專利名稱：脅迫耐受植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有對脅迫尤其是氧化脅迫增強的耐性的植物的方法。本發(fā)明還涉及用于這種方法的基因表達構(gòu)建體和具有對脅迫增強的耐性的轉(zhuǎn)基因植物，例如通過本文所述方法獲得的或可以通過本文所述方法獲得的植物。導(dǎo)言不利地影響生長、發(fā)育或生產(chǎn)的外部條件引發(fā)廣泛植物響應(yīng)，諸如改變的基因表達、細胞代謝以及生長速率和作物產(chǎn)量的變化。有兩種類型的脅迫生物脅迫由其他生物施力口，諸如病原體，而非生物脅迫起因于過度或不足的物理或化學環(huán)境，諸如干旱、鹽度、高或低的溫度或紫外光。環(huán)境脅迫是植物生產(chǎn)率和作物產(chǎn)量的主要限制因素。當植物細胞處于環(huán)境脅迫下時，若干化學上相異的活性氧簇(R0Q由分子氧的部分還原產(chǎn)生并且這些可以引起氧化損傷或充當信號。光合電子傳遞鏈組分的自動氧化導(dǎo)致超氧自由基及其衍生物、過氧化氫和羥基的形成。這些化合物與多種生物分子(包括DNA)反應(yīng)，引起細胞停滯和死亡(Kim等 2008，Vranova 等 2002)。黃素氧還蛋白(Fld)是發(fā)現(xiàn)于細菌和一些海藻中但是未在植物中發(fā)現(xiàn)的電子傳遞黃素蛋白(^irbriggen等，2007)，其能夠有效地參與若干鐵氧還蛋白(Fd)依賴的氧化還原通路，包括光合作用、氮同化和硫氧還蛋白介導(dǎo)的氧化還原調(diào)節(jié)(Tognetti等，2006， 2007b)。在暴露于氧化和非生物脅迫的微生物中，F(xiàn)ld水平被上調(diào)(Singh等，2004)。當表達于植物葉綠體中時，黃素蛋白充當一般的抗氧化劑防止不同類型的ROS在葉綠體中形成 (Tognetti等，2006)。所得的轉(zhuǎn)基因植物對多種環(huán)境挑戰(zhàn)、氧化還原循環(huán)氧化劑和異生素發(fā)展出多重耐性CTognetti等，2006 ；2007a, PCT/GB2002/004612，所述所有文件通過引用并入本文)。在缺鐵(iron-starved)藍細菌中，當其存在于Fld轉(zhuǎn)化植物中時，F(xiàn)ld由光系統(tǒng) I(PSI)還原(Tognetti等，2006)。在異氧菌中，F(xiàn)ld可以被丙酮酸-Fld還原酶和NADPH-Fld 還原酶還原(Blaschkowski等，1982)。Fld也在藍細菌異形胞中組成型地積累并且已經(jīng)證明它可以參與到固氮酶的電子傳遞(Sandmarm等，1990)，但是終極電子供體的性質(zhì)是未知的，并且可以介導(dǎo)此反應(yīng)的更有效的、異形胞特異性的鐵氧還蛋白的誘導(dǎo)已經(jīng)使人們對分子氮固定期間Fld的作用產(chǎn)生了疑問(Razquin等，1995)。在植物和藍細菌兩者中，鐵氧還蛋白-NADP(H)還原酶(FNR) (EC1. 18. 1. 2)是與類囊體結(jié)合的酶，其以物理的、組成型的方式參與從鐵氧還蛋白或Fld到NADP+以形成NADPH 的電子傳遞(Carrillo和Ceccarelli，2003)。當存在來自PSI的強的電子壓力時，此活性與在光照下介導(dǎo)相反反應(yīng)的可能性直接沖突。因此，F(xiàn)NR介導(dǎo)的NADPH對鐵氧還蛋白(或Fld) 的還原不可能以任何顯著的速率在體內(nèi)發(fā)生，并且目前還未報道發(fā)現(xiàn)這種活性。然而，溶解的FNR與其余的鏈分開并且迅速地催化它(Carrillo和Ceccarelli，2003)。實際上，可溶的 FNR在介導(dǎo)分離的、FNR缺失的類囊體的NADP+光還原中幾乎是無活性的O^orti和Bracale， 1984)。在包含用于光捕獲的藻膽蛋白體的藍細菌物種中，F(xiàn)NR由三個結(jié)構(gòu)域組成參與藻膽蛋白體結(jié)合的N端結(jié)構(gòu)域，其后是FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和NADP (H)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和NADP(H)結(jié)合結(jié)構(gòu)域一起構(gòu)成該酶的活性部分(Carrillo和Ceccarelli，2003)。 備選的起始密碼子定位于第二個結(jié)構(gòu)域的開始處以產(chǎn)生兩個結(jié)構(gòu)域的可溶的FNRCThomas 等，2006)。當細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楫愷B(yǎng)生活方式并且需要從NADPH到Fd或Fld傳遞電子的能力時， 優(yōu)選地使用此內(nèi)部Met (Thomas等，2006)。在

圖1中提供了描述該理論模型的圖解。在所有藍細菌和光合真核細胞中都發(fā)現(xiàn)有所述酶。具有相似特異性但是不同生理作用的其他酶已經(jīng)在若干非光合植物組織、在哺乳動物線粒體以及在若干細菌中得到描述。藍細菌FNR 已經(jīng)被很好的表征(Sancho，1987，Schluchter 1992)。此外，編碼FNR的petH基因已經(jīng)從若干藍細菌菌株中克隆(Fillat等，199 ?？梢酝ㄟ^如下所述的心肌黃酶活性測定檢測活性FNR的存在。因此已知將細菌Fld結(jié)合到煙草葉綠體中可以補償Fd水平的降低，產(chǎn)生對氧化劑和廣泛不良脅迫條件增強的耐性。本發(fā)明目標在于通過保證在還原條件中維持Fld來改善植物的脅迫耐性。發(fā)明概述在一方面中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有加強的脅迫耐性的植物的方法，所述方法包括在植物中表達編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸序列。通過這種方法獲得的或可以通過這種方法獲得的植物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明進一步涉及包含基因序列的核酸構(gòu)建體，其中所述基因序列包括編碼藍細菌 FNR的核酸序列和葉綠體靶向序列。在另一個方面中，本發(fā)明涉及這樣的核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼黃素氧還蛋白多肽(Fld)的核酸序列和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶(FNR)多肽的核酸序列。在另一個方面中，本發(fā)明涉及具有加強的脅迫耐性的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸序列。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于在對脅迫的響應(yīng)中減小植物中ROS 量的方法，所述方法包括在植物中表達黃素氧還蛋白多肽和鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽。附圖在非限制性附圖中進一步圖示本發(fā)明。圖1.在表達來自藍細菌的Fld和FNR的雙轉(zhuǎn)化體中的提議的電子路徑。在正常生長條件下(上圖)，鐵氧還蛋白(Fd)和Fld兩者都可以介導(dǎo)到生產(chǎn)路徑的電子傳遞，根據(jù)效率Fd很可能是優(yōu)選的。在脅迫下(下圖)，F(xiàn)d水平下降并且Fld接管了到NADP的光合電子傳遞，同時可溶的FNR使用部分形成的NADPH以保持Fld被還原，防止形成ROS和結(jié)束良性循環(huán)。圖2.在野生型(PH)和轉(zhuǎn)化體煙草的葉片中的FNR累積。相當于17μ g蛋白的來自6周齡獨立轉(zhuǎn)化植物(prm)的葉片提取物通過SDS-PAGE分級并印跡到硝酸纖維膜上以用于使用針對魚腥藍細菌(Anabaena)還原酶的抗血清免疫檢測FNR。圖3.來自轉(zhuǎn)基因煙草植物的FNR的亞細胞定位和膠內(nèi)心肌黃酶活性。A)在滲透休克從野生型和PFNR植物分離的完整葉綠體后，類囊體和基質(zhì)得到分離。相當于4μ g葉綠素的樣品通過SDS-PAGE分離并且通過免疫印跡分析確定FNR的存在。B)相當于15 μ g 總的可溶蛋白的來自野生型和PFNR植物的基質(zhì)，通過非變性電泳分離并且對心肌黃酶活性染色。
圖4.在X4植物后代中的FNR和Fld表達水平。相當于8 μ g總的可溶蛋白的來自6周齡煙草植物的葉片提取物通過SDS-PAGE分級并印跡到硝酸纖維膜上，以用于使用針對魚腥藍細菌FNR和Fld的抗血清的免疫檢測。圖5.甲基紫精(MV)對FNR/Fld表達植物葉盤的作用。將來自6周齡煙草植物的葉盤放置在20 μ M MV上并以600 μ mol quanta πΓ、—1照射。Α)溫育7h后拍攝的照片。B) 在用MV處理葉盤后通過測量介質(zhì)相對電導(dǎo)的增加來評估離子滲漏。C)在MV處理后確定葉綠素和類胡蘿卜素。圖6. MV對整個煙草植物的作用。將四周齡植物轉(zhuǎn)移到水培系統(tǒng)。在生長室條件下在暴露于100 μ M MV 24h后拍攝葉片的照片。圖7. A)檢測脂質(zhì)過氧化物。將來自6周齡植物的葉盤放置在10 μ M MV或水上 (右手的條)并且在池內(nèi)用700 μ mol quanta HT2iT1照射。每個值是四次樣品重復(fù)測量值的平均值士標準差。B)來自FNR/Fld表達植物的葉盤的葉片提取物的APX活性。將來自 6周齡煙草植物的葉盤放置在20 μ M MV上并用600 μ mol quanta πΓ、—1照射。在1. 5和3h 的溫育后采集樣品。圖8.包含編碼豌豆FNR轉(zhuǎn)運肽和黃素氧還蛋白基因的序列之間的框內(nèi) (in-frame)融合片段的雙元載體pCAMBIA 2200的圖示。插在pCAMBIA 2200的Eco RI位點的盒事先構(gòu)建在PDH51中。此Eco RI片段包含CaMV 35S啟動子、黃素氧還蛋白嵌合基因和CaMV35S聚腺苷酸化信號。圖9.包含編碼豌豆FNR轉(zhuǎn)運肽和魚腥藍細菌FNR基因的兩個C端結(jié)構(gòu)域的序列之間的框內(nèi)融合片段的雙元載體pCAMBIA 2200的圖示。插在pCAMBIA2200的Eco RI位點的盒事先構(gòu)建在PDH51中。此Eco RI片段包含CaMV 35S啟動子、FNR嵌合基因和CaMV35S 聚腺苷酸化信號。圖 10.源自 MultiSite Gateway 的雙元載體 pBinary-BRACT Bi，4_ubi_FNR/B2， 3-actin-Fld的圖示，所述載體包含編碼豌豆FNR轉(zhuǎn)運肽和魚腥藍細菌FNR基因的兩個C端結(jié)構(gòu)域的序列之間的、編碼豌豆FNR轉(zhuǎn)運肽和來自魚腥藍細菌PCC7119的Fld(TP-Fld)基因的序列之間的框內(nèi)融合。在共表達載體中，nos聚腺苷酸化信號與ubi和肌動蛋白啟動子分別在TP-FNR和TP-Fld構(gòu)建體的兩側(cè)。這些構(gòu)建體首先通過位點特異性BP重組反應(yīng)克隆到PD0NR221載體系列的合適的供體載體中。所得的進入(entry)克隆又同時參與和定制的雙元 T-DNA MultiSite Gateway 目的載體即 pDEST-BRACT Rl，4_ubi/R2，3-actin 的雙LR位點特異性重組，產(chǎn)生包含兩個目的基因的表達克隆pBinary-BRACT Bi, 4-ubi-FNR/ B2，3-aCtin-Fld。所述構(gòu)建體到雙元載體中的克隆策略基于MultiSite Gateway技術(shù)的BP 禾口 LR 位點特異性重組反應(yīng)(Invitrogen, http://www. invitrogen. com)。Hyg 選擇標記(抗潮霉素(hygromicin)) ；LB 左側(cè)邊界；nos 胭脂堿合成酶；RB 右側(cè)邊界；TP 轉(zhuǎn)運肽；ubi 泛素。圖11.用于在植物中共表達Fld和FNR多肽的雙元載體的構(gòu)建。示意圖顯示用于在植物中共表達 FNR 和 Fld 的 pBinary-BRACT Bi，4_ubi_FNR/B2，3-actin-Fld 雙元載體的構(gòu)建。兩側(cè)具有attB位點特異性重組序列的編碼FNR和Fld到葉綠體靶向轉(zhuǎn)運肽(TP)的嵌合融合的序列的PCR產(chǎn)物(attBl-FNR-attB4和attB2-Fld_attB3，分別)在與合適供體載體(pD0NR21 P1-P4和pDONR p2_P3，分別)進行的BP重組反應(yīng)中是底物。所得的pENTR221L1-L4-FNR和pENTR221 L2-L3_Fld進入克隆又同時參與和定制的雙元T-DNA MultiSite Gateway目的載體即pDEST-BRACT Rl，4_ubi/R2，3-actin的雙LR位點特異性重組，產(chǎn)生包含在組成型啟動子控制下的兩個目的基因的表達克隆。根據(jù)制造商建議的實驗方案、使用說明禾口命名法進行所述過程(Invitrogen,http//www. invitrogen. com)。ccdB 用于載體的陰性選擇的基因；LB 左側(cè)邊界；nos 胭脂堿合成酶；RB 右側(cè)邊界；TP 轉(zhuǎn)運肽；ubi 泛
ο圖12.大麥脅迫。甲基紫精(MV)對FNR/Fld表達雜合大麥植物的葉條(strip)的作用。從生長在土壤中的6周齡大麥植物的葉片上切取10-15mm長度的葉條。然后在20°C 在黑暗中將葉條在50 μ M MV和0. 05% Tween-20中溫育30分鐘以允許MV擴散到組織中。 然后將所述葉條放置在塑料托盤中使近軸側(cè)向上向著450 μ mol quanta HT2iT1光源。使對照保持在包含0. 05% Tween-20的蒸餾水中。在7. 5h的光照后評估A)葉綠素和B)類胡蘿卜素的含量。FNR(Ix)雜合有FNR的轉(zhuǎn)基因大麥。Fld(Ix):雜合有Fld的轉(zhuǎn)基因大麥。 FNR/Fld (Ix)雜合有FNR和Fld轉(zhuǎn)基因大麥。WT 野生型大麥。詳述現(xiàn)在將進一步描述本發(fā)明。在以下段落中，更詳細地限定本發(fā)明的不同方面。這樣限定的各方面可以與任何其他方面結(jié)合，除非清楚地顯示與之相反。尤其是，任何顯示為優(yōu)選的或有利的特征可以與顯示為優(yōu)選的或有利的任何其他特征結(jié)合。除非另外說明，本發(fā)明的實施將采用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的植物學、微生物學、組織培養(yǎng)、分子生物學、化學、生物化學和重組DNA技術(shù)的常規(guī)技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻中得到全面說明。如上所提及，已知將細菌黃素氧還蛋白(Fld)結(jié)合到煙草葉綠體中可以補償Fd 水平的下降，產(chǎn)生對氧化劑和廣泛不良脅迫條件增加的耐性。本發(fā)明人已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)將來源于細菌的具有Fld還原活性的第二基因引入表達細菌Fld的植物中可以改善該植物的脅迫耐性。不希望受理論限制，本發(fā)明人相信這是由于將Fld維持在還原性條件中。如在實施例中所示，本發(fā)明人已經(jīng)使用具有來源于藍細菌并且編碼葉綠體靶向的鐵氧還蛋白 NADP(H)還原酶(FNR)多肽的核酸序列的構(gòu)建體并且在表達葉綠體靶向的Fld的植物中表達所述細菌基因。因此，在一方面中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有增強的脅迫耐性的植物的方法，所述方法包括在植物中表達編碼Fld多肽的核酸序列和編碼FNR多肽的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的這些序列在植物中的表達可以通過如本文所述的不同方式實現(xiàn)。在第一個實施方案中，所述方法包括在植物中如本文所述的表達指導(dǎo)Fld多肽和 FNR共表達的核酸構(gòu)建體。因此，根據(jù)如本文詳述的不同實施方案的單個構(gòu)建體可以在轉(zhuǎn)化有根據(jù)本發(fā)明不同方面的這種構(gòu)建體的植物中指導(dǎo)兩個基因的共表達。所得的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生Fld和FNR多肽。在這種方法中，用共表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物并且產(chǎn)生并選擇表達兩種轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定的雜合植物。以下詳細描述可以用于此方法的構(gòu)建體。所述核酸構(gòu)建體包括編碼Fld多肽的核酸序列和編碼FNR多肽的核酸序列。優(yōu)選地，F(xiàn)ld和FNR序列來源于細菌。在一個實施方案中，編碼Fld多肽的核酸序列來源于藍細菌而黃素氧還蛋白多肽是藍細菌黃素氧還蛋白。備選地，編碼Fld多肽的核酸序列來源于異養(yǎng)菌。藍細菌可以選自Crocosphaera、藍菌屬(Cyanobium)、藍絲菌屬(Cyanothece)、微囊藍細菌屬(Microcystis)、聚球藍細菌屬(Synechococcus)、集胞藍細菌屬(Synechocystis) > Thermosynechococcus、微毛藍細菌屬(Microchaetaceae)、Nostocaceae、鞘絲藍細菌屬 (Lyngbya)、螺旋藍細菌屬(Spirulina)或束毛藍細菌屬(Trichodesmium)。優(yōu)選的屬包括聚球藍細菌屬(Synechococcus)、Fremyella、單歧藍細菌屬CTolypothrix)、魚腥藍細菌屬 (Anabaena)、項圈藍細菌屬(Anabaenopsis)、藍束絲藍細菌屬(Aphanizomenon)、管鏈藍細菌屬(Aulosira) > Cylindrospermopsis、筒 包藍細菌屬(Cylindrospermum) > Loefgrenia> 節(jié)球藍細菌屬(Nodularia)、念球藍細菌屬(Nostoc)或腔管藍細菌屬(Wollea)。優(yōu)選地， 所述屬是魚腥藍細菌屬而藍細菌是魚腥藍細菌屬PCC7119 (Fillat等1990)。在一個實施方案中，F(xiàn)ld序列具有選自如在下面的表1中所示的序列的核酸序列。 在一個實施方案中，F(xiàn)NR序列具有選自如在下面的表2中所示的序列的核酸序列。表 權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生具有加強的脅迫耐性的植物的方法，所述方法包括在植物中表達編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法包括在所述植物中表達核酸構(gòu)建體，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述構(gòu)建體指導(dǎo)黃素氧還蛋白和鐵氧還蛋白NADP(H) 還原酶多肽的共表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法包括a)在植物中表達核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼黃素氧還蛋白多肽的序列，b)在第二植物中表達核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼FNR多肽的核酸序列，c)使第一和第二植物雜交，以及d)產(chǎn)生表達FNR和Fld的穩(wěn)定的純合植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所述方法包括a)在植物中表達核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼黃素氧還蛋白多肽或FNR多肽的序列，b)分別用包含編碼黃素氧還蛋白多肽的序列或編碼FNR多肽的序列的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述植物，以產(chǎn)生表達FNR和Fld的穩(wěn)定的純合植物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中所述核酸序列來源于細菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6方法，其中編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列a)來源于藍細菌并且所述黃素氧還蛋白多肽是藍細菌黃素氧還蛋白或者b)來源于異養(yǎng)細菌。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列選自如在表1中所示的核酸序列。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸序列選自如在表2中所示的核酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶的核酸序列來源于藍細菌多肽，并且所述鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽是藍細菌FNR。
11.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項的方法，其中所述藍細菌選自Cr0C0Sphaera、藍菌屬(Cyanobium)、藍絲菌屬(Cyanothece)、微囊藍細菌屬(Microcystis)、聚球藍細菌屬 (Synechococcus)、集胞藍細菌屬(Synechocystis)、Thermosynechococcus、微毛藍細菌屬 (Microchaetaceae)、Nostocaceae、鞘絲藍細菌屬(Lyngbya)、螺旋藍細菌屬(Spirulina) 或束毛藍細菌屬(Trichodesmium)。
12.根據(jù)權(quán)利要求7至10中任一項的方法，其中所述藍細菌選自Fremyella、單歧藍細菌屬CTolypothrix)、魚腥藍細菌屬(Anabaena)、項圈藍細菌屬(Anabaenopsis)、藍束絲藍細菌屬(Aphahizomenon)、管鏈藍細菌屬(Aulosira)、Cylindrospermopsis、筒孢藍細菌屬(Cylindrospermum)、Loefgrenia、節(jié)球藍細菌屬(Nodularia)、念球藍細菌屬(Nostoc) 或腔管藍細菌屬(Wollea)。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中編碼藍細菌黃素氧還蛋白的核酸序列包括SEQID NO. 1或其功能變體。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中所述編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶的核酸序列包括編碼C端兩個結(jié)構(gòu)域區(qū)域的序列，但是不包括編碼藻膽蛋白體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中編碼藍細菌FNR的核酸序列包括SEQID NO. 3或其功能變體。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含調(diào)節(jié)序列。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求的方法，其中所述構(gòu)建體還包含葉綠體靶向序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述葉綠體靶向序列來源于豌豆FNR。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列包括SEQID NO. 2或其功能變體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其中編碼FNR多肽的核酸序列包括SEQID NO. 4或其功能變體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項的方法，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述植物是作物植物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述植物是煙草或大麥。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至23中任一項的方法，其中所述脅迫選自生物或非生物脅迫。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的方法，其中所述脅迫選自紫外光、極端溫度、水缺乏、鹽度、干旱和病原體感染。
26.通過權(quán)利要求1至25中任一項的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
27.具有增強的脅迫耐性的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物表達編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈或權(quán)利要求27的植物，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是作物植物。
30.根據(jù)權(quán)利要求四的植物，其中所述植物是煙草或大麥。
31.根據(jù)權(quán)利要求27至30中任一項的植物，其中所述植物表達核苷酸序列SEQID No. 2和4或其功能變體。
32.一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的構(gòu)建體，其中所述核酸序列來源于細菌。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的構(gòu)建體，其中所述細菌是藍細菌。
35.根據(jù)權(quán)利要求32至34中任一項的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體還包含葉綠體靶向序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的構(gòu)建體，其中所述葉綠體靶向序列來源于豌豆FNR。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的構(gòu)建體，其中編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列包括SEQID NO. 2或其功能變體。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的構(gòu)建體，其中編碼FNR多肽的核酸序列包括SEQID NO. 4 或其功能變體。
39.一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含基因序列，其中所述基因序列包含編碼藍細菌FNR多肽和轉(zhuǎn)運肽的核酸序列。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的構(gòu)建體，其中所述葉綠體靶向序列來源于豌豆FNR。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的構(gòu)建體，其中編碼藍細菌FNR多肽的核酸序列包括SEQID N0. 4或其功能變體。
42.包含根據(jù)權(quán)利要求32至39中任一項的構(gòu)建體的載體。
43.包含根據(jù)權(quán)利要求32至42中任一項的構(gòu)建體或權(quán)利要求42的載體的宿主細胞。
44.包含根據(jù)權(quán)利要求32至42中任一項的構(gòu)建體或權(quán)利要求42的載體的植物細胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求32至41中任一項的構(gòu)建體或權(quán)利要求42的載體轉(zhuǎn)化的、或者可以通過權(quán)利要求1至25中任一項的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，所述植物部分包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼如權(quán)利要求32至41中任一項所定義的所述多肽的重組核酸。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是作物植物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是煙草或大麥。
49.根據(jù)權(quán)利要求45至48中任一項的植物在產(chǎn)生具有加強的脅迫耐性的植物的方法中的用途。
50.用于在對脅迫的響應(yīng)中減少植物中ROS量的方法，所述方法包括在植物中表達編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸。
51.用于生產(chǎn)產(chǎn)品的方法，所述方法包括以下步驟種植根據(jù)權(quán)利要求45至48中任一項的植物以及從或用本發(fā)明的植物或這些植物的部分，包括種子，生產(chǎn)所述產(chǎn)品。
52.用于增強植物脅迫響應(yīng)或耐性的方法，所述方法包括在植物中表達編碼黃素氧還蛋白多肽的核酸序列和編碼鐵氧還蛋白NADP(H)還原酶多肽的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過在植物中表達編碼Fld多肽的核酸和編碼FNR多肽的核酸序列增強植物脅迫耐性的方法。
文檔編號C12N15/82GK102482681SQ201080035831
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者奈斯托·卡里洛, 安娜貝拉·費爾南達·洛德伊羅, 瑪麗安娜·吉羅, 馬蒂亞斯·丹尼爾·楚爾布里根 申請人:植物生物科學有限公司