專利名稱：發(fā)酵方法
發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及允許改善的細(xì)胞生長及原核生物宿主細(xì)胞中改善的多肽表達的發(fā)酵方法。尤其是，本發(fā)明涉及培養(yǎng)包含在甘露糖-誘導(dǎo)型啟動子控制下編碼多肽的表達載體的原核生物宿主細(xì)胞的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)酵方法在用于生物學(xué)和藥學(xué)應(yīng)用的活性物質(zhì)的生產(chǎn)中非常重要。尤其是，該發(fā)酵方法應(yīng)適合于以對于實際應(yīng)用，諸如臨床或商業(yè)用途足夠的量產(chǎn)生期望的物質(zhì)。已開發(fā)各種策略用于通過培養(yǎng)包含編碼靶向多肽的可表達的核酸序列的原核生物宿主細(xì)胞達到靶向多肽的有效表達。表達效率強烈依賴于控制編碼靶向多肽的核酸序列的表達的啟動子。尤其是，期望允許產(chǎn)生高拷貝數(shù)的靶向多肽的具有高轉(zhuǎn)錄速度的啟動子。而且，在發(fā)酵方法中，期望可控制靶向多肽表達。表達的控制可，例如，通過將編碼靶向多肽的核酸序列可操作地連接到僅在適合的誘導(dǎo)物的存在下起始表達的誘導(dǎo)型啟動子來達到。啟動子是致使編碼靶向多肽的核酸序列(結(jié)構(gòu)基因)轉(zhuǎn)錄的核酸序列。尤其是，本發(fā)明涉及利用新載體的發(fā)酵方法，所述載體用于在包含可操作地連接到包含編碼多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元的甘露糖操縱子的啟動子區(qū)的宿主中異源表達，然而所述核酸序列的表達被所述甘露糖操縱子的啟動子區(qū)控制。通過適合的誘導(dǎo)，啟動子活化及允許結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)可在負(fù)或正控制下。在負(fù)控制中，阻遏物結(jié)合到啟動子及防止結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。如果適合的誘導(dǎo)物存在，阻遏物被滅活及允許轉(zhuǎn)錄。在正誘導(dǎo)中，啟動子在結(jié)合活化物之后活化，其中活化物結(jié)合到啟動子由適合的誘導(dǎo)物介導(dǎo)。典型誘導(dǎo)物可為原核生物宿主代謝需要的底物，例如，不同類型的糖。本發(fā)明涉及正誘導(dǎo)性系統(tǒng)，其中在適合的底物，即誘導(dǎo)物的存在下，活化物結(jié)合到起始可操作地連接到所述啟動子的基因的轉(zhuǎn)錄的啟動子。迄今為止，原核生物宿主系統(tǒng)中的多數(shù)異源基因表達系統(tǒng)完全依賴于有限組的細(xì)菌啟動子。因而，可用作誘導(dǎo)物的底物數(shù)也有限。而且，異源表達系統(tǒng)的產(chǎn)率依賴于可利用的轉(zhuǎn)化的原核生物宿主數(shù)。由此，需要能生長到高細(xì)胞密度，即，允許細(xì)胞分裂中不釋放載體地快速增殖的原核生物宿主系統(tǒng)。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，會自以下說明書明了的這些和其他目的已通過培養(yǎng)用新載體轉(zhuǎn)化的原核生物宿主細(xì)胞的發(fā)酵方法來達到，所述新載體包含可操作地連接到包含對于所述宿主異源的核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元，然而所述核酸序列的表達被所述甘露糖操縱子的啟動子區(qū)控制的甘露糖操縱子的啟動子區(qū)。根據(jù)特定方面，本發(fā)明提供培養(yǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞的方法，所述方法允許細(xì)菌宿主細(xì)胞生長到高細(xì)胞密度。也提供所述新載體在原核生物宿主中核酸序列的調(diào)控的表達中的用途；在包含甘露糖操縱子的啟動子區(qū)的宿主中可表達的分離的及純化的核酸序列；用所述載體或所述分離的及純化的核酸序列轉(zhuǎn)化的原核生物宿主；使用所述載體或所述分離的及純化的核酸序列在宿主中產(chǎn)生多肽的方法；以及在發(fā)酵，尤其是在高細(xì)胞密度發(fā)酵中用所述載體或所述分離的及純化的核酸序列轉(zhuǎn)化的原核生物宿主的用途。其他目的和優(yōu)勢會對于本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以下詳述，以及參照附圖，及隨附的權(quán)利要求而顯而易見。

其顯示于圖1來自manP啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點的作圖中使用的枯草芽胞桿菌 (B. subtilis)的核酸序列，亮顯了在腺嘌呤核苷酸的轉(zhuǎn)錄起始位點，推導(dǎo)的-35和-10盒以斜體字顯示，manR的結(jié)束和Iys基因的起始用箭標(biāo)標(biāo)記，和限制性位點BglII，XbaI，AflII 和NdeI加了下劃線；圖2包含manR啟動子的啟動子區(qū)的核酸序列，將在鳥嘌呤核苷酸的轉(zhuǎn)錄起始位點亮顯，將推導(dǎo)的-10和-35盒以斜體字表示，通過箭標(biāo)指示manR基因的起始，和HindIII 限制性位點和推定的ere序列加了下劃線；圖3自枯草芽胞桿菌(B.subtilis)獲得的核酸序列，其包含如在pSU擬91， PSUN384. 1和pSUN385. 2中分別含有的manR啟動子的啟動子區(qū)，用箭標(biāo)指示IacZ的起始， 和限制性位點加了下劃線；圖4根據(jù)本發(fā)明的表達載體pSUN279. 2的質(zhì)粒圖譜；圖5根據(jù)本發(fā)明的分別含有質(zhì)粒pSUN279. 2，pSUN 284. 1和pSUN 291的枯草芽胞桿菌(B. subtilis) 3NA的β -半乳糖苷酶活性；圖6自枯草芽胞桿菌(B.subtilis)獲得的核酸序列，其包含包括manR的C-端的自枯草芽胞桿菌(B. subtilis)的manP啟動子的啟動子區(qū)，manR和manP之間的基因間區(qū)，在這被報告基因IacZ取代，轉(zhuǎn)錄起始位點，-35和-10盒以粗體顯示，通過箭標(biāo)指示 manR的末端和IacZ的起始，和限制性位點加了下劃線；圖7含有質(zhì)粒pSUN279. 2以及含有顯示于圖6的不同長度的核酸序列的片段的其他質(zhì)粒的枯草芽胞桿菌(B. subtilis) 3NA的β -半乳糖苷酶活性；圖8包含具有顯示于圖3的核酸序列的載體pSU擬91，pSUN384. 1和pSUN;345. 2 的枯草芽胞桿菌(B. subtilis) 3NA的β -半乳糖苷酶活性；圖9根據(jù)本發(fā)明的表達載體ρ麗168.1的質(zhì)粒圖譜；圖10枯草芽胞桿菌(B.subtilis) 3NA中ρ麗168. 1的質(zhì)粒穩(wěn)定性測試的結(jié)果的圖，將含有質(zhì)粒的細(xì)胞的procental部分對于代數(shù)標(biāo)繪；圖11 14對數(shù)性地顯示對于發(fā)酵運行1 4的持續(xù)時間標(biāo)繪的干生物質(zhì)濃度的圖，和對于發(fā)酵運行1 4的發(fā)酵的持續(xù)時間標(biāo)繪的熒光信號(RFU)的圖；以及
圖15和16對于發(fā)酵運行5和6的發(fā)酵的持續(xù)時間標(biāo)繪的熒光信號的圖。發(fā)明詳述如本文所用，提供以下定義以便有利于本發(fā)明的理解?！霸谒拗髦锌杀磉_的載體”或“表達載體”是重組或合成產(chǎn)生的，允許宿主細(xì)胞中特定核酸序列的轉(zhuǎn)錄的一系列特定的多核酸元件的多核酸構(gòu)建體。一般而言，此載體包括包含可操作地連接到啟動子的待轉(zhuǎn)錄的特定核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元。在宿主中可表達的載體可為例如自主或自身-復(fù)制質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。術(shù)語“宿主”，“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文互換使用以指示已導(dǎo)入本發(fā)明的一種或更多載體或分離的及純化的核酸序列的原核生物細(xì)胞。需知，該術(shù)語不僅指稱特定受試者細(xì)胞，而且指稱該細(xì)胞的后代或潛在后代。因為由于突變或環(huán)境影響，某些修飾可在后代發(fā)生，實際上，該后代可與親本細(xì)胞不同，但仍包括在如本文所用的術(shù)語的范圍之內(nèi)。術(shù)語“包含”通常以包括的含義使用，其是說允許存在一種或更多其他特征或組分。如本文所用，“啟動子”指稱控制轉(zhuǎn)錄單元的表達的核酸序列?！皢幼訁^(qū)”是能在細(xì)胞中結(jié)合RNA聚合酶及起始下游(3’方向)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)。啟動子區(qū)之內(nèi)會發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)RNA聚合酶諸如推定的-35盒和ft~ibnow盒(-10盒)的結(jié)合的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (共有序列)。而且，啟動子區(qū)可包含轉(zhuǎn)錄起始位點及調(diào)控蛋白的結(jié)合位點?！案事短遣倏v子”指稱枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操縱子。在甘露糖操縱子中鑒定了 3種基因(Kunst F. N. et al.，"The complete genome sequence of gram-positive bacterium Bacillus subtilis，，，Nature 390, P249-256(1997))ο第1基因，manP，編碼屬于果糖-通透酶家族的甘露糖特定酶組分(轉(zhuǎn)運子)。第2 基因，manA，編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶，然而第3基因，yjdF的功能未知。調(diào)控基因，manR 位于這3種基因的上游及以相同的取向，其編碼ManR，甘露糖操縱子的活化物。甘露糖操縱子，由3個基因manP-manA-yjdF (挨個連接，指稱為“manP”)組成，在本身被正調(diào)控的manP啟動子的控制下。另一啟動子，manR啟動子，負(fù)責(zé)manP-啟動子的甘露糖-依賴性誘導(dǎo)必要的manR 的表達。manR啟動子區(qū)還包含manR基因的分解代謝物調(diào)節(jié)物蛋白結(jié)合位點(分解代謝物響應(yīng)元件(ere))。"Cre序列”指稱位于分解代謝基因的上游(5’方向)的核酸序列。ere序列結(jié)合防止碳分解代謝物阻遏(CCR)中分解代謝基因的表達的分解代謝物控制蛋白(CCP)。“甘露糖操縱子的啟動子區(qū)”意指調(diào)控manP以及含或不含ere序列的manR的表達的啟動子區(qū)?！癿anP啟動子”如本文所指稱，包含至少-35區(qū)，Pribnow盒，及ManR結(jié)合位點?！癿anR啟動子”如本文所指稱，包含至少推定的-35區(qū)，Pribnow盒，ManR結(jié)合位點及，任選地，ere序列。也指稱為“甘露糖”的D-甘露糖是葡萄糖的2-差向異構(gòu)體，且存在于甘露聚糖和雜甘露聚糖多糖，糖蛋白和多種其他復(fù)合糖?！癈cpA”是指“分解代謝物控制蛋白A”，其為全局調(diào)節(jié)物蛋白，且可活化或阻遏一些分解代謝操縱子的活化。在甘露糖操縱子的情況中，CcpA通過結(jié)合ere-序列來起到阻遏作用?！霸鰪娮印笔仟毩⒂谵D(zhuǎn)錄單元的識別，關(guān)于轉(zhuǎn)錄單元的序列位置，或序列取向而發(fā)揮增強轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄的作用的核酸序列。本發(fā)明的載體任選地可包括增強子。如本文所用，“轉(zhuǎn)錄單元”指稱正常轉(zhuǎn)錄為單RNA分子的核酸序列。轉(zhuǎn)錄單元可含有編碼功能性地相關(guān)的多肽分子的一個基因(單順反子)或2個(二順反子)或更多基因 (多順反子)。核酸序列當(dāng)與另一核酸序列放入功能關(guān)系時是“可操作地連接的”。例如，啟動子可操作地連接到編碼序列，如果其影響序列的轉(zhuǎn)錄；或轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，諸如核糖體結(jié)合位點可操作地連接到編碼例如多肽的核酸序列，如果其定位為輔助多肽的翻譯。連接可通過在方便的限制性位點連接來實現(xiàn)。如果該位點不存在，根據(jù)常規(guī)實踐使用合成寡核苷酸銜接子或接頭。如在本發(fā)明中指稱的“核酸”或“核酸序列”或“分離的及純化的核酸或核酸序列” 可為DNA，RNA或DNA/RNA雜交體。在核酸或核酸序列位于載體的情況中，其通常為DNA。DNA 在本文可為任何聚脫氧核苷酸序列，包括，例如雙鏈DNA，單鏈DNA，一條或兩條鏈由2個或更多片段組成的雙鏈DNA，一條或兩條鏈具有未打斷的磷酸二酯主鏈的雙鏈DNA，含有一個或更多單鏈部分及一個或更多雙鏈部分的DNA，DNA鏈完全互補的雙鏈DNA，DNA鏈僅部分互補的雙鏈DNA，環(huán)狀DNA，共價閉合的DNA，線性DNA，共價交叉-連接的DNA，cDNA,化學(xué)-合成的DNA，半-合成DNA，生物合成DNA，天然地-分離的DNA，酶-消化的DNA，剪切的DNA， 標(biāo)記的DNA，諸如放射性標(biāo)記的DNA和熒光色素-標(biāo)記的DNA，含有一種或更多非-天然存在的核酸種類的DNA。DNA序列可通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)，例如，磷酸三酯方法或經(jīng)自動化的合成方法和PCR方法合成。純化的及分離的DNA序列也可通過酶促技術(shù)產(chǎn)生。RNA在本文可為例如單鏈RNA，cRNA,雙鏈RNA，一條或兩條鏈由2個或更多片段組成的雙鏈RNA，一條或兩條鏈具有未打斷的磷酸二酯主鏈的雙鏈RNA，含有一個或更多單鏈部分及一個或更多雙鏈部分的RNA，RNA鏈完全互補的雙鏈RNA，RNA鏈僅部分互補的雙鏈 RNA,共價交聯(lián)的RNA，酶-消化的RNA，剪切的RNA，mRNA，化學(xué)-合成的RNA，半-合成RNA， 生物合成RNA，天然地-分離的RNA，標(biāo)記的RNA，諸如放射性標(biāo)記的RNA和熒光色素-標(biāo)記的RNA，含有一個或更多非-天然存在的核酸種類的RNA。“變體”或“序列變體”意指通過保守性核酸取代自參照序列改變的核酸序列，其中一個或更多核酸被具有相同的特征的另一個取代。變體還包括變質(zhì)的序列，具有缺失和插入的序列，只要該修飾的序列與參照序列呈現(xiàn)相同的功能(功能性地相當(dāng)體)。如本文所用，術(shù)語“多肽”，“肽”，“蛋白”，“多肽”和“肽”互換使用，以指定通過相鄰殘留物的α-氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接的一系列氨基酸殘基。術(shù)語“分離的及純化的核酸序列”指稱核酸序列會根據(jù)本發(fā)明所處于的狀態(tài)。核酸序列會無或基本上無與它們天然地關(guān)聯(lián)的物質(zhì)，諸如見于它們的天然的環(huán)境，或制備(當(dāng)該制備是通過重組技術(shù)體外或體內(nèi)實踐的時)它們的環(huán)境(例如細(xì)胞培養(yǎng))的其他核酸。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”，“轉(zhuǎn)化的”或“引導(dǎo)核酸進入宿主細(xì)胞”表示細(xì)胞外核酸如載體，有或無伴隨物質(zhì)，進入宿主細(xì)胞的任何過程。術(shù)語“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”是指已導(dǎo)入細(xì)胞外核酸而由此帶有細(xì)胞外核酸的細(xì)胞或其后代?？蓪⒑怂釋?dǎo)入細(xì)胞，從而核酸可作為染色體整合體或作為額外染色體元件復(fù)制。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞用例如表達載體的轉(zhuǎn)化可通過熟知的方法諸如微注射，電穿孔，粒子轟擊或通過化學(xué)方法諸如磷酸鈣-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化實現(xiàn)，例如描述于 Maniatis et al. 1982,Molecular CloningiA laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory or in Ausubel et al. 1994，Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons0“異源核酸序列，，或“對于宿主異源的核酸序列，，是指編碼例如表達產(chǎn)物諸如對于宿主外源的多肽(“異源表達”或“異源產(chǎn)物”)的核酸序列，即來源于不同于宿主的供體的核酸序列，或編碼例如表達產(chǎn)物諸如對于宿主外源的多肽的化學(xué)合成的核酸序列，或源于宿主及編碼由所述宿主天然地表達的多肽的核酸序列，其中核酸序列被插入載體及在本發(fā)明的甘露糖操縱子的啟動子區(qū)的控制下。在宿主是特定原核生物物種的情況中，異源核酸序列可來源于生物的不同屬或科，自不同目或綱，自不同門(部)或自不同域(界)。異源核酸序列可在將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞之前，通過單核酸或一部分異源核酸序列的突變，插入，缺失或取代來修飾，只要該修飾的序列與參照序列呈現(xiàn)相同的功能(功能性地相當(dāng)體)。異源核酸序列如本文所指稱，還包括來源于生物諸如自真核生物的不同域(界) (真核起源)的序列，諸如例如已用于噬菌體展示庫及已根據(jù)原核生物宿主的“密碼子利用”修飾的單核酸或一部分核酸序列的人抗體?！稗D(zhuǎn)錄起始區(qū)”是促進轉(zhuǎn)錄起始及包含核糖體結(jié)合位點的序列諸如Siine Dalgarno序列的信號區(qū)。一般，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點的下游及可操作地連接到要表達的基因?！稗D(zhuǎn)錄終止區(qū)”指稱導(dǎo)致RNA聚合酶終結(jié)轉(zhuǎn)錄的序列。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)通常是可避免其他附近基因的不需要的轉(zhuǎn)錄或自其他潛在啟動子的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單元的部分，和可增加mRNA 的穩(wěn)定性?！翱贵w”指稱被抗原刺激之后，由免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞產(chǎn)生的一類血漿蛋白。哺乳動物(即人)抗體是Ig G，M，A，E或D類的免疫球蛋白。為本發(fā)明的目的使用的術(shù)語“抗體” 包括，但不限于，多克隆抗體，單克隆抗體，抗-特應(yīng)抗體和存在于自身免疫疾病，諸如糖尿病，多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的自體-抗體以及嵌合抗體。一方面，本發(fā)明利用在宿主中可表達的載體，所述載體包含可操作地連接到包含可對于該宿主異源的核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元的甘露糖操縱子的啟動子區(qū)，然而，所述核酸序列的表達被所述甘露糖操縱子的啟動子區(qū)控制。本發(fā)明的載體優(yōu)選為自主或自身-復(fù)制質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。 在表達本發(fā)明的核酸序列中可采用廣泛的宿主/載體組合。有用的表達載體，例如，可由染色體，非-染色體和/或合成核酸序列段組成。適合的載體包括具有特定宿主范圍的載體，諸如特異于分別例如枯草芽胞桿菌 (B. subtilis)和大腸埃希氏菌(E.coli)的載體，以及具有廣-宿主-范圍的載體，諸如對于革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌有用的載體?？墒褂谩暗?拷貝”，“中等-拷貝”以及“高-拷貝”質(zhì)粒。
例如，在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中，低拷貝質(zhì)粒是pAMbetal，中等拷貝質(zhì)粒是PBS72衍生物，高拷貝質(zhì)粒是pUBllO。根據(jù)本發(fā)明，甘露糖操縱子的啟動子區(qū)分別包含manR啟動子區(qū)和manP啟動子區(qū)。自枯草芽胞桿菌(B. subtilis)的核酸序列包括manR的C-端，manR和manP之間的基因間區(qū)，之后是作為報告基因的溶葡萄球菌酶基因lys，顯示于圖1。本發(fā)明的核酸序列包含manP的啟動子區(qū)，優(yōu)選包含圖1自bp_80至Iys的起始密碼子的核酸序列(SEQ ID NO 1)和更優(yōu)選圖1自bp-80和包括bp-Ι，即在bp+Ι的轉(zhuǎn)錄起始位點A的上游的核酸序列(SEQ ID NO :2)。自枯草芽胞桿菌(B. subtilis)的核酸序列包括manR的啟動子區(qū)，在bp+Ι的轉(zhuǎn)錄起始位點G，推定的ere序列，bp+1和manR之間的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，以及manR的部分，顯示于圖 2和圖3，其中manR被IacZ取代。本發(fā)明的核酸序列包含manR的啟動子區(qū)，優(yōu)選包含圖3自bp_122至IacZ的起始密碼子的核酸序列(SEQ ID NO 3)，更優(yōu)選地，圖3自bp-122及bp+7的核酸序列，即包括推定的ere-序列，(SEQ ID NO :4)，及，尤其是，圖3自bp-122及bp-Ι，即在pb+Ι的轉(zhuǎn)錄起始位點G的上游的核酸序列(SEQ ID NO 5)。兩個啟動子區(qū)manP和manR包含ManR的結(jié)合位點。本發(fā)明也包括與SEQ ID NO 1 5之任何和其變體互補的序列。本發(fā)明中使用的甘露糖操縱子的啟動子區(qū)，諸如manP啟動子區(qū)，manR啟動子區(qū) (有或無ere序列)以及根據(jù)序列SEQ ID NO :1 5的啟動子區(qū)，其序列互補或其變體通常來自枯草芽胞桿菌(B. subtilis)的甘露糖操縱子或自其他原核生物的功能相當(dāng)體啟動子區(qū)，尤其是芽孢桿菌科(Bacillaceae)生物。其他原核生物的功能相當(dāng)體啟動子區(qū)包括可被甘露糖誘導(dǎo)的啟動子區(qū)，即在甘露糖存在下相比在甘露糖缺失下具有更高表達活性的啟動子區(qū)。在許多原核生物，諸如硬壁菌門(Firmicutes)如枯草芽胞桿菌(B. subtilis)中， 甘露糖操縱子涉及D-甘露糖代謝?？莶菅堪麠U菌(B. subtilis)可使用許多不同糖作為碳源。己糖諸如葡萄糖和 D-甘露糖主要經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTQ攝取。在PTS中， 相應(yīng)己糖在攝取過程中被同時磷酸化及運輸?shù)郊?xì)胞。特定糖底物的攝取和利用經(jīng)歷碳分解代謝物阻遏(CCR)。在葡萄糖的存在下，枯草芽胞桿菌(B. subtilis)的優(yōu)選的糖底物，阻遏用于其他底物的攝取和利用的基因諸如甘露糖操縱子的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域已廣泛研究及知道枯草芽胞桿菌(B. subtilis)中葡萄糖依賴性CCR的機理(Stiilke J. et al. , "Regulation of carbon catabolism in Bacillus species，，，in Annu. Rev. Microbiol. 54，2000，第 849 880 頁)。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單元通常還包含所述轉(zhuǎn)錄單元的翻譯的起始點(起始密碼子) 的翻譯起始區(qū)上游，然而翻譯起始區(qū)可操作地連接到核酸序列。翻譯起始區(qū)通常位于與轉(zhuǎn)錄單元的翻譯的起始點(其可為ATG，GTG或TTG)直接相鄰的上游。翻譯起始區(qū)可為甘露糖操縱子中manP基因或manR基因的轉(zhuǎn)錄單元的翻譯起始區(qū)。甘露糖操縱子的manP或manR基因的翻譯起始區(qū)可被其他翻譯起始區(qū)部分或完全取代?？墒褂美纾鶃碜钥莶菅堪麠U菌(B. subtilis)的tufA(延伸因子Tu)和 gsiB (應(yīng)激蛋白 Jurgen et al.，1998，Mol. Gen. Genet. 258，538-545)的翻譯起始區(qū)。有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和相應(yīng)基因的起始的tufA和gsiB的相應(yīng)核酸序列示于下，將起始密碼子以粗體顯示，限制性位點加下劃線，及將Shine-Dalgarno-序列亮顯。tufA 5 ‘ -CttaaqGAGGATTTTAGA ATG GCTAAAGAAAAATTCggatcc-3 ‘AflII SD 起始密碼子BamHIgsiB 5 ‘ -cttaagAATTAAAGGAGGAATTCAAA ATG GCAGACAATAACAAAggatcc-3 ‘AflII SD 起始密碼子BamHI通過轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的適合的選擇，可增強mRNA的穩(wěn)定性，這是基因表達中的重要特征。mRNA的穩(wěn)定性特征在于其特定半衰期。除了轉(zhuǎn)錄起始區(qū)之外，也可取代翻譯起始點，以及，任選地，起始點后的基因的許多密碼子，例如約5 6個密碼子，例如以上tufA和gsiB的核酸序列中分別顯示的。翻譯起始區(qū)可還包含可操作地連接到要表達的核酸序列的編碼信號序列的序列。 信號序列通常位于與翻譯起始點直接相鄰的下游。在使用二順反子或多順反子轉(zhuǎn)錄單元的情況中，可應(yīng)用可操作地連接到各順反子的不同或同一信號序列。優(yōu)選不同信號序列用于該情況。使用的信號序列可為原核生物或真核生物信號序列。通常應(yīng)用原核生物信號序列。要在本發(fā)明的表達載體中采用的編碼信號序列的DNA序列可商業(yè)上獲得或化學(xué)合成。例如，信號序列可根據(jù)固相亞磷酰胺三酯法合成，例如描述于Beaucage & Caruthers,1981, Tetrahedron LeHs. 22，1859—1862 如描述于 Van Devanter et. Al.， Nucleic Acids Res. 12 :6159-6168 (1984)。寡核苷酸的純化可通過天然丙烯酰胺凝膠電泳或通過如描述于 Pearson & Reanier，J. Chrom. 255 137-149 (1983)的陰離子-交換 HPLC 進行。通常轉(zhuǎn)錄單元還包含轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。優(yōu)選地，使用強轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來避免被啟動子“通讀”出轉(zhuǎn)錄單元而進入側(cè)接質(zhì)粒序列，以及自其他質(zhì)粒啟動子進入轉(zhuǎn)錄單元。在該轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在下觀察到mRNA的進一步穩(wěn)定。用于強轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的適合的例具有來自可商購的枯草芽胞桿菌(B. subtilis) 168 的 tufA 的 3，-區(qū)的核酸序列 5，-CGAGACCCCTGTGGGTCTCG-3，。根據(jù)本發(fā)明，可使用編碼對于宿主外源的表達產(chǎn)物的異源核酸序列。在宿主是原核生物物種諸如枯草芽胞桿菌(B. subtilis)或大腸埃希氏菌(E.coli)的情況中，目的核酸序列可來自另一綱，如Y-蛋白桿菌，諸如自例如伯霍爾德桿菌屬(Burlcholderia sp.)， 尤其是自不同門，諸如古細(xì)菌，或，最特定自真核生物，諸如哺乳動物，尤其是自人。但是，可根據(jù)宿主的“密碼子利用”修飾異源核酸序列。本發(fā)明的異源序列通常是目的基因。目的基因優(yōu)選包括異源多肽諸如結(jié)構(gòu)，調(diào)控或治療性蛋白，或結(jié)構(gòu)，調(diào)控或治療性蛋白與其他蛋白(“Tag”)諸如綠色熒光蛋白的N-或C-端融合物或其他融合蛋白。異源核酸序列還可編碼可以RNA，諸如例如反義-RNA形式使用的轉(zhuǎn)錄物。蛋白可作為不溶性聚集物或作為存在于宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)空間，和/或存在于細(xì)胞外培養(yǎng)基的可溶性蛋白產(chǎn)生。優(yōu)選地，蛋白作為存在于宿主細(xì)胞的周質(zhì)空間和/ 或存在于細(xì)胞外培養(yǎng)基的可溶性蛋白產(chǎn)生。目的異源蛋白可為人，哺乳動物或原核生物起源。其他蛋白是抗原，諸如自微生物病原體的糖蛋白和碳水化合物，病毒和抗細(xì)菌劑二者，及自腫瘤。其他蛋白是酶如凝乳酶， 蛋白酶，聚合酶，脫氫酶，核酸酶，葡聚糖酶，氧化酶，α -淀粉酶，氧化還原酶，脂肪酶，酰胺酶，腈水合酶，酯酶或腈水解酶。在本發(fā)明中，信號序列和異源核酸序列在表達載體之內(nèi)排列的順序及距離可改變。在優(yōu)選的實施方式中，信號序列是5’(上游)到編碼例如目的多肽的核酸序列。信號序列和編碼例如目的多肽的核酸序列可隔0 約1000個氨基酸。在優(yōu)選的實施方式中，信號序列和編碼例如目的多肽的核酸序列彼此直接相鄰，即隔0個核酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的載體包含根據(jù)序列SEQ ID NO :1 5之任何，其序列互補及其變體的甘露糖操縱子的啟動子區(qū)。本發(fā)明也包括本發(fā)明的載體在本發(fā)明的用于原核生物宿主中核酸序列的調(diào)控的異源表達的發(fā)酵方法中的用途。在再一方面，本發(fā)明提供包含甘露糖操縱子的啟動子區(qū)的分離的及純化的核酸序列。優(yōu)選地，分離的及純化的核酸序列包含甘露糖操縱子的manP啟動子和/或manR啟動子。更優(yōu)選地，分離的及純化的核酸序列包含SEQ ID NO :1 5之任何。包含甘露糖操縱子的啟動子區(qū)的分離的及純化的核酸序列可可操作地連接到包含編碼多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元，其中編碼多肽的核酸序列的表達在甘露糖操縱子的啟動子區(qū)的控制下。本發(fā)明的分離的及純化的核酸序列可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR流程和本領(lǐng)域熟知的方法分離。純化的及分離的DNA序列可還包含一個或更多調(diào)控序列，如本領(lǐng)域所知道，例如增強子，通常用于由核酸序列編碼的產(chǎn)物的表達。為了選擇用本發(fā)明的載體或分離的及純化的核酸序列成功地和穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，可將編碼可選擇的標(biāo)記物(例如抗生素抗性)的基因隨目的核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞。編碼可選擇的標(biāo)記物的基因可位于載體或位于分離的及純化的核酸序列或可任選地以分離的形式共導(dǎo)入，例如分離的載體?？墒褂玫母鞣N可選擇的標(biāo)記物包括賦予抗生素抗性的那些，諸如大觀霉素，潮霉素，氨芐西林和四環(huán)素。可根據(jù)需要適應(yīng)抗生素的量，以便創(chuàng)建選擇性條件。通常使用一種可選擇的標(biāo)記物。在載體是穿梭載體的情況中，可使用對于適合的宿主常見的標(biāo)記物。例如，在載體是在大腸埃希氏菌(E.coli)和枯草芽胞桿菌(B.subtilis)中可復(fù)制的穿梭載體的情況中，可使用賦予對于大觀霉素的抗性的編碼糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的大觀霉素-腺苷酸轉(zhuǎn)移酶的抗性標(biāo)記物基因?？蓪⑵渌麍蟾婊蛑T如熒光蛋白隨著目的核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以便測定轉(zhuǎn)化效率。適合的報告基因是，例如，編碼增強的綠色熒光蛋白(eGFP)的那些和編碼β-半乳糖苷酶的lacZ。兩種報告基因可商購及被廣泛使用。
本發(fā)明的另一方面提供用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的原核生物宿主，其中載體包含甘露糖操縱子的啟動子區(qū)。優(yōu)選載體包含SEQ ID NO :1 5之任何，其序列互補或其變體。廣泛的原核生物宿主細(xì)胞有用于用本發(fā)明的甘露糖操縱子的甘露糖-誘導(dǎo)型啟動子區(qū)轉(zhuǎn)化。這些宿主可包括革蘭氏陽性細(xì)胞株，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)和鏈霉菌屬 (Str印tomyces)。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是硬壁菌門(Firmicutes)，更優(yōu)選宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)。可使用的芽孢桿菌屬(Bacillus)是例如枯草芽胞桿菌(B. subtilis)，解淀粉芽胞桿菌(B. amyloliquefacien),地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis),納豆芽胞桿菌(B.natto)，巨大芽胞桿菌(B. megaterium)株，等。優(yōu)選宿主細(xì)胞是枯草芽胞桿菌 (B. subtilis)，諸如枯草芽胞桿菌(B. subtilis) 3NA和枯草芽胞桿菌(B. subtilis) 168?？墒褂玫拇竽c埃希氏菌(E. coli)是例如可商購的株TG1，W3110，DH1，XL1-Blue和 Origami。適合的宿主細(xì)胞是可商購的，例如，自保藏中心諸如DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig,德國)。例如，芽孢桿菌屬(Bacillus)可自芽孢桿菌遺傳保藏中心(Bacillus Genetic Stock Center)獲得。宿主細(xì)胞可或可不代謝甘露糖?？蓪⑼ǔＤ軘z取及代謝甘露糖的宿主細(xì)胞如枯草芽胞桿菌(B. subtilis)修飾為在與甘露糖的攝取和/或代謝相關(guān)的一種或更多功能上缺陷。在與甘露糖的攝取和/或代謝相關(guān)的一種或更多功能上的缺乏可通過例如抑制或阻斷編碼蛋白的基因諸如編碼甘露糖-6-磷酸-異構(gòu)酶的manA基因的表達來達到。此可通過知道的技術(shù)諸如轉(zhuǎn)座子支持的誘變或敲除突變來進行。通常，原核生物宿主對應(yīng)于選擇的信號序列，例如在使用芽孢桿菌屬(Bacillus) 的信號序列的情況中，宿主細(xì)胞通常是芽孢桿菌科(Bacillacea)的相同的家族的成員，更優(yōu)選宿主細(xì)胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)株。優(yōu)選，使用具有磷酸烯醇式丙酮酸碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)的宿主。尤其是，具有PTS系統(tǒng)的宿主是芽孢桿菌目(Bacillales)，尤其是芽孢桿菌屬 (Bacillus)的微生物和更優(yōu)選物種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或腸桿菌目 (Enterobacteriales)，優(yōu)選埃希氏菌屬Escherichia)的微生物和更優(yōu)選物種大腸埃希氏菌(E. coli)。CCR的主要原件是分解代謝物控制蛋白A (CcpA)，其能結(jié)合ere-序列，諸如SEQ ID NO :3和4中的推定的ere序列。在CcpA的結(jié)合的狀態(tài)中，阻遏相應(yīng)基因，在本文中manR的轉(zhuǎn)錄。在葡萄糖的缺失下及在誘導(dǎo)物諸如D-甘露糖的存在下，無通過CcpA的結(jié)合的阻遏，以及通過調(diào)控蛋白(ManR)與甘露糖操縱子的啟動子區(qū)的相應(yīng)結(jié)合位點的結(jié)合起始甘露糖操縱子的基因的轉(zhuǎn)錄。意外地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ManR不僅是manP啟動子區(qū)的調(diào)控蛋白，而且是manR本身的自調(diào)節(jié)物。本發(fā)明提供培養(yǎng)包含載體的原核生物宿主細(xì)胞的發(fā)酵方法，所述載體包含可操作地連接到包含編碼多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操縱子的甘露糖誘導(dǎo)型啟動子，其中在第1步驟中，將原核生物宿主細(xì)胞在不同于誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)物的第1碳源的存在下培養(yǎng)，且在第2步驟中，將原核生物宿主細(xì)胞在所述誘導(dǎo)物的存在下培養(yǎng)。不同于誘導(dǎo)物的碳源一般是宿主細(xì)胞的主要碳源，然而誘導(dǎo)物一般是宿主細(xì)胞的次要碳源。主要碳源是被宿主細(xì)胞優(yōu)選消耗的及，由此，作為發(fā)酵方法中的底物有用。對于許多原核生物宿主細(xì)胞而言，葡萄糖是主要碳源，且可在那些原核生物細(xì)胞的發(fā)酵方法中作為底物適宜地使用。本發(fā)明還提供在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，其包括下列步驟(a)構(gòu)建載體，(b)用所述載體轉(zhuǎn)化原核生物宿主，(C)使所述多肽在適合的條件下在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中表達，(d)自細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)回收所述多肽。使用的載體，以及其構(gòu)建和原核生物宿主的轉(zhuǎn)化如以上定義，然而載體包含的異源核酸序列編碼多肽。作為細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可在培養(yǎng)管，振搖瓶或細(xì)菌發(fā)酵罐中應(yīng)用連續(xù)或非連續(xù)培養(yǎng)諸如分批培養(yǎng)或補料分批培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)選發(fā)酵方法是補料分批發(fā)酵。補料分批過程的特征在于不撤出溶液地底物向培養(yǎng)肉湯的限時補給。補給可為連續(xù)或間隔。一般而言，補料分批過程包含分批期， 期間細(xì)胞起初生長到期望的濃度。在此期間，細(xì)胞生長高，且通常無靶向多肽產(chǎn)生，除非添加誘導(dǎo)物。在達到期望的細(xì)胞濃度之后，補給底物的補給期開始。一般而言，誘導(dǎo)物在補給期期間添加。對于培養(yǎng)宿主細(xì)胞而言，可使用如本領(lǐng)域所知道的常規(guī)培養(yǎng)基，諸如復(fù)合培養(yǎng)基如“營養(yǎng)酵母肉湯培養(yǎng)基”，Kortz et al. 1995，J. Biotechnol. 39，59-65描述的含有甘油的培養(yǎng)基，Kulla et al.，1983，Arch. Microbiol, 135，1 描述的礦物質(zhì)鹽培養(yǎng)基，Wilms et al.，2001，Biotechnol. Bioeng. 73,95-103 描述的用于枯草芽胞桿菌(B. subtilis)發(fā)酵的分批培養(yǎng)基或 Bertram et al，1051，J. Bacteriol. 62，四3_300 描述的 LB-培養(yǎng)基。培養(yǎng)基包含適合的碳源，例如糖諸如葡萄糖作為待生長的宿主細(xì)胞的底物。作為底物使用的碳源不同于誘導(dǎo)物?？筛鶕?jù)適當(dāng)修飾培養(yǎng)基，例如通過添加進一步成分諸如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知道的緩沖劑，鹽，維生素，氨基酸，抗生素或其他微量營養(yǎng)素。同樣，細(xì)胞培養(yǎng)期間可使用不同培養(yǎng)基或培養(yǎng)基的組合。優(yōu)選地，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用的培養(yǎng)基應(yīng)不包括誘導(dǎo)物，以便達到甘露糖啟動子區(qū)的緊密調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的發(fā)酵方法中，通過添加適合的誘導(dǎo)物開始表達。甘露糖操縱子的誘導(dǎo)物是甘露糖。此外，可使用能誘導(dǎo)甘露糖操縱子的manR啟動子區(qū)或manP啟動子區(qū)的甘露糖的衍生物。表達可通過原核生物宿主可利用的誘導(dǎo)物的量來調(diào)控?？稍谂囵B(yǎng)達到測定參數(shù)之后起始誘導(dǎo)物的添加。該測定參數(shù)的例是指示培養(yǎng)的細(xì)胞濃度或不同于誘導(dǎo)物的底物諸如碳源的濃度的光密度(OD)。
例如，在本方法中，誘導(dǎo)物可在培養(yǎng)達到適當(dāng)?shù)腛D之后添加，依賴于特定培養(yǎng)系統(tǒng)。對于分批培養(yǎng)，在振搖瓶中，作為測定參數(shù)的典型0D_是約0. 3或更高。在分批期中，根據(jù)本發(fā)明的補料分批培養(yǎng)的一實施方式，當(dāng)在培養(yǎng)基中僅主要碳源是可利用時，細(xì)胞生長到20 300D·之間的細(xì)胞密度及，然后，培養(yǎng)隨著主要碳源和誘導(dǎo)物的混合物的添加而切換到補給期。在補給期中，主要碳源誘導(dǎo)物的比可改變，適合的比是3 1至1 3。通過主要碳源誘導(dǎo)物的比的改變，可控制表達速度?？梢蕾囉诎l(fā)酵的特定條件選擇添加的誘導(dǎo)物的量?？筛鶕?jù)特定培養(yǎng)系統(tǒng)選擇誘導(dǎo)物的添加模式(誘導(dǎo)方案)。通過添加模式，可進一步調(diào)控宿主細(xì)胞的生長速率和表達速度。例如，可經(jīng)適合的時期不連續(xù)地或連續(xù)添加誘導(dǎo)物。在非連續(xù)模式(沖擊誘導(dǎo))中，添加可為僅在誘導(dǎo)點一次，或以適合的間隔兩次或甚至幾次。適合的模式依賴于培養(yǎng)系統(tǒng)和可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易測定。例如，在連續(xù)模式中，可以恒定速度或降低/增加速度添加誘導(dǎo)物。連續(xù)添加可進一步在培養(yǎng)的選擇的時間間隔，例如培養(yǎng)的指數(shù)生長期間的選擇的時間間隔之內(nèi)。而且，非連續(xù)和連續(xù)誘導(dǎo)方案的組合是可能的。如果以2個或更多部分添加誘導(dǎo)物，進一步誘導(dǎo)物的添加可在培養(yǎng)達到第2測定參數(shù)之后起始。第2測定參數(shù)可為，例如，光密度0D，表達的多肽的濃度，溶液中的誘導(dǎo)物濃度或報告基因的表達的信號強度。通常，將原核生物宿主的培養(yǎng)的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的量調(diào)至約10g/l，優(yōu)選約5g/l， 更優(yōu)選約2g/l。補料期間添加的誘導(dǎo)物的量可經(jīng)補給時期改變。如上所述，主要碳源誘導(dǎo)物的比的變化允許表達速度，即細(xì)胞密度的調(diào)節(jié)。適當(dāng)?shù)膒H范圍是，例如，6-8優(yōu)選7-7. 5，適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度在10和40°C之間，優(yōu)選在30和37°C之間。通常溫育細(xì)胞，直到蓄積了最大量的表達的產(chǎn)物和/或生物質(zhì)，優(yōu)選1小時和20 天之間，更優(yōu)選5小時和3天之間。作為生物質(zhì)的產(chǎn)率，表達的產(chǎn)物量也依賴于使用的培養(yǎng)系統(tǒng)。在振搖瓶中，用經(jīng)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主可產(chǎn)生通常以0.5g/l培養(yǎng)基的量表達產(chǎn)物的培養(yǎng)物。使用發(fā)酵罐，以分批和/或補料分批模式，可獲得以通常大于0. 5g/l發(fā)酵肉湯，優(yōu)選大于lg/Ι，尤其是大于1. 3g/l的量表達產(chǎn)物的培養(yǎng)物。而且，在使用宿主細(xì)胞的本發(fā)明的發(fā)酵方法中，可得到至少10 300D·，尤其是至少500D6(1(1，500D_和更大之間，更優(yōu)選至少5000D·和最優(yōu)選的至少10000D·的高細(xì)胞密度。尤其是，在根據(jù)本發(fā)明的補料分批方法中，可獲得500D·和大于10000D·之間的細(xì)胞密度。為例證，IOD600對應(yīng)于平均約0. 322g干質(zhì)量/1。因而，100的OD6tltl值對應(yīng)于32. 2g 干質(zhì)量/g和5000D_161g干質(zhì)量/1。通過本發(fā)明的特定誘導(dǎo)方案，根據(jù)需求分別考慮到生物質(zhì)，表達產(chǎn)物和誘導(dǎo)物消費，發(fā)酵聚焦可以最大化輸出改變。例如，與第1沖擊誘導(dǎo)的組合的誘導(dǎo)方案和以指數(shù)速度的誘導(dǎo)物的額外的補給導(dǎo)致相對于生物質(zhì)濃度的靶向多肽高表達，其使進一步處理，諸如純化步驟等更有效，及，由此，節(jié)省時間及成本。此外，本發(fā)明的宿主細(xì)胞的發(fā)酵允許無載體損失的高復(fù)制速度。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法的一實施方式，培養(yǎng)宿主細(xì)胞諸如芽孢桿菌屬 (Bacillus)，其包含攜帶可操作地連接到編碼靶向多肽的核酸序列的甘露糖操縱子，PmanR 或PmanP的啟動子的載體。對于芽孢桿菌屬(Bacillus)，優(yōu)選的底物是葡萄糖。而且，甘露糖操縱子的啟動子的誘導(dǎo)物是甘露糖。優(yōu)選，發(fā)酵以補料分批模式進行。更優(yōu)選地，如上所述，通過僅添加葡萄糖，宿主細(xì)胞在分批期期間生長，直到約20 30的OD6tltl的細(xì)胞密度。 隨后補給期期間，可添加葡萄糖和誘導(dǎo)物甘露糖的混合物。也如上所述，在混合物中，葡萄糖與甘露糖的比可改變，例如自3 1至1 3。此夕卜，也可能僅補給甘露糖。優(yōu)選地，除了甘露糖啟動子之外，載體也可包含調(diào)控基因manR的完全或部分序列。發(fā)酵和在宿主細(xì)胞中表達之后，表達的產(chǎn)物諸如目的多肽則可自宿主細(xì)胞的培養(yǎng)回收。為了獲得表達的產(chǎn)物的最大產(chǎn)率，通常在培養(yǎng)末了收獲細(xì)胞，及諸如通過溶菌酶處理，超聲處理或弗壓碎器裂解來裂解。由此，多肽通常作為宿主細(xì)胞的粗裂解物首次獲得。 它們可然后通過本領(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化過程純化，其可包括差異沉淀，分子篩層析，離子-交換層析，等電聚焦，凝膠電泳，親和性及免疫親和性層析。這些熟知的和常規(guī)實踐的方法描述于，例如 Ausubel et al. , supra. , and Wu et al. (eds. ) ,Academic Press Inc., N. Y. ；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology。例如，重組產(chǎn)生的免疫球蛋白的純化，它們可用免疫親和性層析通過含有結(jié)合有表達的免疫球蛋白可特異性結(jié)合的靶分子的樹脂的柱來純化。本發(fā)明也涉及在原核生物宿主中編碼例如多肽的核酸的細(xì)胞內(nèi)異源表達的方法和手段。尤其是，本發(fā)明涉及載體和該載體用于使用本發(fā)明的載體在原核生物宿主中異源多肽的細(xì)胞內(nèi)表達的用途。在細(xì)胞內(nèi)表達中，多肽在細(xì)胞質(zhì)之內(nèi)表達及不自細(xì)胞質(zhì)運輸?shù)椒?細(xì)胞質(zhì)位置。 多肽會以包含體形式或以可溶性形式在細(xì)胞質(zhì)之內(nèi)表達。也熟知用于自細(xì)胞，尤其是自細(xì)胞提取物分離及純化多肽的方法。本發(fā)明的甘露糖啟動子有利，它們可通過常見的和非-毒性及由此工業(yè)上有用的化合物緊密調(diào)控，誘導(dǎo)。而且，本發(fā)明的甘露糖啟動子以及包含該甘露糖啟動子的載體在細(xì)胞之內(nèi)穩(wěn)定， 及甚至在多次細(xì)胞復(fù)制之后不失。由此，根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可有利地生長至非常高的細(xì)胞密度。本領(lǐng)域技術(shù)人員會同意，本文所述的本發(fā)明對除了那些特別描述的之外的變異和修飾靈敏。需知，本發(fā)明在不離開精神或其必要的特征的情況下包括全部該變異和修飾。本發(fā)明也包括此說明書中，個別或共同指稱或指出的全部步驟，特征，組合物和化合物，及任何和全部組合或任何2種或更多所述步驟或特征。本公開因此應(yīng)被認(rèn)為是在全部方面例證且是非限制性的，通過隨附的權(quán)利要求指示的本發(fā)明的范圍，及相當(dāng)?shù)暮x及范圍之內(nèi)的全部變化旨在包括在本文中。貫穿此說明書引用了各種參考文獻，各通過引用整體并入本文。上述描述將參照下列實施例更完全地明晰。但是，該例僅為實行本發(fā)明的方法的例示，及不旨在限制本發(fā)明的范圍。
實施例1甘露糖操縱子的manR啟動子和manP啟動子的啟動子區(qū)的分離和鑒定如果不另外陳述，使用下列材料和方法細(xì)菌株和生長條件將大腸埃希氏菌(E.coli)JM109 (Yanisch-Perron C. et al.，Gene33,1985， 103-119)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subti 1 is) 3NA (Michel J. F. et al.，J. App 1. Bacteriol. 33,1970, 220-227)用作用于克隆及表達的主要宿主。使大腸埃希氏菌 (E. coli)在 LB 液體培養(yǎng)基(Luria S. E. et al.，Virology 12，1960，348-390)和補充了 100μ g/ml氨芐西林或大觀霉素的LB瓊脂板中于37°C生長。使枯草芽胞桿菌(B. subtilis) 在LB液體培養(yǎng)基和C或S最小培養(yǎng)基中于37 °C生長(Martin-Verstraete I.et al.， J. Mol. Biol. 214，1990,657-671)。液體培養(yǎng)基和瓊脂板分別補充了 100 μ g/ml大觀霉素， 10 μ g/ml卡那霉素或5 μ g/ml紅霉素。為誘導(dǎo)甘露糖啟動子，以0. 2% (w/v)的終濃度添加無菌過濾的或高壓滅菌的D-甘露糖。材料全部化學(xué)品從Sigma-Aldrich (Taufkrichen，德國)，F(xiàn)luka (Buchs,德國)或 Merck (Darmstadt，德國)得到。合成 DNA 寡核苷酸購自 Eurofins MWG Operon (Ebersberg, 德國)。限制酶和DNA修飾酶購自 Roche Applied Science (Mannheim，德國)或New England Biolabs。 (Frankfurt am Main,iIH ) 。 PCR M 自 Fermentas (ST. Leon-Rot, H )的真度-DNA聚合酶在自Biozym的MiniCycler上運行。DNA的制備和轉(zhuǎn)化用Qiagen (Hilden，Gemrany)或 Roche (Mannheim，德國)的 DNA 制備試劑盒如制造商所描述進行自大腸埃希氏菌(E. coli)和枯草芽胞桿菌(B. subtilis)或自瓊脂糖凝膠的DNA-分離。貫穿實施例使用標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)。如Chung C. T. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，1989，2172-2175所述將大腸埃希氏菌(E. coli)用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化。將枯草芽胞桿菌(B. subtilis)用質(zhì)粒DNA根據(jù)修飾的“巴黎方法，，轉(zhuǎn)化(Harwood C. R. Molecular Biological Methods for Bacillus, 1990, John Wiley & Sons Ltd. , England)。β-半乳糖苷酶活性測量將要在0. 9ml Z-緩沖劑中檢查的0. Iml的細(xì)胞于37°C用10 μ 1甲苯處理30min。 用ο-硝基苯基-β -吡喃半乳糖苷于22°C根據(jù)Miller氏方法測定β -半乳糖苷酶活性 (Miller J. H. , 1972, experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor, NY)。使用的寡核苷酸表1
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)原核生物宿主細(xì)胞的方法，其中將原核生物宿主細(xì)胞用表達載體轉(zhuǎn)化，所述表達載體包含可操作地連接到包含編碼多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元的枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)的甘露糖操縱子的誘導(dǎo)型啟動子，其中誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)物是能誘導(dǎo)啟動子的甘露糖或其衍生物， 其中，在第1步驟中，將原核生物宿主細(xì)胞在不同于誘導(dǎo)物的第1碳源的存在下培養(yǎng)，且在第2步驟中，將原核生物宿主細(xì)胞在所述誘導(dǎo)物的存在下培養(yǎng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中誘導(dǎo)物的添加在培養(yǎng)達到測定參數(shù)之后開始。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中測定參數(shù)是選自光密度(OD)和碳源濃度的至少一種。
4.權(quán)利要求3的方法，其中測定參數(shù)是在600nm處的光密度。
5.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中方法是補料分批方法。
6.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中經(jīng)時連續(xù)添加全部或部分誘導(dǎo)物。
7.權(quán)利要求1 6中任一項的方法，其中以一份加入至少部分誘導(dǎo)物。
8.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中以經(jīng)時指數(shù)地增加的速度加入至少部分誘導(dǎo)物。
9.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在誘導(dǎo)物的首次添加之后，在培養(yǎng)達到第2測定參數(shù)之后，又添加至少一次誘導(dǎo)物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中第2測定參數(shù)選自光密度0D，溶液中的誘導(dǎo)物濃度，產(chǎn)生的多肽濃度或宿主細(xì)胞中包含的報告基因的信號強度。
11.權(quán)利要求1 10中任一項的方法，其中啟動子選自manP啟動子和manR啟動子
12.權(quán)利要求1 11中任一項的方法，其中將第1碳源和誘導(dǎo)物的混合物補給發(fā)酵培養(yǎng)基，其中第1碳源與誘導(dǎo)物的比是3 1至1 3。
13.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中載體包含調(diào)控基因manR的完全或部分序列。
14.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中載體包含選自SEQID N0:1,SEQ ID NO :2,SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5的序列，與它們互補的序列或其變體。
15.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中不同于誘導(dǎo)物的碳源是葡萄糖。
16.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中編碼多肽的核酸序列是異源核酸序列。
17.在原核生物宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，其包括下列步驟構(gòu)建在原核生物宿主細(xì)胞中可表達的載體，所述載體包含可操作地連接到包含編碼多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操縱子的誘導(dǎo)型啟動子，將原核生物宿主細(xì)胞用所述載體轉(zhuǎn)化，以及通過在權(quán)利要求1 16之任一項中所述的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來使所述多肽表達。
18.權(quán)利要求15的方法，其還包括下列步驟自細(xì)胞或自細(xì)胞培養(yǎng)物回收多肽。
19.重組體原核生物宿主細(xì)胞，其包含表達載體，所述表達載體包含枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操縱子的甘露糖誘導(dǎo)型啟動子、或所述甘露糖操縱子的誘導(dǎo)型啟動子的純化的及分離的核酸序列， 其中所述載體或所述甘露糖操縱子的誘導(dǎo)型啟動子的純化的及分離的核酸序列可操作地連接到包含編碼多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)錄單元。
20.權(quán)利要求19的重組體原核生物宿主細(xì)胞，其中甘露糖操縱子的誘導(dǎo)型啟動子是根據(jù)權(quán)利要求11 13中任一項的一種，或者其中分離的及純化的核酸是根據(jù)權(quán)利要求14的一種。
21.重組體原核生物宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞選自硬壁菌門(Firmicutes)。
22.權(quán)利要求19 21中任一項的重組體原核生物宿主細(xì)胞在權(quán)利要求1 18中任一項的方法中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及培養(yǎng)宿主細(xì)胞的發(fā)酵方法，所述細(xì)胞包含載體，所述載體包含甘露糖操縱子的誘導(dǎo)型啟動子，其中甘露糖操縱子的誘導(dǎo)型啟動子控制編碼多肽的核酸序列的表達，尤其是，本發(fā)明涉及在多肽生產(chǎn)中包含甘露糖操縱子的誘導(dǎo)型啟動子的原核生物宿主細(xì)胞的高細(xì)胞密度發(fā)酵。
文檔編號C12N15/63GK102471773SQ201080035375
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日
發(fā)明者C·基茨亞克, J·埃爾滕布克納, M·文澤爾, M·西曼赫茨伯格 申請人:龍沙股份公司