專利名稱：用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及通過上述方法制備的誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞。
背景技術(shù)：
具有多能性的細(xì)胞已得到報(bào)道，例如胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (iPS細(xì)胞)，其中iPS細(xì)胞可以通過將ー種或多種未分化的細(xì)胞特異性基因引入動(dòng)物的體細(xì)胞內(nèi)來獲得(USP 5，843，780或WO 2007/069666)。因此，已注意到包括移植通過多能干細(xì)胞分化獲得的神經(jīng)細(xì)胞的治療方法，所述方法可以作為用于治療神經(jīng)變性疾病或神經(jīng)損傷的可替代方法。下述方法已作為用于誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞的方法而被開發(fā) (1)通過在無血清培養(yǎng)基中引起類胚體形成的用于誘導(dǎo)分化的方法(SFEB法)(Watanabe K等人Nat Neurosci. 8 =288-96,2005) ； (2)通過在基質(zhì)細(xì)胞上培養(yǎng)ES細(xì)胞的用于誘導(dǎo)分化的方法(SDDWi) (Kawasaki H 等人 Neuron. 28 =31-40,2000)；禾口 (3)用于將藥物加到 Matrigel 上且隨后培養(yǎng)的方法(Chambers SM 等人 Nat Biotechnol. 27 :275-80,2009) 然而，存在一些問題，例如在通過這些方法誘導(dǎo)分化后保留未分化的細(xì)胞，和在這些方法中細(xì)胞因子的使用導(dǎo)致極高成本。相應(yīng)地，許多小分子化合物已作為細(xì)胞因子替代品而被開發(fā)(W02008/033408)，但哪些小分子化合物誘導(dǎo)高效分化成神經(jīng)細(xì)胞仍是未知的。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供使用小分子化合物用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的高效方法。本發(fā)明如下表征。(1)用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，其包括在小分子BMP抑制劑的存在下培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞。(2)根據(jù)(1)的方法，其中一旦培養(yǎng)后還存在小分子TGFii家族抑制劑。(3)根據(jù)⑴或⑵的方法，其中所述培養(yǎng)使用基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行。(4)根據(jù)(3)的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞是PA6細(xì)胞。(5)根據(jù)⑴或⑵的方法，其中所述培養(yǎng)在無血清條件下伴隨類胚體的形成進(jìn)行。(6)根據(jù)(1)或O)的方法，其中所述培養(yǎng)在Matrigel -包被皿上不使用飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行。(7)根據(jù)(1)-(6)中任ー項(xiàng)的方法，其中所述小分子BMP抑制劑是Dorsomorphin 或 LDN-193189。(8)根據(jù)⑵的方法，其中所述小分子TGFii家族抑制劑是SB431542或A-83-01。(9)根據(jù)(1)-(8)中任ー項(xiàng)的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。(10)根據(jù)(1)-(9)中任ー項(xiàng)的方法，其包括在ERK(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)抑制劑的進(jìn)ー步存在下培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞。(11)誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞，其通過根據(jù)(I)-(IO)中任ー項(xiàng)的方法制備。根據(jù)本發(fā)明的上述方法，通過允許小分子BMP抑制劑存在于分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中， 優(yōu)選通過允許小分子BMP抑制劑和小分子TGF β家族抑制劑的組合共存在于分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，可以高效制備誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞。附圖簡述

圖1顯示在分化誘導(dǎo)后第14天時(shí)的相差顯微鏡圖像(a-c)、使用抗巢蛋白抗體獲得的免疫染色圖像(d-f)、使用抗0ct3/4抗體獲得的免疫染色圖像(g_i)、使用DAPI獲得的免疫染色圖像(j-i)。圖2顯示在分化誘導(dǎo)后第14天吋，使用抗1^x6抗體(緑色)和抗Nanog抗體(紅色)獲得的免疫染色圖像、以及使用抗PSA-NCAM抗體(緑色)和抗SSEA3抗體(紅色)獲得的免疫染色圖像。圖3顯示在分化誘導(dǎo)后第21天吋，使用抗TH(酪氨酸羥化酶)抗體(緑色)和抗 TuJl抗體(紅色)獲得的免疫染色圖像。圖4 顯示A，在所有細(xì)胞系中(KhES-l、KhES-2、KhES-3、Gl、G4、B6_B7:M〒. 個(gè)細(xì)胞系η = 4) (η = 28)在分化誘導(dǎo)后第14天時(shí)每孔出現(xiàn)的集落總數(shù)目；和B，在所有細(xì)胞系中(KhES-1、KhES-2、KhES-3、GU G4、B6 和 B7 對(duì)于每個(gè)細(xì)胞系 η = 4) (n = 28)在分化誘導(dǎo)后第14天時(shí)每孔出現(xiàn)的含神經(jīng)細(xì)胞集落(對(duì)于巢蛋白陽性)與含未分化細(xì)胞集落 (對(duì)于0ct3/4陽性)的比值(％)。當(dāng)在集落內(nèi)可以證實(shí)至少ー個(gè)陽性細(xì)胞時(shí)，此類集落計(jì)數(shù)為陽性集落。圖5顯示在每個(gè)ES細(xì)胞系(KhES-1 (A)、KhES-2 (B)或KhES_3 (C))的分化誘導(dǎo)后第14天時(shí)，每孔出現(xiàn)的含神經(jīng)細(xì)胞集落(對(duì)于巢蛋白陽性)與含未分化細(xì)胞集落(對(duì)于 0ct3/4陽性)的比值。圖6顯示在每個(gè)iPS細(xì)胞系(G1 (A)、G4⑶、B6 (C)或B7⑶)的分化誘導(dǎo)后第14 天時(shí)，每孔出現(xiàn)的含神經(jīng)細(xì)胞集落(對(duì)于巢蛋白陽性)與含未分化細(xì)胞集落(對(duì)于0ct3/4 陽性)的比值。圖7顯示如對(duì)Nodal (A)、BMP2 (B)、BMP4 (C)和BMP7 (D)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測量的，在未分化的ES細(xì)胞(KhES-1、KhES-2和KhES_3)或iPS細(xì)胞(G1、G4、B6和B7)中的mRNA表達(dá)水平。圖8是顯示不使用Dorsomorphin和SB431542僅在PA6細(xì)胞上分化誘導(dǎo)后第14 天吋，每個(gè)細(xì)胞系的PSA-NCAM陽性(綠色)和SSEA4陽性(紅色)細(xì)胞含量的圖。圖9顯示FACS圖，其顯示在通過僅經(jīng)由在PA6細(xì)胞上的培養(yǎng)誘導(dǎo)KhESl分化而制備的對(duì)照組(A和B)和在通過經(jīng)由Dorsomorphin和SB431542加入培養(yǎng)基在PA6細(xì)胞上誘導(dǎo)分化而制備的組(C和D)中，表達(dá)SSEA4(或陽性)的細(xì)胞(A和C)和表達(dá)PSA-NCAM的細(xì)胞(B和D)的分布。關(guān)于此處所示的值，上面顯示在KhESl衍生的細(xì)胞中表達(dá)每種標(biāo)記的細(xì)胞比率(％ )(“在靶細(xì)胞中”)，并且下面顯示在含有KhESl衍生的細(xì)胞和PA6細(xì)胞中的皿內(nèi)出現(xiàn)的所有細(xì)胞中表達(dá)每種標(biāo)記的細(xì)胞比率(％ )(“在總細(xì)胞中”)。圖9E是顯示在對(duì)照組 (KhESl對(duì)照)中和在對(duì)于其使用Dorsomorphin和SB431542的分化誘導(dǎo)組(KhESl+D&SB) 中每個(gè)皿獲得的ES細(xì)胞衍生的細(xì)胞(黑色條)、ES細(xì)胞衍生的PSA-NCAM陽性細(xì)胞(白色
4條)、和SSEA4陽性細(xì)胞(陰影條)的數(shù)目的圖。細(xì)胞的數(shù)目通過下式進(jìn)行計(jì)算。(ES細(xì)胞衍生的細(xì)胞的數(shù)目)=(在皿中的總細(xì)胞計(jì)數(shù))-(在皿中PA6飼養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目)(ES細(xì)胞衍生的PSA-NCAM陽性細(xì)胞的數(shù)目)=(在皿中的總細(xì)胞計(jì)數(shù))X (在皿中出現(xiàn)的所有細(xì)胞中PSA-NCAM陽性細(xì)胞的比率)(ES細(xì)胞衍生的SSEA4陽性細(xì)胞)=(在皿中的總細(xì)胞計(jì)數(shù))X (在皿中出現(xiàn)的所有細(xì)胞中SSEA4陽性細(xì)胞的比率)圖9F和9G顯示關(guān)于PA6細(xì)胞和ES細(xì)胞衍生的細(xì)胞的特征分布例子(F 単獨(dú)的 PA6細(xì)胞，和G :PA6細(xì)胞和KhESl (在不存在Dorsomorphin和SB431542的情況下培養(yǎng)))。圖IOA是顯示通過不含飼養(yǎng)細(xì)胞由iPS細(xì)胞形成類胚體，隨后在補(bǔ)充有 Dorsomorphin和SB431542的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，在iPS細(xì)胞(G4)的分化誘導(dǎo)后第14天時(shí) PSA-NCAM陽性細(xì)胞的百分比的圖。此處，紅色曲線指示關(guān)于其中不存在抗體的陰性對(duì)照的結(jié)果，并且藍(lán)色曲線指示關(guān)于由抗PSA-NCAM抗體染色的細(xì)胞的結(jié)果。并且，圖IOB是對(duì)于其通過上述方法誘導(dǎo)分化的進(jìn)行巢蛋白(緑色)和1^x6 (紅色)免疫染色圖像。圖11顯示在補(bǔ)充有每種下述藥物的培養(yǎng)基中通過Matrigel法通過不含飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)iPS細(xì)胞，在iPS細(xì)胞(G4)的分化誘導(dǎo)后第14天時(shí)的相差顯微鏡圖像。在這個(gè)圖中，“N”指示Noggin的添加，“ S”指示SB431542的添加，“ NS”指示Noggin和SB431542的添加，“C”指示對(duì)照DMSO的添加，“D”指示Dorsomorphin的添カロ，“DS”指示Dorsomorphin 和 SB431542 的添カロ，“LDN” 指示 LDN-193189 的添加，并且“LDN+S” 指示 LDN-193189 和 SB431542的添加。圖12顯示在添加每種下述藥物后第14天時(shí)和在每種藥物的添加前每孔出現(xiàn)的細(xì)胞的數(shù)目(或細(xì)胞數(shù)目)。在這個(gè)圖中，第O天指示“在藥物的添加前”，“對(duì)照”指示DMSO 加入其中的對(duì)照組，“N”指示Noggin加入其中的組，“NS”指示Noggin和SB431542加入其中的組，“D”指示Dorsomorphin加入其中的組，“ S”指示SB431542加入其中的組，“ DS”指示 Dorsomorphin 和 SB431542 加入其中的組，“L10S”指示 IOnM LDN-193189 和 SB431542 加入其中的組，“L50S”指示50nMLDN-193189和SB431542加入其中的組，并且“L100S”指示 lOOnMLDN-193189 和 SB431542 加入其中的組。圖13顯示在通過Matrigel法不含飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)iPS細(xì)胞(G4)分化后第14天吋，使用抗1^x6抗體(緑色)和抗Nanog抗體(紅色)獲得的免疫染色圖像、以及使用DAPI (藍(lán)色)獲得的免疫染色圖像。在圖13中，“ SB”指示SB431542，并且“LDN”指示 LDN-193189。圖14顯示在分化誘導(dǎo)后第14天時(shí)的相差顯微鏡圖像㈧，以及使用抗巢蛋白抗體(緑色)和DAPI (藍(lán)色)獲得的免疫染色圖像(B)。根據(jù)SDIA法通過共培養(yǎng)ES細(xì)胞系 (Kh-ES5)與PA6細(xì)胞，隨后在補(bǔ)充有5-500nM LDN-193189和SB431542的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來誘導(dǎo)分化。圖15顯示在根據(jù)SDIA法通過共培養(yǎng)ES細(xì)胞系(Kh-ESl或Kh_ES4)與PA6細(xì)胞， 隨后在補(bǔ)充有5-500nM LDN-193189和SB431542的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)后第14 天吋，使用DAPI (藍(lán)色)和抗巢蛋白抗體(緑色)(A)或抗1^x6抗體(緑色)(B)獲得的免疫染色圖像。
圖16顯示在通過用無飼養(yǎng)物法培養(yǎng)人iPS細(xì)胞(404α)誘導(dǎo)的分化細(xì)胞中對(duì) Nanog(A)、Pax6 (B)和Soxl (C)進(jìn)行定量PCR的結(jié)果。結(jié)果顯示對(duì)于未處理細(xì)胞的值的相對(duì)對(duì)數(shù)值?！癆”至“F”指示下述條件“ A”是含有2μ M Dorsomorphin和10 μ M SB431542 的舊(old)DFK5% ；“B” 是含有 IOOnM LDN913189 和 0. 5 μ M Α-83-01 的舊 GMK8% ；“C” 是含有 2 μ M Dorsomorphin 禾ロ 10 μ M SB431542 的 DFK5% ；“D” 是含有 IOOnM LDN913189 和 0. 5 μ M Α-83-01 的 GMK8% ；‘ ” 是含有 IOOnM LDN913189 禾ロ 10 μ M SB431542 的 GMK8% ； 并且 “F” 是含有 IOOnM LDN913189 和 0. 5μΜ Α-83-01+0. 5 μ M PD0325901 的 GMK8%。圖17顯示FACS圖，其顯示通過使用無飼養(yǎng)物法在含有100nMLDN913189和0. 5 μ M Α-83-01的GMK8%的條件下培養(yǎng)iPS細(xì)胞(404C2)，對(duì)于分化細(xì)胞的0ct3/4的2D展開 (2D-d印loyment) (A)、表達(dá)PSA-NCAM的細(xì)胞(B)、表達(dá)Tuj-I的細(xì)胞(C)以及SSEAl和 SSEA4 的 2D 展開(D)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將如下詳細(xì)描述。本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，其包括在小分子 BMP抑制劑的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞，如上所述。<多能干細(xì)胞>可以在本發(fā)明中使用的多能干細(xì)胞是具有多能性和増殖潛能的干細(xì)胞，所述多能性是干細(xì)胞分化成衍生自活體中存在的外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的所有細(xì)胞的能力。此類干細(xì)胞的例子包括但不限于胚胎干(EQ細(xì)胞、經(jīng)由核移植獲得的胚胎克隆衍生的胚胎干 (ntES:核移植ES)細(xì)胞、男性生殖干細(xì)胞(“GS細(xì)胞”)、胚胎生殖細(xì)胞(“EG細(xì)胞”)、和誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞。優(yōu)選的多能干細(xì)胞是ES細(xì)胞、ntES細(xì)胞和iPS細(xì)胞。(A)胚胎干細(xì)胞ES細(xì)胞是具有多能性和基于自我復(fù)制的増殖潛能的干細(xì)胞，這由哺乳動(dòng)物例如人和小鼠的早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(例如胚泡)建立。ES細(xì)胞是來自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的胚胎衍生的干細(xì)胞，所述胚泡是在受精卵的8細(xì)胞期的桑椹胚階段后的胚胎。ES細(xì)胞具有所謂的多能性和基于自我復(fù)制的増殖潛能的出現(xiàn)，所述多能性是分化成組成成人身體的任何細(xì)胞的能力。ES細(xì)胞在1981年在小鼠中發(fā)現(xiàn) (M. J. Evans 和 M. H. Kaufman (1981)，Nature 292 :154-156)，并且隨后建立了靈長類動(dòng)物例如人和猴的 ES 細(xì)胞系(J. A. Thomson 等人(1999)，Science282 1145-1147 ； J. A. Thomson 等人(1995)，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,92 :7844-7848 ;J. A. Thomson 等人(1996)，Biol. Reprod.，55 :254-259 J. A. Thomson 禾ロ N. S. Marshall (1998)，Curr. Top. Dev. Biol.，38 133-165)。通過從靶動(dòng)物的受精卵的胚泡中取出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，在作為飼養(yǎng)細(xì)胞的成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，可以建立ES細(xì)胞。此外，通過傳代培養(yǎng)(subculture)的細(xì)胞維持可以使用補(bǔ)充有某種物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行，所述物質(zhì)例如白血病抑制因子(LIF)或堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。用于人和猴ES細(xì)胞的建立和維持的方法在下述中描述H. Suemori φ 人(2006)， Biochem. Biophys. Res. Commun. ,345 :926-932 ；Μ. Ueno 等人(2006)， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，103 :9554-9559 ；H. Suemori 等人じ001)，Dev. Dyn.，222 :273-279 ；H. Kawasaki 等人(2002)，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,99 :1580-1585 等。作為用于制備ES細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用例如補(bǔ)充有0. ImM 2_巰基乙醇、0. ImM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酸鹽、20%1 1 和鈕8/11110-ド6ド的01^11/^-12培養(yǎng)基。人ES細(xì)胞可以使用培養(yǎng)基在潮濕氣氛(5% CO2)下在37°C維持。而且，ES細(xì)胞需要每4-5天的傳代培養(yǎng)。在這時(shí)，傳代培養(yǎng)可以使用例如在含有ImM CaCl2和20% KSR的PBS中的0. 25%胰蛋白酶和0. lmg/ml膠原酶IV進(jìn)行。ES細(xì)胞一般可以通過實(shí)時(shí)PCR法進(jìn)行選擇，使用基因標(biāo)記(例如堿性磷酸酶、Oct-3/4和Nanog)的表達(dá)作為指示劑。特別地，人ES細(xì)胞可以使用基因標(biāo)記(例如OCT-3/4、NANOG或ECAD)的表達(dá)作為指示物進(jìn)行選擇(E. Kroon等人Q008)，Nat. Biotechnol. ,26 :443-452)。人 ES 細(xì)胞系例如 KhES-I、KhES-2、KhES-3、KhES-4 和 KhES-5 在 Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (Kyoto,日本)ロ:犾得。(B)男性生殖干細(xì)胞男性生殖干細(xì)胞是睪丸衍生的多能干細(xì)胞，這作為精子發(fā)生的起源。該細(xì)胞可以被誘導(dǎo)以分化成多種細(xì)胞系，如ES細(xì)胞的情況。例如，當(dāng)被移植到小鼠胚泡中時(shí)，該細(xì)胞能夠產(chǎn)生嵌合小鼠(M. Kanatsu-Shinohara 等人 Q003)Biol. R印rod. ,69 :612-616 ； K. Shinohara等人(2004)，Cell, 119 :1001-1012)。細(xì)胞在含有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)的培養(yǎng)基中是可自我復(fù)制的。此外，通過在類似于用于ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件下進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)的重復(fù)，可以獲得男性生殖干細(xì)胞(Masanori Takebayashi等人， (2008)，Experimental Medicine，第 26 卷，No. 5 (Supp 1.)，第 41-46 頁，Y0D0SHA (Tokyo,日本))。(C)胚胎生殖細(xì)胞胚胎生殖細(xì)胞由在產(chǎn)前期的原始生殖細(xì)胞建立，具有類似于ES細(xì)胞的多能性。胚胎生殖細(xì)胞可以通過在某種物質(zhì)例如LIF、bFGF和干細(xì)胞因子的存在下培養(yǎng)原始生殖細(xì)胞來建立(Y. Matsui 等人(1992) ,Cell, 70 :84ト847 J. L. Resnick 等人(1992),Nature, 359 550-551)。(D)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞可以通過將以DNA或蛋白質(zhì)形式的一種或多種特異性重編程因子引入體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行制備。此類iPS細(xì)胞是來自體細(xì)胞的人工干細(xì)胞，具有幾乎等價(jià)于ES細(xì)胞那些的性質(zhì)，例如多能性和基于自我復(fù)制的増殖潛能(K. Takahashi和 S.Yamanaka(2006)Cell, 126 :663-676 ；K. Takahashi 等人(2007)，Cell,131 :861-872 ； J.Yu 等人(2007)，Science, 318 :1917-1920 ；Nakagawa, M.等人，Nat. Biotechnol. 26 101-106(2008)；國際公開WO 2007/069666)。重編程因子可以是在ES細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因或在ES細(xì)胞的未分化維持中起重要作用的基因或其基因產(chǎn)物。此類重編程因子的例子包括但不限于下述的組合0CT3/4、S0X2 和 KLF4 ；0CT3/4、KLF4 和 C-MYC ；0CT3/4、S0X2、 KLF4 和 C-MYC ；0CT3/4 和 S0X2 ；0CT3/4、S0X2 和 NANOG ；0CT3/4、S0X2 和 LI擬8 ；和 0CT3/4 禾ロ KLF4。以蛋白質(zhì)形式的這些因子可以通過一定技術(shù)引入體細(xì)胞內(nèi)，所述技術(shù)例如脂轉(zhuǎn)染、與細(xì)胞膜可透過肽結(jié)合和顯微注射?？商娲兀訢NA形式的這些因子也可以通過一定技術(shù)引入體細(xì)胞內(nèi)，所述技術(shù)例如使用載體例如病毒、質(zhì)粒和人工染色體的技木，脂轉(zhuǎn)染，使用脂質(zhì)體的技木，和顯微注射。病毒載體的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體(Cell， 126，第 663-676 頁，2006 ；Cell, 131，第 86ト872 頁，2007 ；Science, 318，第 1917-1920 頁， 2007)、腺病毒載體(Science，322，945-949，2008)、和腺相關(guān)病毒載體和仙臺(tái)病毒載體。此外，人工染色體載體的例子包括人類人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、和細(xì)菌人 エ染色體(BAC、PAC)載體。作為質(zhì)粒，可以使用用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)粒(Science，322: 949-953,2008)。載體可以包含調(diào)節(jié)序列例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子和多聚腺苷酸化位點(diǎn)，從而使得可以表達(dá)核重編程因子。需要時(shí)，載體可以進(jìn)一歩包含選擇標(biāo)記序列例如藥物抗性基因(例如卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、或嘌呤霉素抗性基因)、胸苷激酶基因和白喉毒素基因，報(bào)道基因序列例如綠色熒光蛋白(GFP)、β葡萄糖醛酸酶(GUQ或FLAG。此外，載體可以具有LoxP序列，這位于編碼重編程因子的基因或編碼在引入體細(xì)胞內(nèi)后與啟動(dòng)子結(jié)合的重編程因子的基因的每個(gè)末端，以便切割基因。為了增加在重編程后的誘導(dǎo)效率，除上述因子外，可以使用組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑[例如小分子抑制劑例如丙戊酸(VPA) (Nat. Biotechnol.，26 (7) 795-797(2008)),曲古菌素 A、丁酸鈉、MC 1293 和 M344 ；針對(duì) HDAC 的 si RNA 和 shRNA (例如核酸表達(dá)抑制劑例如HDACl siRNA Smartpool (Millipore)和針對(duì)HDACl的HuSH 29 聚體shRNA構(gòu)建體(OriGene))]，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(例如5，-氮雜胞苷)(Nat. Biotechnol.，26 (7) :795-797(2008)), G9a組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑[例如小分子抑制劑例如BIX-01294(Cell Stem Cell，2 :525-5 Q008))、和核酸表達(dá)抑制劑例如針對(duì) G9a 的 siRNA 和 shRNA (例如 G9a siRNA (人)(Santa Cruz Biotechnology)) ]，L-鈣通道激動(dòng)劑(例如 Bayk8644) (Cell Stem Cell，3，568-574 (2008))，p53 抑制劑(例如針對(duì) p53 的 siRNA 和 shRNA(Cell Stem Cell,3,475-479 (2008)), UTFl (Cell Stem Cell, 3,475-479 (2008)), Wnt ff ^ (例如可溶性 Wnt3a) (Cell Stem Cell,3,132-135 (2008)), 2i/LIF( “2i”指示分裂原活化蛋白質(zhì)激酶信號(hào)和糖原合酶激酶-3抑制劑，PloSBiology, 6 (10)，2237-2247 (2008)) ,mi RNA 例如 miRj91_3p、miRj94 和 miR-295 (R. L. Judson 等人， Nat. Biotech. ,27 :459-461) (2009)，ALK5 抑制劑(例如 SB431542)等。用于iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的培養(yǎng)基的例子包括(1)含有10% -15% FBS的DMEM、DMEM/ F12或DME培養(yǎng)基(這些培養(yǎng)基可以進(jìn)ー步適當(dāng)?shù)睾蠰IF、青霉素/鏈霉素、嘌呤霉素、 L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇等)和(2)用于ES細(xì)胞培養(yǎng)的含有bFGF-或SCF 的培養(yǎng)基，例如用于小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基(例如TX-WES培養(yǎng)基、Thromb-Χ)或用于靈長類ES細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基(例如用于靈長類(人和猴)ES細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，ReproCELL， Kyoto,日本)。培養(yǎng)方法的例子如下。使體細(xì)胞與重編程因子(DNA或蛋白質(zhì))在含有10% FBS 的DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)基上在37°C在5% CO2的存在下接觸，且隨后培養(yǎng)約4_7天。隨后，將細(xì)胞再種植到飼養(yǎng)細(xì)胞(例如絲裂霉素C處理的STO細(xì)胞或SNL細(xì)胞)上。在體細(xì)胞和重編程因子之間接觸后約10天，在用于靈長類ES細(xì)胞培養(yǎng)的含有bFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在接觸后約30-45天或更長時(shí)間，可以形成iPS細(xì)胞樣集落?？商娲?，可以在飼養(yǎng)細(xì)胞(例如絲裂霉素C處理的STO細(xì)胞或SNL細(xì)胞)上在 37°C在5% CO2的存在下在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基可以進(jìn)ー步任選含有LIF、 青霉素/鏈霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇等)中培養(yǎng)細(xì)胞。在約25-約30天或更長時(shí)間后，可以形成ES樣集落。此外，細(xì)胞還可以在其中氧濃度是5% -10%的低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以增加iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)的效率(W0 2010/013845)。在上述培養(yǎng)過程中，用新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)基更換從培養(yǎng)起始后的第2天起每天進(jìn)行一次。此外，待用于核重編程的體細(xì)胞的數(shù)目并無限制，但范圍為約5X IO3-約5X IO6細(xì)胞/培養(yǎng)皿(IOOcm2)。當(dāng)基因例如藥物抗性基因用作標(biāo)記基因吋，表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞可以通過在含有相關(guān)藥物的培養(yǎng)基(選擇培養(yǎng)基)中培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行選擇。當(dāng)標(biāo)記基因是熒光蛋白質(zhì)基因吋， 表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞可以經(jīng)由在熒光顯微鏡檢查下的觀察進(jìn)行檢測。當(dāng)標(biāo)記基因是發(fā)光酶基因吋，表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞可以通過加入發(fā)光底物進(jìn)行檢測。當(dāng)標(biāo)記基因是酶基因吋，表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞可以通過加入生色底物進(jìn)行檢測。如本文使用的，術(shù)語“體細(xì)胞”指排除生殖系細(xì)胞例如卵子、卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞， 全能細(xì)胞和ES細(xì)胞的所有動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物包括人的細(xì)胞)。體細(xì)胞的例子包括但不限于胎兒的體細(xì)胞、新生兒的體細(xì)胞和成熟健康或致病性體細(xì)胞。其例子還包括原代培養(yǎng)細(xì)胞、傳代細(xì)胞、和建立的細(xì)胞系的細(xì)胞。其例子進(jìn)ー步包括組織干細(xì)胞和組織前體細(xì)胞。體細(xì)胞的具體例子包括但不限于(1)組織干細(xì)胞(體干細(xì)胞)例如神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞，(2)組織前體細(xì)胞，和(3)分化細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞(例如皮膚細(xì)胞)、毛細(xì)胞、肝細(xì)胞、胃粘膜細(xì)胞、腸細(xì)胞、脾細(xì)胞、胰腺細(xì)胞(例如胰腺外分泌細(xì)胞)、腦細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞和皮膚細(xì)胞。(E)通過核移植獲得的胚胎克隆衍生的ES細(xì)胞核移植(nt)ES細(xì)胞是通過核移植技術(shù)制備的胚胎克隆衍生的ES細(xì)胞，具有幾乎與受精卵衍生的ES細(xì)胞那些ー樣的性質(zhì)(T. Wakayama等人(2001)，Science, 292 740-743 ；S.Wakayama 等人(2005)，Biol. R印rod. ,72 :932-936 ;J. Byrne 等人(2007)， Nature, 450 =497-502)。具體地，通過用體細(xì)胞的核代替未受精卵的核獲得的胚胎克隆衍生的胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)建立的ES細(xì)胞是nt ES(核轉(zhuǎn)移的)細(xì)胞。對(duì)于nt ES細(xì)胞的制備，組合使用核移植技術(shù)(J. B. Cibelli 等人(1998)，Nature Biotechnol.，16 :642-646)和 ES 細(xì)胞制備技術(shù)(參見上文)(Kiyoka Wakayama 等人，(2008), Experimental Medicine，第洸卷，No.5(Suppl.)，第47-52頁)。通過核移植，將體細(xì)胞的核注射到去核的哺乳動(dòng)物未受精卵內(nèi)，隨后為數(shù)小時(shí)培養(yǎng)，從而使得可以進(jìn)行重編程。<小分子BMP抑制劑>可以在本發(fā)明中使用的小分子BMP抑制劑是涉及BMP信號(hào)抑制的小分子抑制劑， 這通過BMP (骨形態(tài)發(fā)生蛋白)與BMP受體(I型或II型)的結(jié)合來介導(dǎo)，但不同于其為天然抑制劑的蛋白質(zhì)抑制劑例如Noggin、chordin、卵泡抑素等。如本文使用的，術(shù)語“小分子”意指有機(jī)或無機(jī)分子，并且這個(gè)術(shù)語不包括較大的大分子，例如大蛋白質(zhì)(例如具有超過 2，000,3, 000,4, 000,5, 000,6, 000,7, 000,8, 000,9, 000 或 10，000 的分子量的蛋白質(zhì))、 大核酸(例如具有超過 2，000,3, 000,4, 000,5, 000,6, 000,7, 000,8, 000,9, 000 或 10，000 的分子量的核酸)、或大多糖(例如具有超過2，000,3, 000,4, 000,5, 000,6, 000,7, 000、 8，000,9, 000或10，000的分子量的多糖)。這種抑制劑應(yīng)具有誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的效應(yīng)。具有此類性質(zhì)的小分子BMP抑制劑的例子包括抑制BMP2、BMP4、BMP6或BMP7的化合物，其能夠激活轉(zhuǎn)錄因子SMAD1、SMAD5或SMAD8，例如Dorsomorphin(即 6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑[1，5-a]嘧啶)及其衍生物 (P. B. Yu 等人(2007)，Circulation, 116 11_60 ；P. B. Yu 等人(2008)，Nat. Chem. Biol.，4 33-41 ； J. Hao 等人 Q008)，PLoSONE (www. plozone. org)，3 (8) :e2904)。Dorsomorphin 例如從Sigma-Aldrich商購可得。Dorsomorphin通過抑制BMP與BMP受體的結(jié)合具有抑制上述BMP信號(hào)的生物學(xué)活性。除它們外，BMP I型受體激酶抑制劑的例子包括LDN-193189(即 4- (6- (4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑[1，5-a]嘧啶-3-基)喹啉)及其衍生物(Yu PB等人 Nat Med，14 1363-9，2008)。LDN-193189 例如從 Memgent 商購可得。
<小分子TGF β家族抑制劑>根據(jù)本發(fā)明，多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的誘導(dǎo)效率可以通過組合上述小分子BMP抑制劑與小分子TGF β (轉(zhuǎn)化生長因子β)家族抑制劑得到顯著改善。如本文使用的，術(shù)語“小分子TGFii家族抑制劑”指干擾TGFii家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子抑制劑。此類小分子TGFii家族抑制劑的例子包括SB431542、SB202190(R. K. Lindemann 等人，Mol. Cancer 2 :20(2003)), SB505124 (GlaxoSmithKline)、NPC30345、 SD093, SD908, SD208 (Scios) , LY2109761, LY364947, LY580276 (Lilly Research Laboratories)和 A-83_01(W0 2009146408)。SB431542 或 A-83-01 是優(yōu)選的。TGF^家族成員調(diào)節(jié)細(xì)胞過程和發(fā)育過程，例如有絲分裂、細(xì)胞分化、胚胎模式形成和器官發(fā)生。例如，TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)由絲氨酸-蘇氨酸激酶受體I型和II型的異聚受體復(fù)合物執(zhí)行。這種復(fù)合物激活下游Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。具體地，當(dāng)TGF β與受體復(fù)合物結(jié)合吋，TGF β -II型受體磷酸化TGF β -I型受體，且隨后TGF β -I型受體磷酸化受體介導(dǎo)的Smad (R-Smad)，從而使得起始下游應(yīng)答。激活的R-Smad和Smad4形成多聚復(fù)合物，從而使得激活的R-Smad轉(zhuǎn)移至核且隨后誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。當(dāng)此類TGF β家族信號(hào)被抑制吋，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞。此外，除這種抑制外，當(dāng)抑制上述BMP信號(hào)吋，不僅誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞的速率増加，而且未分化細(xì)胞 (即多能干細(xì)胞)的殘留速率更加減少，因此，轉(zhuǎn)化成神經(jīng)前體細(xì)胞的速率増加。<飼養(yǎng)細(xì)胞>在本發(fā)明中，飼養(yǎng)細(xì)胞不一定總需要，但飼養(yǎng)細(xì)胞可以存在。飼養(yǎng)細(xì)胞的例子包括胚胎成纖維細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。胚胎成纖維細(xì)胞的例子包括MEF (小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)、 STO細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系)、和SNL細(xì)胞(SNL細(xì)胞的亞克??；例如，SNL 76/7細(xì)胞)。此外，基質(zhì)細(xì)胞的例子包括PA6細(xì)胞(小鼠基質(zhì)細(xì)胞系(RIKEN BRC Cell Bank (日本))、MS-5 細(xì)胞(Exp Hematol. 17 145-53 (1989))、和 0P9 細(xì)胞(Science. 265 1098-1101 (1994))。SDIA法包含將ES細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞且特別是與PA6細(xì)胞共培養(yǎng)，以便進(jìn)行幾乎選擇性分化成神經(jīng)前體細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，即使在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，僅通過使得上述小分子BMP抑制劑或小分子BMP抑制劑與上述小分子TGF β家族抑制劑的組合存在于分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，就可以誘導(dǎo)選擇性分化成神經(jīng)前體細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞加上此類培養(yǎng)條件的使用可以進(jìn)一歩改善分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的效率。但是，如果這樣的話，當(dāng)考慮神經(jīng)前體細(xì)胞或由其分化的神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物例如人內(nèi)吋，不言而喻的是應(yīng)盡可能大程度地避免使用對(duì)于供體異源的細(xì)胞。
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<神經(jīng)前體細(xì)胞的分化誘導(dǎo)>(A)分化培養(yǎng)基用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基可以制備為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。此類基礎(chǔ)培養(yǎng)基的例子包括 IMDM培養(yǎng)基、培養(yǎng)基199、伊格爾最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EMEM)、α MEM培養(yǎng)基、達(dá)爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、Ham，s Fl2 培養(yǎng)基、RPMI IMO 培養(yǎng)基、Fischer，s 培養(yǎng)基、Glasgow MEM 及其混合物。培養(yǎng)基可以含有血清或可以是無血清的。需要吋，培養(yǎng)基可以進(jìn)一歩含有ー種或多種血清替代品，例如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 敲除血清替代物(KSR)(在ES細(xì)胞培養(yǎng)上用于FBS的血清替代品)、脂肪酸、胰島素、膠原前體、痕量元素、2-巰基乙醇、3’-巰基甘油、B27添加物和N2添加物，以及ー種或多種物質(zhì)例如脂質(zhì)、氨基酸、非必需氨基酸、維生素、生長因子、細(xì)胞因子、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸鹽、 緩沖試劑和無機(jī)鹽。培養(yǎng)基還可以含有上述小分子BMP抑制劑和/或任選地上述小分子TGF β家族抑制劑。培養(yǎng)基可以進(jìn)一歩含有上述飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。培養(yǎng)基可以進(jìn)一歩含有任何 ERK(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)抑制劑。分化培養(yǎng)基的例子是含有5%敲除血清替代物(KSR)、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和ΙμΜ 2-巰基乙醇0-ΜΕ)的DMEM/Ham' sF12混合培養(yǎng)基，或含有8% KSR、1 μ M 2ΜΕ 丙酮酸鹽和非必需氨基酸的Glasgow MEM，如下文所示實(shí)施例中所述。(B)用于誘導(dǎo)分化的方法根據(jù)本發(fā)明，在多能細(xì)胞例如ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的誘導(dǎo)后， 制備此類細(xì)胞且隨后使用上述文件中所述的方法進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)人ES細(xì)胞或人iPS細(xì)胞時(shí)，可以優(yōu)選使用用于靈長類ES細(xì)胞的培養(yǎng)基(R印r0CELL(Ky0t0，日本))。使用上述分化培養(yǎng)基，多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的誘導(dǎo)可以在飼養(yǎng)細(xì)胞的存在或不存在下進(jìn)行。當(dāng)飼養(yǎng)細(xì)胞存在吋，作為此類細(xì)胞，可以使用上文示例的MEF(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)、STO細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系)、PA6細(xì)胞(小鼠基質(zhì)細(xì)胞系 (RIKEN BRC Cell Bank(日本))、SNL細(xì)胞(SNL細(xì)胞的亞克??；例如，SNL 76/7細(xì)胞)等。 對(duì)于飼養(yǎng)細(xì)胞，一般進(jìn)行絲裂霉素C處理以停止細(xì)胞増殖。優(yōu)選地，在分化誘導(dǎo)前和在分化誘導(dǎo)后，立即將R0CK(pl60-I hO相關(guān)卷曲螺旋激酶)抑制劑加入含有培養(yǎng)的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基。ROCK抑制劑是顯示出在細(xì)胞分散后對(duì)抑制細(xì)胞死亡具有極強(qiáng)效應(yīng)的物質(zhì)。例如，Y-27632, Fasudil (HA-1077)等被稱為此類ROCK 抑制劑(K. Watanabe等人，Nat. Biotech. ,25 :681-686 (2007))。抑制劑濃度范圍為，但不限于，約50nM-約10 μ M/培養(yǎng)皿。在培養(yǎng)基中多能干細(xì)胞的密度優(yōu)選范圍為約5. OX IO4-約1.0 X IO7細(xì)胞，但它可以落入此類范圍外。培養(yǎng)的例子包括在非貼壁條件下的三維培養(yǎng)例如懸浮培養(yǎng)(例如分散培養(yǎng)和聚集-懸浮培養(yǎng))、在貼壁條件下的ニ維培養(yǎng)例如板培養(yǎng)、和構(gòu)成三維培養(yǎng)和隨后ニ維培養(yǎng)的連續(xù)組合的培養(yǎng)。當(dāng)在飼養(yǎng)細(xì)胞的存在下誘導(dǎo)分化吋，可以采用ニ維培養(yǎng)。另ー方面，在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，可以采用三維培養(yǎng)。在細(xì)胞貼壁培養(yǎng)箱的情況下，為了改善細(xì)胞貼壁性質(zhì)的目的，培養(yǎng)箱的表面可以用細(xì)胞支持物質(zhì)包被，例如膠原、明膠、聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、層粘連蛋白、纖連蛋白或 Matrigel (Becton> Dickinson 禾ロ Companyノ。在分散培養(yǎng)中，多能干細(xì)胞以在液體培養(yǎng)基中懸浮的狀態(tài)培養(yǎng)。此外，多能干細(xì)胞團(tuán)(或類胚體)通過聚集-懸浮培養(yǎng)形成。隨后，可以誘導(dǎo)細(xì)胞團(tuán)(或類胚體)分化成目的細(xì)胞。對(duì)于聚集-懸浮培養(yǎng)，例如可以使用類胚體培養(yǎng)法(Keller等人，Curr. Opin. Cell Biol. 7,862-869(1995))或 SFEB 法(例如 Watanabe 等人，Nature Neuroscience 8， 288-296(2005) ；WO 2005/123902)。優(yōu)選方法是如同SFEB法在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)類胚體。在貼壁培養(yǎng)中，例如可以使用Matrigel法(Chambers SM等人Nat Biotechnol. 27 :485,2009)或 SDIA 法(Kawasaki H 等人 Neuron.沘31_40，2000 或 Kawasaki H 等人 Proc Natl Acad Sci U. S. A. 99 1580-5，2002)。關(guān)于培養(yǎng)條件，可以使用上述培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)的溫度并不限于下述例子，但范圍為約30°C -40°C，優(yōu)選約37°C。培養(yǎng)在含CO2空氣的氣氛下進(jìn)行，其中CO2濃度優(yōu)選范圍為約2% -5%。例如在分化誘導(dǎo)條件下，培養(yǎng)的時(shí)間或培養(yǎng)的時(shí)間表范圍為7天-21天，更優(yōu)選14天。關(guān)于用于分化誘導(dǎo)的具體方法和條件，參見下文給出的實(shí)施例?！凑T導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞〉本發(fā)明還提供了通過如上所述用于誘導(dǎo)分化的方法制備的誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)前體細(xì)胞的例子包括所有神經(jīng)細(xì)胞的前體細(xì)胞，例如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)細(xì)胞、在外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、在感覺器官系統(tǒng)中的神經(jīng)細(xì)胞和在自主神經(jīng)中的神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)前體細(xì)胞可以使用表達(dá)標(biāo)記進(jìn)行鑒定，例如用于原始神經(jīng)外胚層或神經(jīng)干細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)記(例如神經(jīng)細(xì)胞粘著分子(NCAM)、聚唾液酸化NCAM、A2B5(在胎兒或新生兒的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的)、中間絲蛋白質(zhì)(巢蛋白、波形蛋白等)和轉(zhuǎn)錄因子I^x-6)、多巴胺神經(jīng)元標(biāo)記(例如酪氨酸羥化酶(TH))和神經(jīng)標(biāo)記(例如TuJl)。在制備后，神經(jīng)前體細(xì)胞可以直接移植到活體內(nèi)，或可以完全或部分分化成神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(包括星形細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞)且隨后移植到活體內(nèi)。<在用于神經(jīng)學(xué)疾病的治療試劑篩選中的用途>本發(fā)明的誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞也可以用于篩選用于治療神經(jīng)學(xué)疾病的化合物 (例如藥物化合物、溶劑、小分子、肽或多核苷酸)。例如，將單獨(dú)或與另ー種藥物組合的候選藥物化合物加入誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞或比前體細(xì)胞更成熟的神經(jīng)細(xì)胞中，并且隨后基于細(xì)胞的形態(tài)或功能變化可以進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估可以通過測量由細(xì)胞產(chǎn)生的多巴胺的量作為功能性變化的例子來進(jìn)行。此處，誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞是優(yōu)選地呈現(xiàn)類似于待治療的神經(jīng)學(xué)疾病的表型的細(xì)胞；和特別優(yōu)選地由受神經(jīng)學(xué)疾病侵襲的體細(xì)胞制備的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，或通過誘導(dǎo)其中受疾病侵襲的體細(xì)胞的核已移植到其內(nèi)的ntES細(xì)胞分化制備的誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞?！磻?yīng)用于再生醫(yī)學(xué)〉本發(fā)明的誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞可以有效用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用于受損神經(jīng)系統(tǒng)組織的正常化。因此，誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞可以用作用于治療與神經(jīng)系統(tǒng)中任何細(xì)胞損傷相關(guān)的疾病的細(xì)胞。
此類疾病的例子包括缺血性腦疾病(例如中風(fēng))、腦外傷、脊柱損傷、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病、 神經(jīng)變性疾病、色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性、內(nèi)耳聽カ損失、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化、脊髄小腦變性、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、癲癇和精神分裂癥。此外，當(dāng)細(xì)胞用于治療時(shí)，應(yīng)希望增加細(xì)胞的純度。此類純化的例子包括用于選擇目的細(xì)胞的方法，例如流式細(xì)胞木，和在含有抗癌劑的培養(yǎng)基中處理細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)通過下述進(jìn)行將細(xì)胞粒子以高速應(yīng)用到極細(xì)的液體流內(nèi)，用激光束照射，且隨后測量由粒子發(fā)出的光例如熒光(當(dāng)細(xì)胞被預(yù)先熒光標(biāo)記時(shí))或散射光。當(dāng)提供細(xì)胞分選儀吋，可以選擇且分離目的細(xì)胞。細(xì)胞可以是使用對(duì)于神經(jīng)前體細(xì)胞特異的抗體(熒光標(biāo)記的)例如抗巢蛋白抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記的。此外，通過在含有抗癌劑的培養(yǎng)基中處理，可以去除未分化的細(xì)胞。此類抗癌劑的例子包括絲裂霉素C、5-氟尿嘧啶、阿霉素和氨甲蝶呤。神經(jīng)前體細(xì)胞可以通過例如Nature Neuroscience，2，1137 (1999)或 N Engl J Med. ；344 =710-9(2001)中描述的方法移植到疾病部位內(nèi)。實(shí)施例本發(fā)明在下文將參考下述實(shí)施例更詳細(xì)地進(jìn)行描述，盡管本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限于其。方法細(xì)胞和培養(yǎng)提供,來自 Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University 的人ES細(xì)胞(KhES-1、KhES-2和KhES-3)，并且隨后通過已知方法培養(yǎng)它們(Suemori H等人 Biochem Biophys Res Commun. 345 :926-32,2006) 人 iPS 細(xì)胞(Gl、G4、B6 和 B7)由 Kyoto University的Dr. Yamanaka提供，并且隨后通過已知方法培養(yǎng)(Takahashi K等人 Cell. 131 :861-72,2007 和 Nakagawa M 等人 Nat Biotechnol. 26 :101-6,2008) 將 PA6 細(xì)胞(RIKEN BRC細(xì)胞庫)接種到明膠包被的皿上，且隨后使用含有10% FBS的MEM α進(jìn)行培養(yǎng)。在誘導(dǎo)分化后，將細(xì)胞培養(yǎng)至少一天，證實(shí)為鋪滿的，并且隨后用作飼養(yǎng)細(xì)胞。使用含有 EBNA-I 和 oriP 的載體(US61/232, 402 和 US61/307, 306)，通過將重編程因子(0CT3/4、 S0X2、KLF4、L-MYC、LI擬8和shRNA for p53)引入人成纖維細(xì)胞內(nèi)建立人iPS細(xì)胞(404C2)， 隨后通過其他人iPS細(xì)胞的相同方法進(jìn)行培養(yǎng)。分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的誘導(dǎo)(在飼養(yǎng)細(xì)胞的存在下SDIA法)使用STO細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞。在分化誘導(dǎo)起始前1天， 將ΙΟμΜ ROCK抑制劑(Y276352)加入培養(yǎng)基內(nèi)。將CTK解離液(0. 25%胰蛋白酶、lmg/ml 膠原酶和KSR 20%和ImMCaCl2)以500 μ l/10cm皿加入，隨后為在37°C孵育3_5分鐘。輕輕敲打皿以去除飼養(yǎng)細(xì)胞。在用PBS洗滌1次后，再次加入CTK解離液，隨后為在37°C孵育10-15分鐘。將與皿分離的ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞懸浮于5ml分化培養(yǎng)基(含有5%敲除血清替代物(KSR)、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、和ΙμΜ 2-巰基乙醇Q-ME)的DMEM/ Ham' sF12)。在離心后，去除上清液。再次，將細(xì)胞懸浮于Iml分化培養(yǎng)基中，并且隨后通過移液彼此分離，以便導(dǎo)致小聚集體(10-20細(xì)胞/塊)。將所獲得的小聚集體以范圍為2500-5000細(xì)胞/cm2的濃度接種到具有PA6作為飼養(yǎng)細(xì)胞的皿上。作為培養(yǎng)基，使用含有2 μ MDorsomorphin(Sigma)和/或ΙΟμΜ SB431542 (Sigma)和/或 300ng/mlNoggin (HZ-1026 =HumanZyme)或 2 μ 1/ 孔 DMSO 的分化培養(yǎng)基。10 μ M Υ276352僅在起始培養(yǎng)中加入。直到第7天才進(jìn)行培養(yǎng)基更換，并且隨后每 3-4天進(jìn)行一次。分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的誘導(dǎo)(在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下SFEBq法)通過上述方法，將已從其中去除飼養(yǎng)細(xì)胞的ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞在37°C孵育5分鐘，使用Iml Accumax(TM)用于分離。在洗滌后，計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目。將細(xì)胞懸浮于上述分化培養(yǎng)基中，且隨后以9000細(xì)胞/孔接種到低粘附96孔板(Lipidure-包被板N0F Corporation)上。對(duì)于培養(yǎng)，使用含有2μ M Dorsomorphin和10 μ M SB431542的分化培養(yǎng)基，并且50ηΜ Υ276352僅在起始培養(yǎng)中加入。直到第7天才進(jìn)行培養(yǎng)基更換，并且隨后每 3天進(jìn)行一次。使用每種藥物分化成神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)(Matrigel法)iPS細(xì)胞(G4)通過20分鐘Accutuase處理進(jìn)行分離，用人ES細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌， 并且隨后連同包含ROCK抑制劑(Y276352)的培養(yǎng)基一起置于明膠包被的皿上1小吋，從而使得去除飼養(yǎng)細(xì)胞。隨后，將ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞(18000細(xì)胞/cm2)接種到Matrigel (BD) 包被的皿上，并且隨后使用補(bǔ)充有bFGF和ROCK抑制劑(Y276352)的MEF條件培養(yǎng)基培養(yǎng) 3天，從而使得細(xì)胞達(dá)到鋪滿(Y276352在中間過程去除)。接下來，將細(xì)胞在含有10 μ M SB431542、2yM Dorsomorphin、300ng/ml Noggin、 InM-IOOnM LDN-193189 (STEMGENT04-0019)或 DMSO (對(duì)照)或其組合的分化培養(yǎng)基(DMEM/ F12、20%敲除血清替代物(Gibco)和0. ImM 2-巰基乙醇)中培養(yǎng)5天。在第5天時(shí)不添加SB431542，細(xì)胞在補(bǔ)充有Dorsomorphin、Noggin、LDN-193189或DMSO的分化培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)。在這時(shí)，N2培養(yǎng)基(通過將N2補(bǔ)充物加入DMEM/F12中制備的培養(yǎng)基)的比例以 2天間隔增加直到25^,50%和隨后75%，而不改變其他藥物的濃度。經(jīng)由LDN-193189和SB431542的添加分化成神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)(SDIA法)在分化誘導(dǎo)起始前1天時(shí)，將CTK解離液(0. 25%胰蛋白酶、lmg/ml膠原酶和KSR 20%和ImM CaCl2)加入ES細(xì)胞(KhES_l、KhES_4和KhES_5)，使集落解離。對(duì)從皿上脫離的ES細(xì)胞實(shí)施在明膠包被上的MEF去除，懸浮于分化培養(yǎng)基(含有5%敲除血清替代物 (KSR)、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、和ΙμΜ 2-巰基乙醇Q-ME)的DMEM/Ham' s F12) 中1小吋，并且隨后通過移液分離，以便形成小聚集體(10-20細(xì)胞/塊)。將獲得的小聚集體以范圍為2500-5000細(xì)胞/cm2的濃度接種到PA6上。在培養(yǎng)第4天吋，將培養(yǎng)基更換為補(bǔ)充有10 μ M SB431542_5-l，000nM LDN-193189的分化培養(yǎng)基。3天后，將培養(yǎng)基更換為不含SB431542和LDN-193189的分化培養(yǎng)基。其后，用不含SB431542和LDN-193189的分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)基更換以2-3天間隔進(jìn)行。關(guān)于在SFEBq法的條件下不同誘導(dǎo)劑組合的研究在對(duì)人iPS細(xì)胞(404以)分化誘導(dǎo)起始前1天，將10 μ M ROCK抑制劑(Y276352) 加入培養(yǎng)基內(nèi)。將CTK解離液(0. 25%胰蛋白酶、lmg/ml膠原酶和KSR 20%和ImM CaCl2) 以500μ 1/lOcm皿加入，隨后為在37°C孵育3-5分鐘。輕輕敲打皿以去除飼養(yǎng)細(xì)胞。在用PBS洗滌1次后，用Iml Accumax 在37°C孵育5分鐘進(jìn)行解離。在洗滌后，計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目。將細(xì)胞懸浮于上述分化培養(yǎng)基中，且隨后以9000細(xì)胞/孔接種到低粘附96孔板(Lipidure-包被板NOF Corporation)上。在細(xì)胞用由下述6個(gè)組合組成的培養(yǎng)基培養(yǎng)4天后，隨后將培養(yǎng)基換成上述分化培養(yǎng)基(含有5%敲除血清替代物(KSR)、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和ΙμΜ 2-巰基乙醇Q-ME)的DMEM/Ham' s F12)。用未分化標(biāo)記 (Nanog)和神經(jīng)分化標(biāo)記(1^x6和Soxl)評(píng)估分化的細(xì)胞。AdHDFK5%+2yM Dorsomorphin+10 μ M SB431542B 舊 GMK8% +IOOnM LDN913189+0. 5 μ M Α-83-01C :DFK5% +2 μ M Dorsomorphin+10 μ M SB431542D :GMK8% +IOOnM LDN913189+0. 5 μ M Α-83-01E :GMK8% +IOOnM LDN913189+10 μ M SB431542F :GMK8% +IOOnM LDN913189+0. 5 μ M Α-83-01+0. 5 μ MPD0325901其中i) “舊”意指在制備后經(jīng)過20天。ii)GMK8%意指由 Glasgow MEM(Invitrogen) ,8% KSRUuM 2ME 丙酮酸鹽和非必
需氨基酸組成的培養(yǎng)基。iii)A-83-01 購自 Sigma-Aldrich Inc.，并且 PD0325901 購自 Wako,日本。免疫染色在分化誘導(dǎo)后第14天吋，細(xì)胞用4% PFA在4°C固定30分鐘，且隨后在PBS中用表1中列出的每種抗體進(jìn)行免疫染色。表1:抗體的列表
權(quán)利要求
1.ー種用于誘導(dǎo)多能細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，其包括在小分子BMP抑制劑的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中一旦培養(yǎng)后還存在小分子TGFii家族抑制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述培養(yǎng)使用基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞是PA6細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述培養(yǎng)在無血清條件下伴隨類胚體的形成進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述培養(yǎng)在Matrigel -包被皿上不使用飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任ー項(xiàng)的方法，其中所述小分子BMP抑制劑是Dorsomorphin或 LDN-193189。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述小分子TGFβ家族抑制劑是SB431542或Α-83-01。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任ー項(xiàng)的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。
10.一種誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞，其通過權(quán)利要求1-9中任ー項(xiàng)的方法制備。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞的方法，其包括在小分子BMP抑制劑的存在下培養(yǎng)多能干細(xì)胞；和通過上述方法制備的誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/07GK102597218SQ201080035829
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者森實(shí)飛鳥, 高橋淳 申請(qǐng)人:國立大學(xué)法人京都大學(xué)