專利名稱：耐受脅迫的棉花植物的制作方法
如下發(fā)明涉及修飾的棉花植物，其具有比相應(yīng)未修飾的棉花植物對不利生長條件尤其非生物性脅迫條件的更高抗性，其中所述不利生長條件例如但不限于低溫或高溫、干旱、高光照強(qiáng)度、化學(xué)污染、洪水、高鹽度、高光照強(qiáng)度、高UV輻射。此類耐脅迫棉花植物可以通過降低，尤其在脅迫條件下降低棉花內(nèi)源性parp2基因的表達(dá)，通過修飾棉花內(nèi)源性parp2基因的活性，通過將棉花內(nèi)源性parp2基因與提供更好脅迫耐性的parp2基因的另一個(gè)等位基因交換，或通過其任意組合而獲得。
相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域描述聚ADP核糖聚合酶(PARP)，又稱作聚ADP核糖轉(zhuǎn)移酶(ADPRT)(EC2.4.2.30)，是一種存在于大多數(shù)真核生物內(nèi)的細(xì)胞核酶，其中所述真核生物包括脊椎動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、黏菌、甲藻、除酵母之外的真菌和其它低等真核生物。酶活性還已在多種植物中得到證實(shí)(Payne等，1976；Willmitzer和Wagner，1982；Chen等，1994；O′Farrell，1995)。
PARP催化源自NAD+的ADP-核糖部分主要轉(zhuǎn)移至靶蛋白中的谷氨酸羧基，并且隨后發(fā)生ADP核糖聚合作用。主要的靶蛋白是PARP自身，不過也已證實(shí)組蛋白、高速泳動(dòng)族(high mobility group)染色體蛋白質(zhì)、拓?fù)洚悩?gòu)酶、內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶也顯示受到這種修飾。
來自動(dòng)物的PARP蛋白是113-120kDa的核蛋白，在大多數(shù)細(xì)胞類型中含量豐富，其由三個(gè)主要功能域組成含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的氨基端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、羧基端催化結(jié)構(gòu)域和受到自我修飾(auto-modified)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域(de Murcia和Ménissier de Murcia，1994；Kameshita等，1984；Lindahl等，1995)。體外(in vitro)酶活性在酶結(jié)合至DNA中的單鏈斷口時(shí)明顯提高。體內(nèi)(in vivo)活性由最終引起DNA斷裂的條件誘導(dǎo)(Alvarez-Gonzalez和Althaus，1989；Ikejima等，1990)。中央結(jié)構(gòu)域的自我修飾似乎起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)PARP的作用。
植物細(xì)胞中的PARP活性首先由檢測來自標(biāo)記NAD+的3H摻入根尖細(xì)胞的細(xì)胞核加以證實(shí)(Payne等，1976；Willmitzer和Wagner，1982)。酶活性還從玉米幼苗中得以部分純化并且發(fā)現(xiàn)與表觀分子量113kDa的蛋白質(zhì)相關(guān)，這提示植物PARP可能與來自動(dòng)物的這種酶相似(Chen等，1994；O′Farrell，1995)。
Chen等(1994)報(bào)道了玉米細(xì)胞核內(nèi)的PARP活性并且將這種酶活性與玉米細(xì)胞核的提取物中存在的大約114kDa蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)。
O′ Farrel(1995)報(bào)道在分離自玉米的RNA上開展的RT-PCR擴(kuò)增(使用基于最高度保守序列的簡并引物)產(chǎn)生300bp的片段，其在氨基酸水平顯示與人PARP蛋白60％的同一性。
Lepiniec等(1995)已經(jīng)分離并克隆來自擬南芥菜(Arabidopsisithaliana)的全長cDNA，其編碼與脊椎動(dòng)物PARP的催化結(jié)構(gòu)域具有高度相似性的72kDa蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)的氨基端結(jié)構(gòu)域未顯示與來自脊椎動(dòng)物的PARP相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的任何序列相似性，但是由與多種核蛋白和DNA結(jié)合蛋白的氨基端顯示相似性的四段氨基酸序列(稱作A1、A2、B和C)組成。A1和A2的預(yù)測二級結(jié)構(gòu)是螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)。
Mahajan和Zuo(1998)描述了玉米聚(ADP)核糖聚合酶的純化和cDNA克隆。該酶是由2943bp可讀框編碼的大約115kD(980個(gè)氨基酸)的單鏈多肽。推導(dǎo)的氨基酸序列顯示對已知脊椎動(dòng)物PARP序列40至42％的同一性以及大約50％的相似性。PARP分子的模塊結(jié)構(gòu)特征如兩個(gè)鋅指、推測的核定位信號、自我修飾結(jié)構(gòu)域和NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域在這種玉米酶中保守。
Babiychuk等(1998)描述在植物中發(fā)現(xiàn)兩種聚ADP核糖聚合酶同系物，為典型的含鋅指聚合酶和缺乏特征性氨基端鋅指結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)不典型的PARP蛋白。
目前的命名將典型的含鋅指聚合酶稱作PARP1蛋白(以及相應(yīng)的parp1基因)，而結(jié)構(gòu)不典型的PARP蛋白目前稱作PARP2(以及相應(yīng)的parp2基因)。
可以確定如下數(shù)據(jù)庫項(xiàng)，其顯示已實(shí)驗(yàn)性證實(shí)的和推測的聚ADP核糖聚合酶蛋白序列、其部分或同源序列BAD53855(稻(Oryza Sativa))；BAD52929(稻)；XP_477671(稻)；BAC84104(稻)；AAT25850(玉米(Zeamays))；AAT25849(玉米)；NP_197639(擬南芥菜(Arabidopsis thaliana))；NP_850165(擬南芥菜)；NP_188107(擬南芥菜)；NP_850586(擬南芥菜)；BAB09119(擬南芥菜)；AAD20677(擬南芥菜)；Q11207(擬南芥菜)；C84719(擬南芥菜)；T51353(擬南芥菜)；T01311(擬南芥菜)；AAN12901(擬南芥菜)；AAM13882(擬南芥菜)；CAB80732(擬南芥菜)；CAA10482(擬南芥菜)；AAC79704(玉米)AAC19283(擬南芥菜)；CAA10888(玉米)；CAA10889(玉米)；CAA88288(擬南芥菜)。
Amor等(1998)描述PARP在植物中參與氧脅迫應(yīng)答。作者證實(shí)在培養(yǎng)的大豆細(xì)胞中，PARP通過介導(dǎo)DNA修復(fù)和程序性細(xì)胞死亡過程分別參與對溫和的和嚴(yán)重的非生物性脅迫的應(yīng)答。
WO 99/37789描述了用于影響植物細(xì)胞代謝狀態(tài)的組合物和方法。組合物包含聚ADP核糖聚合酶基因及其部分，尤其是玉米聚ADP核糖聚合酶基因以及用于聚ADP核糖聚合酶基因的反義核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)了該核苷酸序列在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以改變所轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞的代謝狀態(tài)中的用途。
WO 00/04173描述通過導(dǎo)入影響內(nèi)源性聚ADP核糖聚合酶(PARP)基因表達(dá)和/或表觀活性的調(diào)節(jié)PCD的嵌合基因在真核細(xì)胞和生物，尤其植物細(xì)胞和植物中調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡(PCD)的手段和方法。程序性細(xì)胞死亡可以受到抑制或激發(fā)。本發(fā)明尤其涉及編碼具有PARP活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的用途，用于調(diào)節(jié)PCD、用于增強(qiáng)生長速率或用于產(chǎn)生耐受脅迫的細(xì)胞和生物。
現(xiàn)有技術(shù)因此在提供用于修飾棉花內(nèi)源性PARP基因以得到抗脅迫棉花植物的特定棉花PARP基因方面有缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面是產(chǎn)生耐受脅迫的棉花植物的方法，包括以下步驟將嵌合基因?qū)朊藁?xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的棉花細(xì)胞，該嵌合基因包含有效連接的植物可表達(dá)啟動(dòng)子；包含第一DNA區(qū)域和第二DNA區(qū)域的可轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)域，其中第一DNA區(qū)域包含20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的核苷酸序列，所述的20個(gè)連續(xù)核苷酸選自棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；第二DNA區(qū)域包含選自第一DNA區(qū)域中至少19個(gè)或50個(gè)或200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；其中第一DNA區(qū)域和第二DNA區(qū)域彼此處于反向重復(fù)的方向并且其中轉(zhuǎn)錄自可轉(zhuǎn)錄區(qū)域的RNA分子能夠在轉(zhuǎn)錄自第一DNA區(qū)域的RNA區(qū)域和轉(zhuǎn)錄自第二DNA區(qū)域的RNA區(qū)域之間形成雙鏈RNA區(qū)；和包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域；將轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞再生以得到轉(zhuǎn)基因棉花植物；以及例如使用纖維組織培養(yǎng)試驗(yàn)法，使用冷萌發(fā)測定法，通過測定任一活性氧類、NAD或ATP的濃度或通過任何其它脅迫測定法鑒定比非轉(zhuǎn)化棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的轉(zhuǎn)基因棉花植物。parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列可以包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No.19或SEQ IDNo.20的核苷酸序列或編碼包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No21或SEQ ID No22的蛋白質(zhì)或其變體的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供產(chǎn)生耐受脅迫的棉花植物的方法，包括以下步驟向棉花植物的細(xì)胞提供一種或多種雙鏈RNA分子，其中雙鏈RNA分子包含兩條RNA鏈，一條RNA鏈基本上由選自棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中20至21個(gè)連續(xù)核苷酸的RNA核苷酸序列組成；以及鑒定比不包含該雙鏈RNA分子的相同棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的包含該雙鏈RNA分子的棉花植物。雙鏈RNA可以通過嵌合基因整合入細(xì)胞的基因組而提供給細(xì)胞，該嵌合基因包含處于反義方向或有義方向的有效連接至植物可表達(dá)啟動(dòng)子的DNA區(qū)域，該DNA區(qū)域包含選自棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，和包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列可以包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No.19或SEQ ID N0.20的核苷酸序列或編碼包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No21或SEQ IDNo22的蛋白質(zhì)或其變體的核苷酸序列。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供鑒定棉花parp2 DNA片段的方法，包括以下步驟提供能夠自棉花物種如陸地棉(Gossypium hirsutum)、海島棉(Gossypium barbadense)、樹棉(Gossypium arboreum)或草棉(Gossypiumherbaceum)或者自棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)、三裂棉(Gossypium trilobum)、擬似棉(Gossypiumgossypioides)得到的基因組DNA或cDNA；選擇如下的手段用作探針的DNA片段，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列；用作探針的DNA片段，其包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ IDNo12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No 20的核苷酸序列；用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自編碼氨基酸序列SEQ IDNo13、SEQ ID No21或SEQ ID No22的核苷酸序列中20至1328個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No 20的核苷酸序列中20至1328個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；寡核苷酸序列，其具有包含選自編碼SEQ IDNo13、SEQ ID No.21或SEQ ID No22的氨基酸序列的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ IDNo8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；或用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有任一SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3或SEQ ID No4、SEQ IDNo16或SEQ ID No.17的核苷酸序列；并且利用這種手段，通過使用基因組DNA或cDNA和引物實(shí)施PCR或通過使用基因組DNA或cDNA和探針實(shí)施雜交而鑒定片段。所鑒定的片段隨后可以得到分離并且用于獲得耐受脅迫的棉花細(xì)胞。
本發(fā)明還提供鑒定與增加的脅迫耐性有關(guān)的棉花parp2等位基因的方法，包括以下步驟提供不同的棉花植物品系或與棉花祖先植物相關(guān)的植物品系的群體，任選地是經(jīng)誘變?nèi)后w；根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法鑒定群體中每一植物品系的parp2等位基因；分析群體中每一植物品系的脅迫抗性并鑒定這些棉花植物品系，以及將植物品系中增加的脅迫抗性與存在特定parp2等位基因相關(guān)聯(lián)。棉花parp2等位基因可以導(dǎo)入選擇的棉花植物品系以得到耐脅迫植物。
還提供鑒定抗脅迫棉花植物的方法，包括如下步驟自棉花植物起始纖維組織培養(yǎng)物；使纖維組織培養(yǎng)物受到脅迫條件處理，如提高的溫度，優(yōu)選在45℃至50℃的范圍，持續(xù)所選的時(shí)間期限，優(yōu)選在2至4小時(shí)范圍內(nèi)；并且將培養(yǎng)物中的纖維起始或延伸與從對照植物起始并受到脅迫條件處理的培養(yǎng)物中的纖維起始或延伸進(jìn)行比較。
本發(fā)明又一個(gè)目的是提供分離的DNA片段，其編碼包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No20、SEQ ID No21或SEQ ID No15的蛋白質(zhì)或包含選自任一核苷酸序列SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ IDNo12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供包含以下有效連接的DNA片段的嵌合基因植物可表達(dá)啟動(dòng)子；包含處于有義方向的第一DNA區(qū)域和處于有義方向的第二DNA區(qū)域的可轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)域，其中所述第一DNA區(qū)域包含選自棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，其中所述第二DNA區(qū)域包含選自棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，其中通過可轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的RNA分子能夠通過對應(yīng)于第一DNA區(qū)域的RNA區(qū)域和對應(yīng)于第二RNA區(qū)域的RNA區(qū)域間的堿基配對形成雙鏈RNA區(qū)；和在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。嵌合基因還可以包含植物可表達(dá)啟動(dòng)子；DNA區(qū)域，其包含處于有義方向或反義方向的選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，以及包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
本發(fā)明還提供包含此類嵌合基因的棉花植物細(xì)胞以及基本上由此類棉花植物細(xì)胞組成的棉花植物，以及其種子。
本發(fā)明還涉及編碼包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No.21、SEQ ID No22或SEQ ID No15的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或其包含至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的部分的用途，或涉及任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或其包含至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的部分的用途，以增加棉花植物的脅迫耐性；涉及鑒定在棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉或草棉中或來自與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉中的parp2基因或parp2 cDNA；涉及鑒定在棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉、或草棉中或來自與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉中耐受脅迫的parp2等位基因或涉及在棉花物種中導(dǎo)入耐受脅迫的parp2等位基因。
隨著此后將變得顯而易見的本發(fā)明前述以及其它的目的、優(yōu)勢和特征，本發(fā)明的本質(zhì)可以通過參考如下本發(fā)明不同實(shí)施方案地詳細(xì)描述、所附權(quán)利要求書和圖得到更清楚地理解。
附圖簡述


圖1是T-DNA載體pTMT01的示意圖，其包含一旦轉(zhuǎn)錄即產(chǎn)生能夠減少棉花PARP2基因表達(dá)的雙鏈RNA分子的嵌合基因。使用如下縮寫LB左T-DNA邊界；3’nos來自根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)T-DNA的胭脂氨酸合成酶基因的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號；2mepsps來自玉米的雙突變的5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶合成酶蛋白；TPotpC轉(zhuǎn)運(yùn)肽；PcsvmvX、Y、Z木薯脈花葉病毒啟動(dòng)子的第一、第二和第三部分；P35S2花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；parp2Gh棉花parp2核苷酸序列的部分；Pdk內(nèi)含子來自三脈黃菊(Flaveria trinervia)的pdk-內(nèi)含子的內(nèi)含子2；OCS終止子來自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的章魚堿合酶基因的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號；RB右T-DNA邊界；NPTI-片段nptI抗生素耐藥基因的部分；ORI ColE1ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)；ORI pVS1pVS1復(fù)制子的復(fù)制起點(diǎn)。
圖2冷萌發(fā)測定法的圖例說明。對于每一轉(zhuǎn)基因事件(由X軸上的數(shù)字和圖式顯示)，標(biāo)出在16℃萌發(fā)的幼苗的百分?jǐn)?shù)用于純合(H)和不成對的(h)分離群體。
圖3在用于對照棉花植物(◆)或用于包含parp2沉默構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因棉花品系(■)的不同濃度的百草枯存在下溫育后，培養(yǎng)基傳導(dǎo)性的圖例說明。
圖4是對來自棉花的parp2所得到的多種氨基酸序列的比對。GV1由基因組DNA變體一(SEQ ID NO19)編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO21)；cDNA由cDNA編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO12)；GV2基因組DNA變體二(SEQ ID NO20)編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO22)。
本發(fā)明不同實(shí)施方案的詳述本發(fā)明基于如此發(fā)現(xiàn)，即棉花parp2基因或棉花parp2 cDNA是優(yōu)良的源頭核苷酸序列以便通過修飾棉花內(nèi)源性parp2基因的活性、通過將棉花parp2基因交換為提供更好脅迫耐性的parp2基因的另一個(gè)等位基因或通過其任意組合得到耐受脅迫的棉花植物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于通過減少棉花植物細(xì)胞中內(nèi)源性parp2基因表達(dá)、通過產(chǎn)生包含嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物而得到耐脅迫棉花植物的方法，其中所述嵌合基因能夠產(chǎn)生雙鏈RNA(“dsRNA”)分子，此dsRNA分子的互補(bǔ)性RNA鏈包含從棉花物種或從與棉花祖先物種相關(guān)的物種中所得parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列的部分或包含來自棉花物種或棉花祖先相關(guān)的物種的編碼PARP2蛋白質(zhì)的核苷酸序列的部分。
“棉花”，如本文中所用，包括異源四倍體物種陸地棉、海島棉(AD基因組異源多倍體)和二倍體物種樹棉和草棉(A 基因組二倍體)。與棉花祖先相關(guān)的棉種是雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉(D 基因組二倍體)。
從棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種中得到的parp2基因或parp2 cDNA指該物種中天然存在的parp2基因或指對應(yīng)于該物種中天然存在的parp2基因的mRNA的cDNA。類似地，從棉花物種或從棉花祖先物種相關(guān)的物種中得到的PARP2蛋白質(zhì)指該物種中天然存在的蛋白質(zhì)。
此類棉花或棉花祖先相關(guān)的parp2核苷酸序列的實(shí)例包括那些包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ IDNo20所示的核苷酸序列。此類棉花parp2序列的其它實(shí)例包括編碼包含例如氨基酸序列SEQ ID No13或SEQ ID No21或SEQ ID No22的棉花PARP2基因的核苷酸序列。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將迅速明白所例舉的核苷酸序列或其部分可以用于在其它棉花植物中、還在除Cooker312以外的棉花變種或在棉花祖先相關(guān)植物中鑒定其它parp2基因或parp2 cDNA，并且此類核苷酸序列或其部分還可以用于例如在棉花植物中增加脅迫耐性。所例舉的核苷酸序列可以用于選擇i)用作探針的DNA片段，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列；ii)用作探針的DNA片段，其包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列；iii)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至1382個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；iv)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自編碼氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至2000個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；v)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自任一SEQ IDNo5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ IDNo10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至2000個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；vi)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；vii)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自編碼氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；viii)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自任一SEQID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；或ix)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有任一SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No16或SEQ ID No17的核苷酸序列。
x)使用如vi、vii、viii或ix中所述的寡核苷酸作為引物從棉花基因組或cDNA中能夠擴(kuò)增的片段，如用作探針的包含核苷酸序列SEQ IDNo18的片段。
通過使用來自棉花物種、變種和棉花祖先相關(guān)植物的基因組DNA或cDNA以及所提及作為引物的寡核苷酸實(shí)施PCR或通過在來自棉花物種、變種和棉花祖先相關(guān)植物的基因組DNA或cDNA和所提及的探針之間實(shí)施雜交，優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下，可以鑒定和/或分離此類其它的parp2基因或cDNA或其片段。顯然為了得到耐受脅迫的棉花植物的目的，可能不需要鑒定所分離DNA片段的實(shí)際核苷酸序列。然而任選地，已鑒定和/或分離的DNA片段的核苷酸序列或潛在編碼框的氨基酸序列可以對可得到的核苷酸序列或氨基酸序列進(jìn)行比對。還可以證實(shí)在如此得到的序列中存在所謂PARP標(biāo)簽(TGYMFGKG)或編碼此DNA序列的核苷酸序列。酶活性(聚腺苷酰核糖基化)可如例如WO 00/04173中所述進(jìn)行測試。
“嚴(yán)格雜交條件”如本文中所用意指雜交通常于存在至少95％并且優(yōu)選地至少97％序列同一性下在探針和靶序列之間發(fā)生。嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例為在包含50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切的載體DNA如鮭精DNA的溶液中溫育過夜，隨后通過在0.1×SSC中在大約65℃洗滌雜交支持物例如大約10分鐘(兩次)。其它雜交和洗滌條件是眾所周知的并且在Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，ColdSpring Harbor，NY(1989)、尤其第11章中舉例。
使用例舉的parp2核苷酸序列或PARP2氨基酸序列，還可以通過核苷酸或氨基酸的插入、刪除或替換產(chǎn)生序列變體。棉花PARP2蛋白質(zhì)變體可以描述為這樣的蛋白質(zhì)，其包含基于任一氨基酸序列SEQ ID No13、21或22的氨基酸序列，其中在變異位置處的一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)氨基酸由功能相似的氨基酸序列替代?？蓞^(qū)別如下類型的可交換氨基酸-脂族氨基酸(甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、Leu(L)和異亮氨酸(I))
-芳香族氨基酸(苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W))-含羥基的脂族氨基酸(絲氨酸(S)、蘇氨酸(T))-堿性氨基酸(賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H))-酸性氨基酸(天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))-含酰胺的氨基酸(天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q))認(rèn)為保守氨基酸殘基是如下氨基酸SEQ ID No15在372-380、15、35、63、82、113、115、117、123、163、167、168、172、173、183、189、226、234、242、251、266、271、275、285、289、344、367、368、371、386、394、408、415、429、443和445處的氨基酸。所有其它氨基酸位置可以視為變異位置。因此，PARP2蛋白質(zhì)變體可以包括SEQ ID No15的氨基酸序列。
其它變體蛋白質(zhì)是含有來自SEQ ID 13的至少如下氨基酸，其是在來自小鼠、玉米、稻、擬南芥菜和棉花的parp2所編碼的蛋白質(zhì)間的保守氨基酸位置9、11、14、22、31-32、35-36、40-43、47-50、55、57、58、60、67、70-75、78-79、82、91、96、99、100、103、104、106、108、111、114、121、124、126、127、128、154、157、165、166、167、171、175、177、180、186、187、-189、195、198、199、202、203、205、209、217、223、224、225、226、228、229、230、231、232、233、242、244、248、251、256、257、258、259、261、262、264、266、267、278、279、281、286、292、299、306、310、311、314、315、318、319、326、333、337、345-352、353-355、357、358、360、361-363、365、366、367、369、370、371、372-374、376-383、385-389、391-397、406、408-410、412-416、420-422、431、434-435、439、440、442、446、457和460的氨基酸。這些變體蛋白質(zhì)可以在其它位置具有選自在SEQ ID No15所提供的替代物中的氨基酸或它們甚至可以在那些變異位置具有其它氨基酸。
包含在雙鏈RNA分子的一條鏈內(nèi)的parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列的部分應(yīng)當(dāng)長至少19個(gè)核苷酸，但是可以從長度大約19個(gè)核苷酸變化至等同于parp2 cDNA或parp2基因的長度(以核苷酸計(jì))。有義或反義核苷酸序列的總長度因此可以是至少25nt、或至少大約50nt、或至少大約100nt、或至少大約150nt、或至少大約200nt或至少大約500nt。預(yù)期對有義或反義核苷酸序列的總長度不存在上限。然而，出于實(shí)踐原因(例如嵌合基因的穩(wěn)定性)預(yù)期有義或反義核苷酸序列的長度不應(yīng)當(dāng)超過5000nt，尤其不應(yīng)當(dāng)超過2500nt以及可以限于大約1000nt。
可以理解parp2或parp2 cDNA的部分(有義區(qū)或反義區(qū))的總長度越長，對這些區(qū)域和其互補(bǔ)于內(nèi)源性parp2基因中的相應(yīng)序列之間的序列同性要求的嚴(yán)格性越低。優(yōu)選地，目的核酸應(yīng)當(dāng)具有與相應(yīng)靶序列至少大約75％、特別至少大約80％、更特別地至少大約85％、相當(dāng)特別地大約90％、尤其大約95％、更尤其大約100％的序列同一性，非常特別地是與靶序列或其互補(bǔ)序列的相應(yīng)部分相同。然而，優(yōu)選目的核酸總是包括具有與靶核酸的相應(yīng)部分100％序列同一性的大約19個(gè)連續(xù)核苷酸、特別地大約25nt、更特別地大約50nt、尤其大約100nt、非常特別地大約150nt的序列。優(yōu)選地，為計(jì)算序列同一性和設(shè)計(jì)相應(yīng)的有義序列或反義序列，缺口的數(shù)量應(yīng)當(dāng)最小化，尤其對于較短的有義序列是如此。
為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)相關(guān)核苷酸序列或氨基酸序列的表述為百分?jǐn)?shù)的“序列同一性”指在兩個(gè)已優(yōu)化比對的序列中具有完全相同殘基(×100)的位置數(shù)除以加以比較的位置數(shù)。缺口，即在比對中某殘基在一個(gè)序列中存在而在另一個(gè)序列中不存在的位置。兩個(gè)序列的比對通過Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)開展。以上計(jì)算機(jī)輔助的序列比對可以使用常規(guī)軟件程序，如作為Wisconsin Package Version10.1(Genetics Computer Group，Madision，Wisconsin，USA)部分的GAP，使用默認(rèn)計(jì)分矩陣，以缺口產(chǎn)生罰分為50和缺口延伸罰分為3常規(guī)地開展。
顯而易見，每當(dāng)RNA分子的核苷酸序列通過參考相應(yīng)DNA分子的核苷酸序列加以定義時(shí)，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)應(yīng)當(dāng)由尿嘧啶(U)替代。是否談及的是RNA分子或DNA分子，這從本申請的上下文顯而易見。
已經(jīng)證實(shí)沉默特定靶基因的最小要件是在沉默作用嵌合基因的核苷酸序列中存在長大約20-21個(gè)連續(xù)核苷酸的對應(yīng)于靶基因序列的核苷酸序列，其中20-21個(gè)連續(xù)核苷酸中的至少19個(gè)與對應(yīng)的靶基因序列相同?！?0個(gè)連續(xù)核苷酸中的至少19個(gè)”如本文中所用指選自靶基因的20個(gè)連續(xù)核苷酸具有一個(gè)錯(cuò)配核苷酸的核苷酸序列。如本文中所用“耐受脅迫的棉花植物”或“耐受脅迫條件或不利生長條件的棉花植物”是這樣的植物(尤其根據(jù)本發(fā)明方法得到的棉花植物)，當(dāng)受到不利生長條件作用一段時(shí)間后，例如，但不限于干旱、高溫、受限的營養(yǎng)物(尤其氮)供應(yīng)、高光照強(qiáng)度，其比未用本發(fā)明方法處理的對照植物生長更好。這通常從植物的整體外觀顯而易見并且可以例如通過增加的生物質(zhì)產(chǎn)生、不利條件下的持續(xù)營養(yǎng)生長或者更高種子產(chǎn)量進(jìn)行測量。耐脅迫植物具有更廣的生長譜，即它們能夠耐受更大范圍的氣候變化以及其它非生物性變化，而產(chǎn)量不損失。在生物化學(xué)上，脅迫耐性可以表現(xiàn)為在脅迫條件下與對照植物相比，耐受脅迫的植物更高的NAD+-NADH/ATP含量及產(chǎn)生較少的活性氧類。脅迫耐性還可以表現(xiàn)為在相同條件下與對照植物相比，耐受脅迫的植物中更高的葉綠素含量、更高的光合作用以及更低的葉綠素?zé)晒?。耐受脅迫的棉花植物還可以通過在纖維組織培養(yǎng)物中分析脅迫條件對包括升高的溫度在內(nèi)的脅迫條件下纖維起始和/或延伸的影響加以識別。
顯而易見也不需要為了脅迫耐性變得明顯，將植物在不利條件下連續(xù)培植。通常，本發(fā)明的植物或植物細(xì)胞與對照植物或?qū)φ罩参锛?xì)胞之間在脅迫耐性上的差異甚至僅當(dāng)生長期間遭遇相對較短時(shí)間的不利條件時(shí)就會變得明顯。
編碼減少棉花parp2表達(dá)的本發(fā)明嵌合基因的dsRNA可以包含內(nèi)含子，如異源內(nèi)含子，其根據(jù)WO 99/53050(本文中引用作為參考)的公開內(nèi)容位于例如有義區(qū)域和反義RNA區(qū)域間的間隔序列內(nèi)。
近來已經(jīng)明晰雙鏈RNA分子，如以上所述的一種雙鏈RNA分子在植物細(xì)胞中被切割為大約20-21個(gè)核苷酸的小RNA片段，其在降解相應(yīng)mRNA中起到引導(dǎo)序列作用(由Baulcombe，2004綜述)。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生耐受脅迫的棉花植物的方法，包括以下步驟
a)向棉花植物的細(xì)胞提供一種或多種雙鏈RNA分子，其中雙鏈RNA分子包含兩條RNA鏈，一條RNA鏈基本上由選自棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列中20至21個(gè)連續(xù)核苷酸的RNA核苷酸序列組成；和b)鑒定比不包含此雙鏈RNA分子的相同棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的包含所述雙鏈RNA分子的棉花植物。
所提到長20-21nt的dsRNA序列還在常規(guī)的反義RNA介導(dǎo)的沉默或有義RNA介導(dǎo)的沉默過程中產(chǎn)生。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于產(chǎn)生耐受脅迫的棉花植物的方法，包括向棉花植物的細(xì)胞提供嵌合基因的步驟，其中嵌合基因包含有效連接的如下DNA片段a)植物可表達(dá)啟動(dòng)子；b)DNA區(qū)域，其包含處于反義方向或有義方向的選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸；c)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
所提及的反義或有義核苷酸區(qū)域因此可以大致長約21nt至約5000nt，如21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt，或甚至大約2000nt或更長。此外，為了本發(fā)明的目的，不需要所用的抑制性parp2基因分子或嵌合基因編碼區(qū)的核苷酸序列與棉花內(nèi)源性parp2基因完全相同或互補(bǔ)，其靶向棉花內(nèi)源性parp2基因以便減少內(nèi)源性parp2基因在棉花植物中的表達(dá)。序列越長，對整體序列同一性的嚴(yán)格性要求越低。因此，有義區(qū)域或反義區(qū)域可以具有對內(nèi)源性parp2基因或其互補(bǔ)物的核苷酸序列大約40％或50％或60％或70％或80％或90％或100％的整體序列同一性。然而，如所提及，反義區(qū)域或有義區(qū)域應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地包含具有對parp2基因的核苷酸序列大約100％序列同一性的19-20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列。優(yōu)選地大約100％序列同一性的一段序列應(yīng)當(dāng)是大約50、75或100nt。
用于反義RNA或有義RNA介導(dǎo)基因沉默的以上所提及的嵌合基因的效率可以通過包含引起未多聚腺苷酸化的異常(aberrant)parp2抑制性RNA表達(dá)的DNA元件得以進(jìn)一步增強(qiáng)。一種適用于此目的的DNA元件是如WO/001133中所述的編碼自我剪接的核酶的DNA區(qū)域。嵌合基因的效率還可以通過提供如WO 03/076619中所述的已產(chǎn)生的具有核定位信號或核滯留信號的RNA分子得到增強(qiáng)。
例示性的棉花parp2 cDNA核苷酸序列還可以用于在棉花植物或棉花祖先植物的群體內(nèi)鑒定與增加的脅迫耐性相關(guān)的棉花parp2等位基因。棉花植物群體可以為事先經(jīng)誘變的群體。經(jīng)鑒定的棉花parp2等位基因隨后可以使用常規(guī)育種技術(shù)導(dǎo)入選擇的棉花植物品系。
轉(zhuǎn)化棉花植物的方法也在本領(lǐng)域眾所周知。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)化已經(jīng)例如在美國專利5,004,863或在美國專利6,483,013中描述并且通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化棉花例如在WO 92/15675中報(bào)道。
所描述的方法和手段可以用于棉花植物，如Coker 312、Coker310、Coker 5Acala SJ-5、GSC25110、FIBERMAX變種如FIBERMAX 819、Siokra 1-3、T25、GSA75、Acala SJ2、Acala SJ4、Acala SJ5、Acala SJ-C1、Acala B1644、Acala B1654-26、Acala B1654-43、Acala B3991、AcalaGC356、Acala GC510、Acala GAM1、Acala C1、Acala Royale、AcalaMaxxa、Acala Prema、Acala B638、Acala B1810、Acala B2724、AcalaB4894、Acala B5002、非Acala“picker”Siokra、“stripper”變種FC2017、Coker315、STONEVILLE506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC 3027、CHEMBRED A1、CHEMBRED A2、CHEMBRED A3、CHEMBRED A4、CHEMBRED B1、CHEMBRED B2、CHEMBRED B3、CHEMBRED C1、CHEMBRED C2、CHEMBRED C3、CHEMBRED C4、PAYMASTER145、HS26、HS46、SICALA、PIMAS6和ORO BLANCO PIMA以及具有其衍生基因型的植物。
得到的本發(fā)明的轉(zhuǎn)化棉花植物或得到的其中內(nèi)源性parp2基因已由耐受脅迫的parp2等位基因所替代的耐受脅迫的棉花植物可以在常規(guī)育種計(jì)劃中使用以產(chǎn)生更多具有相同特征的植物或在相同或相關(guān)的植物物種中或在雜交植物中導(dǎo)入本發(fā)明的嵌合基因。從轉(zhuǎn)化的植物中得到的種子含有作為穩(wěn)定的基因組插入物的本發(fā)明嵌合基因并且也由本發(fā)明包括。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣顯而易見的是parp2 cDNA或parp2基因組DNA，或如本文中所描述的其部分還可以根據(jù)WO 00/04173中教授的內(nèi)容用于提高任何植物的生長速度或在任何植物的細(xì)胞中增加脅迫耐性。
此外，已知導(dǎo)入反義RNA、有義RNA或雙鏈RNA或編碼性嵌合基因可以引起表型分布，從幾乎不抑制或很少抑制靶基因的表達(dá)至極其強(qiáng)烈或甚至100％抑制靶基因的表達(dá)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇引起所需程度的沉默和所需表型的那些植物細(xì)胞、植物甚至植物品系。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣顯而易見的是分離自不同品種的parp2基因或cDNA，或其部分，可以在核苷酸序列上或在所編碼的多肽的氨基酸上不同，然而在特定區(qū)域內(nèi)顯著相似或甚至完全相同。換言之，parp2基因的不同變體可以共有20-200個(gè)連續(xù)核苷酸序列的相似或相同片段。因此，每當(dāng)說明書或權(quán)利要求書提到包含來自特定核苷酸序列或來自編碼特定氨基酸序列的核苷酸序列中至少x個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA區(qū)域時(shí)，顯而易見其所指的是此類至少x個(gè)連續(xù)核苷酸而無需指出核苷酸序列的來源。
如本文中所用將“包含”解釋為說明存在如所陳述的特性、整數(shù)、步驟或成分，但是不排除一種或多種特性、整數(shù)、步驟或成分的存在或加入。因此，包含核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白質(zhì)可以包含比實(shí)際所引用的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即包含在更大的核酸或蛋白質(zhì)內(nèi)。經(jīng)功能性或結(jié)構(gòu)性定義的包含DNA區(qū)域的嵌合基因可以包含其它DNA區(qū)域等。
如下的非限制性實(shí)施例描述用于在棉花中改變脅迫耐性特征的嵌合基因及其用途。在實(shí)施例中除非另外說明，所有重組DNA技術(shù)根據(jù)如Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY和美國Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols的第1卷和第2卷中所述的標(biāo)準(zhǔn)方案開展。用于植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法在由BIOSScientific Publications Ltd(UK)和英國BlackwellScientificPublications聯(lián)合出版的Plant Molecular Biology Labfax(1993)by R.D.D.Croy中描述。
在全部說明書和實(shí)施例中，參考了序列表中展示的如下序列SEQ ID No 1適用于擴(kuò)增部分棉花parp2基因或cDNA的寡核苷酸P1a的核苷酸序列。
SEQ ID No 2適用于擴(kuò)增部分棉花parp2基因或cDNA的寡核苷酸P1b的核苷酸序列。
SEQ ID No 3適用于擴(kuò)增部分棉花parp2基因或cDNA的寡核苷酸P1c的核苷酸序列。
SEQ ID No 4適用于擴(kuò)增部分棉花parp2基因或cDNA的寡核苷酸P1x的核苷酸序列。
SEQ ID No 5棉花parp2基因(含有PARP標(biāo)簽)變體1的部分cDNA序列。
SEQ ID No 6棉花parp2基因(含有PARP標(biāo)簽)變體2的部分cDNA序列。
SEQ ID No 7棉花parp2基因(含有PARP標(biāo)簽)變體3的部分cDNA序列。
SEQ ID No 8棉花parp2基因(部分2)變體1的部分cDNA序列。
SEQ ID No 9棉花parp2基因(部分2)變體2的部分cDNA序列。
SEQ ID No 10棉花parp2基因(部分2)變體3的部分cDNA序列。
SEQ ID No 11棉花parp2基因(部分2)變體4的部分cDNA序列。
SEQ ID No 12(融合的)棉花parp2 cDNA的部分核苷酸序列。
SEQ ID No 13棉花PARP2蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。
SEQ ID No 14載體pTMT01的T-DNA區(qū)域的核苷酸序列。
SEQ ID No 15棉花PARP2蛋白質(zhì)部分氨基酸序列的變體。
SEQ ID No 16用于制備棉花parp2特異性探針的寡核苷酸引物1。
SEQ ID No 17用于制備棉花parp2特異性探針的寡核苷酸引物2。
SEQ ID No 18棉花parp2特異性探針的核苷酸序列。
SEQ ID No 19包含棉花parp2基因變體1的基因組DNA的核苷酸序列。
SEQ ID No 20包含棉花parp2基因變體2的基因組DNA的核苷酸序列。
SEQ ID No 21可由SEQ ID No 19編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。
SEQ ID No 22可由SEQ ID No 20編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。
SEQ ID No 23棉花parp2基因變體1的mRNA的cDNA拷貝。
SEQ ID No 24棉花parp2基因變體2的mRNA的cDNA拷貝。
實(shí)施例實(shí)施例1分離棉花parp2的cDNA序列在PCR擴(kuò)增部分棉花parp2基因中待用作簡并引物的寡核苷酸序列可以通過比較可得到的來自擬南芥菜、玉米和稻parp2基因的核苷酸序列加以設(shè)計(jì)。使用外顯子中同源性最高的區(qū)域設(shè)計(jì)引物。以這種方式產(chǎn)生如下簡并引物P1a5’-GGTyGCCAAGkGGAACAACAACACC-3’(SEQ ID No1)P1b5’-GGATGATCCdTTrTATkmTCrmTACmAGC-3’(SEQ ID No2)P1c5’-GAGAArATbGTwAChGCsACrArGAArGG-3’(SEQ ID No3)RNA基于Jone等(1985)所描述的方案自棉花愈傷組織(Corker 312)中提取并根據(jù)制造商說明書，使用SuperScriptTMFirst-strandSynthesisSystem for RT-PCR(Invitrogen LifeTechnologies)用于cDNA合成。
使用cDNA作為模板以及使用引物對P1a/P1b，在如下條件中實(shí)施PCR擴(kuò)增5分鐘，95℃復(fù)性35秒，52℃
延伸35秒，72℃變性1分鐘，92℃共50循環(huán)隨后是40秒，52℃以及10分鐘，72℃。
大約580bp的DNA片段得以擴(kuò)增、克隆并且對數(shù)個(gè)克隆測序(包含SEQ ID 5、6和7的序列)。由變異序列編碼的全部預(yù)測氨基酸序列均含有在全部PARP蛋白中保守的所謂PARP標(biāo)簽(TGYMFGKG)。
在已擴(kuò)增序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)允許擴(kuò)增parp2 cDNA上游部分的新(非簡并)引物P1x5’-CAAGAGGAAACAGTTCACAGTGAAGC-3’(SEQ ID No4).
使用如上所述的cDNA和PCR條件，除開展35個(gè)循環(huán)以及使用作為引物的寡核苷酸P1x和P1c外，大約600bp的DNA片段得以擴(kuò)增，其與parp2 cDNA先前已擴(kuò)增的部分parp2 cDNA發(fā)生重疊并且在先前已擴(kuò)增部分的上游構(gòu)成parp2 cDNA的部分。再次鑒定變異序列(SEQ ID No 8-11)。
SEQ ID No.11代表parp2基因各部分融合后的核苷酸序列。SEQ IDNo13包括由SEQ ID No12的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)PARP2的氨基酸序列。
以A基因組二倍體棉花植物和AD四倍體植物的基因組DNA開展DNA雜交。使用數(shù)種限制性酶消化，可以觀察到兩條帶，其中在A基因組二倍體中僅存在一條帶。
實(shí)施例2構(gòu)建含有PARP2沉默基因的T-DNA載體將含有如實(shí)施例1中所述的PARP標(biāo)簽的擴(kuò)增DNA片段用于構(gòu)建一旦轉(zhuǎn)錄即產(chǎn)生RNA分子的嵌合基因，其包含來自于所擴(kuò)增DNA片段的有義和反義DNA序列，并可以發(fā)生堿基配對以形成雙鏈RNA分子。此種嵌合基因可以用于在棉花中減少parp2表達(dá)。為此目的，使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)有效連接如下DNA片段● 包括花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄物的啟動(dòng)子區(qū)(Odell等，1985)的片段(SEQ ID No14從核苷酸2686至核苷酸3191)。
●片段，其包含以有義方向克隆的陸地棉(棉花)非經(jīng)典型聚(ADP核糖)聚合酶parp2 cDNA編碼序列的包括PARP標(biāo)簽的C端部分(SEQ IDNo14從核苷酸3192至核苷酸3617)。
●片段，其含有如Rosche和Westhoff(1995)所述的來自三脈黃菊的正磷酸丙酮酸二激酶基因的第二內(nèi)含子(SEQ ID No14從核苷酸3649至核苷酸4423)。
●片段，其包含以反義方向克隆的陸地棉(棉花)非經(jīng)典型聚(ADP核糖)聚合酶parp2 cDNA編碼序列的包括PARP標(biāo)簽的C端部分(SEQ IDNo14從核苷酸4424至核苷酸4851)。
●包括如De Greve等(1982)所述的根癌農(nóng)桿菌章魚堿合酶基因3′非翻譯區(qū)的片段(SEQ ID No14從核苷酸4852至核苷酸5591)。
將此嵌合基因隨同編碼可選擇標(biāo)記的嵌合基因?qū)朐赥-DNA載體的T-DNA邊界之間以產(chǎn)生pTMT1(見
圖1；pTMT1的T-DNA的序列在SEQID No14中展示)。載體pTMT1衍生自pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele，1989)。載體主鏈含有如下遺傳元件●質(zhì)粒核，其包含來自質(zhì)粒pBR322(Bolivar等，1977)的用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)(ORI ColE1)以及包含來自假單胞菌(Psudomonas)質(zhì)粒pVS1(Itoh等，1984)的用于在根癌農(nóng)桿菌內(nèi)復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)(ORI pVS1)的限制性片段。
●用于在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌內(nèi)復(fù)制并選擇質(zhì)粒的賦予鏈霉素耐藥性和壯觀霉素(aadA)耐藥性的可選擇標(biāo)記基因。
●DNA區(qū)域，其由來自轉(zhuǎn)座子Tn903(Oka等，1981)的nptI基因的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列的片段組成。
將T-DNA載體導(dǎo)入含有輔助Ti-質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌。棉花植物使用所得到的根癌農(nóng)桿菌菌株根據(jù)如美國專利6,483,013中所述的方案轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例3分析攜帶PARP2沉默基因的轉(zhuǎn)基因棉花植物得到包含如實(shí)施例1中所述嵌合基因的不同轉(zhuǎn)基因棉花品系。轉(zhuǎn)基因植物品系使用DNA印跡分析法在分子水平進(jìn)行分析。類似地，使用RNA印跡分析植物品系的parp2 RNA表達(dá)并且使用例如ELISA或蛋白質(zhì)印跡法分析PARP2蛋白質(zhì)的存在。PARP活性的指標(biāo)可以利用例如使單鏈DNA斷口(break)可見的TUNEL測定法得到。
T0代的轉(zhuǎn)基因植物品系與Coker312植物回交以在所得到的轉(zhuǎn)化植物品系內(nèi)減少潛在的體細(xì)胞克隆變異。
自我授粉的轉(zhuǎn)基因棉花品系的分離群體使用實(shí)時(shí)PCR分析是否存在處于純合或雜合形式的轉(zhuǎn)基因，或是否缺少轉(zhuǎn)基因。
不同植物品系受到不同形式的脅迫處理。將轉(zhuǎn)基因植物的同源群體與未轉(zhuǎn)化的參考植物比較，或使用分離群體，隨后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定純合、雜合和不成對的植物品系。
第一個(gè)測試是“冷萌發(fā)測定法”，其中將種子在沙質(zhì)土壤中在溫度5℃萌發(fā)。類似測試還如Schulze等，1996，Schulze等，1996，Duesterhaus等，1999或Duesterhaus等，2000所述加以使用。
另一個(gè)測試是在對植物進(jìn)行視觀評分之前，使正在生長的植物受到各種時(shí)間長度的干旱或增加的溫度作用(或其組合)，隨后在用于棉花的標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下生長一段時(shí)間。
由于還已知棉花纖維起始和/或延伸易受例如包括寒冷在內(nèi)的多種脅迫條件損害，因此發(fā)展了一種測定法，籍此分析降低的溫度或升高的溫度對起始自不同轉(zhuǎn)基因植物品系的纖維組織培養(yǎng)物的影響。為此目的，起始(initiate)纖維組織培養(yǎng)物，尤其如Beasly和Ting，1974所述。培養(yǎng)物隨后受到改變的溫度(例如在45-50℃，2小時(shí)-4小時(shí))處理一段時(shí)間并且記錄對纖維起始的影響。
又一個(gè)測試是基本如WO02/066972(本文中引用作為參考)中所描述的適應(yīng)性測試(fitness assay)，如其中所描述施加于外植體材料的脅迫條件可以由其它脅迫條件替代或補(bǔ)充，如在降低和升高的溫度下栽培。
還基本如歐洲專利申請EP04077624.7(本文中引用作為參考)中所述，分析轉(zhuǎn)基因植物品系以確定與正常條件下相似植物材料中活性氧類的水平相比，脅迫條件下植物或外植體中活性氧類的水平。類似地，還基本如歐洲專利申請EP04077624.7中所述，分析轉(zhuǎn)基因植物品系以確定與正常條件下相似植物材料中ATP和/或NAD(H)的水平相比，脅迫條件下植物或外植體中ATP和/或NAD(H)的水平。
不同的轉(zhuǎn)基因植物品系還用于田間試驗(yàn)，其中將灌溉的田地與未灌溉的田地比較。當(dāng)與不成對的植物以及參考棉花植物相比較，對植物就農(nóng)學(xué)適應(yīng)性(fitness)和損傷進(jìn)行視觀評分。
觀察到在一個(gè)或多個(gè)以上所述的測定法中對不利生長條件或所施加的脅迫條件表現(xiàn)出增加的耐受性的數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品系。
實(shí)施例4以轉(zhuǎn)基因棉花品系進(jìn)行的田間試驗(yàn)將如實(shí)施例3中所述的經(jīng)鑒定的不同純合轉(zhuǎn)基因棉花品系以及相應(yīng)的無效品系(null line)用于田間試驗(yàn)，將受到全程灌溉的比較性田地與僅在生長季節(jié)開始時(shí)得到灌溉因而使棉花植物遭受顯著熱脅迫作用的田地加以比較。一場冰雹暴風(fēng)毀壞了部分田地，因而結(jié)果難以解釋。然而，似乎一些轉(zhuǎn)基因品系看上去較健康并具有較多的營養(yǎng)生長，即顯得較有活力。
實(shí)施例5使用冷萌發(fā)測定法分析轉(zhuǎn)基因棉花品系。
使轉(zhuǎn)基因棉花品系自我授粉并且如實(shí)施例3中所述對純合或不成對的子代植物分析分離性子代群體。對每一事件，將來自純合植物或來自不成對的植物的50粒種子分別播種在沙子內(nèi)。托盤在恒定溫度16℃溫育21日，此時(shí)計(jì)數(shù)萌發(fā)的幼苗。棉花種子萌發(fā)對低于18℃的溫度敏感。與此同時(shí)，將來自如上提及的相同種子批次的50粒種子培植在沙子內(nèi)，但白天在26℃溫育并且夜晚在21℃溫育持續(xù)12日。計(jì)數(shù)出現(xiàn)的幼苗數(shù)并用于就種子批次質(zhì)量的任何影響校正冷萌發(fā)測試的數(shù)據(jù)。
圖4代表比較純合品系與不成對品系的11個(gè)不同事件的數(shù)據(jù)。尤其，顯示為品系7、9和11的純合轉(zhuǎn)基因品系性能非常好，因?yàn)槊{迫發(fā)生期間幾乎觀察不到萌發(fā)的喪失。
實(shí)施例6分析轉(zhuǎn)基因棉花品系對百草枯處理的耐受性將來自如實(shí)施例5中因性能良好而得到確認(rèn)的三個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花品系的葉進(jìn)行百草枯耐受性測定，與來自非轉(zhuǎn)基因Coker312的葉比較。為此目的，將大約1平方厘米的葉盤在含有不同濃度(每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù))百草枯溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)溫育。培養(yǎng)皿在黑暗中溫育4小時(shí)，隨后在高光照強(qiáng)度下溫育2小時(shí)。此后，將平皿在黑暗中過夜溫育。百草枯對細(xì)胞膜的破壞次日通過測量溫育培養(yǎng)基的傳導(dǎo)性加以評估。這些測量的結(jié)果在圖3中概括。如可從圖3B中見到，至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因品系顯示比對照品系更耐受百草枯處理。
實(shí)施例7分離編碼棉花parp2的基因組克隆棉花parp2基因組克隆使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)從陸地棉BAC文庫分離。簡言之，使用所得到的探針通過PCR擴(kuò)增來篩選商業(yè)可得到的來自陸地棉品種Maxxa的BAC文庫，其中PCR擴(kuò)增使用棉花cDNA作為模版以及具有SEQ ID No16和SEQ ID No17的序列的寡核苷酸作為引物。寡核苷酸的序列衍生自SEQ ID No12的cDNA序列。所擴(kuò)增的DNA片段的序列作為SEQ ID No18提供。12個(gè)BAC克隆鑒定為推測的陽性候選者。分析這些克隆的限制性片段帶型顯示了兩種類型的克隆。基因組變體1是文庫中最豐富的代表。將每一克隆的代表通過引物步移法測定核苷酸序列。對于兩個(gè)克隆的相關(guān)部分的核苷酸序列分別作為SEQ ID No19和SEQ IDNo20提供?？梢杂蛇@些核苷酸序列所編碼的多肽的氨基酸序列分別作為SEQ ID No21和SEQ ID No22提供。轉(zhuǎn)錄和剪接后的mRNA的核苷酸序列作為SEQ ID No23和SEQ ID No24提供。將可由基因組克隆的兩種變體(來自品種Maxxa；SEQ ID Nos.20和21)所編碼的多肽比對并且與由cDNA克隆(來自Coker312；SEQ ID No13)編碼的多肽進(jìn)行比較，如圖4中所示。
如所預(yù)期，三種多肽共有顯著的序列同一性或序列同源性.
由基因組克隆編碼的多肽和由cDNA克隆編碼的(不完整)多肽間的主要差異是在由基因組克隆(兩種變體)編碼的多肽中存在額外的一段26個(gè)氨基酸序列(SEQ ID No21從AA 444至AA 469)。
GV1多肽還具有氨基端延伸(SEQ ID No 21從AA 1至AA 65)，與此同時(shí)其缺少在GV2中存在的48個(gè)氨基酸片段(SEQ ID No 22從AA 174至AA 221)。在cDNA克隆編碼的多肽中也缺少相似的氨基酸片段(除4個(gè)AA；VLQK以外)。此外，GV1多肽在其羧基端部分具有大約11個(gè)氨基酸的插入物(SEQ ID No 21從AA 644至AA 664)。
在本發(fā)明沉默構(gòu)建體中包含的優(yōu)選靶區(qū)域因此可以是編碼具有SEQID No13從7至26；SEQ ID No13從31至238；SEQ ID No13從239至412；SEQ ID No13從413至423；SEQ ID No13從425至460的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
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<223>棉花parp2 CDNA 1_1<400>5accagcagca tcactgtgaa ctgtttcctc ttgacaatga tactgaggag ttcgctttga 60ttgtaaagta tattcagaat actcatgctc agacacattc aaattataca gttgatgttg 120ttcaaatatt caaggtgaca agagacggtg aaagtgaacg ctttaaaaag ttttctggaa 180caaaaaatag aatgctgttg tggcatggtt ctcggcttac taactggact ggcattctgt 240cccaaggttt gcgcattgct ccacctgaag cgcctgccac gggttatatg tttgggaagg 300gggtttactt tgctgatatg ttctccaaaa gtgcaaatta ttgctatact aattctgcct 360tcacaacagg ggtgttgctt ctatgtgagg ttgccctggg tgacatggct gagcttctac 420aagcta 426<210>6<211>573<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>cDNA parp2部分2變體2<400>9gagaaaattg ttaccgcgac aaggaagggg tggctgttct ggatcaaggg atcccagatg 60acataaaggc tcattatcat gttctacaaa agggtgatga tatctatgat gccatgttaa 120atcagacgaa tgttgggcaa aacaataaca aattctttgt gatccagctt ctagaatctg 180atgactcgaa gacatacatg gttcataaca gatggggtag agttggtgtg aagggtcaaa 240ttaagttaca tggccccttt acttcacgac aagccgcaat tgatgagttt caaaccaaat 300tctttaacaa gaccaaaaac tattggtaca acagaaaaga ctttgtttgt cacccaaagt 360gctacacctt gctggagatg gactatgatg aaaaagaaaa ggaatctgat gtcaaaagaa 420aggctaactc ttccattggt gctcaattgc gggagacaaa gcttgaacaa cgtgttgcta 480agtttatctc tattatgtgc aatatcagca tgatgaagca acaaatgatg gaaataggat 540acaatgctga caagttgcct cttggtaagc taagcaaatc cacaatttta aaggggtatg 600atgtcttaaa gaaaattgct gatgtgattg accagtcaaa caggagcaag cttgagcaat 660taagttcgga attttacacc gtgattccac atgattttgg atttagaaaa atgcgtgatt 720tcgtcatcga cacacctcag aagttgaaaa agaagttgga aatggttgaa gccctgggag 780aaatagaggt cgcatcaaaa ttattaatgg atgacattac gatggaggaa gatcctttat 840attatcggta ccaacagctt cactgtgaac tgtttcctct tg 882
<210>10<211>869<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cDNA parp2部分2變體3<400>10cagccacgag aagggggtgg ctgttctgga tcaagggatc ccagacgaca taaaggctca 60ttatcatgtc ctacaaaagg gtgatgatat ctatgatgcc atgttaaatc agacgaatgt 120tgggcaaaac aataacaaat tctttgtgat ccagcttcta gaatctgatg actcgaagac 180atacatggtt cataacagat ggggtagagt tggtgtgaag ggtcaaatta agttacatgg 240cccctttact tcacgacaag ccgcaattga tgagtttcaa accaaattct ttaacaagac 300caaaaactat tggtacaaca gaaaagactt tgtttgtcac ccaaagtgct acaccttgct 360ggagatggac tatgatgaaa aagaaaagga atctgatgtc aaaagaaagg ctaactcttc 420cattggtgct caattgcggg agacagagct tgaacaacgt gttgctaagt ttatctctat 480tatatgcaat atcagcatga tgaagcaaca aatgatggaa ataggataca atgctgacaa 540gttgcctctt ggtaagctaa gcaaatccac aattttaaag gggtatgatg tcttaaagaa 600aattgctgat gtgattgacc agtcaaacag gagcaagctt gagcaattaa gttcggaatt 660ttacaccgtg attccacatg attttggatt tagaaaaatg cgtgattttg tcatcgacac 720acctcagaag ttgaaaaaga agttggaaat ggttgaagcc ctgggagaaa tagaggtcgc 780atctaaatta ttaatggatg acattacgat ggaggaagat cctttatatt atcggtacca 840acagcttcac tgtgaactgt ttcctcttg869<210>11
<211>880<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>cDNA parp2部分2變體4<400>11agaagatcgt aacagcgacg aggaaggggt ggctgttctg gatcaaggga tcccagatga 60gataaaggct cattatcatg ttctacaaaa gggtgatcat atctatgatg ccatgttaaa 120tcagacgaat gttgggcaaa acaataacaa gttctttgtg atccagcttc tagaatctga 180tgactcaaag acatacatgg ttcataatag atggggtaga gttggtgtga agggtcaaat 240taagttacat ggccccttta cttcacgaca ggctgcaatt gatgtgtttc aaaccaagtt 300ctttaacaag accaaaaact attggtacaa cagaaaagac tttgtttgtc acccaaagtg 360ctacaccttg ctggagatgg actatgatga aaaagaaaag gattctgatg tcaaaagaaa 420ggctaactct tccattggtg ctcaattgcg ggagacaaag cttgaacaac gtgttgctaa 480gtttatctct gttatatgca atatcagcat gatgaagcaa caaatgatgg aaataggata 540caatgctgac aagttgcctc ttggtaagct aagcaaatcc acaattttaa aggggtatga 600tatcttaaag aaaattgctg atgtgattga ccagtcaaac aggagcaagc ttgagcaatt 660aagttcggaa ttttacaccg tgattccaca tgattttgga tttagaaaaa tgcgtgattt 720tgtcatcgac aaacctcaga agttgaaaaa gaagttggaa atggttgaag ccctgggaga 780aatagaggtc gcatcaaaat tattaatgga tgacattacg atggaggaag atcctttata 840ttatcggtac cagcagcttc actgtgaact gtttcctctt 880<210>12<211>1384<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>cDNA parp2(融合的)<220>
<221>CDS<222>(3)..(1382)<400>12ga gaa gat bgt tac agc gac gag gaa ggg gtg gct gtt ctg gat caa 47Glu Asp Xaa Tyr Ser Asp Glu Glu Gly Val Ala Val Leu Asp Gln1 5 10 15ggg atc cca gat gac ata aag gct cat tat cat gtt cta caa aag ggt 95Gly Ile Pro Asp Asp Ile Lys Ala His Tyr His Val Leu Gln Lys Gly20 25 30gat gat atc tat gat gcc atg tta aat cag acg aat gtt ggg caa aac143Asp Asp Ile Tyr Asp Ala Met Leu Asn Gln Thr Asn Val Gly Gln Asn35 40 45aat aac aaa ttc ttt gtg atc cag ctt cta gaa tct gat gac tcg aag191Asn Asn Lys Phe Phe Val Ile Gln Leu Leu Glu Ser Asp Asp Ser Lys50 55 60aca tac atg gtt cat aac aga tgg ggt aga gtt ggt gtg aag ggt caa239Thr Tyr Met Val His Asn Arg Trp Gly Arg Val Gly Val Lys Gly Gln65 70 75att aag tta cat ggc ccc ttt act tca cga caa gcc gca att gat gag287Ile Lys Leu His Gly Pro Phe Thr Ser Arg Gln Ala Ala Ile Asp Glu80 85 90 95ttt caa acc aaa ttc ttt aac aag acc aaa aac tat tgg tac aac aga335Phe Gln Thr Lys Phe Phe Asn Lys Thr Lys Asn Tyr Trp Tyr Asn Arg100 105 110aaa gac ttt gtt tgt cac cca aag tgc tac acc ttg ctg gag atg gac383Lys Asp Phe Val Cys His Pro Lys Cys Tyr Thr Leu Leu Glu Met Asp115 120 125tat gat gaa aaa gaa aag gaa tct gat gtc aaa aga aag gct aac tct431
Tyr Asp Glu Lys Glu Lys Glu Ser Asp Val Lys Arg Lys Ala Asn Ser130 135 140tcc att ggt gct caa ttg cgg gag aca aag ctt gaa caa cgt gtt gct 479Set Ile Gly Ala Gln Leu Arg Glu Thr Lys Leu Glu Gln Arg Val Ala145 150 155aag ttt atc tct att ata tgc aat atc agc atg atg aag caa caa atg 527Lys Phe Ile Ser Ile Ile Cys Asn Ile Set Met Met Lys Gln Gln Met160 165 170 175atg gaa ata gga tac aat gct gac aag ttg cct ctt ggt aag cta agc 575Met Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Asp Lys Leu Pro Leu Gly Lys Leu Ser180 185 190aaa tcc aca att tta aag ggg tat gat gtc tta aag aaa att gct gat 623Lys Ser Thr Ile Leu Lys Gly Tyr Asp Val Leu Lys Lys Ile Ala Asp195 200 205gtg att gac cag tca aac agg agc aag ctt gag caa tta agt tcg gaa 671Val Ile Asp Gln Ser Asn Arg Set Lys Leu Glu Gln Leu Set Ser Glu210 215 220ttt tac acc gtg att cca cat gat ttt gga ttt aga aaa atg cgt gat 719Phe Tyr Thr Val Ile Pro His Asp Phe Gly Phe Arg Lys Met Arg Asp225 230 235ttt gtc atc gac aca cct cag aag ttg aaa aag aag ttg gaa atg gtt 767Phe Val Ile Asp Thr Pro Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Glu Met Val240 245 250 255gaa gcc ctg gga gaa ata gag gtc gca tca aaa tta tta atg gat gac 815Glu Ala Leu Gly Glu Ile Glu Val Ala Ser Lys Leu Leu Met Asp Asp260 265 270att acg atg gag gaa gat cct tta tat tat cgg tac caa cag ctt cac 863Ile Thr Met Glu Glu Asp Pro Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gln Gln Leu His275 280 285tgt gaa ctg ttt cct ctt gac aat gat act gag gag ttc gct ttg att 911Cys Glu Leu Phe Pro Leu Asp Asn Asp Thr Glu Glu Phe Ala Leu Ile290 295 300gta aag tat att cag aat act cat gct cag aca cat tca aat tat aca 959Val Lys Tyr Ile Gln Asn Thr His Ala Gln Thr His Ser Asn Tyr Thr305 310 315gtt gat gtt gtt caa ata ttc aag gtg aca aga gac ggt gaa agt gaa 1007Val Asp Val Val Gln Ile Phe Lys Val Thr Arg Asp Gly Glu Ser Glu320 325 330 335
cgc ttt aaa aag ttt tct gga aca aaa aat aga atg ctg ttg tgg cat1055Arg Phe Lys Lys Phe Ser Gly Thr Lys Asn Arg Met Leu Leu Trp His340 345 350ggt tct cgg ctt act aac tgg act ggc att ctg tcc caa ggt ttg cgc1103Gly Ser Arg Leu Thr Asn Trp Thr Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu Arg355 360 365att gct cca cct gaa gcg cct gcc acg ggt tat atg ttt ggg aag ggg1151Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ala Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly370 375 380gtt tac ttt gct gat atg ttc tcc aaa agt gca aat tat tgc tat act1199Val Tyr Phe Ala Asp Met Phe Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Tyr Thr385 390 395aat tct gcc ttc aca aca ggg gtg ttg ctt cta tgt gag gtt gcc ctg1247Asn Ser Ala Phe Thr Thr Gly Val Leu Leu Leu Cys Glu Val Ala Leu400 405 410 415ggt gac atg gct gag ctt cta caa gct aaa agc gat gct gat aag ctg1295Gly Asp Met Ala Glu Leu Leu Gln Ala Lys Ser Asp Ala Asp Lys Leu420 425 430ccg gat ggg aag ttg agc aca aaa ggt gtt ggt gca act gca ccg gat1343Pro Asp Gly Lys Leu Ser Thr Lys Gly Val Gly Ala Thr Ala Pro Asp435 440 445cct tct gaa gcc cag tca ctt gat gat ggt gtt gtt gtt cc 1384Pro Ser Glu Ala Gln Ser Leu Asp Asp Gly Val Val Val450 455 460<210>13<211>460<212>PRT<213>人工序列<400>13Glu Asp Xaa Tyr Ser Asp Glu Glu Gly Val Ala Val Leu Asp Gln Gly1 5 10 15
Ile Pro Asp Asp Ile Lys Ala His Tyr His Val Leu Gln Lys Gly Asp20 25 30Asp Ile Tyr Asp Ala Met Leu Asn Gln Thr Asn Val Gly Gln Asn Asn35 40 45Asn Lys Phe Phe Val Ile Gln Leu Leu Glu Ser Asp Asp Ser Lys Thr50 55 60Tyr Met Val His Asn Arg Trp Gly Arg Val Gly Val Lys Gly Gln Ile65 70 75 80Lys Leu His Gly Pro Phe Thr Ser Arg Gln Ala Ala Ile Asp Glu Phe85 90 95Gln Thr Lys Phe Phe Asn Lys Thr Lys Asn Tyr Trp Tyr Asn Arg Lys100 105 110Asp Phe Val Cys His Pro Lys Cys Tyr Thr Leu Leu Glu Met Asp Tyr115 120 125Asp Glu Lys Glu Lys Glu Ser Asp Val Lys Arg Lys Ala Asn Ser Ser130 135 140Ile Gly Ala Gln Leu Arg Glu Thr Lys Leu Glu Gln Arg Val Ala Lys145 150 155 160Phe Ile Ser Ile Ile Cys Asn Ile Ser Met Met Lys Gln Gln Met Met165 170 175Glu Ile Gly Tyr Asn Ala Asp Lys Leu Pro Leu Gly Lys Leu Ser Lys180 185 190Ser Thr Ile Leu Lys Gly Tyr Asp Val Leu Lys Lys Ile Ala Asp Val195 200 205Ile Asp Gln Ser Asn Arg Ser Lys Leu Glu Gln Leu Ser Ser Glu Phe210 215 220
Tyr Thr Val Ile Pro His Asp Phe Gly Phe Arg Lys Met Arg Asp Phe225 230 235 240Val Ile Asp Thr Pro Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Glu Met Val Glu245 250 255Ala Leu Gly Glu Ile Glu Val Ala Ser Lys Leu Leu Met Asp Asp Ile260 265 270Thr Met Glu Glu Asp Pro Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gln Gln Leu His Cys275 280 285Glu Leu Phe Pro Leu Asp Asn Asp Thr Glu Glu Phe Ala Leu Ile Val290 295 300Lys Tyr Ile Gln Asn Thr His Ala Gln Thr His Ser Asn Tyr Thr Val305 310 315 320Asp Val Val Gln Ile Phe Lys Val Thr Arg Asp Gly Glu Ser Glu Arg325 330 335Phe Lys Lys Phe Ser Gly Thr Lys Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly340 345 350Ser Arg Leu Thr Asn Trp Thr Gly Ile Leu Ser Gln Gly Leu Arg Ile355 360 365Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ala Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Val370 375 380Tyr Phe Ala Asp Met Phe Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Tyr Thr Asn385 390 395 400Ser Ala Phe Thr Thr Gly Val Leu Leu Leu Cys Glu Val Ala Leu Gly405 410 415
Asp Met Ala Glu Leu Leu Gln Ala Lys Ser Asp Ala Asp Lys Leu Pro420 425 430Asp Gly Lys Leu Ser Thr Lys Gly Val Gly Ala Thr Ala Pro Asp Pro435 440 445Ser Glu Ala Gln Ser Leu Asp Asp Gly Val Val Val450 455 460<210>14<211>5616<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>T-DNA載體pTMT01<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>LB來自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的左邊界重復(fù)(Zambryski，1988)<220>
<221>misc_feature<222>(25)..(439)<223>3’nos包括來自如Depick等人1982年所述的pTiT37 T-DNA的胭脂氨酸合成酶基因3’非翻譯區(qū)的序列(逆時(shí)針)<220>
<221>misc_feature
<222>(440)..(1777)<223>2mepsps(Eagl)來自玉米的雙突變的5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶合成酶基因的編碼序列(非PvuII)(Lebrun等人，2003).(逆時(shí)針)<220>
<221>misc_feature<222>(1778)..(2150)<223>TPotp C如Lebrun等人(1996)所述的優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽(逆時(shí)針)<220>
<221>misc_feature<222>(2151)..(2685)<223>Pcsvmv XYZ包括木薯脈花葉病毒啟動(dòng)子區(qū)的序列(Verdaguer等人，1996).(逆時(shí)針)<220>
<221>misc_feature<222>(2686)..(3191)<223>P35s2包括花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄物啟動(dòng)子區(qū)的序列(Odell等人，1985).(順時(shí)針)<220>
<221>misc_feature<222>(3192)..(3617)<223>parp2Gh(C端)包括陸地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)非經(jīng)典型聚(ADP核糖)聚合酶的部分編碼區(qū)的序列(順時(shí)針)
<220>
<221>misc_feature<222>(3649)..(4423)<223>內(nèi)含子pdk如Rosche和Westhoff(1995)所述的來自三脈黃菊(Flaveria trinervia)磷酸丙酮酸二激酶基因的第二內(nèi)含子(順時(shí)針)<220>
<221>misc_feature<222>(4424)..(4851)<223>parp2Gh(C端)包括陸地棉(Gossypium hirsutum)(棉花)非經(jīng)典型聚(ADP核糖)聚合酶的部分編碼區(qū)的序列(逆時(shí)針)<220>
<221>misc_feature<222>(4852)..(5591)<223>3’ocs包括如De Greve等(1982)所述的根癌農(nóng)桿菌章魚堿合酶基因3′非翻譯區(qū)的序列(順時(shí)針)<220>
<221>misc_feature<222>(5592)..(5616)<223>RB來自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的右邊界重復(fù)(Zambryski，1988)<400>14cggcaggata tattcaattg taaatggctc catggcgatc gctacctggc tggcgaaagg 60gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 120taaaacgacg gccagtgaat tgcggccgca attcccgatc tagtaacata gatgacaccg 180
cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt240ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc atctcataaa taacgtcatg cattacatgt300taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg360caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatcg gggaaattcg420tcgaagcttc ttctagagct taattcttga cgaaagtgct cagcacatcg aagtagtcgg480ggaaggtctt ccgggtgcac ccagggtccc ggatggtgac ggggacctcg gcacaggcgg540caagggagaa ggccatcgcc atcctgtggt cgtcgtacgt gtcgatcgcc gtcacgttca600gcttctccgg cggcgtgatg atgcagtagt ccggcccttc ctcaacagat gctcccagct660tggttagctc cgtccggatc gcaaccatcc tctcggtctc ctttactctc caggaagcca720cgtctctgat ggctgtcggg ccatcggcaa agagggcaac cacagcaaga gtcatggcga780catcaggcat cttgttcatg ttgacatcaa tcgccttgag gtgtttcctc ccaaatggct840cccgcggtgg gccagtaaca gttacgctag tctcggtcca tgtaaccttc gctcccatca900tctccagtac ctcagcaaac ttcacatcac cctgcaaact ggtggtgcca caaccttcca960cagtcacagt ccctccagta attgcagcac cagccaagaa atagcttgcg cttgaggcat 1020caccttcaac ataggcattt ttaggggact tgtatttttg acctccctta atgtagaatc 1080tgtcccagct atcagaatgc tctgctttca caccaaaacg ctccatcaat ctcaatgtca 1140tttcgacgta cggaatggag attaatttat caatgatttc aatctccaca tccccaagag 1200ccaaaggagc agccatcagc aaggcactca agtactgact gctgatggag ccagacagct 1260tgaccttgcc accaggtagc cctccgattc cattgacacg aacaggtggg cagtcagtgc 1320caaggaaaca atcaacatct gcaccaagct gcttcaatcc gacaaccaag tcgccaatgg 1380gtctctccct cattcttggt actccatcaa gcacgtaagt tgcatttcca ccagcagcag 1440taacggccgc tgtcaaggac cgcattgcga ttccagcatt ccccaagaag agctgcactt 1500cctctttagc atcctcaact gggaactttc caccacagcc aacaactaca gctcttttgg 1560cagctttgtc cgcttcgaca gagagaccaa gagtcctcaa ggccccgagc atgtagtgga 1620catcctcact gttcagcagg ttatcaacca ctgttgtccc ctcggacagg gcggcgagta 1680
ggaggatccg gttggaaagc gacttggacc ccggcagctt gacggtgccg gagatctcct 1740tgatgggctg cagcacgatc tcctcggcgc cggccatgca ccggatcctt ccgccgttgc 1800tgacgttgcc gaggcttctg gaggagcggc gggcgacggg gaggctggcg gtggacttga 1860gcccctggaa cggagcgacg gcggtggccg acgaggccat catcacggtg ggcgccatag 1920acagcggcgg caggtacgac agcgtctcga acttcttgtt gccgtaggcc ggccacacct 1980gcatacattg aactcttcca ccgttgctgg gaagggtgga gaagtcgtta gccttcttgg 2040tggtggggaa ggcggcgttg gacttaaggc cggtgaacgg agccaccatg ttggcctgag 2100caggggcggt ccggctaacg gtcgcgactg aggaggagat cgaagccatg ggccgcttta 2160gaattgagat ctacaaactt acaaatttct ctgaagttgt atcctcagta cttcaaagaa 2220aatagcttac accaaatttt ttcttgtttt cacaaatgcc gaacttggtt ccttatatag 2280gaaaactcaa gggcaaaaat gacacggaaa aatataaaag gataagtagt gggggataag 2340attcctttgt gataaggtta ctttccgccc ttacattttc caccttacat gtgtcctcta 2400tgtctctttc acaatcaccg accttatctt cttcttttca ttgttgtcgt cagtgcttac 2460gtcttcaaga ttcttttctt cgcctggttc ttctttttca atttctacgt attcttcttc 2520gtattctggc agtataggat cttgtatctg tacattcttc atttttgaac ataggttgca 2580tatgtgccgc atattgatct gcttcttgct gagctcacat aatacttcca tagtttttcc 2640cgtaaacatt ggattcttga tgctacatct tggataatta ccttctggaa gcttatcgat 2700accgtcgagg gcatatggcg cgccgcggcc gctttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc 2760ttcgtcaaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc 2820tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc 2880ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc 2940acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac 3000agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca 3060accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca 3120caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag 3180
aggactcgag taccagcagc atcactgtga actgtttcct cttgacaatg atactgagga 3240gttcgctttg attgtaaagt atattcagaa tactcatgct cagacacatt caaattatac 3300agttgatgtt gttcaaatat tcaaggtgac aagagacggt gaaagtgaac gctttaaaaa 3360gttttctgga acaaaaaata gaatgctgtt gtggcatggt tctcggctta ctaactggac 3420tggcattctg tcccaaggtt tgcgcattgc tccacctgaa gcgcctgcca cgggttatat 3480gtttgggaag ggggtttact ttgctgatat gttctccaaa agtgcaaatt attgctatac 3540taattctgcc ttcacaacag gggtgttgct tctatgtgag gttgccctgg gtgacatggc 3600tgagcttcta caagctaggt accccagctt ggtaaggaaa taattatttt cttttttcct 3660tttagtataa aatagttaag tgatgttaat tagtatgatt ataataatat agttgttata 3720attgtgaaaa aataatttat aaatatattg tttacataaa caacatagta atgtaaaaaa 3780atatgacaag tgatgtgtaa gacgaagaag ataaaagttg agagtaagta tattattttt 3840aatgaatttg atcgaacatg taagatgata tactagcatt aatatttgtt ttaatcataa 3900tagtaattct agctggtttg atgaattaaa tatcaatgat aaaatactat agtaaaaata 3960agaataaata aattaaaata atattttttt atgattaata gtttattata taattaaata 4020tctataccat tactaaatat tttagtttaa aagttaataa atattttgtt agaaattcca 4080atctgcttgt aatttatcaa taaacaaaat attaaataac aagctaaagt aacaaataat 4140atcaaactaa tagaaacagt aatctaatgt aacaaaacat aatctaatgc taatataaca 4200aagcgcaaga tctatcattt tatatagtat tattttcaat caacattctt attaatttct 4260aaataatact tgtagtttta ttaacttcta aatggattga ctattaatta aatgaattag 4320tcgaacatga ataaacaagg taacatgata gatcatgtca ttgtgttatc attgatctta 4380catttggatt gattacagtt gggaagctgg gttcgaaatc gattagcttg tagaagctca 4440gccatgtcac ccagggcaac ctcacataga agcaacaccc ctgttgtgaa ggcagaatta 4500gtatagcaat aatttgcact tttggagaac atatcagcaa agtaaacccc cttcccaaac 4560atataacccg tggcaggcgc ttcaggtgga gcaatgcgca aaccttggga cagaatgcca 4620gtccagttag taagccgaga accatgccac aacagcattc tattttttgt tccagaaaac 4680
tttttaaagc gttcactttc accgtctctt gtcaccttga atatttgaac aacatcaact 4740gtataatttg aatgtgtctg agcatgagta ttctgaatat actttacaat caaagcgaac 4800tcctcagtat cattgtcaag aggaaacagt tcacagtgaa gctgctggta tctagagtcc 4860tgctttaatg agatatgcga gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg 4920tgcacgttgt aaaaaacctg agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca 4980ttctaatgaa tatatcaccc gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat 5040ttactgattg taccctacta cttatatgta caatattaaa atgaaaacaa tatattgtgc 5100tgaataggtt tatagcgaca tctatgatag agcgccacaa taacaaacaa ttgcgtttta 5160ttattacaaa tccaatttta aaaaaagcgg cagaaccggt caaacctaaa agactgatta 5220cataaatctt attcaaattt caaaaggccc caggggctag tatctacgac acaccgagcg 5280gcgaactaat aacgttcact gaagggaact ccggttcccc gccggcgcgc atgggtgaga 5340ttccttgaag ttgagtattg gccgtccgct ctaccgaaag ttacgggcac cattcaaccc 5400ggtccagcac ggcggccggg taaccgactt gctgccccga gaattatgca gcattttttt 5460ggtgtatgtg ggccccaaat gaagtgcagg tcaaaccttg acagtgacga caaatcgttg 5520ggcgggtcca gggcgaattt tgcgacaaca tgtcgaggct cagcaggacc tgcaggtcga 5580cggccgagta ctggcaggat atataccgtt gtaatt 5616<210>15<211>457<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>變體棉花parp2片段<220>
<221>變體<222>(2)..(2)<223>T<220>
<221>變體<222>(1)..(1)<223>F或W<220>
<221>變體<222>(3)..(3)<223>E<220>
<221>變體<222>(4)..(4)<223>D<220>
<221>變體<222>(5)..(5)<223>D<220>
<221>變體<222>(6)..(6)<223>A或V或L或I<220>
<221>變體<222>(7)..(7)<223>A或G或L或I<220>
<221>變體<222>(8)..(8)<223>V或G或L或I<220>
<221>變體<222>(9)..(9)<223>A或G或L或I<220>
<221>變體<222>(10)..(10)<223>A或G或V或I<220>
<221>變體<222>(11)..(11)<223>E<220>
<221>變體<222>(12)..(12)<223>N<220>
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<221>變體<222>(17)..(17)<223>E<220>
<221>變體<222>(18)..(18)<223>A或V或G或L<220>
<221>變體<222>(19)..(19)<223>R或H<220>
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<221>變體<222>(21)..(21)<223>R或K<220>
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<221>變體<222>(224)..(224)<223>G或I或L或A<220>
<221>變體<222>(225)..(225)<223>G或V或L或A<220>
<221>變體<222>(227)..(227)<223>R或K<220>
<221>變體<222>(228)..(228)<223>E<220>
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<221>變體<222>(230)..(230)<223>I或L或A或V<220>
<221>變體<222>(231)..(231)<223>Y或W<220>
<221>變體<222>(232)..(232)<223>H或K<220>
<221>變體<222>(233)..(233)<223>R或K<220>
<221>變體<222>(235)..(235)<223>H或K<220>
<221>變體<222>(236)..(236)<223>E<220>
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<221>變體<222>(239)..(239)<223>G或V或L或A<220>
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<221>變體<222>(245)..(245)<223>G或V或I或A<220>
<221>變體<222>(246)..(246)<223>R或H<220>
<221>變體<222>(247)..(247)<223>R或H<220>
<221>變體<222>(248)..(248)<223>R或H<220>
<221>變體<222>(249)..(249)<223>G或I或V或A<220>
<221>變體<222>(250)..(250)<223>D<220>
<221>變體<222>(252)..(252)<223>G或I或L或A<220>
<221>變體<222>(253)..(253)<223>D<220>
<221>變體<222>(254)..(254)<223>G或I或V或L<220>
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1.產(chǎn)生耐受脅迫的棉花植物的方法，其包括以下步驟a)將嵌合基因?qū)朊藁?xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞，所述嵌合基因包含下列有效連接的DNA片段i)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；ii)可轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，其包含(1)包含20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的核苷酸序列的第一DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；(2)包含選自所述第一DNA區(qū)域中20個(gè)連續(xù)核苷酸的至少19個(gè)的核苷酸序列的第二DNA區(qū)域；其中所述第一DNA區(qū)域和所述第二DNA區(qū)域處于彼此反向重復(fù)的方向并且其中轉(zhuǎn)錄自所述可轉(zhuǎn)錄區(qū)域的RNA分子能夠在轉(zhuǎn)錄自所述第一DNA區(qū)域的RNA區(qū)域與轉(zhuǎn)錄自所述第二DNA區(qū)域的RNA區(qū)域間形成雙鏈RNA區(qū)域；和iii)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域；b)再生所述轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞以得到轉(zhuǎn)基因棉花植物；以及c)鑒定比未轉(zhuǎn)化的棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的轉(zhuǎn)基因棉花植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ IDNo12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包含SEQ IDNo13或SEQ ID No21或SEQ ID No22的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包含SEQ IDNo15的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一DNA區(qū)域和所述第二DNA區(qū)域包含至少50個(gè)連續(xù)核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一DNA區(qū)域和所述第二DNA區(qū)域包含至少200個(gè)連續(xù)核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中比未轉(zhuǎn)化的棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的所述轉(zhuǎn)基因棉花植物使用纖維組織培養(yǎng)物測定法進(jìn)行鑒定。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中比未轉(zhuǎn)化的棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的所述轉(zhuǎn)基因棉花植物使用冷萌發(fā)測定法進(jìn)行鑒定。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中比未轉(zhuǎn)化的棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的所述轉(zhuǎn)基因棉花植物通過測定任一活性氧類、NAD或ATP的濃度進(jìn)行鑒定。
10.產(chǎn)生耐受脅迫的棉花植物的方法，其包括以下步驟a)向所述棉花植物的細(xì)胞提供一種或多種雙鏈RNA分子，其中所述雙鏈RNA分子包含兩條RNA鏈，一條RNA鏈基本上由20至21個(gè)連續(xù)核苷酸中19個(gè)的RNA核苷酸序列組成，所述20至21個(gè)連續(xù)核苷酸選自棉花物種或與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；以及b)鑒定包含所述雙鏈RNA分子的比不包含該雙鏈RNA分子的相同棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的棉花植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述雙鏈RNA通過嵌合基因整合入所述細(xì)胞的基因組而向所述細(xì)胞提供，所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)包含處于反義方向的20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)核苷酸的DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；c)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述雙鏈RNA通過嵌合基因整合入所述細(xì)胞的基因組向所述細(xì)胞提供，所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)包含處于有義方向的20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)核苷酸的DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；c)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述雙鏈RNA通過嵌合基因整合入所述細(xì)胞的基因組向所述細(xì)胞提供，所述嵌合基因包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)可轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，其包含i)包含處于有義方向的20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)核苷酸的第一DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；ii)包含處于有義方向的20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)核苷酸的第二DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列，其中通過轉(zhuǎn)錄所述可轉(zhuǎn)錄DNA區(qū)域產(chǎn)生的RNA分子能夠在對應(yīng)于所述第一DNA區(qū)域的RNA區(qū)域與對應(yīng)于所述第二RNA區(qū)域的RNA區(qū)域間通過堿基配對形成雙鏈RNA區(qū)；以及c)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含任一SEQ ID No5、SEQ IDNo6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID No13或SEQ ID No21或SEQ ID No22的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至13中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID No15的氨基酸序列。
17.產(chǎn)生耐受脅迫的棉花植物的方法，其包括以下步驟a)使用選自如下的手段，從能夠獲自棉花物種如陸地棉(Gossypiumhirsutum)、海島棉(Gossypium barbadense)、樹棉(Gossypium arboreum)或草棉(Gossypium herbaceum)或從與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉(Gossypium raimodii)、三裂棉(Gossypium trilobum)和擬似棉(Gossypium gossypium)的基因組DNA或cDNA鑒定編碼PARP2的DNA序列的片段i)用作探針的DNA片段，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列；ii)用作探針的DNA片段，其包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列；iii)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至1382個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；iv)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自編碼氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至2000個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；v)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自任一SEQ IDNo5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ IDNo10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至2000個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；vi)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；vii)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自編碼氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；viii)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ IDNo20的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；或ix)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有任一SEQ IDNo1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No16或SEQID No17的核苷酸序列；x)使用如vi、vii、viii或ix中所述的寡核苷酸作為引物從棉花基因組或cDNA中能夠擴(kuò)增的片段，如用作探針的包含核苷酸序列SEQ IDNo18的片段；b)向所述棉花植物的細(xì)胞提供一種或多種雙鏈RNA分子，其中所述雙鏈RNA分子包含兩條RNA鏈，一條RNA鏈基本上由20至21個(gè)連續(xù)核苷酸的RNA核苷酸序列組成，所述20至21個(gè)連續(xù)核苷酸選自編碼PARP2的DNA序列的所述片段的核苷酸序列；和c)鑒定包含所述雙鏈RNA分子的比不包含該雙鏈RNA分子的相同棉花植物更抵抗非生物性脅迫條件的棉花植物。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述雙鏈RNA分子的提供通過向所述植物細(xì)胞提供雙鏈RNA分子而實(shí)現(xiàn)，該雙鏈RNA分子包含20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的第一核苷酸序列和與所述第一核苷酸序列互補(bǔ)的第二核苷酸序列，其中所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自編碼PARP2的DNA序列的所述片段的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述雙鏈RNA分子通過嵌合DNA整合入植物基因組而提供，所述嵌合DNA包含以下有效連接的DNA片段a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)可轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，其包含i)包含20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的核苷酸序列的第一DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自編碼PARP2的DNA序列的所述片段的核苷酸序列；ii)包含選自所述第一DNA區(qū)域中至少19個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的第二DNA區(qū)域；其中所述第一DNA區(qū)域和所述第二DNA區(qū)域處于彼此反向重復(fù)的方向并且其中轉(zhuǎn)錄自所述可轉(zhuǎn)錄區(qū)域的RNA分子能夠在轉(zhuǎn)錄自所述第一DNA區(qū)域的RNA區(qū)域與轉(zhuǎn)錄自所述第二DNA區(qū)域的RNA區(qū)域間形成雙鏈RNA區(qū)域；和iii)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任意一項(xiàng)所述的方法，其還包括將所述抗脅迫棉花植物與另一種棉花植物雜交以得到抵抗脅迫的棉花子代植物的步驟。
21.鑒定棉花parp2 DNA片段的方法，其包括以下步驟a) 提供能夠獲自棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉或草棉中或從與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉的基因組DNA或cDNA；b)選擇如下一種方式i)用作探針的DNA片段，其包含編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列；ii)用作探針的DNA片段，其包含任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列；iii)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至1382個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；iv)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自編碼氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至2000個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；v)用作探針的DNA片段或寡核苷酸，其包含由選自任一SEQ IDNo5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ IDNo10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列中20至2000個(gè)連續(xù)核苷酸組成的核苷酸序列；vi)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自編碼氨基酸序列SEQ ID No13的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；vii)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自編碼氨基酸序列SEQ ID No21或22的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；viii)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有包含選自任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No19或SEQ IDNo20的核苷酸序列中20至200個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；或ix)用作PCR反應(yīng)中引物的寡核苷酸序列，其具有任一SEQ IDNo1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No16或SEQID No17的核苷酸序列；x)使用如vi、vii、viii或ix中所述的寡核苷酸作為引物從棉花基因組或cDNA中能夠擴(kuò)增的片段，如用作探針的包含核苷酸序列SEQ IDNo18的片段；c)通過使用所述基因組或所述cDNA以及所述引物實(shí)施PCR或通過使用所述基因組或所述cDNA以及所述探針實(shí)施雜交而鑒定所述片段。
22.分離棉花parp2 DNA片段的方法，其包括以下步驟a)根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法鑒定所述的棉花parp2片段；和b)分離所述的棉花parp2片段。
23.鑒定與增加的脅迫耐性相關(guān)的棉花parp2等位基因的方法，其包括以下步驟a)提供不同棉花植物品系或與棉花祖先植物相關(guān)的植物品系的群體，任選地是誘變的群體；b)根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法鑒定所述群體中每一植物品系的parp2等位基因；c)分析所述群體的每一植物品系的脅迫抗性并鑒定那些棉花植物品系；d)將植物品系提高的脅迫抗性與特定parp2等位基因的存在相關(guān)聯(lián)。
24.獲得耐受脅迫的棉花植物的方法，其包括以下步驟a)根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法鑒定與增加的脅迫耐性相關(guān)的棉花parp2等位基因；b)將所述的棉花parp2等位基因?qū)脒x擇的棉花植物品系。
25.鑒定抵抗脅迫的棉花植物的方法，其包括以下步驟a)自所述棉花植物起始纖維組織培養(yǎng)物；b)使所述的纖維組織培養(yǎng)物受到脅迫條件作用，和c)將所述培養(yǎng)物中的纖維起始或延伸與自對照植物起始并受到所述脅迫條件作用的培養(yǎng)物中的纖維起始或延伸進(jìn)行比較。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的脅迫條件包含使所述的纖維組織培養(yǎng)物受到升高的溫度作用選擇的時(shí)間期間。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述升高的溫度選自45℃至50℃范圍，并且所述時(shí)間期間選自2小時(shí)至4小時(shí)范圍。
28.分離的DNA片段，其編碼包含SEQ ID No13、SEQ ID No15、SEQ ID No21或SEQ ID No22的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
29.分離的DNA片段，其編碼包含SEQ ID No15的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
30.分離的DNA片段，其包含選自任一核苷酸序列SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No19或SEQ IDNo20的核苷酸序列。
31.分離的DNA片段，其能夠通過權(quán)利要求21所述的方法獲得。
32.包含以下有效連接的DNA片段的嵌合基因a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)可轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域，其包含i)包含處于有義方向的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；ii)包含處于有義方向的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第二DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；其中通過轉(zhuǎn)錄所述可轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域產(chǎn)生的RNA分子能夠通過堿基配對在對應(yīng)于所述第一DNA區(qū)域的RNA區(qū)域與對應(yīng)于所述第二RNA區(qū)域的RNA區(qū)域間形成雙鏈RNA區(qū)；和c)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
33.包含以下有效連接的DNA片段的嵌合基因a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)包含處于有義方向的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；以及c)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
34.包含以下有效連接的DNA片段的嵌合基因a)植物可表達(dá)的啟動(dòng)子；b)包含處于反義方向的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA區(qū)域，所述20個(gè)連續(xù)核苷酸選自來自棉花物種或來自與棉花祖先物種相關(guān)的物種parp2基因或parp2 cDNA的核苷酸序列；以及c)包含在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號的DNA區(qū)域。
35.根據(jù)權(quán)利要求32至34中任意一項(xiàng)所述的嵌合基因，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含任一SEQ ID No5、SEQ IDNo6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No18、SEQ ID No.19或SEQ ID No.20的核苷酸序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求32至34中任意一項(xiàng)所述的嵌合基因，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID No13、SEQ ID No20或SEQ ID No21的氨基酸序列。
37.據(jù)權(quán)利要求32至34中任意一項(xiàng)所述的嵌合基因，其中所述parp2基因或parp2 cDNA的所述核苷酸序列包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID No15的氨基酸序列。
38.棉花植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求32至37中任意一項(xiàng)所述的嵌合DNA。
39.棉花植物，其基本上由權(quán)利要求38所述的棉花植物細(xì)胞組成。
40.棉花植物，其能夠通過權(quán)利要求24所述的方法獲得。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或權(quán)利要求40所述的棉花植物的種子。
42.編碼包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No21或SEQ IDNo22的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于增加棉花植物的脅迫耐性。
43.編碼包含氨基酸序列SEQ ID No.15的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于增加棉花植物的脅迫耐性。
44.任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于增加棉花植物的脅迫耐性。
45.編碼包含氨基酸序列SEQ ID No.13的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉或草棉中或從與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉中鑒定parp2基因或parp2 cDNA。
46.編碼包含氨基酸序列SEQ ID No.15的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉或草棉中或從與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉中鑒定parp2基因或parp2 cDNA。
47.任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉或草棉中或從與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉中鑒定parp2基因或parp2 cDNA。
48.編碼包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No.21或SEQ IDNo22的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉或草棉中或從與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉中鑒定耐受脅迫的parp2等位基因。
49.編碼包含氨基酸序列SEQ ID No.15的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉或草棉中或從與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉中鑒定耐受脅迫的parp2等位基因。
50.任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種如陸地棉、海島棉、樹棉或草棉中或從與棉花祖先物種相關(guān)的棉花物種如雷蒙德氏棉、三裂棉和擬似棉中鑒定耐受脅迫的parp2等位基因。
51.編碼包含氨基酸序列SEQ ID No13、SEQ ID No21或SEQ IDNo22的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種內(nèi)導(dǎo)入耐受脅迫的parp2等位基因。
52.編碼包含氨基酸序列SEQ ID No.15的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種內(nèi)導(dǎo)入耐受脅迫的parp2等位基因。
53.任一SEQ ID No5、SEQ ID No6、SEQ ID No7、SEQ ID No8、SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ IDNo18、SEQ ID No19或SEQ ID No20的核苷酸序列或包含其20個(gè)連續(xù)核苷酸中至少19個(gè)的部分的用途，用于在棉花物種內(nèi)導(dǎo)入耐受脅迫的parp2等位基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及棉花parp2基因或cDNA序列用于獲得耐受脅迫的棉花植物的用途。本發(fā)明還提供了多個(gè)棉花parp2序列。
文檔編號A01H5/00GK101090971SQ200580045194
公開日2007年12月19日 申請日期2005年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月29日
發(fā)明者M·范托爾諾特, A·雷納爾特斯, J·雅各布斯 申請人:拜爾生物科學(xué)公司