯磺?；h(huán)氧 基團(tuán)或碘乙酰氨基。類似地，如果所述生物材料的反應(yīng)基為氨基，則 所述生物材料反應(yīng)端基將是能夠與氨基反應(yīng)的基團(tuán)如磺基琥珀酰亞 胺基酯基團(tuán)、三氟乙磺酸酯基團(tuán)、環(huán)氧基團(tuán)、五氟苯基酯基團(tuán)等?；?質(zhì)反應(yīng)端基和生物材料反應(yīng)端基可能相同或可能能夠與同一基團(tuán)反 應(yīng)，但是優(yōu)選不同基團(tuán)，并且選擇基團(tuán)時應(yīng)注意使基質(zhì)反應(yīng)端基和生 物材料反應(yīng)端基彼此不反應(yīng)，以防止與表面和/或生物材料反應(yīng)。本 領(lǐng)域技術(shù)人員不需要過度的實(shí)驗(yàn)就應(yīng)該能夠選擇適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)。
具有水解裂解的間隔基的兩種生物降解異雙功能(氨基和硫醇反
應(yīng))交聯(lián)劑1和2 (
圖1A和1B，分別為式(a)和(b))的合成如下所述。 為制備交聯(lián)劑l，使SPDP與3-氨基丙醇反應(yīng)，用己二酸酐將所
得的醇3?；?，生成含有酯鍵的酸4。最后通過化合物4與N-羥基磺
基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的酯化反應(yīng)制備交聯(lián)劑1
(圖2)。
吡啶二硫基-醇3。
將3-氨基丙醇(0.76 ml, 10 mmol)溶于CH2C12 (5 ml)和2-丙醇(3 ml) 的混合物中，在冰浴中冷卻。在約1分鐘內(nèi)逐滴加入SPDP(1.23 g，3.9 mmol)在CH2C12 (2 ml)中的溶液。將混合物在冰浴中攪拌1.25小時， 加入13% NaH2P04水溶液(15 ml)和85% H3P04 (0.5 ml)。將產(chǎn)物用乙 酸乙酯(2x30ml)萃取，有機(jī)層用13% NaH2P04、 15。/。KHC(V冼漆， 并真空干燥。將粗化合物3 (1.14 g)經(jīng)硅膠閃蒸色譜純化，用CHC13 和2-丙醇的混合物(體積100:0-100:7)洗脫。純化合物3的收率1.01 g (94%)。化合物3的TLC (CHCl3-2-丙醇，9: 1): 一點(diǎn)，Rfca.0.3。化合 物3的NMR (CDC13), S， ppm: 1.68 (五重峰，6Hz， 2H)， 2.60 (t， 7Hz， 2H), 3.05 (t， 7Hz， 2H), 3.4 (br" 1H), 3.42 (q, 6Hz， 2H), 3.62 (br,, 2H)， 6.99 (br.， 1H), 7.10 (m， 1H), 7.58國7.65 (m, 2H)， 8.41 (m, 1H)。
吡啶二硫基-羧酸4。
將醇3 (1,44 g， 5.3 mmol)溶于CH2C12 (6 ml)中，加入己二酸酐 (1.74 g， 13.6 mmol)(制備參見N. Ropson, P. H. Dubois, R. Jerome and P. H. Teyssie: Synthesis and characterization of biodegradable homopolymers and block copolymers based on adipic anhydride. Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistiy 1997， 35， 183-192)。將 混合物真空干燥為漿狀物(3.29 g)，使之在22'C下反應(yīng)8小時，并用 吡啶(5ml)稀釋。攪拌10分鐘后，加入水(55ml)，將混合物在35-40 -C下真空濃縮至ca. 30 g。將酸4用CHC13 (2x50 ml)萃取并再萃取入 4% KHC03 (3x40 ml)中。水層用H3P04酸化至pH=3 ，酸4用CHC13 (3x40 ml)萃取，粗化合物(2.59 g)經(jīng)硅膠閃蒸色譜純化，用CHCl3和 2-丙醇的混合物(體積100:0-100:8)洗脫。純化合物4收率1.78 g (84%)?；衔?的TLC: (CHCl3-2-丙醇，9:1): 一點(diǎn)，Rf ca. 0.5。 4 的'H NMR (CDC13)， S, ppm: 1.70 (m， 4H), 1.88 (五重峰，6Hz， 2H)， 2.36 (t, 7Hz, 2H)， 2.38 (t， 7Hz， 2H)， 2.61 (t， 7Hz， 2H)， 3.05 (t， 7Hz, 2H)， 3.36 (q, 6Hz, 2H)， 4.15 (t, 6Hz, 2H), 6,96 (br. t, 1H), 7.16 (m， 1H)， 7.66畫7.73 (m， 2H), 8.44 (m， 1H)。
生物降解異雙功能交聯(lián)劑1
將酸4 (0.934 g, 2.33 mmol)溶于N,N-二甲基乙酰胺(17 ml)中。依 次加入N-羥基磺基琥珀酰亞胺二鈉鹽(Pierce， 0.469 g， 2.16 mmol)、 二 環(huán)己基碳二亞胺(l.OO g， 4.85 mmol)和水(2.0 ml)，將混合物在20-22°C 下攪拌4小時。濾除二環(huán)己脲沉淀，將濾液真空濃縮(在不高于0.1 mm Hg和不高于30。C下)至漿狀物(2.5 g)。用己垸分幾部分(共140 ml)徹 底洗滌漿狀物，用乙酸乙酯研磨(45ml)至固化。在4。C下放置過夜， 濾除固體，用叔丁醇(30ml)、乙酸乙酯(60ml)洗滌，真空干燥。將粗 產(chǎn)物1 (1.215 g)溶于甲醇(30ml)中并用乙醇(30ml)稀釋進(jìn)行純化，濾 過纖維素CC 31 (Whatman)層，將濾液真空濃縮至懸浮液(6.9 g)，隨 后過濾，用乙醇洗滌，并真空干燥。純交聯(lián)劑l收率1.06g(80%)。 1的'H NMR (DMSO-d6)， S, ppm: 1.62 (m， 4H), 1.69 (五重峰，7Hz, 2H)，
2.33 (t, 7Hz, 2H)， 2.49 (t, 7Hz， 2H), 2.68 (t, 7Hz, 2H), 2.85 (dd， 18， 2Hz, 1H), 3.01 (t, 7Hz， 2H), 3.10 (q， 7Hz, 2H), 3.16 (br" 1H), 3.94 (br. d， 1H) 4.01 (t, 7Hz， 2H), 7.25 (m， 1H)， 7.76 (m, 1H)， 7.83 (m， 1H)， 8.00 (br. t, 6Hz， 1H), 8.46 (m, 1H)。
為合成交聯(lián)劑2，使j3-巰基乙醇與2-吡啶亞硫酰氯(從2,2，-二吡 啶二硫化物和Cl2新制)反應(yīng)，用Boc-Gly-OSu將2-(2-吡啶二硫基)乙 醇5酯化。將所得的Boc-甘氨酸酯6脫保護(hù)得到胺7，用己二酸酐將 其酰化。最后，以與交聯(lián)劑1相似的方法制備交聯(lián)劑2 (參見圖3)。
2-(2-吡啶二硫基)乙醇5
將2，2，-二吡啶二硫化物(Sigma-Aldrich， 2.50 g, 11.35 mmol)懸浮 于無水戊垸(150ml)中，在17-2(TC下劇烈攪拌下用02飽和20分鐘。 將所得的2-吡啶亞硫酰氯粘稠懸浮液在15 mmHg下抽空至干，用氬 氣保護(hù)殘余物，加入無水乙酸(39 ml)。在持續(xù)氬氣保護(hù)下，在18-20 。C下在15分鐘內(nèi)向攪拌的混合物中逐滴加入|3-巰基乙醇(1.05 ml)在 無水乙酸(12ml)中的溶液。繼續(xù)攪拌5分鐘，加入水(25ml)。將反應(yīng) 溶液真空干燥至漿狀物(6.66 g)，加入KHC03 (11 g)在7K中(65 ml)的 溶液。反應(yīng)產(chǎn)物用CHCl3(2x50ml)萃取，有機(jī)層用硫酸鈉干燥，濾出 干燥劑，并真空除去溶劑。粗化合物5(3.59g)經(jīng)硅膠閃蒸色譜純化， 用己垸和乙酸乙酯的混合物(體積5:1-1:1)洗脫。純化合物5的收率 2.58 g (92%)。 5的TLC(庚垸-乙酸乙酯，2:3): 一點(diǎn)，Rfca.0.4。化合 物5的！H NMR (CDC13), S， ppm: 2.93 (t, 6Hz， 2H), 3.77 (br. m， 2H)， 5.75 (br. m, 1H), 7.13 (m, 1H), 7.38 (m, IH)， 7.56 (m， 1H), 8.49 (m， IH)。
Boc-保護(hù)的甘氨酸酯6
將于無水吡啶(3.5 ml)中的醇5 (0.818 g， 4.36 mmol)和Boc-甘氨酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯(Boc-GIy-OSu) (Sigma-Aldrich， 1.835 g， 6.45 mmol)在55-65'C下攪拌1小時。將反應(yīng)混合物用甲苯(30 ml)稀釋， 真空干燥。將殘余物(3.28g)溶于乙酸乙酯(40ml)中，用己垸(100ml) 稀釋，過濾并用10Q/。NaCl(50ml)洗滌。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，濾出干燥劑，真空干燥。粗化合物6(1.80g)經(jīng)硅膠閃蒸色譜純化，用己垸 和乙酸乙酯的混合物(體積5:1-1:1)洗脫。純化合物6的收率1.41 g (94%)?；衔?的TLC(庚烷-乙酸乙酯，2:3): —點(diǎn)，Rf ca. 0.7?；?合物6的&麗R (CDC13)， S， ppm: 1,42 (s, 9H), 3.02 (t， 7Hz, 2H), 3.88 (d, 6Hz， 2H)， 4.38 (t， 7Hz， 2H)， 4.98 (br., 1H)， 7.08 (m, 1H), 7.60 - 7.66 (m, 2H), 8.45 (m， 1H)。 吡啶二硫基-羧酸8
將化合物6 (1.431 g， 4.1 mmol)溶于CH2C12 (10 ml)中，并加入 CF3COOH(5ml)。將混合物置于室溫下2小時。真空除去揮發(fā)物，將 殘余的胺7的三氟乙酸酯(3.59 g)溶于CH2C12 (10 ml)和吡啶(5 ml)的 混合物中，在冰浴中冷卻。在1分鐘內(nèi)逐滴加入己二酸酐(1.86g, 14.5 mmol)，將混合物在冰浴中攪拌10分鐘，在室溫下攪拌0.5 h。真空 除去溶劑，將殘余漿狀物用水(40 ml)稀釋，用KHC03 (4.0 g)中和， 真空濃縮至30g(除去吡啶)，用H3P04酸化至pH-3。酸8用CHCl3 (2x30ml)萃取，萃取液用硫酸鈉干燥，真空除去溶劑。在KHC03(3.0 g)存在下，將粗化合物8 (2.35 g)溶于水(60 ml)中。非酸性雜質(zhì)用 CHClr己烷(體積3:1， 60 ml)萃取，水相用H3P04酸化至pH = 4。用 CHC13 (2x45 ml)萃取后，用硫酸鈉干燥，真空除去溶劑，將殘余物(1.86 g)溶于乙酸乙酯(4ml)中，并通過緩慢加入庚烷(4ml)結(jié)晶。放入化合 物8晶種輔助結(jié)晶。濾出晶體，用乙酸乙酯-庚烷(l:l， 10ml)、己垸(IO ml)洗滌，真空干燥。純晶體化合物8的收率1.31 g (85%)?；衔?8的TLC (CHC13—2-丙醇，9: l):一點(diǎn)，RfCa. 0.4?；衔?的^NMR (CDC13)， 5, ppm: 1.67 (m， 4H)， 2.26 (t, 6Hz， 2H)， 2.35 (t, 6Hz， 2H), 3.02 (t， 7Hz， 2H)， 4.00 (d, 6Hz, 2H), 4.39 (t， 7Hz, 2H)， 6.28 (br. t, 6Hz， 1H)， 7.10 (m， 1H)， 7.60畫7.80 (m, 2H)， 8,45 (m, 1H)。
生物降解異雙功能交聯(lián)劑2。如以上制備交聯(lián)劑l中所述，使酸 8 (1.284 g， 3.45 mmol)、 N-羥基磺基琥珀酰亞胺二鈉鹽(Pierce, 0.700 g， 3.22 mmol)和二環(huán)己基碳二亞胺(1.50 g， 4.85 mmol)在N,N-二甲基乙酰胺(26 ml)和水(3.0 ml)中反應(yīng)。交聯(lián)劑2的分離和純化與交聯(lián)劑1 相似。純交聯(lián)劑2的收率1.652 g (90%)。交聯(lián)劑2的NMR (DMSO-d6), S, ppm: 1.61 (m, 4H), 2.18 (t, 6Hz, 2H)， 2.67 (br. t, 6Hz, 2H)， 2. 86 (d， 18Hz， 1H), 3.15 (br" 1H)， 3.1 1 (t， 7Hz, 2H), 3.82 (d, 6Hz, 2H)， 3.94 (br. d, 1H) 4.26 (t， 7Hz， 2H)， 7.26 (m， 1H)， 7.78 (m, 1H), 7.86 (m, 1H)， 8.30 (br. t, 6Hz， 1H)， 8.46 (m， 1H)。
官能化含有反應(yīng)基的表面
本文可互換使用的術(shù)語"表面"、"基質(zhì)"、"基質(zhì)"或"支持 體"是指任何處理或官能化以及要處理或要官能化以含有適合于通過 本發(fā)明的生物降解交聯(lián)劑與生物材料連接的官能團(tuán)的表面。所述表面 的非限制性實(shí)例包括金屬表面、具有至少一個碳的非金屬表面以及復(fù) 合材料例如有機(jī)化金屬。
在本發(fā)明中，"金屬支持體"表示均一的固體勻質(zhì)或非均質(zhì)材料 支持體，或者適用于本發(fā)明的生物材料遞送的支持結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。金屬支 持體可以是具有金屬表面的任何結(jié)構(gòu)，包括器件，且優(yōu)選醫(yī)學(xué)器件。 術(shù)語"醫(yī)學(xué)器件"是指醫(yī)學(xué)介入中可以使用的任何工具、機(jī)械或裝置， 包括但不限于手術(shù)植入物、手術(shù)縫線和假肢。優(yōu)選適用于本發(fā)明的器 件具有至少0.1 mm的空間尺寸。但是，也包括更小的尺寸(即低于0.1 mm)。
如果器件永久地或暫時地與細(xì)胞或組織接觸，其中整個器件或它 的一部分與細(xì)胞或組織接觸，則將該器件"植入"。
本發(fā)明涵蓋的表面可以具有適用于各種目的例如將生物材料遞 送至有機(jī)體的各種形狀或形式。其中，所述表面可以是現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)植 入物例如可被官能化然后經(jīng)處理與生物材料連接的支架、心血管瓣膜 或縫線。此外，可以在將所述表面模塑成期望形狀之前或之后將所述 表面先官能化然后經(jīng)處理以含有所述生物材料。在一些實(shí)施方案中， 所述表面可以是如下所述官能化的聚合物顆粒的形式。
適合于本發(fā)明中生物材料遞送的醫(yī)學(xué)器件包括但不限于心臟瓣
膜、金屬縫線、暫時性關(guān)節(jié)替代物和尿道擴(kuò)張器。其它適用于本發(fā)明 的醫(yī)學(xué)器件包括骨科植入物如關(guān)節(jié)假體、螺釘、釘、螺母、螺栓、板、
棒(rod)、針、線、插件、osteoports、 halo系統(tǒng)以及用于穩(wěn)定或固定脊 椎和長骨骨折或關(guān)節(jié)切斷的其它骨科器件。其它器件可以包括非骨科 器件、暫時性替代物、永久性植入物如氣管造口器件、空腸造口管和 胃造口管、尿道內(nèi)和其它泌尿生殖道植入物、管心針、擴(kuò)張器、支架、 血管夾和過濾器、起搏器、導(dǎo)絲(wire guide)、皮下植入血管插管的入 口以及接觸鏡。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表面是具有不銹鋼表面的 醫(yī)學(xué)器件，例如支架。
可用于本發(fā)明的其它器件的非限制性實(shí)例包括可用于例如科研 或診斷的容器、平臺或板。
以下進(jìn)一步描述使用于本發(fā)明的表面官能化的方法的實(shí)例。
金屬表面
金屬支持體可以用具有與該金屬結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)的單體或聚合 物表面修飾劑官能化，如2002年6月14日遞交的Levy等的美國專 利申請2003/0044408 Al中所述，該申請引入本文作為參考。合適的 金屬材料的實(shí)例是不銹鋼、MP35不銹鋼、氧化鋁、鉑、鉑合金、埃 爾吉洛伊非磁性合金(Elgiloy)、 tivanium、維塔利姆耐熱合金 (vitallium)、鈦、鈦合金、鎳鈦諾(鎳鈦合金)、鉻、鈷及它們的合金和 氧化物。
適用于使金屬支持體官能化的表面修飾劑是任何化合物，其(i) 能夠與金屬表面進(jìn)行化學(xué)配位和(ii)具有反應(yīng)基，該反應(yīng)基是適合于 與生物降解交聯(lián)劑的基質(zhì)反應(yīng)端基進(jìn)行共價反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。
所述表面修飾劑的實(shí)例包括但不限于聚雙膦酸酯和聚胺，優(yōu)選聚 氨基雙膦酸酯。其它具有側(cè)鏈官能團(tuán)用于支鏈連接和擴(kuò)增的表面配位 化合物包括任何含有能夠與金屬離子配位的基團(tuán)(如螯合基團(tuán))如膦酸 基、異羥肟酸、羧基、磺?；喕酋；桶被木酆衔?、低聚物或
單體化合物。
用于金屬表面的表面修飾劑的反應(yīng)基是適合于與生物降解交聯(lián) 劑的基質(zhì)反應(yīng)端基進(jìn)行共價反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。反應(yīng)基的非限制性實(shí)例 包括氨基或硫醇基(也包括潛在的修改形式，例如烷基二硫基，其可 以在使用前被還原為硫醇基)、烷基化基團(tuán)(馬來酰亞氨基、乙烯磺酰 基、環(huán)氧基團(tuán)或碘乙酰氨基)以及其它適用于共價連接其它反應(yīng)基同 時對與表面上的金屬離子的配位相對惰性的基團(tuán)。
聚合物表面修飾劑的聚合骨架在含水環(huán)境中應(yīng)該足夠穩(wěn)定，可由 完全由碳原子組成的鏈代表(例如基于聚烯丙胺的聚合物)，或者可以 向聚合鏈(如聚賴氨酸，為更好地與金屬配位還具有一部分被修飾以 插入螯合基團(tuán)的賴氨酸殘基)中引入雜原子(如氧、氮等)。聚合物表面 修飾劑可以衍生于聚胺或其它聚合物。例如，它可以是具有側(cè)膦酸酯 基或偕雙膦酸酯基(用于與表面上的金屬離子配位)并具有作為潛在的 用于后續(xù)反應(yīng)的硫醇基官能團(tuán)的垸基二硫基的聚合物。
螯合基團(tuán)可以是由幾個能夠與金屬離子配位的單元組成的化學(xué) 實(shí)體，各單元的位置彼此靠近，這樣它們就能同時與同一金屬離子結(jié) 合，因此增加相互作用強(qiáng)度。螯合基團(tuán)可以包含能夠與金屬離子僅形 成金屬氧配位鍵的單元(偕雙膦酸酯基、偕二羧酸酯基或連二羧酸酯 基或異羥肟酸酯基)，或者它們還可以包含其它原子(如亞氨基二乙酸 酯基，其除了金屬氧鍵之外還可以形成涉及叔氨基的金屬氮鍵)。
與金屬表面的配位通常取決于pH，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性介質(zhì)都抑制配 位。較強(qiáng)的螯合劑(如偕雙膦酸酯基)可用于廣泛的pH范圍(大約從2 至12)，而氨基對于與金屬表面的配位要弱得多，可能只在接近其特 征性pKa (對于脂族氨基ca. lO)的很窄的pH范圍內(nèi)有效。這些基團(tuán) 單獨(dú)或組合使用都將適合于基于配位化學(xué)的表面修飾。優(yōu)選地，所述 表面修飾劑是聚胺、聚氨基雙膦酸酯、聚賴氨酸或聚烯丙胺。
例如，可以用含有潛在硫醇基的聚烯丙氨基雙膦酸酯(PAABP)
或聚雙膦酸酯處理金屬表面以通過與雙膦酸酯基的配位結(jié)合形成化
學(xué)吸附層。如果使用PAABP，則可以將PAABP化學(xué)吸附層的伯氨 基轉(zhuǎn)化為潛在的硫醇基，然后其可用于連接本發(fā)明的生物降解交聯(lián) 劑。
還可能通過使用擴(kuò)展化學(xué)(expansion chemistry)的幾種變體擴(kuò)增 與化學(xué)吸附層連接的反應(yīng)官能團(tuán)的數(shù)目。因此，使用擴(kuò)增劑可以控制 反應(yīng)官能團(tuán)的數(shù)目。 一個這樣的變體是存在在化學(xué)吸附層上的硫醇基 與含有多個硫醇反應(yīng)基的聚合物的反應(yīng)，例如用2-吡啶二硫基(PDT 基)修飾的(聚)乙烯亞胺(PEI)(PEI-PDT)，然后用還原劑處理PEI-PDT 形成硫醇基(參見實(shí)施例1)。
例如，吡啶二硫基與硫醇在含水(pH 5-8)和非水介質(zhì)中都迅速反 應(yīng)，形成穩(wěn)定的二硫鍵。通過使用大量過量的PAA-吡啶二硫基聚合 物，擴(kuò)增聚合物的多數(shù)吡啶二硫基將不反應(yīng)，后來可以被還原形成硫 醇基。具有多個吡啶二硫基的聚合物可以從SPDP與聚胺如聚烯丙胺 和聚乙烯亞胺反應(yīng)來制備。"游離堿"形式的這些聚胺可以容易地溶 解于非水溶劑(二氯甲烷或二氯甲烷與異丙醇的混合物)中，并在0-20 t;下與SPDP平穩(wěn)地發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)通常在少于30分鐘內(nèi)完成，沒 有副反應(yīng)(琥珀酰亞胺基酯基的水解或吡啶二硫基的降解)。以這種方 式制備的修飾聚合物可以通過用合適的溶劑(如甲醇或異丙醇)萃取來 除去非聚合物雜質(zhì)(N-羥基琥珀酰亞胺以及有時過量的SPDP)而純 化。
具有至少一個碳的非金屬表面
優(yōu)選的具有至少一個碳的非金屬表面是聚合物表面。本發(fā)明的聚 合物表面可以是生物降解的以及非生物降解的。本發(fā)明中使用的聚合 物表面的非限制性實(shí)例是聚氨酯、聚酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙交 酯-乙交酯共聚物、聚s己內(nèi)酯、聚苯乙烯、聚酰胺、橡膠、硅橡膠、 聚丙烯腈、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯、聚((x-羥酸)、聚二氧雜環(huán)
己酮、聚原酸酯、聚醚酯、聚內(nèi)酯、其混合物及其共聚物。
含有至少一個碳的表面(例如聚合物表面)還可以通過使用例如含 有光活化基團(tuán)和期望的反應(yīng)基的表面修飾劑進(jìn)行官能化，其中所述光 活化基團(tuán)使修飾劑與表面共價結(jié)合，使期望的反應(yīng)基懸掛于表面。
本文使用的術(shù)語"光活化基團(tuán)"表示吸收外部電磁能或動能(熱 能)時能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)如自由基、氮烯、碳烯和酮激活態(tài)的化學(xué)基 團(tuán)。所選擇的這些基團(tuán)對電磁光譜的多個部分產(chǎn)生反應(yīng)，即該基團(tuán)對 光譜的紫外、可見光和紅外部分產(chǎn)生反應(yīng)。優(yōu)選的光活化基團(tuán)是二苯 酮、苯乙酮和芳基疊氮化物。在激發(fā)時，光活化基團(tuán)能夠與包含至少 一個碳的表面如聚合物共價連接。
該表面修飾劑的一個實(shí)例是水溶性光活化聚合物，如2004年4 月16日遞交的本發(fā)明的發(fā)明人的題為"MAGNETICALLY CONTROLLABLE DRUG AND GENE DELIVERY STENTS"的PCT 申請PCT/US04/011861和2005年10月14日遞交的上述PCT申請繼 續(xù)的美國申請11/250,877中所述，該P(yáng)CT申請以其全部內(nèi)容引入本 文。所述水溶性光活化聚合物基于聚合物前體，還包含與聚合物前體 共價連接的以下基團(tuán)光活化基團(tuán)、期望的反應(yīng)基和親水基。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述聚合物前體包含至少一個選自 烯丙胺、乙烯胺、丙烯酸、羧酸、醇、環(huán)氧乙烷和酰肼的單體。優(yōu)選 聚合物前體是聚烯丙胺。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，聚烯丙胺的分 子量為約200 KDa至約5 KDa。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分子量為70 KDa至15KDa。
水溶性光活化聚合物的反應(yīng)基是適合于與生物降解交聯(lián)劑的基 質(zhì)反應(yīng)端基共價反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)。所述反應(yīng)基的非限制性實(shí)例是(伯 或仲)氨基、硫醇反應(yīng)基、羧基、硫醇基、保護(hù)的硫醇基、酰肼基、 環(huán)氧基團(tuán)、醛基和羥基。優(yōu)選硫醇反應(yīng)基是選自2-吡啶二硫基、3-羧基-4-硝基苯基二硫基、馬來酰亞胺基、碘乙酰氨基和乙烯磺?；?br> 成員。
本發(fā)明的水溶性光活化聚合物的親水基以足以使所述水溶性光 活化聚合物溶于水的量存在。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述親水 基是氨基或羧基。
本發(fā)明的水溶性光活化聚合物的反應(yīng)基和親水基可以相同或不 同。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述反應(yīng)基和親水基都是氨基。在
本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述反應(yīng)基是2-吡啶二硫基，而親水基 是羧基。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述光活化基團(tuán)是芳基酮或芳基疊 氮化物。優(yōu)選芳基酮是二苯酮或苯乙酮。
所述水溶性光活化聚合物可以具有一個或多個光活化基團(tuán)。在某 些實(shí)施方案中，所述水溶性光活化聚合物每分子具有至少一個光活化 基團(tuán)。優(yōu)選所述水溶性光活化聚合物每分子具有多個光活化基團(tuán)。更 優(yōu)選，所述光活化基團(tuán)使聚合物前體的至少0.1%，更優(yōu)選至少1%, 最優(yōu)選約20%至約50%的單體單元修飾。
輻照源可以是本領(lǐng)域已知的能夠發(fā)射具有可被本發(fā)明的光活化 基團(tuán)吸收的波長的光的輻照源。用二苯酮作為光活化基團(tuán)時，優(yōu)選 UV燈。
本文中使用的術(shù)語"水溶性聚合物"是指本發(fā)明的水溶性光活化 聚合物可以用水稀釋至至少1重量％、優(yōu)選至至少0.1重量％以在20
x:的溫度下形成單相，條件是水基本不含有機(jī)共溶劑。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述水溶性聚合物是聚烯丙胺系二
苯酮(PAA-BzPh)，其由下式代表
<formula>formula see original document page 29</formula>
其中n是50-2000， k是10-1000。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述水溶性聚合物是進(jìn)一步被修
飾含有2-吡啶二硫基團(tuán)的聚烯丙胺系二苯酮(PDT-BzPh)，其由下式代
(- H-CH2-)n-k,-(— H-CH2-)m-(- H-CH2-)k CH^ CH^ CH^
T ^一T N飛
CH2CH2COOH CHsCHzSS^J^
NH l|JH NH-OC"f VCOPh
0=C 0=C
其中n是50-2000， k是10-1000， m是10-1000。
當(dāng)激發(fā)光活化基團(tuán)時，所述水溶性聚合物與表面共價結(jié)合，并在 表面上形成單分子層。
本文使用的術(shù)語"層"是指通過本發(fā)明的聚合物與表面共價鍵合 形成的連續(xù)或非連續(xù)沉積(deposit)。優(yōu)選所述層高度均勻且純，在于 其基本上由水溶性聚合物組成。 生物材料
本發(fā)明的生物材料可以是任何具有合適的反應(yīng)基如羧基 (-C00H)、氨基(-NH2)或硫醇基(-SH)的分子或大分子。例如，可以使 用經(jīng)修飾含有硫醇基或含有氨基的蛋白質(zhì)或肽。與一個蛋白質(zhì)分子連 接的硫醇反應(yīng)基(2-吡啶二硫、馬來酰亞胺等)與另一蛋白質(zhì)分子(或其 它生物分子)的硫醇基的反應(yīng)被廣泛地用于制備蛋白質(zhì)結(jié)合物(參見 Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego 1996)。在含水介質(zhì)中在溫和條件下，硫醇基與大多數(shù)硫醇反應(yīng) 基(特別是2-吡啶二硫基團(tuán))的反應(yīng)具有非常高的特異性且非?？臁？?以使用二硫橋的部分還原或通過使用多種試劑使賴氨酸殘基硫醇化 來將蛋白質(zhì)硫醇化(參見Hermanson, pp. 57-70)。優(yōu)選具有硫醇反應(yīng)基 的生物材料，優(yōu)選硫醇反應(yīng)基是能夠與生物生物降解交聯(lián)劑的生物材 料反應(yīng)基反應(yīng)的氨基。
所述生物材料還具有治療應(yīng)用。合適的生物材料包括核酸序列如
轉(zhuǎn)座子；促進(jìn)傷口愈合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白如TGF-卩、FGF、 PDGF、 IGF 和GH蛋白以及調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和凋亡的蛋白如Bcl-l家族成員和半胱 氨酸天冬氨酸蛋白酶；腫瘤抑制蛋白質(zhì)如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、p53、PAC、 DCC， NF1、 NF2、 RET、 VHL和WT-1基因產(chǎn)物；細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 如層粘連蛋白、纖連蛋白和整聯(lián)蛋白；細(xì)胞粘附分子如鈣粘著蛋白、 N-CAM、選擇蛋白和免疫球蛋白；抗炎蛋白如胸腺素|3-4、 IL-10和 IL國12。
在某些實(shí)施方案中，所述生物材料包括至少以下之一肝素、共 價肝素或其它凝血酶抑制劑、水蛭素、水蛭肽、阿加曲班、D-苯丙氨 ?；?L-聚-L-精氨?；燃谆蚱渌寡ㄋ帲蛩鼈兊幕旌衔?； 尿激酶、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活物或其它溶血栓藥或它們的混 合物；纖維蛋白溶解劑；血管痙攣抑制劑；鈣通道阻斷劑、硝酸酯、 一氧化氮， 一氧化氮促進(jìn)劑或其它血管擴(kuò)張劑；抗微生物劑或抗生素； 阿司匹林、噻氯匹定、糖蛋白1Ib/IIIa抑制劑或表面糖蛋白受體抑制 劑，或其它抗血小板劑；秋水仙素或其它抗有絲分裂劑或其它微管抑 制劑、二甲亞砜(DMSO)、類維生素A或其它抗分泌劑；松胞菌素或 其它肌動蛋白抑制劑；重塑抑制劑；脫氧核糖核酸、反義核苷酸或其 它用于分子遺傳介入的活性劑；甲氨喋呤或其它抗代謝劑或抗增殖 抓檸檬酸他莫西芬、紫杉斷TaxoF"或其衍生物，或其它抗癌化療
藥；地塞米松、地塞米松磷酸鈉、醋酸地塞米松或其它地塞米松衍生 物，或其它抗炎甾體或非甾體抗炎藥；環(huán)孢菌素或其它免疫抑制劑； 曲匹地爾(PDGF拮抗劑)、血管生成素、血管抑肽(生長激素拮抗劑)、 生長因子或抗生長因子抗體，或其它生長因子拮抗劑；多巴胺、甲磺 酸溴隱亭、甲磺酸培高利特或其它多巴胺激動劑，放療劑；含碘化合 物、含鋇化合物、金、鉭、鉑、鎢或其它作為不透射線劑起作用的重 金屬；肽、蛋白、酶、細(xì)胞外基質(zhì)成分，細(xì)胞成分或其它生物劑；卡 托普利、依那普利或其它血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑；抗壞血酸、
a生育酚、超氧化物岐化酶、去鐵胺、21-氨基甾體化合物(lasaroid) 或其它自由基清除劑、鐵螯合劑或抗氧化劑；前述任何物質(zhì)的14C、 3H、 32P或36S放射標(biāo)記形式或其它放射性標(biāo)記形式；激素；雌激素 或其它性激素；AZT或其它抗聚合酶劑；阿昔洛韋、泛昔洛韋、鹽 酸金剛乙胺、甘昔洛韋鈉或其它抗病毒劑；5-氨基乙酰丙酸、四間羥 基苯基二氫卟吩、十六氟代酞菁鋅、四甲基血卟啉、羅丹明123或其 它光動力治療劑；針對銅綠假單胞菌內(nèi)毒素A并與A431表皮樣癌細(xì) 胞反應(yīng)的IgG2 k抗體，與皂草素結(jié)合的針對去甲腎上腺素能酶多巴 胺p-羥化酶的單克隆抗體，或者其它抗體靶向治療劑；基因治療劑； 以及依那普利和其它前藥，或者它們?nèi)魏蔚幕旌衔?。所述生物材料還 可以選自屬于幾個主要受體家族例如整聯(lián)蛋白、鈣粘著蛋白、免疫球 蛋白超家族、透明質(zhì)酸酯受體和粘液素及它們配體的細(xì)胞粘附分子。
此外，所述生物材料還可以是任何親和配體對的任一組分。該親 和配體對的實(shí)例包括抗生物素-生物素和IgG蛋白A。此外，所述生 物材料可以是任何受體配體對的任一組分。 一個實(shí)例是轉(zhuǎn)鐵蛋白及其 受體。其它親和配體對包括強(qiáng)力的氫鍵或離子鍵合實(shí)體如化學(xué)復(fù)合 物。后者的實(shí)例包括金屬胺復(fù)合物。其它有吸引力的復(fù)合物包括能夠 固定特定序列的寡核苷酸的核酸堿基對，特別是反義對。核酸引誘物 (decoy)或合成的類似物也可用作配對劑以將設(shè)計(jì)的基因載體與感興 趣位點(diǎn)結(jié)合。此外，DNA結(jié)合蛋白也可認(rèn)為是特異性親和劑；這些 包括諸如組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和受體如糖皮質(zhì)激素受體的實(shí)體。
在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物材料是抗核酸抗體。因此所 述抗體可以與編碼減少細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的產(chǎn)物(或產(chǎn)物前體) 的核酸特異性結(jié)合，從而減輕動脈和其它血管的再狹窄問題。經(jīng)抗體 與支持體連接的核酸能夠有效地轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。 一般而言，"基因 治療"領(lǐng)域涉及向靶細(xì)胞內(nèi)遞送一些多核苷酸，例如對含有它們的細(xì) 胞或有機(jī)體具有治療或預(yù)防作用的反義DNA或RNA、核酶、病毒片
段或功能活性基因。Culver, 1994, GENE THERAPY: A HANDBOOK FOR PHYSICIANS (Mary Ann Liebert， Inc., New York, N.Y.)。組合物
中的抗體可以是全長(即天然存在或經(jīng)過正常的免疫球蛋白基因片段 重組形成)的免疫球蛋白分子(如IgG抗體或IgM或任何抗體亞型)或 免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性(即特異性結(jié)合)部分?？贵w包含一個或 多個與核酸特異性結(jié)合的位點(diǎn)(即其基本不與其它類型的分子結(jié)合)。 結(jié)合位點(diǎn)可以是與期望類型的核酸特異性結(jié)合的位點(diǎn)，而與核酸的核 苷酸序列無關(guān)。或者結(jié)合位點(diǎn)可以是只與含有期望的核苷酸序列的核 酸特異性結(jié)合的位點(diǎn)。優(yōu)選抗體是硫醇基修飾的抗體。
多核苷酸與關(guān)聯(lián)抗體之間形成的復(fù)合物可以固定于各種表面上， 因此，當(dāng)表面原位接觸生理環(huán)境時，連接的多核苷酸隨時間推移被釋 放，其以增強(qiáng)多核苷酸向附近細(xì)胞遞送的方式釋放。令人驚奇地，通 過免疫特異性連接進(jìn)行的DNA轉(zhuǎn)移保持了進(jìn)行基因治療的區(qū)域的核 酸水平。
合適的抗體的實(shí)例包括Fv、 F(ab)和F(ab')2片段，它們可經(jīng)常規(guī) 方式例如通過用胃蛋白酶或其它蛋白溶解酶處理抗體來產(chǎn)生。本發(fā)明 的組合物中使用的核酸結(jié)合抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。 "單克隆"抗體僅包含一種類型的與核酸特異性結(jié)合的抗原結(jié)合位 點(diǎn)。"多克隆"抗體可以包含與核酸特異性結(jié)合的多個抗原結(jié)合位點(diǎn)。 本發(fā)明中使用的抗體優(yōu)選是全長抗體或具有期望結(jié)合性質(zhì)的抗體片 段，例如F(ab')2。
本發(fā)明中使用的核酸可以是任何期望被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)部的多核 苷酸。由此，"治療性多核苷酸"是當(dāng)提供給細(xì)胞或在細(xì)胞中表達(dá)時， 緩解、抑制或預(yù)防疾病或不良癥狀例如炎癥和/或促進(jìn)組織愈合和修 復(fù)(如傷口愈合)的多核苷酸。核酸可以由脫氧核苷核酸或核糖核苷組 成，可以具有磷酸二酯鍵或修飾的鍵，例如以下所述的那些。短語"核 酸"還包括包括由除生物系統(tǒng)中的典型的五種堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、
胸腺嘧咬、胞嘧啶和尿嘧啶之外的堿基組成的多核苷酸。
合適的核酸可以是線性或環(huán)狀DNA或RNA，且可以是單股或雙 股的。這方面的"DNA"種類包括cDNA;基因組DNA;三螺旋 DNA、超螺旋DNA、 Z-DNA以及其它不常見形式的DNA;多核苷 酸類似物；包含編碼包括治療性蛋白在內(nèi)的蛋白的DNA片段的表達(dá) 構(gòu)建體；所謂的"反義"構(gòu)建體，當(dāng)轉(zhuǎn)錄時其生成核酶或反義RNA; 病毒基因組片段，例如病毒DNA;質(zhì)粒和粘粒；以及基因或基因片 段。
核酸還可以是RNA，例如反義RNA、催化RNA、催化RNA/蛋 白質(zhì)復(fù)合物(S卩"核酶")，以及由其可直接被翻譯生成蛋白質(zhì)，或者 可以被反轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后翻譯分別生成RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的 RNA組成的表達(dá)構(gòu)建體；包含含有經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成DNA所必須的啟動 子/調(diào)節(jié)序列的RNA的可轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體；病毒RNA;以及編碼治療性 蛋白的RNA等。合適的核酸可以根據(jù)核酸被遞送至耙細(xì)胞內(nèi)或其核 內(nèi)后將表現(xiàn)的已知的、預(yù)期的或期望的生物學(xué)活性來選擇。
核酸的長度對于本發(fā)明并不是關(guān)鍵的。可以轉(zhuǎn)染直至全長基因的 任何數(shù)目的堿基對。例如，核酸可以是長約100-10000個堿基對的線 性或環(huán)狀雙股DNA分子，但是也可以使用更長或更短的核酸。
核酸可以是治療劑，如抑制mRNA翻譯的反義DNA分子。或者， 核酸可以編碼治療劑，例如當(dāng)含有核酸的組合物遞送的靶細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物時，所述轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物對于該細(xì)胞或包含該 細(xì)胞的宿主有機(jī)體具有治療作用。治療性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的實(shí)例包括蛋白質(zhì) (如抗體、酶、受體結(jié)合配體、傷口愈合蛋白、抗再狹窄蛋白、抗癌 蛋白以及轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)蛋白)、反義RNA分子、核酶、病毒基因組 片段等。使用本發(fā)明的組合物，核酸同樣可以編碼作為轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的 標(biāo)記物的產(chǎn)物。標(biāo)記物的實(shí)例包括具有可識別的光譜性質(zhì)的蛋白質(zhì)如 綠色熒光蛋白(GFP)和細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白(即可通過使靶細(xì)胞與特
異性結(jié)合該蛋白的活性劑接觸來檢測)。此外，核酸可以是用于預(yù)防 疾病的預(yù)防劑。
對于本發(fā)明而言重要的核酸類別包括編碼影響傷口愈合的蛋白
質(zhì)的多核苷酸。例如，基因egf、 tgf、 kgf、 hb-egf、 pdgf、 igf、 fgf-l、 fgf-2、 vegf、其它生長因子及其受體在傷口愈合中發(fā)揮非常重要的作 用。
另一類編碼調(diào)節(jié)或抵抗炎癥過程的因子的多核苷酸對于本發(fā)明 也是重要的。此外，編碼抗炎劑如MSH、細(xì)胞因子如IL-10或減輕 炎癥反應(yīng)的受體拮抗劑的基因也是相關(guān)性的。
合適的多核苷酸可以編碼誘導(dǎo)細(xì)胞死亡或促進(jìn)細(xì)胞存活的表達(dá) 產(chǎn)物，這取決于該核酸。這些多核苷酸不僅對于治療致癌細(xì)胞和其它 異常細(xì)胞有用，而且對于誘導(dǎo)正常細(xì)胞中的凋亡也有用。因此，另一 值得注意的本發(fā)明的核酸類別涉及一種多核苷酸，其表達(dá)時編碼抗癌 蛋白或轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生抗癌反義寡核苷酸。由此，短語"抗癌蛋白"和"抗 癌反義寡核苷酸"分別表示當(dāng)將其提供給任何期望細(xì)胞死亡的區(qū)域或 個體中的癌性損害或癌前損害部位時，其在該部位預(yù)防、抑制、逆轉(zhuǎn) 異常或正常細(xì)胞生長或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白或反義寡核苷酸。根據(jù)本 發(fā)明，將該多核苷酸遞送至細(xì)胞可以抑制細(xì)胞生長、分化或遷移以防 止在轉(zhuǎn)移部位或其附近的移動或不期望的組織擴(kuò)張。該抗癌類別的實(shí) 例是編碼已知抗癌蛋白質(zhì)之一的多核苷酸。該多核苷酸將包括例如來 自或衍生自以下基因中的一種或多種的核苷酸序列abl、 akt2、 apc、 bcl2-a、 bcl2-p、 bcl3、 bcl3、 bcl國x、 bad、 bcr、 brcal、 brca2、 cbl、 ccndl、 cdk4、 crk畫II、 csflr/fms、 dbl、 dcc、 dpc4/smad4、 e-cad、 e2fl/rbap、 egfr/erbb-l、 elkl、 elk3、 eph、 erg、 etsl、 ets2、 fer、 fgr/src2、 fas、 Q)s/fes、 fral、 fra2、 fyn、 hck、 hek、 her2/erbb-2/neu、 her3/erbb-3、 her4/erbb-4、 hrasl、 hst2、 hstfl、 ink4a、 ink4b、 int2/fgf3、 jun、 junb、 jund、 kip2、 kit、 kras2a、 kras2b、 ck、 lyn、 mas、 max、 mcc、 met、 mlhl、 mos、msh2、 msh3、 msh6、 myb、 myba、 mybb、 myc、 mycll、 mycn、 nfl、 nf2、 nras、 p53、 pdgfb、 piml、 pmsl、 pms2、 ptc、 pten、 raft、 rbl、 rel、 ret、 rosl、 ski、 srcl、 tall、 tgfbr2、 thral、 thrb、 tiaml、 trk、 vav、 vhl、 wafl、 wntl、 wnt2、 wtl和yesl。同理，抑制這些基因之一表達(dá)的寡核 苷酸可用作抗癌反義寡核苷酸。
具有修飾的核苷酸間鍵的核酸也可用于本發(fā)明的組合物中。例 如，可以使用含有修飾的核苷酸間鍵的核酸，其表現(xiàn)增加的核酸酶穩(wěn) 定性。該多核苷酸包括例如含有一個或多個磷酸酯、硫代磷酸酯、二 硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲氧基乙基氨基磷酸酯、甲縮醛 (formacetal)、硫甲縮醛(thioformacetal) 、 二異丙基甲硅垸基、 acetamidate、氨基甲酸酯、二亞甲基硫化物(-CH2-S-CH2-)、 二亞甲基 亞砜(-CH2-SO-CH2-)、 二亞甲基砜(-CH2-S02-CH2-)、 2'-0-烷基和2'-脫氧-2'-氟-硫代磷酸酯核苷酸間鍵的多核苷酸。
為本發(fā)明的目的，核酸可以通過任何通常用于制備或分離核酸的 常規(guī)方法進(jìn)行制備或分離。例如，根據(jù)已知方法使用可商購獲得的試 劑和合成器化學(xué)合成DNA和RNA。例如參見Gait, 1985，在 OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH (IRL Press, Oxford, England)中。RNA分子也可以通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù) 使用質(zhì)粒如可從Promega Corporation (Madison, WI)獲得的SP65以高 收率制備。核酸可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒兓?，許多這樣的方法都是 已知的。例如，核酸可以通過反相HPLC或離子交換HPLC、分子排 阻色譜或凝膠電泳純化。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，純化方法 將部分地取決于要純化的DNA的大小。核酸還可以通過已知的或以 后開發(fā)的無數(shù)種重組技術(shù)中的任何來制備。
合適的核酸可以經(jīng)基因工程引入各種已知的宿主載體系統(tǒng)中，該 系統(tǒng)提供用于以適合于制備發(fā)明組合物的規(guī)模復(fù)制核酸。載體系統(tǒng)可 以是病毒或非病毒載體。病毒載體系統(tǒng)的具體實(shí)例包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)
錄病毒、腺相關(guān)病毒和單純皰疹病毒。優(yōu)選使用腺病毒載體。非病毒
載體系統(tǒng)包括質(zhì)粒、環(huán)狀雙股DNA分子。病毒和非病毒載體系統(tǒng)可
以使用已知方法設(shè)計(jì)以在其遞送的細(xì)胞中包含用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄、翻譯或
轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸必要元件?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法構(gòu) 建具有可操作地與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制信號連接的蛋白質(zhì)編碼序列
的表達(dá)構(gòu)建體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)和合成技術(shù)。例如， 參見Sambrook等，1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory, New York)以及Ausubel等, 1997, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, New York)。
編碼一個或多個感興趣蛋白的核酸可以操作地與各種不同的啟 動子/調(diào)節(jié)子序列相連。啟動子/調(diào)節(jié)子序列可以包括組成型或誘導(dǎo)型 啟動子，可以在適當(dāng)?shù)臈l件下使用以指導(dǎo)感興趣基因的高水平表達(dá)或 調(diào)控表達(dá)?？梢允褂玫膯幼?調(diào)節(jié)子區(qū)域的具體實(shí)例包括巨細(xì)胞病 毒(CMV)啟動子/調(diào)節(jié)子區(qū)和與SV40早期基因或SV40晚期基因相關(guān) 的啟動子/調(diào)節(jié)子區(qū)。優(yōu)選使用人CMV啟動子，但是基本可以使用任 何指導(dǎo)感興趣基因高水平表達(dá)或調(diào)控表達(dá)的啟動子/調(diào)節(jié)子區(qū)。
所使用的核酸含有組合于單個基因構(gòu)建體上在一個或多個啟動 子控制下的多個蛋白編碼區(qū)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩個或多個蛋白編 碼區(qū)可以在單個啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，核酸的轉(zhuǎn)錄可以包含一個或多 個介于蛋白編碼區(qū)之間的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。因此，可以使用無數(shù) 種不同的基因和遺傳構(gòu)建體。
本發(fā)明的生物材料還包括藥物、顯象劑和診斷劑。
在所述組合物的某些實(shí)施方案中，所述生物材料選自抗體、病毒 載體、生長因子、生物活性多肽、編碼生物活性多肽的多核苷酸、細(xì) 胞調(diào)節(jié)小分子、肽、蛋白、寡核苷酸、基因治療劑、基因轉(zhuǎn)染載體、 受體、細(xì)胞、藥物、藥物遞送劑、 一氧化氮、抗微生物劑、抗生素、
抗有絲分裂劑、二甲亞砜、抗分泌劑、抗癌化療藥、甾體和非甾體抗 炎藥、激素、細(xì)胞外基質(zhì)、自由基清除劑、鐵螯合劑、抗氧化劑、顯
象劑、放療劑。優(yōu)選地，所述生物材料是抗knob抗體、腺病毒、柯 薩奇腺病毒受體D1域(CARD1)、胰島素、血管生成肽、抗血管生成 肽、抗生物素蛋白、生物素、IgG、蛋白質(zhì)A、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白 受體、細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞粘附分子配體。在該方法的某些實(shí)施方案 中，所述生物材料選自核酸、基因載體、蛋白、肽和細(xì)胞的成員。幾 種不同的生物材料可以固定于同 一表面上。 本發(fā)明的組合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明還提供所述組合物的制備方法。該方法包括提供生物降解 交聯(lián)劑，提供具有至少一個反應(yīng)基的基質(zhì)，提供生物材料，使所述基 質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑的基質(zhì)反應(yīng)端基反應(yīng)以使生物降解交聯(lián)劑 部分與基質(zhì)共價連接，以及使所述生物材料與所述生物降解交聯(lián)劑的 生物材料反應(yīng)端基反應(yīng)，從而使所述生物材料與所述生物降解交聯(lián)劑 部分共價連接以制備所述組合物。該方法的非限制性實(shí)例顯示在圖 4A中。不是必需首先使所述生物材料與所述交聯(lián)劑反應(yīng)，但是似乎 這是更方便的順序。因此，在某些實(shí)施方案中，所述使所述生物材料 與所述生物降解交聯(lián)劑的生物材料反應(yīng)端基反應(yīng)在所述使所述基質(zhì) 與所述生物降解交聯(lián)劑的基質(zhì)反應(yīng)端基反應(yīng)之前或與之同時進(jìn)行。
在該方法的某些實(shí)施方案中，提供所述生物降解交聯(lián)劑并與所述 生物材料反應(yīng)包括提供(i)第一反應(yīng)物，其具有生物材料反應(yīng)端基和 第一官能端基，和(ii)第二反應(yīng)物，其包含(a)含有水解鍵的生物降解 交聯(lián)劑部分，(b)能夠與第一官能端基反應(yīng)的第二官能端基，禾n(c)基 質(zhì)反應(yīng)端基；使生物材料與第一反應(yīng)物的生物材料反應(yīng)端基反應(yīng)；和 使第一官能基與第二官能基反應(yīng)，形成所述生物降解交聯(lián)劑修飾的生 物材料。在這些實(shí)施方案中，所述生物降解交聯(lián)劑直接形成于生物材 料上，然后將所得的生物材料/交聯(lián)劑組合與表面連接。在該實(shí)施方
案的一個變體中，所述第一反應(yīng)物是馬來酰亞胺-(磺基)琥珀酰亞胺基 酯、馬來酰亞胺-三氟乙磺酸酯或吡啶二硫基-(磺基)琥珀酰亞胺基酯， 而所述第二反應(yīng)物是二硫酚、硫醇-二甲硫或雙(二甲硫)。
諸如溫度、緩沖劑和反應(yīng)材料等條件可以根據(jù)期望的結(jié)構(gòu)進(jìn)行選 擇。根據(jù)一般化學(xué)原則本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠進(jìn)行該方法。以下在實(shí)
施例2-4中進(jìn)一步提供該方法的非限制性實(shí)例。 生物材料遞送
本發(fā)明還提供本發(fā)明的組合物的使用方法，例如生物材料的遞送 方法，所述方法包括使所述組合物與動物細(xì)胞或組織接觸一段時間， 該時間足以使所述水解鍵水解并釋放所述生物材料，從而將所述生物 材料遞送至動物細(xì)胞或組織。該方法的非限制性實(shí)例在圖4B中顯示。 實(shí)施例5描述了該方法的一個實(shí)例。
在該方法的某些實(shí)施方案中，所選擇的組合物的生物降解交聯(lián)劑 影響所述時間。如前所述，生物降解交聯(lián)劑可以較快水解或較慢水解， 這取決于其設(shè)計(jì)。因此，遞送速率可以通過選擇合適的生物降解交聯(lián) 劑來控制。此外，取決于表面上和生物材料上的反應(yīng)基的數(shù)目，連接 在表面上的生物材料的量可變化。使用例如PEI-PDT的擴(kuò)增方法可 用于獲得含有期望反應(yīng)基數(shù)目的表面。此外，當(dāng)處理PDT基團(tuán)與硫 醇基交換以進(jìn)一步與生物降解交聯(lián)劑反應(yīng)時，可以將一部分PDT基 團(tuán)而不是全部PDT基團(tuán)修飾，因此又提供了另一種選擇期望的生物 材料負(fù)載量的方法。根據(jù)這一指導(dǎo)，生物材料的負(fù)載量可以選擇為可 利用基團(tuán)的100%至0.1%。在一個變體中，負(fù)載量為25%。
參考以下實(shí)施例將進(jìn)一步詳細(xì)例示本發(fā)明，但是應(yīng)該理解不認(rèn)為 本發(fā)明限于此。
實(shí)施例
實(shí)施例1
本實(shí)驗(yàn)證明了使用硫醇可裂解的異雙功能交聯(lián)劑磺基琥珀酰亞胺基6-(3'-[2-吡啶二硫基]-丙酰胺基)己酸酯(磺基-LC-SPDP) (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)將生物材料與不銹鋼表面直接共價 連接的想法。
使500 pCy3-標(biāo)記的腺病毒(Cy3Ad-GFP)(批次11; 1.3xl(^顆粒) 與15 mg LC-磺基-SPDP在室溫下反應(yīng)70分鐘，生成Cy3-標(biāo)記的DPT 修飾的腺病毒(Cy3Ad-PDT-GFP)。將反應(yīng)混合物置于截斷值為10 kDa 的SLIDE-A-LYZER透析盒中，用PBS進(jìn)行透析22小時，換三次PBS。 將最后一份PBS脫氣，其含有l(wèi)OmMEDTA，透析在氬氣氛下進(jìn)行。
第二天，按標(biāo)準(zhǔn)方法(即接觸1N硝酸15分鐘，然后接觸異丙醇 15分鐘，用雙蒸水洗漆5次)預(yù)處理9個316L鋼篩。
將6個篩在60'C下在1.3%的PrSSPAABP溶液中溫育5小時， 所述PrSSPAABP為用2,2-二膦酰基乙基(BP)和吡啶二硫基(PrSS)修 飾的聚烯丙胺(PAA)，而3個篩在6(TC下在用2,2-二膦?；一揎?的3Q/。聚烯丙胺(PAABP)溶液中溫育5小時。然后將篩用雙蒸水(DDW) 洗滌，并使用PrSSPAABP處理的6個篩與三(2-羧基乙基)膦(TCEP) (20 mg/ml，在0.1 M乙酸緩沖液)在室溫下反應(yīng)25分鐘。然后，用乙 酸緩沖液和PBS洗滌篩，其中3個篩與用2-吡啶二硫基團(tuán)(PDT基) 修飾的聚乙烯亞胺(PEI) (PEI-PDT)擴(kuò)增劑(高修飾度(乙烯亞胺鍵總數(shù) 的25%) 09 IA -46-4 - 0.5 ml、 DDW - 1.25 ml、 0.4 M乙酸緩沖液-0.25 ml)在RT和震搖下反應(yīng)40分鐘。擴(kuò)增程序的目的是增加表面上PDT 基團(tuán)的數(shù)目。
將其它3個篩以及與PAABP —起溫育的3個篩在小Eppendorf 管中與在4% BSA中的150 nl透析脫氣的Cy3-標(biāo)記的DPT修飾的腺 病毒(Cy3Ad-PDT-GFP)反應(yīng)。與擴(kuò)增劑反應(yīng)的3個篩用乙酸緩沖液和 PBS洗滌，并與DTT (20 mg/ml，在DDW中)在室溫和震搖下反應(yīng)20 分鐘。最后，將篩用PBS洗滌，在小Eppendorf管中與在4% BSA中 的150 ^透析脫氣的Cy3 Ad-PDT-GFP反應(yīng)。對于所有3組，都在室
溫和震搖下使病毒與篩結(jié)合過夜。
一般而言，3組篩的化學(xué)方案可以如下表示
1. 對照組'.Me-PAABP + (PDT-Ad)(無共價鍵形成)
2. 無擴(kuò)增組(Me-PrSSPAABP+TCEP) -> Me-PAABP-SH + PDT-Ad -> Me-PAABP-Ad
3. PEI擴(kuò)增組(Me-PrSSPAABP+TCEP) -> Me-PAABP-SH + PDT-PEI -> Me-PAABP-PEI-PDT(n) + DTT -> Me-PAABP-PEI-SH(n) 十PDT-Ad -> Me-PABPP-PEI-Ad
在這一一般方案中，為方便參照，將Cy3Ad-PDT-GFP縮寫為PDT-Ad。 第二天，在熒光顯微鏡下檢查篩。對照樣品(第1組)中基本沒有 觀察到熒光，而在第2組的樣品中觀察到低度至中度熒光，在第3組 樣品中觀察到中度至高度熒光。
同一天，將篩置于ca. 60%匯合的HEK 293和A 10 (大鼠動脈平 滑肌細(xì)胞)細(xì)胞培養(yǎng)物中。篩放置后24小時各孔中均沒有觀察到任何 GFP陽性細(xì)胞。然后換培養(yǎng)基，將濃度為40mg/ml的DTT溶于培養(yǎng) 基(80mg/每孔)中。另外溫育5天也沒有出現(xiàn)GFP陽性細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn) 證明難降解的共價連接劑如磺基-LC-SPDP阻止腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
實(shí)施例2
進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)以在使用具有長時水解動力學(xué)的可裂解的(可水解的) N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)交聯(lián)劑檢測Ad與鋼 表面共價結(jié)合的策略。以標(biāo)準(zhǔn)方法預(yù)處理12個316L鋼篩，其中8 個篩在6(TC下、在1 %PrSSPAABP中反應(yīng)5小時。4個對照篩(PAABP 上沒有硫醇基，所以不與Ad共價鍵合)在6(TC下與用2，2-二膦酰基乙 基修飾的3。/。聚烯丙胺(PAABP)反應(yīng)5小時。洗滌篩，用PrSSPAABP 處理的樣品與TCEP (20 mg/ml，在0.1 M乙酸緩沖液中)在室溫和震 搖下反應(yīng)25分鐘。TCEP裂解后，將篩在DDW中洗滌，并與PEI-PDT 擴(kuò)增劑(09IA-46-4;0.5ml、 DDW1.25ml、 0.4M乙酸緩沖液0.25 ml)
反應(yīng)1小時。然后用乙酸緩沖液和DDW洗滌篩，使之與DTT (20 mg/ml，在DDW中)在室溫和震搖下反應(yīng)20分鐘。
平行地，使750 pi Cy3AdGFP (批次14)與30 mg可裂解的SPDP 類似物即生物降解交聯(lián)劑1 (12IA-40-1)(見圖IA)在室溫和震搖下反應(yīng) 1小時。使用經(jīng)脫氣PBS/EDTA預(yù)處理的脫鹽柱(Ultragel A6)純化修 飾的病毒。
然后使活化的病毒與硫醇化篩以及對照篩在5% BSA/脫氣PBS 中反應(yīng)過夜。第二天，在熒光顯微鏡下檢査篩。對照和適當(dāng)結(jié)合的篩 都顯示有Cy3Ad存在。但是，適當(dāng)結(jié)合的篩中相關(guān)Ad的量要高得多 (術(shù)語"適當(dāng)結(jié)合的"是指其中Ad通過還原PrSSPAABP的硫醇基與 篩實(shí)際上共價結(jié)合的情況)。進(jìn)行該對照以評價與篩結(jié)合的總體病毒 中的非特異性結(jié)合組分。
將篩置于匯合的HEK293和30%匯合的A 10細(xì)胞培養(yǎng)物中，24 小時后檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)情況。置于HEK293和A IO細(xì)胞中的對照樣品以及 適當(dāng)結(jié)合的樣品中都沒有觀察到轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。因此，使用本實(shí)施例中 使用的連接劑量，連接劑的長時水解動力學(xué)不能使腺病毒發(fā)生轉(zhuǎn)導(dǎo)。
實(shí)施例3
進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)以探究使用具有快速水解動力學(xué)的可裂解的(可水解 的)SPDP交聯(lián)劑使Ad與鋼表面共價結(jié)合的策略。
將12個316L不銹鋼篩用異丙醇和1 N硝酸洗凈，在8(TC和劇 烈震搖下在1.5% PrSSPAABP中溫育3.5小時。用DDW洗滌篩，使 之與TCEP (30 mg/ml;在0.1 M乙酸緩沖液中)在室溫和震搖下反應(yīng) 30分鐘。依次用乙酸緩沖液和水洗滌后，使篩與PEI-PDT在42。C和 劇烈震搖下反應(yīng)90分鐘。然后用PBS洗滌篩，并與DTT (25 mg/ml， 在DDW中)在室溫和劇烈震搖下反應(yīng)30分鐘。
平行地，用0.5 ml碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH-9.3)稀釋1 ml
Ad-GFP(自產(chǎn)批料，2.25x 1012/ml)。將12.2 mg迅速水解的交聯(lián)劑2 (13 IA - 55-3)(見
圖1 B)溶于1 ml PBS中，并將64 jxl該溶液加入Ad 懸浮液中。再將1 mg Cy3-NHS染料溶于1 ml碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖 液中，將200pl該稀釋液加入反應(yīng)混合物中。使反應(yīng)在室溫和中度震 搖下進(jìn)行40分鐘，再在4卩下進(jìn)行30分鐘。然后使用Ultragel A6將 Ad凝膠過濾至脫氣的PBS/EDTA中，合并含有病毒的部分(5-7.5 ml), 并鼓入氬氣。將1 ml雙修飾的Ad用1 ml脫氣PBS稀釋，使之與篩 在氬氣氛、22。C和劇烈震搖(240rpm)下反應(yīng)14小時。
第二天，用熒光顯微鏡檢查篩，觀察到強(qiáng)的表明病毒結(jié)合的表面 標(biāo)記物，而游離的雙修飾的Ad只具有非常微弱的熒光。令人驚奇地， 表面上的Ad層非常耐磨損，因?yàn)橛盟莸南鹉z手套揉搓篩時熒光 仍大部分保留。
將2個篩置于HEK293細(xì)胞培養(yǎng)物中，將4個篩置于A 10細(xì)胞 培養(yǎng)物中。其余4個篩分別置于250 nl PBS的Eppendorf管中，將試 管在室溫下(n-2)或在4'C下(i^2)震搖68小時。
篩放置后18小時，在HEK 293和A 10培養(yǎng)物中都觀察到強(qiáng)的 定位轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后將來自A IO培養(yǎng)物的篩轉(zhuǎn)移至新細(xì)胞培養(yǎng)物中，18 小時后觀察到強(qiáng)的新的轉(zhuǎn)導(dǎo)(未顯示)，這表明持續(xù)存活的載體仍然存 在。
被指定用于體外"釋放"實(shí)驗(yàn)的篩在開始溫育后68小時進(jìn)行分 析。在4'C下溫育的篩與在室溫下處理的篩相比保留了更高量的Cy3 標(biāo)記的Ad。該觀察與假設(shè)的基于將Ad與鋼表面連接的交聯(lián)劑的水 解的釋放機(jī)制相一致。
實(shí)施例4
用異丙醇和1 N硝酸預(yù)處理9個篩，并在7(TC和劇烈震搖(250 rpm)下在2%的PrSSPAABP溶液中溫育3小時。然后使篩與TCEP (20 mg/ml，在O.l M乙酸緩沖液中)在30。C和震搖下反應(yīng)25分鐘。將篩 洗滌后，與PEI-PDT (14IA-13-1)在30。C和強(qiáng)震搖下反應(yīng)1小時。洗 滌篩并在同樣條件下與DTT(20mg/ml，在水中)反應(yīng)30分鐘。最后， 將洗滌的篩在3(TC和250 rpm的震搖下與用可快速裂解的交聯(lián)劑修 飾的0.5 ml Ad-GFP反應(yīng)2小時。
簡言之，用350 碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液^11=9.3)稀釋350 pl 新Ad-GFP批料(5el2/ml)，并加入在PBS中的75 pl 12.2 mg/ml快速 水解的交聯(lián)劑2 (13IA-55-3)。修飾在室溫下進(jìn)行30分鐘，最后將反 應(yīng)混合物用Ultragel A6進(jìn)行凝膠過濾。合并部分5-8 ml，并用于結(jié)合。
將洗滌的篩置于匯合的單層A 10 (n-6)和HEK 293 (11=3)中。將 培養(yǎng)物照相，然后20和72小時后用熒光測定法分析。
A 10和HEK的結(jié)果(圖5)清楚地表明GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)在20和72小時 之間急劇增加(A 10為ca. 10倍)，而由親和接合體介導(dǎo)的病毒連接系 統(tǒng)的情況則不是這樣。這些結(jié)果表明由于連接劑水解而發(fā)生Ad釋放 (連接劑在室溫下的t1/2為26天)。
實(shí)施例5
將6個不銹鋼VelocityTM支架(Cordis Corp)用異丙醇、THF、氯仿 (在55。C下2小時)、1N硝酸(1小時)洗凈，并加熱至260。C，保持1 小時。然后將支架加捻在導(dǎo)管上，并與2%的PrSSPAABP水溶液在 58。C和250rpm下反應(yīng)4小時。然后，用TCEP (25 mg/ml，在0.1M 乙酸緩沖液中)在40-35。C和250 rpm下將樣品還原25分鐘。洗滌后， 使支架在28。C和250 rpm下與PEI-PDT擴(kuò)增劑(14IA-13-1)反應(yīng)過夜。
然后，用乙酸鹽緩沖液和PBS洗滌樣品，使之與DTT 16mg/ml 在28。C和250 rpm下反應(yīng)25分鐘。平行地，用350 pl碳酸鹽/碳酸氫 鹽緩沖液(pH-9.3)稀釋350 ^ Ad-GFP (5el2/ml)，并加入在PBS中的 75 pi 12.2 mg/ml快速水解的交聯(lián)劑2 (13IA-55-3)溶液。修飾在室溫下
進(jìn)行30分鐘，最后將反應(yīng)混合物用UltmgdA6進(jìn)行凝膠過濾。合并 部分(5-8 ml)。在28t和250 rpm下使DTT步驟后洗滌的支架接觸 Ad/交聯(lián)劑混合物5小時。
使用已建立的方法用TEFLON保護(hù)管鞘使6只大鼠接受支架移 植物。放置支架后4天處死動物。用福爾馬林灌注固定后，取出放入 支架的動脈段。除去支架，將動脈在PBS中洗滌，并將其包埋在最 佳切割溫度的復(fù)合物(低溫塊制備組織學(xué)中通常使用的PVA和PEG 的混合物)中。切割塊，動脈切片直接經(jīng)熒光顯微鏡檢査或用抗GFP 抗體進(jìn)行免疫染色。在全部6只大鼠中，放入支架后3天在放入支架 的動脈段的中膜和外膜中都觀察到了強(qiáng)的GFP表達(dá)。
實(shí)施例6
設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)以研究直接與聚雙膦酸酯修飾的鋼連接的Ad的釋放 速率。使用實(shí)施例2和3中描述的具有慢速水解動力學(xué)和快速水解動 力學(xué)的兩種不同的水解交聯(lián)劑(即分別是交聯(lián)劑1 (SHC)和交聯(lián)劑2 (RHC))。此外，用兩個不同濃度的交聯(lián)劑RHC對Ad進(jìn)行修飾。為 使表面上連接的Ad視覺可見以及使熒光測定評價和顯微鏡評價成為 可能，用交聯(lián)劑和熒光標(biāo)簽Cy3共修飾Ad。
表面結(jié)合的Ad的釋放只有在將其與表面連接的水解鍵全部斷裂 后才發(fā)生。由于交聯(lián)劑中每個單個酯鍵的tm都是常數(shù)且RHC的顯著 更高，所以預(yù)期1)交聯(lián)劑濃度增加由于使控制單個病毒顆粒的全部 交聯(lián)劑分子水解需要的時間延長，所以將減緩Ad的釋放速率，和2) 與SHC處理的Ad相比，用RHC修飾的Ad的釋放速率將更快。
為研究釋放，使用兩種基于熒光的方法以下描述的上清液法和 表面相關(guān)熒光法。
上清液法
在37'C下，將結(jié)合病毒的不銹鋼箔分別置于瀝濾液(PBS/0.06n/。 吐溫-20)中。在預(yù)定的時間點(diǎn)收集上清液，加入新PBS/0.06%吐溫 -20。用熒光測定法測定上清液中Cy3標(biāo)記的Ad的量。 表面相關(guān)熒光法
病毒結(jié)合后，立即用熒光顯微鏡檢查箔表面，使用顯微鏡和相機(jī)
的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)置獲取每片箔的四個隨機(jī)弱場圖像。然后將箔置于 PBS/0.06°/。吐溫-20中。在預(yù)定時間點(diǎn)再次獲取圖像(與換緩沖液并進(jìn) 行上清液取樣同時)。使用Adobe Photoshop生成的直方圖的平均發(fā)光 強(qiáng)度分析數(shù)字圖像用于表面連接的Ad的定量。
使用Carver press將14片1.25cm x 1.25cm的不銹鋼箔壓平，稱 重，用異丙醇和硝酸洗凈，單個在1% PrSSPAABP溶液(N- 12)或1.5% PAABP溶液0SN2，對照)中反應(yīng)3.5小時(72'C， 200 rpm)。用大量DDW 洗滌后，使用PrSSPAABP處理的樣品接觸TCEP (20 mg/ml，在0.1 M 乙酸緩沖液中；37°C，200 rpm)25分鐘。然后將箔洗滌，并與PEI-PDT 擴(kuò)增劑(15IA-36-l)反應(yīng)(90min,37'C，200rpm)。然后用水洗滌箔，并 與DTT反應(yīng)(15 mg/ml; 30 min， RT，輕度震搖；4。C下30 min)。快速洗 滌箔，并與如下所述制備的Cy3/可裂解的交聯(lián)劑共修飾的Ad-tPA反 應(yīng)。
將三等分部分500 pl的病毒(4.3xl0力ml)每份用200 pl碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH-9.3)稀釋至700 pl。然后向三等分部分病毒中的 一等分部分(制劑# l)中加入150 pl Cy3NHS (1 mg/ml，在碳酸鹽順?biāo)?氫鹽緩沖液中)和75 pl可裂解的交聯(lián)劑2 (13IA-55-3; 20 mg/ml，在碳 酸鹽順?biāo)釟潲}緩沖液中)。
同樣地制備制劑弁2，但是代替快速水解的交聯(lián)劑，使用相同摩 爾濃度(75 pl 21.4 mg/ml的PBS溶液)的具有長時水解動力學(xué)的交聯(lián) 劑即交聯(lián)劑2(12IA-40-l)。
最后，與制劑# 1類似地制備制劑#3，但是加入25 pl而不是75 ^的交聯(lián)劑2。對于三種Ad制劑，都在3(TC和200 rpm下結(jié)合30
分鐘，并在室溫和不震搖下再進(jìn)行20分鐘。結(jié)合的Ad樣品用脫氣 的PBS/3 mM EDTA預(yù)處理的Sepharose B6柱進(jìn)行純化。收集部分， 具有4-9 ml (制劑1、 2、 3的純化收率分別為ca. 77、 86和75%)。
為獲得制劑熒光和顆粒數(shù)之間的轉(zhuǎn)換因數(shù)，進(jìn)行分光光度法后立 即用熒光測定法相對Cy3校正曲線對樣品進(jìn)行測定。制劑1、 2、 3 的平均標(biāo)記程度分別為每個病毒體2792、 2472和4152個Cy3殘基。
用1 ml 0.36Q/。吐溫/PBS稀釋制劑1和2，得到6 ml 0.06%的吐溫 /PBS基制劑。用1 ml 0.36。/。的吐溫/PBS和1 ml 0.06。/。的吐溫/PBS稀 釋制劑3，得到7 ml 0.06。/。的吐溫/PBS基制劑。
將1 ml等分部分的制劑井1 (2.695x1011顆粒)加入箔##3-6上。將 lml等分部分的制劑#2 (3.01xl011粒)加入箔絲7-10上。將1 ml等分部 分的制劑#3 (2.25xl()H粒)加入箔絲11-14上以及2個(PAA PB-處理的) 對照箔#1-2上。結(jié)合(以及偽結(jié)合)在28匸和震搖(200 rpm)下進(jìn)行13 小時。將未使用的殘余病毒制劑(2 ml懸浮液l和2， 1 ml懸浮液3) 接觸與結(jié)合箔相同的條件，作為非消耗(depleted)對照。然后用熒光測 定法和分光光度法評價非消耗對照以及各箔的上清液。最后，用熒光 顯微鏡檢査各樣品，每片箔取4個代表性圖像。將樣品分別置于瓶中， 加入lml0.06n/。吐溫/PBS。在預(yù)定的時間點(diǎn)，通過熒光測定法和熒光 顯微鏡分別評價箔上清液和箔表面。
經(jīng)慢速水解的交聯(lián)劑1 (SHC)連接的Ad的釋放速率(累積等分部 分；圖6)比經(jīng)快速水解的交聯(lián)劑2 (RHC)連接的Ad的釋放速率要平 得多。此外，低濃度的RHC比該同一化合物的高濃度允許更快的釋 放(曲線更陡)。通過表面熒光強(qiáng)度估算的釋放(圖7)在一些程度上與這 些數(shù)據(jù)平行(特別是早期時間點(diǎn))。不過，有一個現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)沒有 充分考慮的問題。在顯微鏡檢査中鋼表面的發(fā)光似乎引起Cy3的衰 變，這部分地?fù)p害了該方法獲得的釋放結(jié)果的有效性。但是，由于兩 個實(shí)驗(yàn)都在相同條件下進(jìn)行，因此這一觀察不應(yīng)該改變總效果。
實(shí)施例7
除了實(shí)施例1中描述的擴(kuò)增劑之外，擴(kuò)增程序中還可以使用以下 的基于聚烯丙胺的擴(kuò)增劑。該擴(kuò)增劑的制備如下所述(見路線1)。
通過在水溶液中用強(qiáng)堿性陰離子交換劑Dowex G-55 (Sigma, OH 形式)處理將鹽酸聚烯丙胺(PAA，HC1， Sigma-Aldrich，數(shù)量平均分子 量Mn 10 kDa,加權(quán)平均分子量Mw 15 kDa，聚合度n IOO)轉(zhuǎn)化 為游離PAA堿。然后將水換為2-丙醇，使用在2-丙醇中的PAA堿溶 液(含ca. 1.1 mmol/g順2基團(tuán))用于進(jìn)一步合成。將該溶液(2.207 g, 2.43 mmol NH》用CH2C12 (5 ml)稀釋，在冰上冷卻，在攪拌下2分鐘 內(nèi)逐滴加入在CH2C12中的SPDP (Pierce, 0.379 g, 1.21 mmol)溶液。將 混合物在冰上再攪拌20分鐘，并一次性加入琥珀酸酐(Sigma-Aldrich, 0.161 g, 1.61 mmol)。在冰上再攪拌1小時后，將混合物真空干燥，將 聚合物殘余物與乙酸乙酯共蒸發(fā)直至固化。將固體聚合物用乙酸乙酯 洗滌，干燥并溶于加有KHCO3 (0.556 g,5 55 mmol)的水(10ml)中。將 溶液過濾，用H3P04酸化至pH-3。濾出聚合物沉淀，用水、乙酸乙 酯洗滌，真空干燥。收率0.510 g。 NMR (D20 + K2C03， pH = 9)表 明用2-吡啶二硫基團(tuán)的修飾和用琥珀酰酯基團(tuán)NHCOCH2CH2COOH (k 50)的修飾幾乎相等，前者的信號出現(xiàn)3個帶，位于S 8.20、 7.48 和7.02ppm(強(qiáng)度1:2:1)，后者的CH2位于5 2.41 ppm。
路線1 <formula>formula see original document page 49</formula>
權(quán)利要求
1.一種用于將生物材料遞送至動物細(xì)胞或組織的組合物，所述組合物包含(a)生物材料；(b)具有水解鍵的生物降解交聯(lián)劑部分，其中所述生物降解交聯(lián)劑部分與所述生物材料共價結(jié)合；和(c)基質(zhì)，其中所述基質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑部分共價結(jié)合，條件是通過斷裂所述水解鍵，所述生物降解交聯(lián)劑適于水解，從而釋放并遞送所述生物材料。
2. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述生物材料是選自核酸、基因 載體、蛋白質(zhì)、肽和細(xì)胞的成員。
3. 權(quán)利要求l的組合物，其中所述生物材料包括藥物。
4. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述水解鍵包括酰氧鍵。
5. 權(quán)利要求4的組合物，其中所述生物降解交聯(lián)劑部分是選自 以下的成員<formula>formula see original document page 2</formula><formula>formula see original document page 3</formula>
6. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述基質(zhì)是選自金屬、金屬氧化 物、礦物質(zhì)、陶瓷、聚合物、碳、有機(jī)化材料和金屬有機(jī)材料的成員。
7. 權(quán)利要求1的組合物，其中選擇的所述生物降解交聯(lián)劑部分 影響足以釋放并遞送所述生物材料的時間。
8. 權(quán)利要求1的組合物，其中所述生物材料包括病毒載體，所 述生物降解交聯(lián)劑部分由以下式(b)代表且所述基質(zhì)包括金屬。
9. 權(quán)利要求1的組合物的使用方法，所述方法包括使權(quán)利要求1的組合物與所述動物細(xì)胞或所述組織接觸一段時 間，所述時間足以使所述水解鍵水解并釋放所述生物材料，從而將所 述生物材料遞送至所述動物細(xì)胞或所述組織。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中選擇所述生物降解交聯(lián)劑部分以影 響所述時間。
11. 權(quán)利要求1的組合物的制備方法，所述方法包括提供生物降解交聯(lián)劑，其具有(a)含有水解鍵的生物降解交聯(lián)劑部分，(b)生物材料反應(yīng)端基，禾卩(C)基質(zhì)反應(yīng)端基； 提供具有至少一個反應(yīng)基的基質(zhì)；提供生物材料；使所述基質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑的基質(zhì)反應(yīng)端基反應(yīng)以使所述生物降解交聯(lián)劑部分與所述基質(zhì)共價連接；和使所述生物材料與所述生物降解交聯(lián)劑的生物材料反應(yīng)端基反 應(yīng)，從而使所述生物材料與所述生物降解交聯(lián)劑部分共價連接以制備 所述組合物。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述使所述生物材料與所述生物 降解交聯(lián)劑的生物材料反應(yīng)端基反應(yīng)在所述使所述基質(zhì)與所述生物 降解交聯(lián)劑的基質(zhì)反應(yīng)端基反應(yīng)之前或與之同時進(jìn)行。
13. 權(quán)利要求11的方法，其中所述基質(zhì)反應(yīng)端基是硫醇反應(yīng)基。
14. 權(quán)利要求11的方法，其中所述生物材料反應(yīng)端基是磺基琥 珀酰亞胺基酯基團(tuán)、三氟乙磺酸酯基團(tuán)和環(huán)氧基團(tuán)中的至少一種。
15. 權(quán)利要求11的方法，其中所述基質(zhì)的至少一個反應(yīng)基是硫 醇基。
16. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述生物降解交聯(lián)劑是選自以下 的成員 <formula>formula see original document page 5</formula>
17. 權(quán)利要求11的方法，其中所述生物材料是選自核酸、基因 載體、蛋白質(zhì)、肽和細(xì)胞的成員。
18. 權(quán)利要求ll的方法，其中所述生物材料包括藥物。
19. 權(quán)利要求11的方法，其中所述基質(zhì)是選自金屬、金屬氧化 物、礦物質(zhì)、陶瓷、聚合物、碳、有機(jī)化材料和金屬有機(jī)材料的成員。
20. 權(quán)利要求11的方法，其中所述生物材料與所述生物材料反 應(yīng)端基在使所述基質(zhì)與所述基質(zhì)反應(yīng)端基反應(yīng)之前反應(yīng)，形成生物降 解交聯(lián)劑修飾的生物材料。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述提供所述生物降解交聯(lián)劑和 所述與所述生物材料反應(yīng)包括-提供(i)第一反應(yīng)物，其具有所述生物材料反應(yīng)端基和第一官能 端基，和(ii)第二反應(yīng)物，其包含(a)含有所述水解鍵的所述生物降 解交聯(lián)劑部分、(b)能夠與所述第一官能端基反應(yīng)的第二官能端基和 (c)基質(zhì)反應(yīng)端基；使所述生物材料與所述第一反應(yīng)物的生物材料反應(yīng)端基反應(yīng)；和 使第一官能基與第二官能基反應(yīng)，形成所述生物降解交聯(lián)劑修飾 的生物材料。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中所述第一反應(yīng)物是馬來酰亞胺-(磺 基)琥珀酰亞胺基酯、馬來酰亞胺-三氟乙磺酸酯或吡啶二硫基-(磺基) 琥珀酰亞胺基酯，而所述第二反應(yīng)物是二硫酚、硫醇-二甲硫或雙(二 甲硫)。
23. —種將生物材料遞送至動物細(xì)胞或組織的方法，所述方法包括提供一種組合物，其包含(a)生物材料；(b)具有水解鍵的生物 降解交聯(lián)劑部分，其中所述生物降解交聯(lián)劑部分與所述生物材料共價 結(jié)合；和(c)基質(zhì)，其中所述基質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑部分共價結(jié) 合，條件是通過斷裂所述水解鍵，所述生物降解交聯(lián)劑適于水解，從 而釋放所述生物材料；和使所述組合物與動物細(xì)胞或組織接觸一段時間，該時間足以使所 述水解鍵水解并釋放所述生物材料，從而將所述生物材料遞送至所述 動物細(xì)胞或所述組織。
全文摘要
本發(fā)明提供用于將生物材料遞送至動物細(xì)胞或組織的方法和組合物，所述組合物包含(a)生物材料；(b)具有水解鍵的生物降解交聯(lián)劑部分，其中所述生物降解交聯(lián)劑部分與所述生物材料共價結(jié)合；和(c)基質(zhì)，其中所述基質(zhì)與所述生物降解交聯(lián)劑部分共價結(jié)合，條件是通過斷裂所述水解鍵，所述生物降解交聯(lián)劑適于水解，從而釋放并遞送所述生物材料。本發(fā)明還提供所述組合物的制備方法。本發(fā)明還提供將生物材料遞送至動物細(xì)胞或組織的方法。
文檔編號A01N65/00GK101098703SQ200580046037
公開日2008年1月2日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者I·菲什拜因, I·阿爾費(fèi)里夫, R·J·利維 申請人:費(fèi)城兒童醫(yī)院