發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于發(fā)酵博德特氏菌的方法，其包括a)提供博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品；b)在第一環(huán)境中在至少一種bvg(博德特氏菌毒力基因)調(diào)節(jié)條件下將所述博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品孵育至少5代，從而產(chǎn)生成熟培養(yǎng)物；c)在第二環(huán)境中在至少一種bvg調(diào)節(jié)條件不存在的情況下孵育所述成熟培養(yǎng)物；其中步驟c)在步驟b)之后發(fā)生。
【專利說(shuō)明】發(fā)酵方法
[0001] 背景 細(xì)菌百日咳博德特氏菌/76?τ--5·5·Υ5·)是百日咳（在嬰兒和年幼兒童中可 嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾?。┑闹虏∫蜃印Ｔ摷膊〔〕痰奶卣髟谟诳焖倏人缘陌l(fā)作，和隨后的吸 氣努力，經(jīng)常與特征性的"喘息"聲音相關(guān)。在嚴(yán)重的情況下，缺氧可導(dǎo)致腦損傷；然而，最 常見(jiàn)的并發(fā)癥是繼發(fā)性肺炎。
[0002] 百日咳通常認(rèn)為由百日咳博德特氏菌引起，但偶爾副百日咳博德特氏菌（漢 從具有百日咳的典型體征和癥狀的患者分離到。副百日咳博德特氏菌 感染比百日咳博德特氏菌的頻率更低，其中5-10%的百日咳與副百日咳博德特氏菌相關(guān) (Mertsola (1985) Eur J Clin Microbiol 4; 123; Lautrop (1971) Lancet 1(7711) 1195-1198)。副百日咳博德特氏菌與輕度的臨床癥狀相關(guān)，其組合它與百日咳博德特氏菌 的血清學(xué)交叉反應(yīng)性，使得副百日咳博德特氏菌難以診斷。
[0003] 針對(duì)百日咳博德特氏菌的第一代疫苗是全細(xì)胞疫苗，由殺滅的全細(xì)菌構(gòu)成。這些 在20世紀(jì)50年代和60年代在許多國(guó)家被引入，并且成功降低百日咳的發(fā)病率。用全細(xì)胞 百日咳博德特氏菌疫苗的問(wèn)題在于與它們相關(guān)的高水平的反應(yīng)原性。含有純化的百日咳博 德特氏菌蛋白的無(wú)細(xì)胞疫苗反應(yīng)原性較低，并且已經(jīng)被用于許多國(guó)家的接種疫苗計(jì)劃。通 常含有百日咳毒素（PT)、絲狀血細(xì)胞凝集素（FHA)和相當(dāng)經(jīng)常的百日咳桿菌粘附素（PRN) 的無(wú)細(xì)胞疫苗被廣泛使用并提供有效保護(hù)免于百日咳的嚴(yán)重性。
[0004] 概述 介紹 在第一個(gè)方面，提供了發(fā)酵方法，其包括以下步驟： a) 提供博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品； b) 在第一環(huán)境中在至少一種bvg (博德特氏菌毒力基因）調(diào)節(jié)條件下將所述博德特氏 菌屬物種細(xì)菌的樣品孵育至少5代，從而產(chǎn)生成熟培養(yǎng)物； c) 在第二環(huán)境中在至少一種bvg調(diào)節(jié)條件不存在的情況下孵育所述成熟培養(yǎng)物； 其中步驟c)在步驟b)之后發(fā)生。
[0005] 在第二個(gè)方面，提供了發(fā)酵方法，其包括以下步驟： a) 在包含至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的第一培養(yǎng)基中提供博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品； b) 在包含至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的第一培養(yǎng)基中將所述樣品孵育至少5代，從而產(chǎn)生成 熟培養(yǎng)物； C)在第二培養(yǎng)基中在至少一種bvg調(diào)節(jié)劑不存在的情況下孵育所述成熟培養(yǎng)物； 其中步驟C)在步驟b)之后發(fā)生。
[0006] 在第三個(gè)方面，提供了發(fā)酵方法，其包括以下步驟： a) 在第一培養(yǎng)基中提供博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品； b) 在包含至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的第一培養(yǎng)基中將所述樣品孵育至少5代，從而產(chǎn)生成 熟培養(yǎng)物； C)在第二培養(yǎng)基中在至少一種bvg調(diào)節(jié)劑不存在的情況下孵育所述成熟培養(yǎng)物； 其中步驟C)在步驟b)之后發(fā)生。
[0007] 在第四個(gè)方面，提供了通過(guò)所述方法可獲得的毒力因子。
[0008] 在第五個(gè)方面，提供了通過(guò)所述方法獲得的毒力因子。
[0009] 在第六個(gè)方面，提供了包含毒力因子和藥學(xué)上可接受的賦形劑的免疫原性組合 物。
[0010] 在第七個(gè)方面，提供了包含免疫原性組合物的疫苗。
[0011] 在第八個(gè)方面，提供了免疫原性組合物或疫苗在預(yù)防或治療疾病中的用途。
[0012] 在第九個(gè)方面，提供了免疫原性組合物或疫苗在制備用于治療或預(yù)防細(xì)菌性疾病 的藥物中的用途。
[0013] 在第十個(gè)方面，提供了預(yù)防或治療疾病的方法，其包括向患者施用免疫原性組合 物或疫苗。
[0014] 附圖簡(jiǎn)述 圖1.描繪bvf基因型和bvg+基因型百日咳博德特氏菌細(xì)胞針對(duì)發(fā)酵時(shí)間的生長(zhǎng)的 圖。bvf細(xì)胞的生長(zhǎng)通過(guò)連接菱形點(diǎn)的線描繪；bvg+細(xì)胞的生長(zhǎng)通過(guò)連接正方形點(diǎn)的線描 繪。
[0015] 圖2.描繪在不同水平的bvg調(diào)節(jié)劑煙酸存在的情況下作為bvf基因型的百日 咳博德特氏菌細(xì)胞針對(duì)代數(shù)的比例的圖。當(dāng)使用〇. 〇〇4g/L煙酸時(shí)，連接正方形點(diǎn)的線描繪 bvg_細(xì)胞的比例，當(dāng)使用0. 021g/L煙酸時(shí)，連接圓形點(diǎn)的線描繪bvg^基因型細(xì)胞的比例， 當(dāng)使用〇. 113g/L煙酸時(shí),連接菱形點(diǎn)的線描繪bvg^細(xì)胞的比例，當(dāng)使用0. 604g/L煙酸時(shí)， 連接三角形點(diǎn)的線描繪bvg^細(xì)胞的比例。
[0016] 圖3描繪對(duì)于實(shí)施例6中描述的兩次發(fā)酵的溶解氧概況的圖。頂部線描繪當(dāng)發(fā)酵 是氧充足時(shí)的溶解氧概況，且底部線描繪當(dāng)發(fā)酵是氧受限時(shí)的溶解氧概況。
[0017] 圖4描繪在0. 004g/L煙酸存在的情況下發(fā)酵的4次培養(yǎng)物中bvg-基因型細(xì)胞針 對(duì)代數(shù)的比例的圖。正方形點(diǎn)代表發(fā)酵開(kāi)始時(shí)具有95% bvg-基因型細(xì)胞的起始比例的培 養(yǎng)物。圓形點(diǎn)代表發(fā)酵開(kāi)始時(shí)具有75% bvg-基因型細(xì)胞的起始比例的培養(yǎng)物。三角形點(diǎn) 代表發(fā)酵開(kāi)始時(shí)具有25% bvg-基因型細(xì)胞的起始比例的培養(yǎng)物。菱形點(diǎn)代表發(fā)酵開(kāi)始時(shí) 具有5% bvg-基因型細(xì)胞的起始比例的培養(yǎng)物。
[0018] 圖5描繪在0.6g/L煙酸存在的情況下發(fā)酵的4次培養(yǎng)物中bvg-基因型細(xì)胞針對(duì) 代數(shù)的比例的圖。正方形點(diǎn)代表發(fā)酵開(kāi)始時(shí)具有95% bvg-基因型細(xì)胞的起始比例的培養(yǎng) 物。圓形點(diǎn)代表發(fā)酵開(kāi)始時(shí)具有75% bvg-基因型細(xì)胞的起始比例的培養(yǎng)物。三角形點(diǎn)代 表發(fā)酵開(kāi)始時(shí)具有25% bvg-基因型細(xì)胞的起始比例的培養(yǎng)物。菱形點(diǎn)代表發(fā)酵開(kāi)始時(shí)具 有5% bvg-基因型細(xì)胞的起始比例的培養(yǎng)物。
[0019] 詳述 總體 本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，百日咳毒力因子的更高產(chǎn)量可以通過(guò)在至少一種bvg 調(diào)節(jié)條件存在的情況下培養(yǎng)本文所述的百日咳物種來(lái)獲得，盡管bvg調(diào)節(jié)條件通常被認(rèn)為 抑制百日咳物種的毒力因子的表達(dá)。
[0020] 百日咳博德特氏菌可以在毒力方面顯示不同的表型。這些表型被命名為Bvg+和 Bvg- (Bvg表明博德特氏菌毒力基因的表達(dá)或其缺乏）。Bvg+表型是特征在于毒力因子諸 如百日咳毒素（PT)、絲狀血細(xì)胞凝集素（FHA)和百日咳桿菌粘附素（PRN)，而且還有其它毒 素和粘附素的高表達(dá)的毒力表型。Bvg-表型是不表達(dá)毒力因子諸如PT或其它毒素/粘附 素的無(wú)毒表型。
[0021] 表型狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換是在雙組分調(diào)控系統(tǒng)BvgAS的控制之下，其直接或間接檢測(cè) 環(huán)境條件，諸如溫度、硫酸鹽、煙酸，并調(diào)節(jié)在其控制下的基因表達(dá)。在某些條件下，傳感蛋 白BvgS自磷酸化，并且經(jīng)由磷酸化級(jí)聯(lián)，磷?；罱K被轉(zhuǎn)移到應(yīng)答調(diào)節(jié)因子BvgA?；钚?BvgA~P(磷酸化的）結(jié)合毒力因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平。此類(lèi)調(diào)節(jié)系統(tǒng)在 一種單一中央轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子BvgAS的水平上導(dǎo)致環(huán)境信號(hào)（environmental cues)的整合。 作為輸出，百日咳博德特氏菌響應(yīng)于環(huán)境條件在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)毒力因子的表達(dá)。
[0022] 基因在BvgAS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄控制下形成Bvg調(diào)節(jié)子。
[0023] 抑制百日咳菌產(chǎn)生毒力因子的化合物經(jīng)常通過(guò)調(diào)節(jié)bvg遺傳基因座發(fā)揮作用，因 此可以被命名為bvg調(diào)節(jié)劑。類(lèi)似地，有利于Bvg+表型的條件可以被命名為bvg調(diào)節(jié)條件。
[0024] 通常，博德特氏菌細(xì)胞能夠在Bvg+和Bvg-基因型之間突變。具體而言，在培養(yǎng)過(guò) 程中，博德特氏菌細(xì)胞可以經(jīng)由自發(fā)突變突變?yōu)锽vg-基因型。Bvg-基因型細(xì)胞具有Bvg-表 型，這意味著它們產(chǎn)生較少量的毒力因子（并且因此在旨在產(chǎn)生高水平毒力因子的發(fā)酵方 法中是不希望的）。Bvg-基因型細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的毒力因子這一事實(shí)相比于Bvg+基因 型細(xì)胞為Bvg-基因型細(xì)胞提供了優(yōu)勢(shì)，即在產(chǎn)生毒力因子中消耗其能量較少，使它們生長(zhǎng) 更快。出于這個(gè)原因，當(dāng)培養(yǎng)博德特氏菌細(xì)胞時(shí)，具有Bvg-基因型的細(xì)胞比例趨向于隨著 時(shí)間增加（稱為Bvg-接管（Bvg- takeover))。本發(fā)明人已經(jīng)表明，可以通過(guò)添加 Bvg調(diào) 節(jié)條件在Bvg+基因型中維持較高比例的細(xì)胞。這些條件，如上所解釋，有利于Bvg-表型狀 態(tài)，并且此類(lèi)條件的存在使得博德特氏菌表達(dá)Bvg-表型（同時(shí)保持它們的Bvg+基因型）。 這去除了 Bvg-基因型細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，意味著B(niǎo)vg-基因型細(xì)胞在最終培養(yǎng)物中的比例較 低。在發(fā)酵的生長(zhǎng)階段過(guò)程中，博德特氏菌可以在這些bvg調(diào)節(jié)條件下生長(zhǎng)，直到達(dá)到所需 質(zhì)量的Bvg+基因型細(xì)胞。一旦博德特氏菌細(xì)胞的質(zhì)量足夠高，則可以去除bvg調(diào)節(jié)條件， 使得Bvg+基因型細(xì)胞回復(fù)至Bvg+表型并表達(dá)高水平的毒力因子。
[0025] 為了避免疑問(wèn)，任何提及"Bvg+細(xì)胞"或"bvg+細(xì)胞"是指具有Bvg+基因型的細(xì) 胞，類(lèi)似地，任何提及"Bvg-細(xì)胞"或"bvg-細(xì)胞"是指具有Bvg-基因型的細(xì)胞。
[0026] 因此，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵博德特氏菌屬物種的方法可以通過(guò)增加在至少一 種bvg調(diào)節(jié)條件中培養(yǎng)博德特氏菌屬物種的步驟得到改進(jìn)，這確保了博德特氏菌可以生長(zhǎng) 至高質(zhì)量，同時(shí)保持高比例的Bvg+基因型的博德特氏菌細(xì)胞，并且當(dāng)達(dá)到足夠細(xì)胞量時(shí)， 可以去除bvg調(diào)節(jié)條件，留下培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物含有高比例的以高水平表達(dá)毒力因子的 Bvg+基因型細(xì)胞。這導(dǎo)致從博德特氏菌屬物種產(chǎn)生的毒力因子的產(chǎn)量增加。盡管事實(shí)是， 通常，如本文定義的bvg調(diào)節(jié)條件導(dǎo)致毒力因子表達(dá)的減少。
[0027] 因此，在第一個(gè)實(shí)施方案中，提供了發(fā)酵方法，其包括以下步驟： a) 提供博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品； b) 在第一環(huán)境中在至少一種bvg (博德特氏菌毒力基因）調(diào)節(jié)條件下將所述博德特氏 菌屬物種細(xì)菌的樣品孵育至少5代，從而產(chǎn)生成熟培養(yǎng)物； c) 在第二環(huán)境中在至少一種bvg調(diào)節(jié)條件不存在的情況下孵育所述成熟培養(yǎng)物； 其中步驟c)在步驟b)之后發(fā)生。
[0028] 步驟b)描述了以下步驟，其中存在bvg調(diào)節(jié)條件，并且博德特氏菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)以 提供足夠細(xì)胞量用于高表達(dá)，同時(shí)保留了 Bvg+基因型（降低Bvg-細(xì)胞的接管）。然后應(yīng) 該將博德特氏菌屬物種轉(zhuǎn)移至不存在bvg調(diào)節(jié)條件的條件中以允許毒力因子的表達(dá)（步驟 c)?？梢栽诎l(fā)酵方法的早期將博德特氏菌屬物種暴露于bvg調(diào)節(jié)條件，例如可以在細(xì)胞建 庫(kù)步驟的過(guò)程中使用bvg調(diào)節(jié)條件。或者，可以在隨后階段，諸如預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中添加 bvg調(diào) 節(jié)條件。
[0029] 術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵方法"是指用于培養(yǎng)細(xì)胞和/或從那些細(xì)胞表達(dá)蛋白的工業(yè)規(guī)模（例如 20升或更多升）的方法。在這種情況下，本公開(kāi)的方法可以用于從博德特氏菌屬物種表達(dá) 高濃度的毒力因子?；蛘?，可以設(shè)想其它應(yīng)用，例如該方法可用于培養(yǎng)博德特氏菌屬物種， 以用于制備全細(xì)胞博德特氏菌疫苗。任選地，發(fā)酵方法是用于從博德特氏菌屬物種產(chǎn)生一 種或多種毒素的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法是用于在工業(yè)培養(yǎng)物中保存bvg+基因型 的博德特氏菌屬物種的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法是用于在工業(yè)培養(yǎng)物中在生長(zhǎng)中 防止毒力因子的表達(dá)損失的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法是用于增強(qiáng)博德特氏菌屬物 種產(chǎn)生毒力因子的方法。
[0030] 術(shù)語(yǔ)"博德特氏菌屬物種"是指博德特氏菌屬的物種，包括但不限于百日咳博 德特氏菌、副百日咳博德特氏菌--)、和支氣管炎博德特氏菌 ，優(yōu)選百日咳博德特氏菌。
[0031] 除非另有解釋，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本公開(kāi)內(nèi)容所屬領(lǐng)域普通 技術(shù)人員的通常理解具有相同含義。分子生物學(xué)中的常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)的定義可以參見(jiàn)Benjamin Lewin, (yefles K,由 Oxford University Press 出版，1994 (ISBN 0-19-854287-9); l&aArm 等 k {魚(yú)填The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (編輯）， Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
[0032] 除非上下文另有明確指明，單數(shù)術(shù)語(yǔ)"一個(gè)/種（a)"、"一個(gè)/種（an)"和"所述 (the) "包括所有復(fù)數(shù)所指物。類(lèi)似地，除非上下文另有明確指明，詞語(yǔ)"或"意圖包括"和"。 術(shù)語(yǔ)"多個(gè)/種"指兩個(gè)/種或更多個(gè)/種。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，對(duì)核酸或多肽給出的所 有堿基大小或氨基酸大小，和所有分子量或分子質(zhì)量值是近似的，并且為了描述而提供。另 夕卜，關(guān)于物質(zhì)諸如抗原的濃度或水平給出的數(shù)值限制意圖為近似的。因此，當(dāng)指明濃度是至 少（例如）200 pg時(shí)，則意圖該濃度被理解為至少約（或"大約"或"200 pg。
[0033] 盡管與本文所述的方法或材料相同或等效的方法或材料可以用于本公開(kāi)的實(shí) 施或測(cè)試中，但下文描述合適的方法和材料。術(shù)語(yǔ)"包含"意味著"包括"。因此，除非上 下文另有要求，否則詞語(yǔ)"包含（comprises)"和變體諸如"包含（comprise)"和"包含 (comprising)"將被理解為暗示包括所述化合物或組合物（例如，核酸，多肽，抗原）或 步驟，或化合物或步驟的組，但不排除任何其它化合物、組合物、步驟或其組。在每種情 況下，本發(fā)明人旨在本文中的術(shù)語(yǔ)"包含（comprising) "、"包含（comprise)"和"包含 (comprises)"任選可分別被術(shù)語(yǔ)"由......組成（consisting of) "、"由......組成 (consist of) "和"由......組成（consists of) "所取代。
[0034] 縮寫(xiě)"例如（e.盡）"衍生自拉丁語(yǔ)例如（exempli gratia)，并且在本文中用于表 示非限制性實(shí)例。因此，縮寫(xiě)"例如（ag.)"與術(shù)語(yǔ)"例如（for example)"是同義的。
[0035] 步驟 a) 步驟a)描述了將博德特氏菌屬物種暴露于bvg調(diào)節(jié)條件之前發(fā)酵方法的階段；這通 常是指提供一定量的活博德特氏菌細(xì)菌樣品的步驟。接種的培養(yǎng)基可以是固體或液體培養(yǎng) 基。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括選擇博德特氏菌屬物種的細(xì)菌樣品的步驟i)，其 中所述細(xì)菌樣品主要是Bvg+基因型，并且其中步驟i)在步驟a)之前發(fā)生。任選地，細(xì)菌 樣品的多于50%、多于60%、多于70%、多于75%、多于80%、多于85%、多于90%、多于 95%、多于 98 %、85%至 100%、90%至 100%、95%至 100%或 98%至 100%在步驟 a)中是 Bvg+基因型。
[0036] 本公開(kāi)的方法降低了 Bvg-基因型細(xì)胞的接管，所以它對(duì)于使用主要為Bvg+基因 型的博德特氏菌屬物種樣品開(kāi)始該方法是有利的。
[0037] 步驟a)中使用的樣品可以從任何來(lái)源獲得，例如，樣品可以從實(shí)驗(yàn)室內(nèi)持有的細(xì) 胞系進(jìn)行選擇，或者可以從機(jī)構(gòu)諸如ATCC (美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）獲得。
[0038] 步驟 b) 步驟b)描述了將步驟a)的樣品暴露于至少一種bvg調(diào)節(jié)條件，此類(lèi)條件可以是降低 Bvg-基因型細(xì)胞的接管或保留Bvg+基因型的任何條件。不被理論所束縛，當(dāng)博德特氏菌在 培養(yǎng)物中（例如在實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)設(shè)施中）孵育時(shí)，Bvg-基因型的細(xì)胞的比例趨向于隨著時(shí) 間（幾代）增加。這可能是由于不表達(dá)毒力因子導(dǎo)致的選擇性優(yōu)勢(shì)，這對(duì)于培養(yǎng)中的博德 特氏菌沒(méi)有益處。出于這個(gè)原因，在降低毒力因子表達(dá)的條件存在的情況下孵育博德特氏 菌降低了來(lái)自轉(zhuǎn)換為Bvg-基因型的選擇性優(yōu)勢(shì)，從而降低了培養(yǎng)中的Bvg-基因型細(xì)胞的 接管。從而保持了樣品中的Bvg+基因型群體。
[0039] 出于這個(gè)原因，bvg調(diào)節(jié)條件包括降低毒力因子表達(dá)的條件。任選地，"bvg調(diào)節(jié) 條件"是在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多代之后防止Bvg-基因型 細(xì)胞的比例增加超過(guò)25倍、15倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1. 5倍 的條件。代是指培養(yǎng)物中的細(xì)菌數(shù)加倍花費(fèi)的時(shí)間，其對(duì)于百日咳博德特氏菌大約為4小 時(shí)，然而，這根據(jù)培養(yǎng)百日咳博德特氏菌的條件而不同?？梢源_定潛在bvg調(diào)節(jié)條件事實(shí) 上是否是在潛在bvg調(diào)節(jié)條件下培養(yǎng)細(xì)胞至少8代且將細(xì)胞鋪板在Bordet-Gengou培養(yǎng)基 (其含有 5%血液）（Bordet J 和 Gengou 0，Le Microbe de la coqueluche, Annales de 1' Institut Pasteur 1906; 20:731-41)上以獲得單一菌落的bvg調(diào)節(jié)條件。在BG培養(yǎng) 基上，Bvg+基因型細(xì)胞呈現(xiàn)為半球形（domed)、緊湊的、溶血菌落，而B(niǎo)vg-基因型細(xì)胞呈現(xiàn) 為平的、未溶血菌落。應(yīng)當(dāng)將這種測(cè)試的結(jié)果與在相同條件下但不使用潛在bvg調(diào)節(jié)條件 生長(zhǎng)的細(xì)胞比較。如果Bvg-基因型細(xì)胞的比例顯著低于參考樣品中Bvg-基因型細(xì)胞的比 例，則該條件是bvg調(diào)節(jié)條件。
[0040] 在本公開(kāi)的上下文中可以使用任何bvg調(diào)節(jié)條件；具體實(shí)例包括高或低pH條件、 低氧條件、低溫條件或bvg調(diào)節(jié)劑的存在。
[0041] 短語(yǔ)"bvg調(diào)節(jié)劑"是指降低Bvg-基因型細(xì)胞的接管的合適濃度（調(diào)節(jié)濃度）的 化合物。bvg調(diào)節(jié)劑的濃度在整個(gè)步驟b)中不一定是恒定的，但在整個(gè)步驟b)中保持在調(diào) 節(jié)濃度內(nèi)。例如，各種濃度（包括〇.604g/L)的煙酸是bvg調(diào)節(jié)劑。通常，抑制來(lái)自百日咳 博德特氏菌的毒素諸如百日咳毒素表達(dá)的化合物是bvg調(diào)節(jié)劑。
[0042] 步驟b)是指其中存在至少一種bvg調(diào)節(jié)條件的發(fā)酵方法的任何階段，例如該步驟 可以包括細(xì)胞建庫(kù)和/或預(yù)培養(yǎng)和/或大規(guī)模發(fā)酵。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞建庫(kù)"對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員 是清楚的。通常，細(xì)胞建庫(kù)涉及制備用于貯存的細(xì)菌菌株，并且可以涉及利用細(xì)菌克?。ㄆ?可以是上面提到的接種物），并且孵育細(xì)菌克隆，直到獲得小體積的細(xì)菌?？梢詫⑦@種體積 的細(xì)菌的樣品制備、快速冷凍和保存在冰箱中。預(yù)培養(yǎng)通常涉及采用起始培養(yǎng)物并允許細(xì) 胞繁殖以達(dá)到濃度足以用于方法中的下一個(gè)步驟（例如毒力因子表達(dá)）的濃度。這可以涉 及幾種小孵育，例如博德特氏菌的小樣品可以在小搖瓶中生長(zhǎng)，并且可以將該小搖瓶的內(nèi) 容物轉(zhuǎn)移至較大搖瓶。這甚至可以涉及其中細(xì)胞在小發(fā)酵罐中生長(zhǎng)的步驟。
[0043] 任選地，預(yù)培養(yǎng)階段可以包括產(chǎn)生約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18代的百 日咳菌。任選地，預(yù)培養(yǎng)階段為1小時(shí)至200小時(shí)，2小時(shí)至150小時(shí)，5小時(shí)至125小時(shí)， 10小時(shí)至100小時(shí)，20小時(shí)至50小時(shí)，大于或等于1小時(shí)，大于或等于2小時(shí)，大于或等于 5小時(shí)，大于或等于10小時(shí)，大于或等于20小時(shí)，大于或等于50小時(shí)，小于或等于200小 時(shí)，小于或等于150小時(shí)，小于或等于125小時(shí)，小于或等于100小時(shí)，或小于或等于50小 時(shí)。任選地，預(yù)培養(yǎng)階段在小于10升、小于8升、小于5升、1至10升、1至8升、1至5升、 1至3升、2至8升、2至5升或2至3升的容器中進(jìn)行。
[0044] 在步驟b)過(guò)程中，將博德特氏菌在"第一環(huán)境"（其是指包含bvg調(diào)節(jié)條件的環(huán) 境）中培養(yǎng)。例如，這種環(huán)境可以指缺氧環(huán)境或高pH環(huán)境。術(shù)語(yǔ)"環(huán)境"也可以指包含至少 一種bvg調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基。因此，第一環(huán)境可以指包含至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的第一培養(yǎng)基， 且第二環(huán)境可以指不包含至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的第二培養(yǎng)基。任選地，至少一種bvg調(diào)節(jié) 條件包含第一培養(yǎng)基中的至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的存在。任選地，第一和第二培養(yǎng)基是相同 的。任選地，第一和第二培養(yǎng)基是不同的。任選地，第二培養(yǎng)基包含Stainer Scholte培養(yǎng) 基?；蛘?，第二培養(yǎng)基包含改良的Stainer Scholte培養(yǎng)基。Stainer Scholte培養(yǎng)基的組 成描述于 Cohen 和 Wheeler, Jffiericafl/otfraa/ (1946) 36:371-376。 如果培養(yǎng)基含有基本上相同濃度的基本相同的培養(yǎng)基組分，然而，含有培養(yǎng)基組分中1至5 種的濃度的改良，缺乏培養(yǎng)基組分中的1至3種，或含有1至20種額外培養(yǎng)基組分，則所述 培養(yǎng)基是改良的Stainer Scholte培養(yǎng)基。
[0045] 步驟b)導(dǎo)致產(chǎn)生可用于步驟c)中的成熟培養(yǎng)物。短語(yǔ)"成熟培養(yǎng)物"是指已經(jīng) 在至少一種bvg調(diào)節(jié)條件存在的情況下生長(zhǎng)至少5代的接種物。
[0046] 任選地，步驟b)的至少部分在體積為50 ml至25升、50ml至20升、50ml至15升、 50 ml至10升、50ml至5升、小于或等于25升、小于或等于20升、小于或等于15升、小于 或等于10升、小于或等于5升、大于或等于25 ml、大于或等于50 ml、大于或等于100ml、大 于或等于250ml、大于或等于500ml、大于或等于1升或大于或等于2升的容器中進(jìn)行。
[0047] 任選地，步驟c)在發(fā)酵罐中進(jìn)行。發(fā)酵罐工作體積可以是5至10000升、10至 5000升、20至2000升、50升至1000升、大于或等于5升、大于或等于10升、大于或等于15 升、大于或等于20升、大于或等于25升、大于或等于50升、大于或等于100升、小于或等于 10000升、小于或等于5000升或小于或等于2500升。
[0048] 任選地，步驟b)包括細(xì)胞建庫(kù)階段。或者，細(xì)胞建庫(kù)發(fā)生在步驟a)和步驟b之間。
[0049] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)包含至少5、6、7、8、9、10、12、14、16、或17代。任選地， 步驟b)包含小于40、小于35、小于30、小于25、小于20或小于18代。任選地，步驟b)是 小于或等于200小時(shí)、小于或等于150小時(shí)、小于或等于100小時(shí)、小于或等于80小時(shí)、小 于或等于70小時(shí)、小于或等于60小時(shí)、小于或等于55小時(shí)、大于或等于10小時(shí)、大于或等 于15小時(shí)、大于或等于20小時(shí)、大于或等于25小時(shí)、大于或等于30小時(shí)、大于或等于35 小時(shí)、大于或等于40小時(shí)、10小時(shí)至200小時(shí)、15小時(shí)至150小時(shí)、20小時(shí)至100小時(shí)、25 小時(shí)至80小時(shí)、或30小時(shí)至70之間。
[0050] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)在20°C至45°C、22°C至43°C、24°C至42°C、28°C至 42°C、30°C至42°C或32°C至40°C的溫度進(jìn)行。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)在6. 5至7. 8、6· 7至7. 5、6· 9至7. 3或7.0至7. 2的 pH進(jìn)行。
[0052] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)在10%至50%、15%至45%、20%至35%的溶解氧存 在的情況下進(jìn)行。
[0053] 步驟 c) 步驟c)是指其中博德特氏菌在步驟b)的至少一種bvg調(diào)節(jié)條件不存在的情況下生長(zhǎng) 的步驟。通常，去除步驟b)的bvg調(diào)節(jié)條件的存在，例如，如果bvg調(diào)節(jié)條件是低于28°C的 溫度，則在至少一種bvg調(diào)節(jié)條件不存在的情況下孵育成熟培養(yǎng)物涉及在大于28°C的溫度 下孵育成熟培養(yǎng)物。類(lèi)似地，如果至少一種bvg調(diào)節(jié)條件是bvg調(diào)節(jié)劑的存在，則在至少一 種bvg調(diào)節(jié)條件不存在的情況下孵育成熟培養(yǎng)物涉及在bvg調(diào)節(jié)劑不存在的情況下孵育成 熟培養(yǎng)物。例如，如果煙酸是bvg調(diào)節(jié)劑，則可以將其添加至用于步驟b)的第一培養(yǎng)基，并 降低在用于步驟c)的第二培養(yǎng)基中的濃度（從而使得其低于調(diào)節(jié)濃度）。
[0054] 通常，步驟c)不需要在步驟b)之后直接發(fā)生，可以有數(shù)天或數(shù)周的間隔，例如在 發(fā)酵中實(shí)際使用細(xì)胞之前數(shù)周或數(shù)個(gè)月進(jìn)行細(xì)胞建庫(kù)的情況下。任選地，步驟c)在步驟b) 之后直接發(fā)生。
[0055] 步驟b)可以在多于一種bvg調(diào)節(jié)條件存在的情況下發(fā)生。在這種情況下，這些 bvg調(diào)節(jié)條件中的至少一種，優(yōu)選所有，應(yīng)當(dāng)在步驟c)過(guò)程中去除。
[0056] 博德特氏菌屬物種在步驟c)中通常表達(dá)較高水平的毒力因子，可以將其純化用 于免疫原性組合物或疫苗中。步驟c)的至少部分通常在發(fā)酵罐中進(jìn)行，盡管步驟c)可以 在任何適當(dāng)容器中進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵罐工作體積是5至10000升、10至5000 升、20至2000升、50升至1000升、大于或等于5升、大于或等于10升、大于或等于15升、大 于或等于20升、大于或等于25升、大于或等于50升、大于或等于100升、小于或等于10000 升、小于或等于5000升或小于或等于2500升。
[0057] 步驟c)可以是分批補(bǔ)料方法。在分批補(bǔ)料方法中，將新培養(yǎng)基連續(xù)添加至發(fā)酵 罐。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c)小于或等于100小時(shí)、小于或等于80小時(shí)、小于或等于60 小時(shí)、小于或等于40小時(shí)、大于或等于5小時(shí)、大于或等于10小時(shí)、大于或等于15小時(shí)、大 于或等于25小時(shí)、5小時(shí)至100小時(shí)、10小時(shí)至80小時(shí)、15小時(shí)至60小時(shí)、25小時(shí)至40 小時(shí)。
[0058] 任選地，在步驟c)開(kāi)始時(shí)或步驟b)結(jié)束時(shí)，成熟培養(yǎng)物的小于或等于20%、小于 或等于18%、小于或等于15%、小于或等于12%、小于或等于10%、小于或等于8%、小于 或等于6%、小于或等于5%、小于或等于4%、小于或等于3%、大于或等于1%、大于或等 于2%、大于或等于3%、2%至10%、2%至8%、2%至12%、2%至10%、2%至6%或2%至 5%是1^-〇
[0059] 步驟c)可以在大于或等于32°C、大于或等于33°C、大于或等于34°C、大于或等于 35°C、小于或等于45°C、小于或等于42°C、小于或等于40°C、小于或等于38°C、32°C至45°C、 33°C至42°C、34°C至40°C或35°C至38°C的溫度進(jìn)行。
[0060] 任選地，在步驟C)中使用機(jī)械消泡器。
[0061] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c)為小于或等于200小時(shí)、小于或等于150小時(shí)100小 時(shí)、小于或等于80小時(shí)、小于或等于60小時(shí)、小于或等于40小時(shí)、大于或等于5小時(shí)、大于 或等于10小時(shí)、大于或等于15小時(shí)、大于或等于25小時(shí)、5小時(shí)至200小時(shí)、10小時(shí)至150 小時(shí)、15小時(shí)至100小時(shí)或25小時(shí)至80小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c)包括在第二環(huán) 境/第二培養(yǎng)基中將成熟培養(yǎng)物孵育至少5、6、7、8、9、10、12、15、18、20代或小于200、175、 150 或 125 代。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c)在6. 5至7. 8、6· 8至7. 5、6· 9至7. 3或7.0至7. 2的 pH進(jìn)行。
[0063] 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c)在10%至50%、15%至45%、20%至35%的溶解氧存 在的情況下進(jìn)行。
[0064] BVG調(diào)節(jié)備件 在本發(fā)明的上下文中可以使用任何bvg調(diào)節(jié)條件。下面提供了一些實(shí)例。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)條件包括在低于或等于28°C、低于或等于 27°C、低于或等于26°C、低于或等于25°C、高于或等于18°C、高于或等于20°C、高于或等于 22°C、高于或等于24°C、0°C至28°C、0°C至27°C、0°C至26°C或0°C至25°C的溫度孵育樣品。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)條件包括在低于或等于0. 100、低于或等于 0. 090、低于或等于0. 080、低于或等于0. 070、高于或等于0. 001、高于或等于0. 050、高于 或等于0. 010、高于或等于0. 015、高于或等于0. 020、高于或等于0. 025、0. 010至0. 100、 0. 010至0. 090、0. 010至0. 080或0. 010至0. 070 mmol溶解02/每升的氧濃度下孵育樣品。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)條件包括在堿性pH孵育樣品。任選地，pH 是大于或等于7. 2、大于或等于7. 3、大于或等于7. 4、小于或等于9. 5、小于或等于9. 0、小于 或等于8. 5、小于或等于8. 0、7. 2至8. 0、7. 3至8. 0或7. 4至8. 0的pH。
[0068] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)條件包括在酸性pH孵育樣品。任選地，酸性 pH是小于或等于7. 0、小于或等于6. 8、小于或等于6. 6、小于或等于6. 4、小于或等于6. 2、 高于或等于4. 5、高于或等于5. 0、高于或等于5. 5、高于或等于6. 0、高于或等于6. 5、5. 0至 7. 0、5· 0 至 6. 9 或 5. 0 至 6. 8 的 pH。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含煙酸。任選地，bvg調(diào)節(jié)劑包含濃度 為大于或等于〇. 〇〇4g/l、大于或等于0. Olg/Ι、大于或等于0. lg/Ι、大于或等于0. 2g/l、大 于或等于0. 3g/l、大于或等于0. 004g/l、小于或等于400g/l、小于或等于300 g/Ι、小于或 等于200g/l、小于或等于100g/l、小于或等于50g/l、小于或等于5g/l、0. 004g/l至500g/ 1、 0· 01g/l 至 400g/l、0. lg/1 至 300g/l、0. 4g/l 至 200g/l 或 0· 2g/l 至 100g/l 的煙酸。
[0070] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含選自鎂鹽、硫酸鹽、磷酸鹽和碳酸 鹽的無(wú)機(jī)鹽。任選地，無(wú)機(jī)鹽是硫酸鹽。硫酸鹽可以是以大于或等于0.04mM、大于或等于 0. 08mM、大于或等于ImM、大于或等于4mM、大于或等于8mM、大于或等于10mM、小于或等于 50mM、小于或等于40mM、小于或等于35mM、小于或等于30mM、小于或等于25mM、小于或等于 20mM、小于 15mM、0. 04mM 至 40mM、0. 08mM 至 至 40mM、8mM 至 10mM、15mM 至 40mM、或 17mM至40mM的濃度。
[0071] 任選地，無(wú)機(jī)鹽是磷酸鹽。磷酸鹽可以是以大于或等于〇.4g/l、大于或等于0.5g/ 1、大于或等于〇.6g/l、大于或等于0.7g/L、小于或等于20g/l、小于或等于18g/l、小于或等 于16g/l、小于或等于10g/l、小于或等于5g/l、小于或等于2g/l、0. 4g/L至20g/L、0. 5g/L 至 20g/L、0. 6g/L 至 20g/L 或 0· 7g/L 至 20g/L 的濃度。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含蔗糖。蔗糖可以是以大于或等于 10mM、大于或等于15mM、大于或等于20mM、大于或等于25mM、大于或等于30mM、大于或等于 35mM、大于或等于40mM、小于或等于100mM、小于或等于90mM、小于或等于85mM、小于或等于 80mM、小于或等于75mM、小于或等于70mM、小于或等于50mM、10mM至100mM、15mM至95mM、 20mM 至 90mM、25mM 至 85mM 或 30mM 至 80mM 的濃度。
[0073] 任選地，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含選自酵母提取物、胰蛋白酶大豆瓊脂、磷酸胰蛋 白|際（tryptose phosphate)、蛋白胨和腦心組織浸出物和蛋白胨的復(fù)合培養(yǎng)基組分。復(fù) 合培養(yǎng)基組分可以是以大于或等于lg/L、大于或等于3g/L、大于或等于5g/L、大于或等于 l〇g/L、小于或等于40g/L、小于或等于35g/L、小于或等于30g/l、小于或等于25g/l、小于或 等于 20g/L、lg/L 至 40g/l、3g/l 至 40g/l、5g/l 至 40g/L、或 10g/L 至 40g/L 的濃度。
[0074] 任選地，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含脯氨酸。脯氨酸可以是以大于或等于0. 25g/l、 大于或等于〇. 4g/l、大于或等于0. 5g/l、大于或等于0. 6g/L、大于或等于lg/L、大于或等于 2g/L、大于或等于3g/L大于或等于4g/l、小于或等于50g/L、小于或等于30g/L、小于或等 于 25g/L、小于或等于 20g/L、小于或等于 15g/L、0. 25g/L 至 50g/L、0. 4g/L 至 50g/L、0. 5g/ L 至 50g/L、0. 6g/L 至 50g/L、lg/L 至 50g/L、2g/L 至 50g/L、3g/L 至 50g/L、或 4g/L 至 50g/ L的濃度。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含濃度為大于100mM、大于120mM、大于 150mM、大于 175mM、大于 200mM、大于 250mM、小于 2000mM、小于 lOOOmM、小于 800mM、100mM 至 2000mM、120mM 至 2000mM、150mM 至 2000mM、175mM 至 2000mM、或 200mM 至 2000mM 的鈉離子。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施方案中，bvg調(diào)節(jié)劑包含消泡劑。任選地，消泡劑是聚二甲基硅氧烷。 聚二甲基硅氧烷可以是大于或等于5g/l、大于或等于10g/l、大于或等于15g/l、大于或等 于20g/l、大于或等于25g/l、大于或等于30g/l、大于或等于40g/l、小于或等于250g/l、 小于或等于230g/l、小于或等于200g/l、小于或等于180g/l、小于或等于150g/l、5g/l至 250g/l、10g/l 至 230g/l、15g/l 至 200g/l、20g/l 至 180g/l、25g/l 至 150g/l 或 25g/l 至 150g/l的濃度。
[0077] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含谷胱甘肽。谷胱甘肽可以是大于或 等于0. 15g/L、大于或等于0. 20g/L、大于或等于0. 25g/L、大于或等于0. 30g/L、大于或等于 0. 35g/L、大于或等于0. 40g/L、小于或等于20g/L、小于或等于15g/l、小于或等于12g/L、小 于或等于 l〇g/L、0· 15g/L 至 20g/L、0. 20g/L 至 20g/L、0. 25g/L 至 20g/L、0. 30g/L 至 20g/ L、0. 35g/L 至 20g/L、0· 35g/L 至 20g/L 或 0· 40g/L 至 20g/L 的濃度。
[0078] 在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含含硫氨基酸，這些氨基酸包括半胱 氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸，而且還包括含有硫原子的任何其它氨基酸（天然的和非天然氨基 酸）。這些氨基酸可以衍生自蛋白或肽來(lái)源，或者可以作為個(gè)別氨基酸來(lái)源。在進(jìn)一步的 實(shí)施方案中，至少一種bvg調(diào)節(jié)劑包含濃度大于或等于0. 25mM、大于或等于0. 5mM、大于或 等于0. 8mM、小于或等于lOOOrnM、小于或等于500mM、小于或等于250mM、小于或等于lOOmM、 小于或等于50mM、小于或等于25mM、小于或等于10mM、0. 25mM至lOOOmM、0. 5mM至500mM、 0. 8mM至250mM、或0. 5mM至100mM的含硫氨基酸。
[0079] 講一步的步驟 在一個(gè)實(shí)施方案中，博德特氏菌屬物種表達(dá)至少一種選自百日咳毒素、絲狀血細(xì)胞凝 集素、菌毛凝集原（fimbrial aggultinogen)和百日咳桿菌粘附素（Pertactin)的毒力因 子。任選地，百日咳毒素在步驟b)中以小于 2,8 mgL4 2,7 mgV1 Ο?ψ^：\ 2,6 rngL1 Ο?ψ^；\ 23mgL·'· Ο?ψ^\ 2,4 rngl^1 , 2^3 nigL ODesonm , 2.2 mgL ODesj--r( . 2.1 mgL 〇Ορ·>〇,:^ , 2 0 mgL 00 1-9 mgL ' 00Λι·,?：!, 1,8 mgL^ 17 mgL^ OOe^.；1, j*1.6 mgL^ OD?；：,,?；1 的百日咳毒素比生產(chǎn)速率產(chǎn)生。任選地，百日咳毒素在步驟c)過(guò)程中以大于 S mgL、心乂 2 J mgL * 礙.m \ 3.0 mgL \於二 3.1 m§L mgLVcm1 的百日咳毒素比 生產(chǎn)速率產(chǎn)生。
[0080] 本公開(kāi)的方法可以包括進(jìn)一步的純化毒力因子以產(chǎn)生純化的毒力因子的步驟d)。 純化的毒力因子可以是純化的百日咳毒素（PT)、絲狀血細(xì)胞凝集素（FHA)、百日咳桿菌粘 附素（PRN)、凝集原2或凝集原3。純化的毒力因子可以在純化后進(jìn)行改變，例如百日咳毒素 可以在純化后進(jìn)行化學(xué)去毒。對(duì)于百日咳抗原的制備，也參見(jiàn)EP 427462和W0 91/12020。 在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟d)涉及使用層析的細(xì)胞純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述層析技術(shù) 是親和層析、凝膠過(guò)濾、高壓液相層析（HPLC)或離子交換層析。任選地，親和層析使用親和 標(biāo)簽純化柱、抗體純化柱、凝集素親和柱、前列腺素純化柱或鏈霉親和素柱。任選地，HPLC 使用離子交換柱、反相柱或大小排阻柱。任選地，離子交換柱是陰離子交換柱或陽(yáng)離子交換 柱。
[0081] 該方法可以進(jìn)一步包括配制包含純化的毒力因子的免疫原性組合物的步驟e)。
[0082] 該方法可以進(jìn)一步包括將至少一種進(jìn)一步的抗原添加至免疫原性組合物的步驟 f)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種進(jìn)一步的抗原選自百日咳毒素、絲狀血細(xì)胞凝集素、百日 咳桿菌粘附素、菌毛凝集原、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、至少一種綴合的來(lái)自腦膜炎奈瑟 氏球菌的糖抗原、乙型肝炎表面抗原、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒（IPV)和 綴合的來(lái)自b型流感嗜血桿菌b)的糖抗原。至少一種綴合的來(lái) 自腦膜炎奈瑟氏球菌的糖抗原可以是MenC、MenY、MenA和MenW (例如A+C、A+Y、A+W、C+Y、 C+W、Y+W、A+C+Y、A+C+W、A+Y+W、C+Y+W、A+C+Y+W);任選地，包括 MenC 和 / 或 MenY，任選包括 所有四種。
[0083] 或者或除了上述腦膜炎球菌抗原以外，免疫原性組合物可以包含一種或多種肺炎 球菌莢膜寡糖或多糖-載體蛋白綴合物。
[0084] 通常，本發(fā)明的組合物中代表的肺炎球菌莢膜寡糖或多糖（優(yōu)選后者）包含衍生 自肺炎球菌的至少四種血清型的抗原。優(yōu)選地，四種血清型包含6B、14、19F和23F。更優(yōu) 選地，組合物中包含至少7種血清型，例如衍生自血清型4、68、聽(tīng)、14、18(：、19?和23?的那 些。仍然更優(yōu)選地，組合物中包含至少11種血清型（11價(jià)），例如衍生自血清型1、3、4、5、 6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的那些。仍然更優(yōu)選地，組合物中包含至少10種血清型（10 價(jià)），例如衍生自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的那些。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，包含至少13種此類(lèi)綴合的肺炎球菌抗原，盡管本發(fā)明還考慮進(jìn)一步的抗 原，例如 23 價(jià)（諸如血清型 1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、 19A、19F、20、22F、23F 和 33F)。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方 案中，發(fā)酵方法包括將藥學(xué)上可接受的賦形劑添加至免疫原性組合物的步驟g)。
[0086] 在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含佐劑，諸如磷酸鋁或氫氧化鋁。在一個(gè)實(shí) 施方案中，發(fā)酵方法包括將佐劑添加至免疫原性組合物的步驟f)。將DTPa和DTPw抗原吸 附至鋁佐劑的方法是本領(lǐng)域中已知的。參見(jiàn)例如W0 93/24148和W0 97/00697。通常，將抗 原在本發(fā)明的組合免疫原性組合物中混合在一起之前，吸附至佐劑的組分在室溫在適當(dāng)pH 放置至少10分鐘期間，用于吸附大部分且優(yōu)選所有抗原。
[0087] 與其它組分混合之前，其它組分是優(yōu)選未吸附的（諸如IPV)或特異性吸附至其它 佐劑上-乙型肝炎表面抗原（HBsAg)優(yōu)選吸附至磷酸鋁（如W0 93/24148中描述）上。 [0088] 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了通過(guò)所述方法可獲得的毒力因子。在一個(gè)進(jìn) 一步的實(shí)施方案中，提供了通過(guò)所述方法獲得的毒力因子。
[0089] 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了包含毒力因子和藥學(xué)上可接受的賦形劑的免 疫原性組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含至少一種進(jìn)一步的抗原。在一個(gè) 實(shí)施方案中，至少一種進(jìn)一步的抗原選自百日咳毒素、絲狀血細(xì)胞凝集素、百日咳桿菌粘附 素、菌毛凝集原、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、至少一種綴合的來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的糖 抗原、乙型肝炎表面抗原、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒（IPV)和綴合的來(lái)自b型流感嗜血桿菌的 糖抗原（任選綴合至破傷風(fēng)類(lèi)毒素）。至少一種綴合的來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的糖抗原可 以是 MenC、MenY、MenA 和 MenW (例如 A+C、A+Y、A+W、C+Y、C+W、Y+W、A+C+Y、A+C+W、A+Y+W、 C+Y+W、A+C+Y+W);任選地，包括MenC和/或MenY，任選包括所有四種。在一個(gè)實(shí)施方案中， 疫苗包含白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素和PT、FHA和PRN中的至少一種（DTPa疫苗）。
[0090] 在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物進(jìn)一步包含佐劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原 性組合物包含磷酸鋁或氫氧化鋁。將DTPa抗原吸附至鋁佐劑的方法是本領(lǐng)域中已知的。參 見(jiàn)例如W0 93/24148和W0 97/00697。通常，將抗原在本發(fā)明的組合免疫原性組合物中混合 在一起之前，吸附至佐劑的組分在室溫在適當(dāng)pH放置至少10分鐘期間，用于吸附大部分且 優(yōu)選所有抗原。
[0091] 與其它組分混合之前，其它組分是優(yōu)選未吸附的（諸如IPV)或特異性吸附至其它 佐劑上-乙型肝炎表面抗原（HBsAg)優(yōu)選吸附至磷酸鋁（如W0 93/24148中描述）上。
[0092] 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含免疫原性組合物的疫苗。
[0093] 疫苗制備通常描述于 Vaccine Design - The Subunit and adjuvant approach Ed Powell and Newman; Pellum Press。有利地，根據(jù)本發(fā)明的組合疫苗是兒科疫苗。 [0094] 選擇每個(gè)疫苗劑量中多糖或寡糖綴合物抗原的量作為誘導(dǎo)免疫保護(hù)應(yīng)答、而在典 型接種疫苗者中沒(méi)有明顯不利副作用的量。此類(lèi)量將根據(jù)采用何種具體免疫原而不同。通 常，預(yù)期每個(gè)劑量將包含1-1000 μ g、優(yōu)選2-100 μ g、更優(yōu)選4-40、2-15或3-10 μ g、最優(yōu) 選約或恰好5 μ g綴合的多糖或寡糖（以糖的量表示）。
[0095] 疫苗中蛋白抗原的含量將通常在l-100yg的范圍內(nèi)，優(yōu)選5-50yg，最通常5 -25 μ g的范圍內(nèi)。
[0096] 可以通過(guò)涉及觀察受試者中的抗體效價(jià)和其它應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究來(lái)確定用于特定 疫苗的抗原的最佳量。在最初接種疫苗之后，受試者可以以約4周或更長(zhǎng)時(shí)間間隔接受一 次或兩次加強(qiáng)注射。
[0097] 本發(fā)明的疫苗制劑可用于借助經(jīng)由全身或粘膜途徑施用所述疫苗保護(hù)或治療易 受傳染的哺乳動(dòng)物（優(yōu)選人）。這些施用可包括經(jīng)由肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射。 [0098] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，提供了如前所述的免疫原性組合物或疫苗，其用于預(yù)防或治 療疾病。
[0099] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，提供了如前所述的免疫原性組合物或疫苗，其用于預(yù)防或治 療百日咳博德特氏菌疾病。
[0100] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，提供了如前所述的免疫原性組合物或疫苗用于預(yù)防或治療疾 病的用途。
[0101] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，提供了如前所述的免疫原性組合物或疫苗在制備用于治療或 預(yù)防細(xì)菌性疾病的藥物中的用途。
[0102] 在一個(gè)進(jìn)一步方面，提供了預(yù)防或治療疾病的方法，其包括向患者施用如前所述 的免疫原性組合物或疫苗。
[0103] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病是百日咳博德特氏菌疾病。 實(shí)施例
[0104] 實(shí)施例1 - 20L規(guī)樽發(fā)酵中百日晐博德特氐菌1^￡±和1^￡=突奪體的牛長(zhǎng)和毒力 閔子產(chǎn)牛 將百日咳博德特氏菌的搖瓶培養(yǎng)物鋪板在Bordet-Gengou培養(yǎng)基（含有5 %綿羊血 液），以便能夠檢測(cè)溶血0^·§·+)和非溶血菌落。從這些板分離一個(gè)單一 6嘆+菌落和 一個(gè)單一 菌落，并用于進(jìn)行20L規(guī)模發(fā)酵。
[0105] 用1〇9百日咳博德特氏菌CFU接種含有7. 5 ml新鮮培養(yǎng)基（通過(guò)添加二甲基- -環(huán)糊精1 g/L和酸酪蛋白水解物10 g/L、用L-半胱氨酸40 mg/L替代L-胱氨酸40 mg/ L并使用較高濃度的L-谷氨酸鈉（11.84 g/L)、還原型谷胱甘肽（150 mg/L)和抗壞血酸 (400 mg/L)而改變自 Stainer 和 Scholte (J. Gen. Microbiol. 63:211-220 (1971)))的 第一搖瓶預(yù)培養(yǎng)物，并在35°C (+/_ 1°C)和150 rpm孵育24h (+/- lh)以產(chǎn)生第一預(yù)培 養(yǎng)物。使用第一預(yù)培養(yǎng)物接種含有l(wèi)〇〇ml新鮮培養(yǎng)基的第二搖瓶預(yù)培養(yǎng)物。將第二預(yù)培養(yǎng) 物在35°C (+/_ 1°C)和150 rpm孵育24h (+/- lh)，并用于接種兩個(gè)各含1L新鮮培養(yǎng)基 的搖瓶。在35°C (+/_ 1°C)和150 rpm生長(zhǎng)24h (+/- 4h)之后，將來(lái)自第三次預(yù)培養(yǎng)的 兩個(gè)搖瓶合并。第三次預(yù)培養(yǎng)一停止，馬上將合并的預(yù)培養(yǎng)物用來(lái)接種發(fā)酵罐。平行地，通 過(guò)將適當(dāng)?shù)南♂屛镤伆逶贐G (Bordet Gengou)培養(yǎng)基（含有5%血液）上測(cè)量第三次預(yù)培 養(yǎng)結(jié)束時(shí)6嘆+和6嘆細(xì)胞的比例。該比例代表20L發(fā)酵中6嘆細(xì)胞的初始比例（表1)。
[0106] 使用20L發(fā)酵罐（Biolafitte?)。將10L培養(yǎng)基無(wú)菌轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中。使用以下條 件來(lái)校準(zhǔn)100%溶解氧（D0)水平：溫度（35°C )、排出壓力（head pressure) (0. 4巴（bar))、 空氣流速（4. 6L鼓泡空氣/分鐘）和攪拌速度（50 rpm或每分鐘轉(zhuǎn)動(dòng)）。
[0107] 通過(guò)添加1. 5L合并的預(yù)培養(yǎng)物實(shí)現(xiàn)接種。
[0108] 在發(fā)酵過(guò)程中，使溫度（35°C )和排出壓力（0· 4巴）保持在恒定水平。使用機(jī)械 消泡器來(lái)控制發(fā)酵過(guò)程中的泡沫。根據(jù)預(yù)先定義的曲線，空氣流速在發(fā)酵過(guò)程中漸進(jìn)地增 力口。將溶解氧的水平設(shè)定在25%，并通過(guò)當(dāng)D0下降至25%以下時(shí)增加攪拌進(jìn)行調(diào)節(jié)。將 最低攪拌速度設(shè)定在50 rpm ;將最大攪拌速度設(shè)定在550 rpm。將pH通過(guò)添加乙酸50% (?八或重量/體積）調(diào)節(jié)在7.2。
[0109] 在發(fā)酵過(guò)程中，bvg-和bvg+培養(yǎng)物的生長(zhǎng)作為650 nm處的光密度（0D65Qnm ;圖1) 進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（定義為氧消耗降低-作為谷氨酸鹽耗竭的結(jié)果_，導(dǎo)致攪拌速 度降低的時(shí)間），培養(yǎng)上清液中百日咳毒素（PT)的產(chǎn)生通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定，并且6嘆+和 辦嘆_細(xì)胞的比例通過(guò)將發(fā)酵液的適當(dāng)稀釋物鋪板在含有5%血液的BG培養(yǎng)基上進(jìn)行測(cè)量 (表1)。該比例代表20L發(fā)酵中6嘆細(xì)胞的最終比例（表1)。
[0110] 與用6嘆+分離株發(fā)酵相比，用分離株發(fā)酵導(dǎo)致更快生長(zhǎng)，但非常低的PT產(chǎn) 生。然而，兩種分離株之間的最大生物量濃度沒(méi)有不同。
【權(quán)利要求】
1. 發(fā)酵方法，其包括以下步驟： a) 提供博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品； b) 在第一環(huán)境中在至少一種bvg(博德特氏菌毒力基因）調(diào)節(jié)條件下將所述博德特氏 菌屬物種細(xì)菌的樣品孵育至少5代，從而產(chǎn)生成熟培養(yǎng)物； c) 在第二環(huán)境中在至少一種bvg調(diào)節(jié)條件不存在的情況下孵育所述成熟培養(yǎng)物； 其中步驟c)在步驟b)之后發(fā)生。
2. 權(quán)利要求1的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)條件包括在以下溫度下孵育所述樣品 (i) 低于或等于28°C、低于或等于27°C、低于或等于26°C、或低于或等于25°C ; (ii) 高于或等于18°C、高于或等于20°C、高于或等于22°C、或高于或等于24°C ;或 (iii) 0°C至 28°C、0°C至 27°C、0°C至 26°C或 0°C至 25°C。
3. 權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)條件包括在以下氧濃度下孵 育所述樣品 (i) 低于或等于〇. 100、低于或等于〇. 090、低于或等于0. 080、或低于或等于0. 070 mmol溶解02 /升； (ii) 聞?dòng)诨虻扔?. 001、聞?dòng)诨虻扔?. 050、聞?dòng)诨虻扔?. 010、聞?dòng)诨虻扔?. 015、聞 于或等于〇. 020、或高于或等于0. 025 mmol溶解02 /升；或 (iii) 0· 010 至 0· 100、0· 010 至 0· 090、0· 010 至 0· 080 或 0· 010 至 0· 070 mmol 溶解 02 /升。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)條件包括在堿性pH孵育所述 樣品。
5. 權(quán)利要求4的發(fā)酵方法，其中所述堿性pH是以下pH (i) 大于或等于7. 2、大于或等于7. 3、大于或等于7. 4; (ii) 小于或等于9. 5、小于或等于9. 0、小于或等于8. 5或小于或等于8. 0 ;或 (iii) 7. 2 至 8. 0、7· 3 至 8.0 或 7. 4 至 8.0。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)條件包括在酸性pH孵育所述 樣品。
7. 權(quán)利要求6的發(fā)酵方法，其中所述酸性pH是以下pH (i) 小于或等于7. 0、小于或等于6. 8、小于或等于6. 6、小于或等于6. 4或小于或等于 6. 2 ； (ii) 高于或等于4. 5、高于或等于5. 0、高于或等于5. 5、高于或等于6. 0或高于或等于 6. 5 ;或 (iii) 5.0 至 7. 0、5.0 至 6. 9 或 5.0 至 6. 8。
8. 任何前述權(quán)利要求的發(fā)酵方法，其中所述第一環(huán)境是第一培養(yǎng)基。
9. 任何前述權(quán)利要求的發(fā)酵方法，其中所述第二環(huán)境是第二培養(yǎng)基。
10. 權(quán)利要求8的發(fā)酵方法，其中所述至少一種bvg調(diào)節(jié)條件包括在所述第一培養(yǎng)基中 的至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的存在。
11. 發(fā)酵方法，其包括以下步驟： a) 在包含至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的第一培養(yǎng)基中提供博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品； b) 在所述包含至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的第一培養(yǎng)基中將所述樣品孵育至少5代，從而產(chǎn) 生成熟培養(yǎng)物； C)在第二培養(yǎng)基中在至少一種bvg調(diào)節(jié)劑不存在的情況下孵育所述成熟培養(yǎng)物； 其中步驟C)在步驟b)之后發(fā)生。
12. 發(fā)酵方法，其包括以下步驟： a) 在第一培養(yǎng)基中提供博德特氏菌屬物種細(xì)菌的樣品； b) 在包含至少一種bvg調(diào)節(jié)劑的第一培養(yǎng)基中將所述樣品孵育至少5代，從而產(chǎn)生成 熟培養(yǎng)物； C)在第二培養(yǎng)基中在至少一種bvg調(diào)節(jié)劑不存在的情況下孵育所述成熟培養(yǎng)物； 其中步驟C)在步驟b)之后發(fā)生。
13. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述博德特氏菌屬物種是選自百日咳博 德特氏菌副百日咳博德特氏菌（/ferofeieBa 和 支氣管炎博德特氏菌（及的物種。
14. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述發(fā)酵方法是用于從博德特氏菌屬物 種生產(chǎn)一種或多種毒素的方法。
15. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)包括小于40、小于35、小于30、小 于25、小于20或小于18代。
16. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述方法是用于在工業(yè)培養(yǎng)物中保存 bvg+基因型的博德特氏菌屬物種的方法。
17. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述方法是用于在工業(yè)培養(yǎng)物中在生長(zhǎng) 中將毒力因子的表達(dá)損失降到最低的方法。
18. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述方法是用于增強(qiáng)產(chǎn)生博德特氏菌屬 物種毒力因子的方法。
19. 權(quán)利要求10-18中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含煙酸。
20. 權(quán)利要求19的發(fā)酵方法，其中所述煙酸是以以下的濃度 (i) 大于或等于〇. 〇〇4g/l、大于或等于0. 01g/l、大于或等于0. lg/Ι、大于或等于 0. 2g/l、大于或等于0. 3g/l、或大于或等于0. 004g/l ; (ii) 小于或等于400g/l、小于或等于300 g/1、小于或等于200g/l、小于或等于100g/ 1、 小于或等于50g/l、或小于或等于5g/l ;或 (iii) 0· 004g/l至 500g/l、0. 01g/l至 400g/l、0. lg/Ι至 300g/l、0. 4g/l至 200g/l或 0·2g/l 至 100g/l。
21. 權(quán)利要求10-20中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含選自鎂鹽、硫酸鹽、 磷酸鹽和碳酸鹽的無(wú)機(jī)鹽。
22. 權(quán)利要求21的發(fā)酵方法，其中所述無(wú)機(jī)鹽是硫酸鹽。
23. 權(quán)利要求22的發(fā)酵方法，其中所述硫酸鹽是以以下的濃度 (i) 大于或等于〇. 〇4mM、大于或等于0. 08mM、大于或等于ImM、大于或等于4mM、大于或 等于8mM或大于或等于10mM ; (ii) 小于或等于50mM、小于或等于40mM、小于或等于35mM、小于或等于30mM、小于或 等于25mM、小于或等于20mM或小于或等于15mM ;或 (iii) 0. 04mM 至 40mM、0. 08mM 至 至 40mM、8mM 至 10mM、15mM 至 40mM、或 17mM 至 40mM。
24. 權(quán)利要求21的發(fā)酵方法，其中所述無(wú)機(jī)鹽是磷酸鹽。
25. 權(quán)利要求24的發(fā)酵方法，其中所述磷酸鹽是以以下的濃度 (i) 大于或等于〇. 4g/l、大于或等于0. 5g/l、大于或等于0. 6g/l、或大于或等于0. 7g/ L ； (ii) 小于或等于20g/l、小于或等于18g/l、小于或等于16g/l、小于或等于10g/l、小 于或等于5g/l、或小于或等于2g/l ;或 (iii) 0· 4g/L 至 20g/L、0. 5g/L 至 20g/L、0. 6g/L 至 20g/L 或 0· 7g/L 至 20g/L。
26. 權(quán)利要求10-25中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含蔗糖。
27. 權(quán)利要求26的發(fā)酵方法，其中所述蔗糖是以以下的濃度 (i) 大于或等于10mM、大于或等于15mM、大于或等于20mM、大于或等于25mM、大于或等 于30mM、大于或等于35mM或大于或等于40mM ; (ii) 小于或等于l〇〇mM、小于或等于90mM、小于或等于85mM、小于或等于80mM、小于或 等于75mM、小于或等于70mM或小于或等于50mM ;或 (iii) 10mM 至 lOOmM、15mM 至 95mM、20mM 至 90mM、25mM 至 85mM 或 30mM 至 80mM。
28. 權(quán)利要求10-27中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含選自酵母提取物、 胰蛋白酶大豆瓊脂、磷酸胰蛋白際、腦心組織浸出物和蛋白胨的復(fù)合培養(yǎng)基組分。
29. 權(quán)利要求28的發(fā)酵方法，其中所述復(fù)合培養(yǎng)基組分是以以下的濃度 (i) 大于或等于lg/L、大于或等于3g/L、大于或等于5g/L、或大于或等于10g/L ; (ii) 小于或等于40g/L、小于或等于35g/L、小于或等于30g/l、小于或等于25g/l、或 小于或等于20g/L;或 (iii) lg/L 至 40g/l、3g/l 至 40g/l、5g/l 至 40g/L、或 10g/L 至 40g/L。
30. 權(quán)利要求10-29中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含脯氨酸。
31. 權(quán)利要求30的發(fā)酵方法，其中所述脯氨酸是以以下的濃度 (i) 大于或等于〇. 25g/l、大于或等于0. 4g/l、大于或等于0. 5g/l、大于或等于0. 6g/ L、大于或等于lg/L、大于或等于2g/L、大于或等于3g/L、或大于或等于4g/l ; (ii) 小于或等于50g/L、小于或等于30g/L、小于或等于25g/L、小于或等于20g/L、或小 于或等于15g/L ;或 (iii) 0· 25g/L 至 50g/L、0. 4g/L 至 50g/L、0. 5g/L 至 50g/L、0. 6g/L 至 50g/L、lg/L 至 50g/L、2g/L 至 50g/L、3g/L 至 50g/L、或 4g/L 至 50g/L。
32. 權(quán)利要求10-31中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含以以下濃度的鈉離子 (i) 大于l〇〇mM、大于120mM、大于150mM、大于175mM、大于200mM、或大于250mM ; (ii) 小于2000mM、小于lOOOmM、或小于800mM ;或 (iii) lOOmM 至 2000mM、120mM 至 2000mM、150mM 至 2000mM、175mM 至 2000mM、或 200mM 至 2000mM。
33. 權(quán)利要求10-32中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含消泡劑。
34. 權(quán)利要求33的發(fā)酵方法，其中所述消泡劑是聚二甲基硅氧烷。
35. 權(quán)利要求33或34的發(fā)酵方法，其中所述聚二甲基硅氧烷是以以下的濃度 (i)大于或等于5g/l、大于或等于10g/l、大于或等于15g/l、大于或等于20g/l、大于 或等于25g/l、大于或等于30g/l、或大于或等于40g/l ; (ii) 小于或等于250g/l、小于或等于230g/l、小于或等于200g/l、小于或等于180g/l、 或小于或等于150g/l ;或 (iii) 5g/l 至 250g/l、10g/l 至 230g/l、15g/l 至 200g/l、20g/l 至 180g/l、25g/l 至 150g/l 或 25g/l 至 150g/l。
36. 權(quán)利要求10-35中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含谷胱甘肽。
37. 權(quán)利要求36的發(fā)酵方法，其中所述谷胱甘肽是以以下的濃度 (i) 大于或等于〇. 15g/L、大于或等于0. 20g/L、大于或等于0. 25g/L、大于或等于 0· 30g/L、大于或等于0· 35g/L、或大于或等于0· 40g/L ; (ii) 小于或等于20g/L、小于或等于15g/l、小于或等于12g/L、或小于或等于10g/L、或 (iii) 0· 15g/L 至 20g/L、0. 20g/L 至 20g/L、0. 25g/L 至 20g/L、0. 30g/L 至 20g/L、 0· 35g/L 至 20g/L、0. 35g/L 至 20g/L 或 0· 40g/L 至 20g/L。
38. 權(quán)利要求10-37中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含至少一種含硫氨基 酸。
39. 權(quán)利要求38的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含半胱氨酸。
40. 權(quán)利要求39的發(fā)酵方法，其中所述bvg調(diào)節(jié)劑包含甲硫氨酸。
41. 權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述含硫氨基酸是以以下的濃度 (i) 大于或等于0. 25mM、大于或等于0. 5mM、或大于或等于0. 8mM ; (ii) 小于或等于l〇〇〇mM、小于或等于500mM、小于或等于250mM、小于或等于100mM、小 于或等于50mM、小于或等于25mM、或小于或等于10mM ;或 (iii) 0· 25mM 至 lOOOmM、0· 5mM 至 500mM、0. 8mM 至 250mM、或 0· 5mM 至 lOOmM。
42. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中 在步驟c)開(kāi)始時(shí)，所述成熟培養(yǎng)物的 (i) 小于或等于20%、小于或等于18%、小于或等于15%、小于或等于12%、小于或等于 10%、小于或等于8%、小于或等于6%、小于或等于5%、小于或等于4%、或小于或等于3% ; (ii) 大于或等于1%、大于或等于2%、或大于或等于3% ;或 (iii) 2% 至 10%、2% 至 8%、2% 至 12%、2% 至 10%、2% 至 6% 或 2% 至 5% 是bvg-基因型。
43. 權(quán)利要求9-42中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述第二培養(yǎng)基包含Stainer Scholte 培養(yǎng)基。
44. 權(quán)利要求9-42中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述第二培養(yǎng)基包含改良的Stainer Scholte培養(yǎng)基。
45. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)的至少部分在體積為 (i) 50ml 至 25 升、50ml 至 20 升、50ml 至 15 升、50ml 至 10 升、或 50ml 至 5 升； (ii) 小于或等于25升、小于或等于20升、小于或等于15升、小于或等于10升、或小于 或等于5升；或 (iii) 大于或等于25 ml、大于或等于50ml、大于或等于100ml、大于或等于250ml、大于 或等于500ml、大于或等于1升、或大于或等于2升 的容器中進(jìn)行。
46. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟c)在發(fā)酵罐中進(jìn)行。
47. 權(quán)利要求46的發(fā)酵方法，其中所述發(fā)酵罐工作體積為 (i) 5 至 10000 升、10 至 5000 升、20 至 2000 升、或 50 升至 1000 升； (ii) 大于或等于5升、大于或等于10升、大于或等于15升、大于或等于20升、大于或 等于25升、大于或等于50升、或大于或等于100升；或 (iii) 小于或等于10000升、小于或等于5000升、或小于或等于2500升。
48. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)在以下溫度下進(jìn)行 (i) 大于或等于32°C、大于或等于33°C、大于或等于34°C、或大于或等于35°C ; (ii) 小于或等于45°C、小于或等于42°C、小于或等于40°C、或小于或等于38°C ;或 (iii) 32°C至 45°C、33°C至 42°C、34°C至 40°C、或 35°C至 38°C。
49. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中在步驟c)中使用機(jī)械消泡器。
50. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)包括預(yù)培養(yǎng)階段。
51. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)包括細(xì)胞建庫(kù)階段。
52. 權(quán)利要求1-49中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中細(xì)胞建庫(kù)在步驟a)和步驟b)之間發(fā)生。
53. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述方法進(jìn)一步包括選擇博德特氏菌屬 物種的細(xì)菌樣品的步驟i)，其中所述細(xì)菌樣品主要是Bvg+基因型，并且其中步驟i)在步驟 a)之前發(fā)生。
54. 權(quán)利要求53的發(fā)酵方法，其中所述細(xì)菌樣品的大于85%、大于90%、大于95%、大于 98%、85% 至 100%、90% 至 100%、95% 至 100% 或 98% 至 100% 是 Bvg+ 基因型。
55. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)包括至少8、10、12、14、16或17 代。
56. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)是 (i) 小于或等于200小時(shí)、小于或等于150小時(shí)、小于或等于100小時(shí)、小于或等于80 小時(shí)、小于或等于70小時(shí)、小于或等于60小時(shí)、或小于或等于55小時(shí)； (ii) 大于或等于10小時(shí)、大于或等于15小時(shí)、大于或等于20小時(shí)、大于或等于25小 時(shí)、大于或等于30小時(shí)、大于或等于35小時(shí)、或大于或等于40小時(shí)；或 (iii) 10小時(shí)至200小時(shí)、15小時(shí)至150小時(shí)、20小時(shí)至100小時(shí)、25小時(shí)至80小時(shí)、 或30小時(shí)至70小時(shí)。
57. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中步驟c)是 (i) 小于或等于200小時(shí)、小于或等于150小時(shí)、小于或等于100小時(shí)、小于或等于80 小時(shí)、小于或等于60小時(shí)、或小于或等于40小時(shí)； (ii) 大于或等于5小時(shí)、大于或等于10小時(shí)、大于或等于15小時(shí)、或大于或等于25 小時(shí)；或 (iii) 5小時(shí)至200小時(shí)、10小時(shí)至150小時(shí)、15小時(shí)至100小時(shí)、或25小時(shí)至80小 時(shí)。
58. 權(quán)利要求1或3-57中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)在20°C至45°C、22°C至 43°C、24°C至 42°C、28°C至 42°C、30°C至 42°C、或 32°C至 40°C 的溫度下進(jìn)行。
59. 權(quán)利要求1-3和8-58中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)在6. 5至7. 8或6. 8至 7. 5的pH進(jìn)行。
60. 任何前述權(quán)利要求的發(fā)酵方法，其中步驟c)在6. 5至7. 8或6. 8至7. 5的pH進(jìn) 行。
61. 權(quán)利要求1-2和4-60中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中步驟b)在10%至50%、15%至45%、 20%至35%溶解氧存在的情況下進(jìn)行。
62. 任何前述權(quán)利要求的發(fā)酵方法，其中步驟c)在0%至50%、0%至45%、0%至35%溶解 氧存在的情況下進(jìn)行。
63. 前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其中所述博德特氏菌屬物種表達(dá)至少一種選 自百日咳毒素、絲狀血細(xì)胞凝集素、百日咳桿菌粘附素和菌毛凝集原的毒力因子。
64. 權(quán)利要求63的發(fā)酵方法，其中所述百日咳毒素在步驟b)中以小于 2.8 mpL " 2.7 wpL ODt.w--> . 2.6 mpL OD <sSS,1F；!, 2.5 mgL" 00050.:^, 2.4 mgl' 00 2,3 mgL* 2,2 mgL1 0Das,,，；2,1 mgL" - 2.0 ip§L . 00 1,9 mgL'1 \ 18 mgL' OD ' O mgL+-! 00(.κ.ρ.τΛ 成 1-6 mgl_ OD 6s〇r.:ii 的百日咳毒素比生產(chǎn)速率產(chǎn)生。
65. 權(quán)利要求53或65的發(fā)酵方法，其中所述百日咳毒素在步驟c)過(guò)程中以大于 8 ingL (；μι，ιι-- 12 9 rngL ξ：!>··,?.Τι , 3,0 mgL ?.*i,m . 3.1 mgL <>wwf· i*E3*2 itiqL 的百日咳毒素比生 產(chǎn)速率產(chǎn)生.66.權(quán)利要求63-65中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其進(jìn)一步包括純化所述毒力因子 以產(chǎn)生純化的毒力因子的步驟d)。
66. 權(quán)利要求63-65中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其進(jìn)一步包括純化所述毒力因子以產(chǎn)生純 化的毒力因子的步驟d)。
67. 權(quán)利要求66的發(fā)酵方法，其進(jìn)一步包括配制包含所述純化的毒力因子的免疫原性 組合物的步驟e)。
68. 權(quán)利要求67的發(fā)酵方法，其進(jìn)一步包括將至少一種抗原添加至所述免疫原性組合 物的步驟f)。
69. 權(quán)利要求68的發(fā)酵方法，其中所述抗原選自百日咳毒素、絲狀血細(xì)胞凝集素、百日 咳桿菌粘附素、菌毛凝集原、白喉類(lèi)毒素、破傷風(fēng)類(lèi)毒素、綴合的來(lái)自腦膜炎奈瑟氏球菌的 糖抗原、乙型肝炎表面抗原、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒（IPV)和綴合的來(lái)自b型流感嗜血桿菌 的糖抗原。
70. 權(quán)利要求67-69中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其包括將藥學(xué)上可接受的賦形劑添加至所 述免疫原性組合物的步驟g)。
71. 權(quán)利要求67-70中任一項(xiàng)的發(fā)酵方法，其包括將佐劑添加至所述免疫原性組合物 的步驟f)。
72. 權(quán)利要求71的發(fā)酵方法，其中所述佐劑包含磷酸鋁或氫氧化鋁。
【文檔編號(hào)】A61K39/00GK104093416SQ201380007654
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月1日
【發(fā)明者】P.M.H.德霍泰, P.戈芬 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司