專利名稱：新型變體紅褐肉座菌cbh2纖維素酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變體纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)和編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明也涉及核酸構(gòu)建物、載體和包含所述核酸序列的宿主細(xì)胞，以及用于生產(chǎn)重組變體CBH多肽的方法。
參考文獻(xiàn)1.Sheehan and Himmel Biotechnology Progress 15，pp 817-827(1999)2.Matti Linko Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reeseiCellulases and Other Hydrolases pp 9-11(1993)3.Tuula T.Teed Trends in Biotechnology 15，pp 160-167(1997)4.T.T.Teeri et al. Spec.Publ.-R.Soc.Chem.，246(Recent Advances in CarbohydrateBioengineering)，pp 302-308.(1999)5.PDB reference 1QK2(Cel6A＝CBH2)J.-Y.Zou，G.J. Kleywegt，J.Stahlberg，H.Drigues，W.Nerinckx，M.Claeyssens，A.Koivula，T.T.Toeri，.T.A Jones，Structure(LONDON)，V.7 p.1035(1999)6.PDB reference 2BVW Structural changes of the aclive site tunnel of Humicolainsolens celloblohydrolase，Cel6A，upon oligosaccharide binding.，Varrot A，SchuleinM，Davies GJ，Biochemistry 1999 Jul 13；38(28)8884-91.
7.PDB reference 1DYS Structure and function of Humlcola insolens family 6cellulases；structure of the endoglucanase，Cel6B，at 1.6 A resolution.，DaviesGJ，Brzozowski AM，Dauter M，Varrot A，Schulein M， Blochem J 2000 May15；348 Pt 1201-7.
背景技術(shù)：
纖維素(Cellulose)和半纖維素(hemicellulose)是由光合作用生成的最豐富的植物材料。它們可以被許多微生物降解并用作能量來源，這包括細(xì)菌、酵母和真菌，它們產(chǎn)生能夠?qū)⒍嗑坌偷孜锼鉃閱误w型糖的胞外酶(Aro et al.，J.Biol.Chem.，vol.276，no.26，pp.24309-24314，June 29，2001)。由于不可再生資源途徑的限制，纖維素成為主要的可再生能源的潛力是巨大的(Krishna et al.，BioresourceTech.77193-196，2001)。通過生物學(xué)方法有效利用纖維素，是解決食品、飼料和燃料短缺的一個途徑(Ohmiya et al.，Biotechnol.Gen.Engineer.Rev.vol.14，pp.365-414，1997)。
纖維素酶(Cellulases)是水解纖維素(β-1，4葡聚糖或者βD-糖苷鍵)導(dǎo)致形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖(cellooligosaccharides)和類似物質(zhì)的酶。纖維素酶在傳統(tǒng)上已被分為三個主要類型內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases)(EC3.2.1.4)(″EG″)，外切葡聚糖酶(exoglucanases)或者纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)(EC 3.2.1.91)(″CBH″)和β-葡萄糖苷酶([β]-D-glucosideglucohydrolase；EC 3.2.1.21)(″BG″)。(Knowles et al.，TIBTECH 5，255-261，1987；Shülein，Methods Enzymol.，160，25，pp.234-243，1988)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的非晶體部分，而纖維二糖水解酶也可以降解晶體纖維素(Nevalainenand Penttila，Mycot，Mycota 303-319，1995)。因此，纖維二糖水解酶在纖維素酶體系中的存在對于晶體纖維素的有效溶解是必需的(Suurnakki，et al.Cellulose7189-209，2000)。β-葡萄糖苷酶的作用是從纖維二糖、纖維寡糖和其它糖苷釋放出D-葡萄糖單位(Freer，J.Biol.Chem.vol.268，no.13，pp.9337-9342，1993)。
已知纖維素酶是由眾多的細(xì)菌、酵母和真菌產(chǎn)生的。一些真菌產(chǎn)生能夠降解晶體形式的纖維素的完整纖維素酶系統(tǒng)，這樣，纖維素酶很容易地通過發(fā)酵而大量生成。由于許多酵母，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)缺乏水解纖維素的能力，絲狀真菌起了特殊的作用。參見，例如，Aro et al.，2001；Biochemistry andGenetics of Cellulose Degradation，eds.Aubert，J.P.et al.，Academic Press，1988；Woodet al.，Methods in Enzymology，vol.160，no.9，pp.87-116，1988，和Coughlan，et al. ″Comparative Biochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic EnzymeSystems″Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，pp.11-30 1988。
真菌纖維素酶的CBH、EG和BG分類可以被進(jìn)一步擴(kuò)大，在每種類別中包括多種成分。例如，多種CBHs、EGs和BGs已經(jīng)從各種真菌來源分離出來，包括里氏木霉(Trichoderma reesei)(也稱為紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina))，其含有下列已知基因2個CBHs，即CBHI(“CBH1”)和CBHII(“CBH2”)，至少8個EGs，即EGI、EGII、EGIII、EGIV、EGV、EGVI、EGVII和EGVIII，和至少5個BGs，即BG1、BG2、BG3、BG4和BG5。EGIV、EGVI和EGVIII也具有木葡聚糖酶活性。
為了有效地將晶體纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，完整的纖維素酶系統(tǒng)是必需的，其包括來自CBH、EG和BG類別中每一類的成分，而孤立的成分在水解晶體纖維素方面的有效性較小(Filho et al.，Can.J.Microbiol.421-5，1996)。已經(jīng)觀察到，在不同類別的纖維素成分之間存在協(xié)同關(guān)系。特別地，EG-型纖維素酶和CBH-型纖維素酶協(xié)同地相互作用，以更加有效地降解纖維素。參見，例如，Wood，BiochemicalSociety Transactions，611thMeeting，Galway，vol.13，pp.407-410，1985。
在本領(lǐng)域已知，纖維素酶在織物的處理方面是有用的，可用于增強(qiáng)洗滌劑組合物清潔能力、用作軟化劑、用于改善棉織物的手感和外觀，和類似方面(Kumaret al.，Textile Chemist and Colorist，2937-42，1997)。
已經(jīng)描述了，具有改進(jìn)的清潔特性的含纖維素酶的洗滌劑組合物(美國專利4,435,307號；英國申請2,095,275號和2,094,826號)，以及用于織物處理以改善織物的手感和外觀的含纖維素酶的洗滌劑組分(美國專利5,648,263、5,691,178和5,776,757號；英國申請1,358,599號；The Shizuoka Prefectural HammamatsuTextile Industrial Research Institute Report，Vol.24，pp.54-61，1986)。
因此，真菌和細(xì)菌中產(chǎn)生的纖維素酶受到了重大關(guān)注。特別地，已經(jīng)表明，木霉屬某些種(Trichoderma spp.)(例如，長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)或者里氏木霉(Trichoderma reesei))發(fā)酵生成能夠降解晶體形式纖維素的完整纖維素酶系統(tǒng)。
盡管纖維素組合物在之前已被描述過，但仍存在著對新的和改進(jìn)的纖維素組合物的需求，它們將用于家用洗滌劑、石洗組合物或者洗衣洗滌劑，等等。顯示出改進(jìn)性能的纖維素酶是特別令人感興趣的。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了分離的纖維素酶蛋白，其在本文中被稱為變體CBH2，和編碼變體CBH2的核酸。
在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及變體CBH2纖維素酶，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基V94、P98、G118、M120、M134、T142、L144、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、S210、I212、T214、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426和/或A429。在第一方面，本發(fā)明包括變體CBH2纖維素酶，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基V94E、P98L、G118P、M120L、M134G/L/V、T142V、L144G/R/S、M145L、T148Y、T154A、L179A、Q204E、V206L、S210L/R、I212V、T214M/Y、L215I、G231N、T232V、V250I、Q276L、N285Q、S291G、G308A、T312S、S316P、V323L/N/Y、N325D、I333L、G334A、S343P、T349L/V、G360R、S380T、A381T、S386P、F411Y、S413Y、A416G、Q426E和/或A429T。
在第二個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基V94、P98、G118、M120、M134、T142、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、I212、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426和/或A429。在第一方面，本發(fā)明包括CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基V94E、P98L、G118P、M120L、M134V、T142V、M145L、T148Y、T154A、L179A、Q204E、V206L、I212V、L215I、G231N、T232V、V250I、Q276L、N285Q、S291G、G308A、T312S、S316P、V323N、N325D、I333L、G334A、S343P、T349L、G360R、S380T、A381T、S386P、F411Y、S413Y、A416G、Q426E和/或A429T。
在第三個實(shí)施方式中，本發(fā)明包括CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基P98、M134、V206、I212、T312、S316、F411和/或S413。在第一方面，本發(fā)明包括CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基P98L、M134G/L/V、V206L、I212V、T312S、S316P、F411Y和/或S413Y。
在第四個實(shí)施方式中，本發(fā)明包括CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在部分區(qū)域中對應(yīng)于一個或多個殘基的位置處的取代或者缺失所述部分區(qū)域選自紅褐肉座菌CBH2(SEQ ID NO2)中的(210，214)、(253，255，257，258)、(411，413，415)、(412，414，416)、(312，313)、323、(212，149，152)、(134，144)和98。在第一方面，本發(fā)明包括CBH2纖維素酶變體，其中所述變體選自來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的S3 16P/V323L、S316P/V323Y、V206L/S210R/S316P、V206L/S316P、V206L/S210L/T214M/S316P、V206L/S210R/T214Y/S316P、M134G/L144G/S316P、M134L/L144R/S316P和M134L/L144S/S316P。
在第五個實(shí)施方式中，本發(fā)明包括CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基P98、M134、V206、S210、T214、S316、V323和/或8413。在第一方面，本發(fā)明包括CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基P98L、M134L/V、L144R、V206L、S210L/R、T214Y、S316P、V323Y和/或S413Y。在第二方面中，本發(fā)明包括CBH2纖維素酶變體，其中所述變體選自來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的98L/134V/206L/210R/214Y/316P/413Y、98L/134L/144R/316P/413Y、98L/134L/144R/206L/210R/214Y/316P/413Y、98L/134V/316P/323Y/413Y、98L/134V/206L/210R/214Y/316P/323Y/413Y、98L/134L/144R/316P/323Y/413Y、98L/134L/144R/206L/210R/214Y/316P/323Y/413Y、98L/134L/144R/210R/214Y/316P/323Y/413Y和98L/134L/144R/210L/214Y/316P/323Y/413Y。
在第六個實(shí)施方式中，本發(fā)明包括分離的核酸，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
在第一方面中，本發(fā)明包括分離的核酸，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽，該多肽是糖基水解酶家族6的變體，并且其中所述核酸編碼在所述核酸編碼的多肽中對溫度壓力敏感的殘基上的缺失，其中所述纖維二糖水解酶變體源生于紅褐肉座菌纖維二糖水解酶。在第二方面，本發(fā)明包括分離的核酸，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽，該多肽是糖基水解酶家族6的變體，并且其中所述核酸編碼在所述核酸編碼的多肽中實(shí)現(xiàn)酶可加工性的殘基上的取代，其中所述纖維二糖水解酶變體源于紅褐肉座菌纖維二糖水解酶。在第三方面，本發(fā)明包括分離的核酸，其編碼具有纖維二糖水解酶活性的多肽，該多肽是糖基水解酶家族6的變體，并且其中所述核酸編碼在所述核酸編碼的多肽中實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物抑制的殘基上的取代，其中所述纖維二糖水解酶變體源于紅褐肉座菌纖維二糖水解酶。
在另一方面，本發(fā)明涉及編碼CBH2纖維素酶變體的分離的核酸，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代來自紅褐肉座菌CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基V94、P98、G118、M120、M134、T142、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、I212、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S390、F411、S413、A416、Q426和/或A429。
在第七個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及表達(dá)盒，其包含編碼CBH2變體的核酸。在一方面，存在這樣的構(gòu)建物，其包含可操縱性連接到調(diào)節(jié)序列的編碼CBH2變體的核酸。
在第八個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及載體，其包含編碼CBH2變體的核酸。在一方面，存在這樣的構(gòu)建物，其包含可操縱性連接到調(diào)節(jié)序列的編碼CBH2變體的核酸。
在第九個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，其用包含編碼CBH2變體的核酸的載體轉(zhuǎn)化。
在第十個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生CBH2變體的方法，包括步驟(a)在合適的條件下，在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)用包含編碼CBH2變體的核酸的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生CBH2變體；(b)獲得所述產(chǎn)生的CBH2變體。
在第十一個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有表面活性劑和CBH2變體的洗滌劑組合物。在本實(shí)施方式的一個方面，該洗滌劑是洗衣洗滌劑。在本實(shí)施方式的第二方面，該洗滌劑是盤碟洗滌劑。在本實(shí)施方式的第三方面，所述CBH2變體被用于含有纖維素的織物的處理，特別地，用于石洗或者靛青染色的粗斜棉布。
在第十二個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及含有CBH2變體的飼料添加劑。
在第十三個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及處理木漿的方法，包括將所述木漿和CBH2變體接觸。
在第十四個實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及將生物物質(zhì)(biomass)轉(zhuǎn)化為糖的方法，包括使所述生物物質(zhì)和CBH2變體接觸。
在一個實(shí)施方式中，所述纖維素酶來源于真菌、細(xì)菌或放線菌。在一個方面，所述纖維素酶來源于真菌。在另一方面，真菌是絲狀真菌。優(yōu)選的是，所述絲狀真菌屬于真子囊菌(Euascomycete)，具體而言，屬于曲霉屬某些種(Aspergillusspp.)、粘帚霉屬某些種(Gliocladium spp.)、鐮刀霉屬某些種(Fusarium spp.)、支頂孢屬某些種(Acremonium spp.)、Myceliophtora spp、輪生菌屬某些種(Verticilliumspp.)、漆斑菌屬某些種(Myrothecium spp.)或青霉屬某些種(Penicillium spp.)。在本實(shí)施方式的進(jìn)一步的方面，纖維素酶是纖維二糖水解酶。
通過下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征和優(yōu)勢將變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解，該詳細(xì)描述和具體實(shí)施例，盡管指出本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是仍僅以舉例說明的方式給出，因?yàn)橥ㄟ^本詳細(xì)描述，在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)各種變化和改變對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將是顯然的。
附圖簡述


圖1是來自紅褐肉座菌的野生型Cel6A(CBH2)的氨基酸(SEQ IDNO2)序列。
圖2是野生型紅褐肉座菌CBH2的核酸序列(SEQ ID NO1)。
圖3A-C顯示了具有可獲得的晶體結(jié)構(gòu)的Cel6家族成員的氨基酸序列比對。所述序列是異常腐質(zhì)霉(Humicola insolens)CBH2、支頂孢屬CBH2、傘菌屬(Agaricus)CBH2、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)CBH2、康寧肉座菌(Hypocreakoningii)CBH2、黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)CBH2、Talaromycesemersonii CBH2、里氏木霉(T.reesei)即紅褐肉座菌CBH2、和共有序列。采用VectorNTI Suite軟件程序，通過空位罰分為10的Clustal W，進(jìn)行比對。
圖4是pRAX1載體。該載體是以質(zhì)粒pGAPT2為基礎(chǔ)，不同的是構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因組DNA片段AMA1序列的5259bp的HindIII片段(Aleksenko and Clutterbuck，Molecular Microbiology 1996 19565-574)被插入。堿基1-1134包含黑曲霉葡糖淀粉酶基因啟動子。堿基3098至3356和4950至4971包含黑曲霉葡糖淀粉酶終止子。構(gòu)巢曲霉pyrG基因被插入到3357至4949，作為真菌轉(zhuǎn)化的標(biāo)記(marker)。存在可以插入基因的多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site(MCS))。
圖5是pRAXdes2載體骨架。此載體是基于質(zhì)粒載體pRAX1。Gateway序列盒(Gateway cassette)已被插入pRAX1載體(用環(huán)狀質(zhì)粒內(nèi)的箭頭表示)。此序列盒含有重組序列attR1和attR2和選擇性標(biāo)記物(marker)catH和ccdB。該載體是根據(jù)GatewayTMCloning Technology第一版34-38頁中的指南被制備，并且僅可以在Invitrogen的大腸桿菌DB3.1中復(fù)制；在其它大腸桿菌宿主中，ccdB基因是致命的。首先，用含有attB1/2重組序列的引物獲得PCR片段。將此片段與pDONR201(可以從Invitrogen公司購得)重組；此載體含有attP1/2重組序列，catH和ccdB位于重組位點(diǎn)之間。應(yīng)用Invitrogen的BP clonase酶，將該P(yáng)CR片段重組到被稱為ENTRY的載體中，帶有插入的PCR片段的克隆可以用50μg/ml卡那霉素選擇出來，原因是表達(dá)ccdB的克隆不存活?，F(xiàn)在，att序列被改變，并且被稱為attL1和attL2。第二個步驟是，用pRAXdes2載體(在重組位點(diǎn)之間含有attR1和attR2 catH和ccdB)重組此克隆。應(yīng)用Invitrogen的LP clonase酶，將來自ENTRY載體的插入片段重組到目標(biāo)載體(destination vsctor)中。應(yīng)用100μg/ml氨芐青霉素，僅pRAXCBH1載體被選擇出來，原因是ccdB是致命的，而且ENTRY載體對氨芐青霉素敏感。通過這種方法，現(xiàn)在，表達(dá)載體得以制備并且可以用于轉(zhuǎn)化黑曲霉。
圖6提供了對pRAXdes2cbh2載體的說明，該載體被用于在曲霉菌中表達(dá)編碼CBH2變異體的核酸。通過att序列的同源重組，編碼CBH2酶同源物或者變異體的核酸被克隆入該載體。
圖7提供了pENTRY-CBH2載體的說明。
圖8是不同變體從磷酸膨脹的纖維素劑量依賴性釋放糖的圖。所述變體展示出對該底物寬范圍的活性。
圖9是由變體產(chǎn)生的(平均)總糖與由野生型CBH2產(chǎn)生的(平均)總糖之間比率的柱狀圖，如對PASC所測量的。
圖10是顯示了通過改變酶量所釋放的糖量的圖。野生型酶被表示為FCA500.3(空心菱形)，而所述變體是FCA543(P98L/M134V/T154A/I212V/S316P/S413Y)(空心正方形)。來自CBH2缺失株的培養(yǎng)基作為對照。
圖11是由變體產(chǎn)生的(平均)總糖與由野生型CBH2產(chǎn)生的(平均)總糖之間比率的柱狀圖，如對預(yù)處理玉米秸稈所測量的。y軸的最小刻度值為0.6，表示由CBH2缺失株產(chǎn)生的(平均)總糖除以由野生型CBH2聯(lián)合CBH2缺失株產(chǎn)生的(平均)總糖的值。值1表示與野生型相似的活性水平。
圖12是時程試驗(yàn)(time course experiment)的圖。在53℃下，通過CBH2分子，隨時間從PASC釋放的總糖被示出。變體以實(shí)心三角形(▲)表示；野生型以空心正方形(□)表示。
圖13是時程試驗(yàn)的圖。在65℃下，通過CBH2分子，隨時間從PASC釋放的總糖被示出。變體以實(shí)心三角形(▲)表示；野生型以空心正方形(□)表示。
圖14是時程試驗(yàn)的圖。在75℃下，通過CBH2分子，隨時間從PASC釋放的總糖被示出。變體以實(shí)心三角形(▲)表示；野生型以空心正方形(□)表示。
圖15是描繪在38℃下纖維素酶混合物的具體性能的圖。該混合物含有嗜酸耐熱菌(Acidothermus cellulolyticus)E1催化核心以及或者野生型或者變體纖維二糖水解酶。野生型被標(biāo)明為301、500，其表示野生型CBH1(即301)和野生型CBH2(即500)被使用。變體被標(biāo)明為469、543，其表示變體CBH1(即469)和變體CBH2(即543)被使用。
圖16是描繪在65℃下纖維素酶混合物的具體性能的圖。該混合物含有嗜酸耐熱菌(Acidothermus cellulolyticus)E1催化核心以及或者野生型或者變體纖維二糖水解酶。野生型被標(biāo)明為301、500，其表示野生型CBH1(即301)和野生型CBH2(即500)被使用。變體被標(biāo)明為469、543，其表示變體CBH1(即469)和變體CBH2(即543)被使用。
圖17是在上面
圖16中所述的變體纖維素酶混合物在不同溫度下的小規(guī)模糖化轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的圖。
發(fā)明詳述
現(xiàn)在，將通過參考下面的定義和實(shí)施例來詳細(xì)描述本發(fā)明，此處提及的所有的專利和出版物，包括在這些專利和出版物中公開的序列，都特意地以引用方式并入。
除非本文另有定義，此處應(yīng)用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語，皆具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所普遍理解的含義。Singleton，et al.，DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OFBIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)向技術(shù)人員提供了本發(fā)明中應(yīng)用的許多術(shù)語的一般性解釋。盡管與此處描述的方法和材料相似或者等價的任意方法和材料可以被用于本發(fā)明的實(shí)踐或者試驗(yàn)中，但仍描述了優(yōu)選的方法和材料。數(shù)字范圍包括用于限定該范圍的端值。除非另有指明，核酸以5’-3’的方向從左至右書寫；氨基酸序列以氨基末端向羧基末端的方向從左至右書寫。關(guān)于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，實(shí)踐者可以特別地參考Sambrook et al.，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL(Second Edition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989和Ausubel FM et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，NY，1993。應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所描述的具體的方法學(xué)、方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢宰兓?br> 本文提出的標(biāo)題不是對本發(fā)明各個方面或者各種實(shí)施方案的限制，可以通過參考整個說明書來考慮它們。因此，通過將說明書作為一個整體來參考，下面即將被定義的術(shù)語可以被更加全面地定義。
本文引用的所有出版物均特意地通過引用方式并入本文，以用于描述和揭示可能與本發(fā)明聯(lián)系使用的組合物和方法學(xué)。
1.定義
如此處所使用，術(shù)語“多肽”(“polypeptide”)是指通過肽鍵連接的單鏈氨基酸殘基。如此處所使用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”(“protein”)可以與術(shù)語“多肽”同義。
“變體”(“variant”)是指衍生于前體蛋白質(zhì)(例如，天然蛋白質(zhì))的蛋白質(zhì)，其通過向C末端和N末端的任一端或兩端添加一個或多個氨基酸、在氨基酸序列的一個位點(diǎn)或者許多不同位點(diǎn)處一個或者多個氨基酸的取代、或在蛋白質(zhì)的一端或兩端或者在氨基酸序列的一個或者多個位點(diǎn)上一個或多個氨基酸的缺失而生產(chǎn)。通過修飾編碼天然蛋白質(zhì)的DNA序列，將該修飾的DNA序列轉(zhuǎn)化到合適的宿主，并表達(dá)該修飾的DNA序列以形成酶變異體，酶變體的制備得以優(yōu)選地完成。本發(fā)明的CBH2酶變體包括這樣的肽，與前體酶氨基酸序列相比，其含有改變的氨基酸序列，其中該變體CBH2酶保留了前體酶的特征性的纖維水解性質(zhì)，但是在一些特定方面可以具有改變的性質(zhì)。例如，變體CBH2酶可以具有增加的最適pH，或者具有增加的溫度或氧化穩(wěn)定性，但仍保持其特征性的纖維水解活性。預(yù)期根據(jù)本發(fā)明的變體可以來源于編碼纖維素變體CBH2酶的DNA片段，其中所表達(dá)的纖維素酶變體的功能性活性被保留。例如，編碼纖維素酶的DNA片段還可以包括編碼在5′或3′端連接于纖維素酶DNA序列的鉸鏈或連接體的DNA序列或其部分，其中所編碼的纖維素酶結(jié)構(gòu)域的功能性活性被保留。術(shù)語變體和衍生物在本文中可以互換使用。
“等價殘基(equivalent residues)”也可以被定義，通過在前體纖維素酶的三級結(jié)構(gòu)水平上確定同源性，所述前體纖維素酶的三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過X射線晶體學(xué)確定。等價殘基被定義為這樣的殘基，對于它們來說，纖維素酶和紅褐肉座菌CBH在聯(lián)配(alignment)之后，特定氨基酸殘基的主鏈原子(N對N，CA對CA，C對C和O對O)中的2個或者更多個的原子坐標(biāo)是在0.13nm內(nèi)，優(yōu)選地在0.1nm內(nèi)。在討論紅褐肉座菌CBH2時，聯(lián)配是在最佳模型已經(jīng)被定向和定位從而得到纖維素酶的非氫蛋白原子的原子坐標(biāo)的最大重疊之后實(shí)現(xiàn)的。所述的最佳模式是在可利用的最高分辨率下對于衍射實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)給出最低R因子的晶體學(xué)模型。
在功能上類似于紅褐肉座菌CBH2特定殘基的等價殘基被定義為纖維素酶的那些氨基酸，其可以采用一種構(gòu)象，以致于它們以限定或影響紅褐肉座菌CBH2特定殘基的方式，改變、修飾或者影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合或者催化作用。進(jìn)一步地，它們是纖維素酶(其三級結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過X射線晶體學(xué)獲得)的那些殘基，其占據(jù)相似的位置，所述的相似達(dá)到了這樣的程度，雖然給定殘基的主鏈原子可能不滿足基于占據(jù)同源位置的等價標(biāo)準(zhǔn)，但是殘基的側(cè)鏈原子中的至少2個的原子坐標(biāo)位于紅褐肉座菌CBH2的對應(yīng)側(cè)鏈原子的0.13nm內(nèi)。紅褐肉座菌CBH2的晶體結(jié)構(gòu)在Zou et al.(1999)(見上參考文獻(xiàn)5)中被示出。
術(shù)語“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子?？梢岳斫獾氖牵捎谶z傳密碼的簡并性，編碼一種給定蛋白如CBH2和/或其變體的多個核苷酸序列可以產(chǎn)生。本發(fā)明涵蓋了每一種可能的變異體核苷酸序列，其編碼變體CBH2，所有的序列都可能被賦予遺傳密碼的簡并性。
“異源的”核酸構(gòu)建物或序列具有與表達(dá)它的細(xì)胞不存在天然聯(lián)系的序列的一部分。有關(guān)于調(diào)控序列的異源序列，是指調(diào)節(jié)基因的表達(dá)的控制序列(即，啟動子或者增強(qiáng)子)，但是在自然界它并不調(diào)節(jié)現(xiàn)在它所調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。通常地，異源核酸序列對于其所存在的細(xì)胞或者基因組部分不是內(nèi)源性的，而是通過感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔或者類似方法被加入該細(xì)胞。“異源的”核酸構(gòu)建物可以含有調(diào)控序列/DNA編碼序列組合，該組合可以與天然細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的調(diào)控序列/DNA編碼序列組合相同或者不同。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語“載體”是指設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建物。“表達(dá)載體”是指具有整合異源DNA片段和在外源細(xì)胞中表達(dá)異源DNA片段的能力的載體。許多原核細(xì)胞和真核細(xì)胞表達(dá)載體是商業(yè)上可得到的。對合適載體的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
因此，“表達(dá)序列盒”或者“表達(dá)載體”是重組產(chǎn)生或者合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建物，其帶有允許特定核酸在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的一系列特定核酸元件。重組表達(dá)序列盒可以被并入質(zhì)粒、染色體、線粒體DNA、質(zhì)體DNA、病毒或者核酸片段。典型地，其他序列之外，表達(dá)載體的重組表達(dá)序列盒部分包括將被轉(zhuǎn)錄的核酸序列和啟動子。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語“質(zhì)?！笔侵腑h(huán)狀雙鏈(ds)DNA構(gòu)建物，其用作克隆載體，并且在許多細(xì)菌和一些真核細(xì)胞中形成染色體外的自我復(fù)制遺傳元件。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語“編碼選擇性標(biāo)記物的核苷酸序列”是指能夠在細(xì)胞中表達(dá)的核酸序列，并且選擇性標(biāo)記物的表達(dá)使含有該被表達(dá)的基因的細(xì)胞能夠在存在相應(yīng)的選擇試劑的條件下或者在相應(yīng)的選擇生長條件下生長。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語“啟動子”是指核酸序列，其功能是指導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄。啟動子通常適用于表達(dá)靶基因的宿主細(xì)胞。啟動子連同其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)核酸序列和翻譯調(diào)節(jié)核酸序列(也被稱為“調(diào)控序列”)，對表達(dá)特定的基因是必需的。通常地，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和翻譯調(diào)節(jié)序列包括但不限于，啟動子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始序列和轉(zhuǎn)錄終止序列、翻譯起始序列和翻譯終止序列，以及增強(qiáng)子或者激活子序列。
如此處所定義，“嵌合基因”或者“異源核酸構(gòu)建物”是指非天然的基因(即，已被導(dǎo)入到宿主中的基因)，其可以由不同的基因部分組成，包括調(diào)控元件。典型地，用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的嵌合基因構(gòu)建物包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域(啟動子)，其可操作性地連接于異源蛋白編碼序列，或者，在選擇性標(biāo)記物嵌合基因的情形中，其可操作性地連接于選擇性標(biāo)記物基因，該基因編碼使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有例如抗生素抗性的蛋白。本發(fā)明的用于轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞的典型嵌合基因包括，組成型或者誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、蛋白編碼序列和終止子序列。如果需要分泌靶蛋白，嵌合基因構(gòu)建物也可以包括編碼信號肽的另一個DNA序列。
當(dāng)一個核酸被置于與另一個核酸序列的功能聯(lián)系中時，該核酸便是“可操縱性連接的(operably linked)”。例如，如果多肽是以參與該多肽的分泌的前蛋白形式被表達(dá)，那么編碼分泌型前導(dǎo)序列的DNA便與該多肽的DNA是可操縱性連接的；如果啟動子或增強(qiáng)子可影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動子或增強(qiáng)子便是可操縱性連接于該序列；或者，如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被定位以致于可協(xié)助翻譯，那么該核糖體結(jié)合位點(diǎn)便是可操縱性連接于編碼序列。通常地，“可操縱性連接”意味著被連接的DNA序列是相鄰的，而且在促分泌前導(dǎo)序列的情形中，是相鄰的和處于正確的閱讀框架中的。然而，增強(qiáng)子不一定是相鄰的。連接可以通過在方便的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接而完成。如果這樣的位點(diǎn)不存在，可以按照常規(guī)的實(shí)踐，應(yīng)用合成的寡核苷酸接頭、連接子或PCR引物。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語“基因”是指參與生成多肽鏈的DNA片段，可以包括或者不包括編碼區(qū)之前的區(qū)域和之后的區(qū)域，例如，5’非翻譯區(qū)(5’UTR)或者“前導(dǎo)”序列和3’UTR或者“尾部”序列，也可以包括或者不包括各個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。
一般來說，在中度至高度嚴(yán)緊(stringency)的條件下，編碼變異體CBH2的核酸分子會和本文提供為SEQ ID NO1的野生型序列雜交。然而，在一些情形下，應(yīng)用的是具有基本上不同的密碼子使用的編碼CBH2的核苷酸序列，而由該編碼CBH2的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有和天然蛋白質(zhì)相同的或者大體上相同的氨基酸序列。例如，根據(jù)特定密碼子被宿主應(yīng)用的頻率，編碼序列可以被修飾以有利于CBH2在特定原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中更快地表達(dá)。例如，Te′o，et al.(FEMS Microbiology Letters 19013-19，2000)描述了在絲狀真菌中表達(dá)基因的最優(yōu)化方式。
如果兩個序列在中度至高度嚴(yán)緊的雜交和洗脫條件下彼此特異地雜交，那么便認(rèn)為其中一個核酸序列對于另一個參照核酸序列，是“可選擇性地雜交”的。雜交條件基于核酸結(jié)合復(fù)合物或者探針的解鏈溫度(Tm)。例如“最大的嚴(yán)緊性”典型地發(fā)生在大約Tm-5℃(低于探針的Tm 5℃)；“高嚴(yán)緊性”發(fā)生在低于Tm大約5-10℃；“中度”或者“中間嚴(yán)緊性”發(fā)生在低于探針的Tm大約10-20℃；“低嚴(yán)緊生”發(fā)生在低于Tm大約20-25℃。從功能上來說，最大嚴(yán)緊條件可以被用來鑒定與雜交探針具有嚴(yán)格同一性或者接近嚴(yán)格的同一性的序列；而高嚴(yán)緊條件被用來鑒定與探針具有大約80％或者更多的序列同一性的序列。
中度嚴(yán)緊和高度嚴(yán)緊的雜交條件在本領(lǐng)域是公知的(參見，例如，Sambrook，et al，1989，Chapters 9 and 11，以及Ausubel，F(xiàn).M.，et al.，1993，在此特意地并入作為參考)。高度嚴(yán)緊條件的例子包括，在大約42℃，在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml變性載體DNA中雜交，隨后，用2×SSC和0.5％SDS室溫洗滌2次，用0.1×SSC和0.5％SDS在42℃再洗滌2次。
如此處所使用，術(shù)語“重組體”，當(dāng)用于細(xì)胞或者載體時，表示該細(xì)胞或者載體已經(jīng)通過異源性核酸序列的導(dǎo)入而被修飾，或者該細(xì)胞衍生于如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在該細(xì)胞的天然(非重組)形式中未發(fā)現(xiàn)的相同形式的基因，或者由于精細(xì)的人為干預(yù)，表達(dá)的是天然基因，但是該天然基因在其它情況下是異常地表達(dá)、表達(dá)不足或者根本不表達(dá)。
如本文所應(yīng)用，當(dāng)用于描述細(xì)胞時，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”或者“轉(zhuǎn)基因的”是指該細(xì)胞具有非天然的(異源的)核酸序列，其被整合入細(xì)胞的基因組中或者作為附加體質(zhì)粒，經(jīng)過多代之后依然被維持。
如本文所應(yīng)用，術(shù)語“表達(dá)”是指根據(jù)基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過程。此過程既包括轉(zhuǎn)錄又包括翻譯。
在談及將核酸序列插入到細(xì)胞中時，術(shù)語“導(dǎo)入”是指“轉(zhuǎn)染”或者“轉(zhuǎn)化”或者“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，包括將核酸序列整合到真核細(xì)胞或者原核細(xì)胞中，其中所述核酸序列可以被并入到細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或者線粒體DNA)，轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾鲝?fù)制子，或者短暫地表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
接下來，術(shù)語“CBH2表達(dá)”是指cbh2基因或其變體的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)物包括前體RNA、mRNA、多肽、翻譯后加工的多肽、以及它們的衍生物，包括來自相關(guān)種例如康寧木霉(Trichoderma koningii)、紅褐肉座菌(也稱為長梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、綠色木霉(Trichoderma viride))和施韋尼茲肉座菌(Hypocrea schweinitzii)的CBH2。作為例子，對CBH2表達(dá)的分析包括CBH2蛋白的蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、cbh2 mRNA的RNA印跡(Northernblot)分析和反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析，以及磷酸膨脹纖維素和PAHBAH測定(Phosphoric Acid Swollen Cellulose and PAHBAH assays)，如在(a)PASC(Karlsson，J.et al.(2001)，Eur.J.Biochem，268，6498-6507，Wood，T.(1988)inMethods in Enzymology，Vol.160.Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose (Wood，W.& Kellog，S.Eds.)，pp.19-25，Academic Press，San Diego，CA，USA)和(b)PAHBAH(Lever，M.(1972)Analytical Biochemistry，47，273，Blakeney，A.B.&Mutton，L.L.(1980)Journal of Science of Food and Agriculture，31，889，Henry，R.J.(1984)Journal of the Institute of Brewing，90，37)中所描述。
術(shù)語“選擇性剪接”是指由單一的基因產(chǎn)生多個多肽異構(gòu)體的過程，其涉及將不連續(xù)的外顯子通過剪接方式連在一起，這發(fā)生在一些但不是所有的基因轉(zhuǎn)錄物的加工過程中。因此特定的外顯子可以與數(shù)個可供選擇的外顯子中的任意一個相連，以形成信使RNA。選擇性剪接的mRNA生成多肽(“剪接變異體”)，其中一些部分是共同的，而其它部分是不同的。
術(shù)語“信號序列”是指蛋白質(zhì)N端部分的氨基酸序列，其幫助成熟形式的蛋白質(zhì)分泌出細(xì)胞。成熟形式的胞外蛋白缺乏信號序列，其在分泌過程中被切割。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指含有載體并支持表達(dá)構(gòu)建物的復(fù)制和/或轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄和翻譯(表達(dá))的細(xì)胞。用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌，或者真核細(xì)胞，如酵母、植物、昆蟲、兩棲動物或者哺乳動物細(xì)胞。通常地，宿主細(xì)胞是絲狀真菌。
術(shù)語“絲狀真菌”是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所認(rèn)識的任何和所有絲狀真菌。優(yōu)選的真菌選自曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、鐮孢菌屬(Fusarium)、金孢菌屬(Chrysosoporium)、青霉屬(Penicillium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、脈孢菌屬(Neurospora)、或可選地，它們的有性形式例如肉座菌屬(Emericella)、肉座菌屬(Hypocrea)?，F(xiàn)已證明無性工業(yè)真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是真子囊菌紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的克隆衍生物。參見Kuhls et al.，PNAS(1996)937755-7760。
術(shù)語“纖維寡糖(cellooligosaccharide)”是指含有2-8個葡萄糖單元并具有β-1，4鍵的寡糖組，例如纖維二糖。
術(shù)語“纖維素酶”是指酶的一個種類，其能夠?qū)⒗w維素多聚物水解為較短的纖維寡糖寡聚物、纖維二糖和/或葡萄糖。纖維素酶的許多例子，如外切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡糖苷酶已經(jīng)從可水解纖維素的生物體中獲得，特別地，包括真菌、植物和細(xì)菌。
來自紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的CBH2是糖基水解酶家族6(因此稱為Cel6)的一個成員，特別地，是該家族(Cel6)在紅褐肉座菌中鑒定的第一個成員。糖基水解酶家族6既含有內(nèi)切葡聚糖酶又含有纖維二糖水解酶/外切葡聚糖酶，CBH2是后者。因此，短語CBH2、CBH2-型蛋白和Cel6纖維二糖水解酶在此可以互換地應(yīng)用。
如此處所應(yīng)用，術(shù)語“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(cellulose binding domain)”是指纖維素酶的部分氨基酸序列，或者該酶的一個區(qū)域，其參與纖維素酶或其衍生物的纖維素結(jié)合活性。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常通過將該纖維素酶非共價地結(jié)合于纖維素、纖維素衍生物或者它們的其它多糖等價物而起作用。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域允許或有助于通過結(jié)構(gòu)上不同的催化核心區(qū)域進(jìn)行纖維素纖維的水解，并且，典型地，它們獨(dú)立于催化核心而起作用。因此，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域不具有顯著的水解活性，水解活性可歸因于催化核心。換言之，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是纖維素酶蛋白三級結(jié)構(gòu)中不同于具有催化活性的結(jié)構(gòu)元件的結(jié)構(gòu)元件。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和纖維素結(jié)合組件(cellulose binding module)在本文中可以互換使用。
如本文中所使用的，術(shù)語“表面活性劑”是指在本領(lǐng)域通常被認(rèn)為具有表面活性性質(zhì)的任何化合物。因此，例如，表面活性劑包括陰離子、陽離子表面活性劑和非離子型表面活性劑，如通常發(fā)現(xiàn)于洗滌劑中的那些表面活性劑。陰離子表面活性劑包括線性的或者分支的烷基苯磺酸鹽；具有線性或分支烷基基團(tuán)或者烯基基團(tuán)的烷基或烯基醚硫酸鹽；烷基或烯基硫酸鹽；烯烴磺酸鹽和烷基磺酸鹽。兼性表面活性劑(兩性表面活性劑)包括季銨磺酸鹽和甜菜堿型兼性表面活性劑。這樣的兼性表面活性劑在同一分子中既有正電荷基團(tuán)又有負(fù)電荷基團(tuán)。非離子型表面活性劑可以包括聚乙二醇，以及更高級的脂肪酸鏈烷醇酰胺或者其氧化烯加合物、脂肪酸甘油單酯和類似物。
如本文所應(yīng)用，術(shù)語“含纖維素的織物(cellulose containing fabric)”是指任何縫制或者非縫制的織物、紗或者纖維，由含棉或者不含棉的纖維素制成，或者由含棉或者不含棉的纖維素混合物制成，包括天然纖維素和人造纖維素(如黃麻、亞麻、苧麻、人造絲和萊賽爾纖維(lyocell))。
如本文中所使用的，術(shù)語“含棉織物(cotton-containing fabric)”指縫制或者非縫制的織物、紗或纖維，其由純棉或棉混合物制成，棉混合物包括棉織物(cottonwoven fabrics)、棉編織物(cotton knits)、斜紋粗棉布(cotton denims)、棉紗(cottonyarns)、原棉和類似物。
如本文中所應(yīng)用，術(shù)語“石洗組合物(stonewashing composition)”是指用于石洗含纖維素的織物的制劑。石洗組合物被用于在出售之前，即，在生產(chǎn)過程中修飾含纖維素的織物。與之不同，洗滌劑組合物主要用于清潔污染的衣服，而不是用在生產(chǎn)過程中。
如本文中所應(yīng)用，術(shù)語“洗滌劑組合物(detergent composition)”是指打算應(yīng)用于洗滌介質(zhì)中用于洗滌污染的含纖維素織物的混合物。就本發(fā)明來說，除了纖維素酶和表面活性劑，這樣的組合物還可以包括另外的水解酶、增潔劑、漂白劑、漂白催化劑、藍(lán)色漂白劑(bluing agents)和熒光染料、結(jié)塊抑制劑、掩蔽劑(maskingagents)、纖維素酶激活劑、抗氧化劑和增溶劑。
如本文中所應(yīng)用，術(shù)語“cbh2基因表達(dá)的降低或者消除”是指cbh2基因已經(jīng)從基因組中剔除，因此不能被重組宿主微生物表達(dá)，或者cbh2基因已經(jīng)被修飾以致于有功能的CBH2酶不能被宿主微生物產(chǎn)生。
術(shù)語“變異體cbh2基因”，或者“變異體CBH2”分別指，來自紅褐肉座菌的cbh2基因的核酸序列已經(jīng)通過去除、增加和/或操縱編碼序列而被改變，或者被表達(dá)的蛋白的氨基酸序列已經(jīng)被修飾，與本文所描述的發(fā)明一致。
如本文中所應(yīng)用，術(shù)語“純化”通常是指使含轉(zhuǎn)基因核酸或蛋白的細(xì)胞經(jīng)受生化純化和/或柱層析。
如本文中所應(yīng)用，術(shù)語“活性的”或者“生物活性的”是指與特定蛋白相關(guān)聯(lián)的生物活性，它們在此可以互換應(yīng)用。例如，與蛋白酶相關(guān)聯(lián)的酶活性是蛋白水解，因此，活性蛋白酶具有蛋白水解活性。這樣，特定蛋白的生物活性是指本領(lǐng)域技術(shù)人員通常認(rèn)為該蛋白具有的任何生物活性。
如本文所使用，術(shù)語“富集的(enriched)”是指CBH2的濃度大于在野生型或天然存在的真菌纖維素酶組合物中發(fā)現(xiàn)的CBH2濃度。術(shù)語富集的、升高的(elevated)、增強(qiáng)的(enhanced)在本文中可以互換使用。
野生型真菌纖維素酶組合物是由天然存在的真菌來源產(chǎn)生的組合物并且其包含一種或多種BGL、CBH、EG成分，其中這些成分的每一種以所述真菌來源產(chǎn)生的比率被發(fā)現(xiàn)。因此，富集的CBH組合物將具有改變的比率的CBH，其中CBH與其它纖維素酶(即，EGs、β葡糖苷酶和其它內(nèi)切葡聚糖酶)的比率被升高。該比率可以通過由本領(lǐng)域已知的任何方式增加CBH或降低(或消除)至少一種其它成分而被增加。
如此處所使用，術(shù)語“分離的”或“純化的”是指核酸或氨基酸從與其天然相關(guān)的至少一種成分移出。
因此，為了舉例說明，通過文獻(xiàn)中充分公開的公認(rèn)的分離技術(shù)，包括在合適的pH下的離子交換層析、親合層析、大小排阻和類似技術(shù)，天然存在的纖維素酶系統(tǒng)可以被純化成基本上純的成分。例如，在離子交換層析(通常為陰離子交換層析)中，通過用pH梯度、鹽梯度、或同時用pH和鹽梯度洗脫，分離纖維素酶成分是可能的。然后，純化的CBH可以被加到酶促溶液，得到富集的CBH溶液。采用分子遺傳方法以過表達(dá)編碼CBH的基因，增加微生物產(chǎn)生的CBH的量是可能的，這可能與缺失一種或多種編碼其它纖維素酶的基因相結(jié)合。
真菌纖維素酶可以含有一種以上CBH成分。不同的成分通常具有不同的等電點(diǎn)，這使得可以通過離子交換層析和類似方法分離它們。單個CBH成分或CBH成分的組合可以被用在酶促溶液中。
當(dāng)應(yīng)用于酶溶液時，同源或者變異CBH2成分通常被加入的量足以允許可溶性糖以最大速度從生物物質(zhì)中釋放出來。加入的CBH2同源物或者變異體的量取決于要被糖化的生物物質(zhì)的類型，這可以被技術(shù)人員容易地確定。當(dāng)被應(yīng)用時，在纖維素組合物中存在的CBH2同源物或者變異體成分的重量百分比優(yōu)選地在1和100之間，示例性例子為大約1、優(yōu)選地大約5、優(yōu)選地大約10、優(yōu)選地大約15或者優(yōu)選地大約20的重量百分比至優(yōu)選地大約25、優(yōu)選地大約30、優(yōu)選地大約35、優(yōu)選地大約40、優(yōu)選地大約45或者優(yōu)選地大約50的重量百分比。進(jìn)一步地，優(yōu)選的范圍可以是，大約0.5至大約15的重量百分比、大約0.5至大約20的重量百分比、從大約1至大約10的重量百分比、從大約1至大約15的重量百分比、從大約1至大約20的重量百分比、從大約1至大約25的重量百分比、從大約5至大約20的重量百分比、從大約5至大約25的重量百分比、從大約5至大約30的重量百分比、從大約5至大約35的重量百分比、從大約5至大約40的重量百分比、從大約5至大約45的重量百分比、從大約5至大約50的重量百分比、從大約10至大約20的重量百分比、從大約10至大約25的重量百分比、從大約10至大約30的重量百分比、從大約10至大約35的重量百分比、從大約10至大約40的重量百分比、從大約10至大約45的重量百分比、從大約10至大約50的重量百分比、從大約15至大約60的重量百分比、從大約15至大約65的重量百分比、從大約15至大約70的重量百分比、從大約15至大約75的重量百分比、從大約15至大約80的重量百分比、從大約15至大約85的重量百分比、從大約15至大約95的重量百分比。然而，當(dāng)被應(yīng)用時，CBH2同源物或者變異體成分相對于纖維素酶組合物中存在的EG類型成分的重量百分比是從優(yōu)選地大約1、優(yōu)選地大約5、優(yōu)選地大約10、優(yōu)選地大約15或者優(yōu)選地大約20的重量百分比至優(yōu)選地大約25、優(yōu)選地大約30、優(yōu)選地大約35、優(yōu)選地大約40、優(yōu)選地大約45或者優(yōu)選地大約50的重量百分比。進(jìn)一步地，優(yōu)選的范圍可以是，大約0.5至大約15的重量百分比、大約0.5至大約20的重量百分比、從大約1至大約10的重量百分比、從大約1至大約15的重量百分比、從大約1至大約20的重量百分比、從大約1至大約25的重量百分比、從大約5至大約20的重量百分比、從大約5至大約25的重量百分比、從大約5至大約30的重量百分比、從大約5至大約35的重量百分比、從大約5至大約40的重量百分比、從大約5至大約45的重量百分比、從大約5至大約50的重量百分比、從大約10至大約20的重量百分比、從大約10至大約25的重量百分比、從大約10至大約30的重量百分比、從大約10至大約35的重量百分比、從大約10至大約40的重量百分比、從大約10至大約45的重量百分比、從大約10至大約50的重量百分比、從大約15至大約20的重量百分比、從大約15至大約25的重量百分比、從大約15至大約30的重量百分比、從大約15至大約35的重量百分比、從大約15至大約30的重量百分比、從大約15至大約45的重量百分比、從大約15至大約50的重量百分比。
II.宿主生物體
絲狀真菌包括所有絲狀形式的真菌亞門(Eumycota)和卵菌亞門(Oomycota)。絲狀真菌的特征在于營養(yǎng)菌絲，其具有由幾丁質(zhì)、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁，營養(yǎng)生長是通過菌絲的延長，碳分解代謝是專性好氧的。
在本發(fā)明中，絲狀真菌親代細(xì)胞可以是下述種—但不限于這些種—的細(xì)胞木霉，如長梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉屬某種(Penicillium sp.)；腐質(zhì)霉屬某種(Humicola sp.)包括異常腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)和灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)；金孢菌某種(Chrysosporium sp.)包括拉克淖金孢菌(C.lucknowense)；粘帚霉某種(Gliocladium sp.)；曲霉屬某種；鐮孢菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢菌屬某種(Neurospora sp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)。如本文中所使用的，術(shù)語“木霉”或“木霉屬某種”指之前已被歸入木霉屬的任何真菌菌株或目前被歸入木霉屬的任何真菌菌株。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，絲狀真菌親代細(xì)胞是黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)或構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)細(xì)胞。
在另外一種優(yōu)選實(shí)施方案中，絲狀真菌親代細(xì)胞是里氏木霉細(xì)胞。
III.纖維素酶 在本領(lǐng)域中，已知纖維素酶是水解纖維素(β-1，4葡聚糖或者βD-葡糖苷鍵)從而導(dǎo)致形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖和類似物質(zhì)的酶。如前面所闡明，纖維素酶傳統(tǒng)地被分為三個主要類型內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(″EG″)、外切葡聚糖酶或者纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(″CBH″)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)(″BG″)(Knowles，et al.，TIBTECH 5，255-261，1987；Schulen，1988)。
一些真菌產(chǎn)生包括外切-纖維二糖水解酶或者CBH-型纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶或者EG-型纖維素酶、β-葡糖苷酶或者BG-型纖維素酶在內(nèi)的完整的纖維素酶系統(tǒng)(Schulein，1988)。然而，有時這些系統(tǒng)缺乏CBH-型纖維素酶，細(xì)菌纖維素酶通常也含有很少的CBH-型纖維素酶或者不含有CBH-型纖維素酶。此外，已經(jīng)表明，EG成分和CBH成分協(xié)同地相互作用，以更加有效地降解纖維素。參見，例如，Wood，1985。多組分或者完整的纖維素酶系統(tǒng)中的不同成分，即，各種內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維二糖水解酶，通常具有不同的性質(zhì)，如等電點(diǎn)、分子量、糖基化程度、底物特異性和酶作用方式。
據(jù)認(rèn)為，內(nèi)切葡聚糖酶型纖維素酶水解在纖維素酶的低結(jié)晶度區(qū)中的內(nèi)部β-1，4-糖苷鍵，而外切纖維二糖水解酶型纖維素酶從纖維素的還原端和非還原端水解纖維二糖。隨后，通過產(chǎn)生被外切纖維二糖水解酶識別的新的鏈末端，內(nèi)切葡聚糖酶組分的作用可以極大地促進(jìn)外切纖維二糖水解酶的作用。此外，已經(jīng)標(biāo)明，β-葡糖苷酶型纖維素酶可催化烷基和/或芳基β-D-糖苷例如甲基β-D-糖苷和對硝基苯基糖苷以及僅含有糖殘基的糖苷例如纖維二糖的水解。這產(chǎn)生作為微生物唯一產(chǎn)物的葡萄糖，并降低或消除抑制纖維二糖水解酶和內(nèi)切葡聚糖酶的纖維二糖。
還發(fā)現(xiàn)，纖維素酶在洗滌劑組合物中的許多用途，包括增強(qiáng)清洗能力、作為軟化劑和改善棉織物的手感(Hemmpel，ITB Dyeing/Printing/Finishing 35-14，1991；Tyndali，Textile Chemist and Colorist 2423-26，1992；Kumar etal.，TextileChemist and Colorist，2937-42，1997)。盡管該機(jī)理不是本發(fā)明的一部分，但是纖維素酶的軟化和顏色保持性能被歸因于纖維素酶組合物中的堿性內(nèi)切葡聚糖酶組分，如美國專利5,648,263、5,691,178和5,776,757所例證，其公開含有富集有專用堿性內(nèi)切葡聚糖酶組分的纖維素酶組合物的洗滌劑組合物，相比于未富集有這樣的組分的纖維素酶組合物，賦予被處理的衣物持色和改善的軟化。此外，已經(jīng)表明，堿性內(nèi)切葡聚糖酶組分在洗滌劑組合物中的使用補(bǔ)足了所述洗滌劑組合物的pH要求。(例如，通過在7.5-10的堿性pH下表現(xiàn)出最大活性，如美國專利5,648,263、5,691,178和5,776,757中所描述)。
也已經(jīng)表明，纖維素酶組合物可降解含棉織物，導(dǎo)致織物減弱的強(qiáng)度喪失(美國專利4,822,516)，這造成了在商業(yè)洗滌劑應(yīng)用中不愿使用纖維素酶組合物。已經(jīng)有提示，與含有完整的纖維素酶系統(tǒng)的組合物相比，包含內(nèi)切葡聚糖酶成分的纖維素酶組合物對含棉織物顯示出降低的強(qiáng)度喪失。
也已經(jīng)表明，纖維素酶可以用于將纖維素生物物質(zhì)降解為乙醇(其中纖維素酶降解纖維素為葡萄糖，酵母或者其它微生物進(jìn)一步酵解葡萄糖為乙醇)，用于機(jī)械紙漿處理(Pere et al.，In Proc.Tappi Pulping Conf.，Nashville，TN，27-31，pp.693-696，1996)，用作飼料添加劑(WO91/04673)和用在谷物濕磨(wet milling)中。
大多數(shù)CBH和EG具有由通過連接肽分隔開的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)和核心結(jié)構(gòu)域組成的多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(Suurnakki et al.，2000)。核心結(jié)構(gòu)域含有活性位點(diǎn)，而CBD通過使酶結(jié)合于纖維素而與纖維素發(fā)生作用(van Tilbeurgh et al.，F(xiàn)EBS Lett.204223-227，1986；Tomme et al.，Eur.J.Biochem.170575-581，1988)。CBD在晶體狀纖維素的水解中特別重要。已經(jīng)表明，當(dāng)CBD不存在時，纖維二糖水解酶降解晶體狀纖維素的能力明顯降低(Linder and Teeri，J.Biotechnol.5715-28，1997)。然而，CBD的確切作用和作用機(jī)制仍然是一種推論。已經(jīng)有人提出，CBD僅僅通過增加纖維素表面的有效酶濃度(Stahlberg et al.，Bio/Technol.9286-290，1991)，和/或通過從纖維素表面松開單個的纖維素鏈(Tormo et al.，EMBO J.vol.15，no.21，pp.5739-5751，1996)來增強(qiáng)酶活性。涉及纖維素酶結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌孜锏淖饔玫拇蠖鄶?shù)研究是應(yīng)用纖維二糖水解酶的核心蛋白來進(jìn)行的，原因是它們的核心蛋白可以容易地通過木瓜蛋白酶的有限蛋白水解而產(chǎn)生(Tomme et al.，1988)。許多纖維素酶已經(jīng)在科學(xué)文獻(xiàn)中被描述，其例子包括來自里氏木霉Shoemaker，S.et al.，Bio/Technology，1691-696，1983，其公開了CBH1；Teeri，T.et al.，Gene，5143-52，1987，其公開了CBH2。來自不同于木霉的其它種的纖維素酶也已經(jīng)被描述，例如Ooi et al.Nucleic Acids Research，vol.18，no.19，1990，其公開了編碼棘孢曲霉產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T et al.，Gene 173(2)287-8，1996，其公開了編碼棘孢曲霉的β-葡糖苷酶的cDNA的克隆和測序；Sakamoto et al.，Curr.Genet.27435-439，1995，其公開了編碼白曲霉(Aspergillus kawachii)IFO 4308的內(nèi)切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；Saarilahti et al.，Gene 909-14，1990，其公開了來自歐氏桿菌(Erwinia carotovara)的內(nèi)切葡聚糖酶；Spilliaert R，et al.，EurJ Biochem.224(3)923-30，1994，其公開了bglA的克隆和測序，bglA編碼Rhodothermus marinus的熱穩(wěn)定β-葡聚糖酶；Halldorsdottir S et al.，Appl MicrobiolBiotechnol.49(3)277-84，1998，其公開了Rhodothermus marinus基因的克隆、測序和過量表達(dá)，Rhodothermus marinus基因編碼糖基水解酶家族12的熱穩(wěn)定性纖維素酶。然而，仍然需要鑒定和表征新型的纖維素酶，它們應(yīng)具有改良的特性，諸如在熱應(yīng)激下或在表面活性劑存在的情況下改善的性能、增加的比活性、改變的底物切割模式和/或體外高水平的表達(dá)。
對含有不同含量CBH類型纖維素酶的新的和改進(jìn)的纖維素酶組合物的開發(fā)，對下列用途是有價值的(1)用在洗滌劑組合物中，其表現(xiàn)出增強(qiáng)的清洗能力，起到柔軟劑的作用和/或改善棉織物的手感(例如，“石洗”或者“生物拋光(biopolishing)”；(2)用在用于將木漿或者其它生物物質(zhì)降解為糖的組合物中(例如，用于生物乙醇生產(chǎn))；和/或(3)用在飼料組合物中。
IV分子生物學(xué) 在一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在絲狀真菌中有功能的啟動子的控制下表達(dá)變體cbh2基因。因此，本發(fā)明依賴于重組遺傳學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。公開了用于本發(fā)明的一般性方法的基本文獻(xiàn)包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and ExpressionALaboratory Manual(1990)，和Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in MolecularBiology(1994)。
用于鑒定同源cbh2基因的方法 在
圖1中顯示了野生型紅褐肉座菌CBH2的核酸序列。本發(fā)明，在一個方面，包括了此處描述的編碼CBH2同源物的核酸分子。該核酸可以是DNA分子。
可以被用來分離編碼同源CBH2的DNA序列的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，包括但不限于，用同源DNA探針進(jìn)行cDNA文庫篩選和/或基因組文庫篩選，用活性分析或者抗CBH2抗體進(jìn)行表達(dá)篩選。這些方法中的任一種都可以發(fā)現(xiàn)于Sambrook，et al.或者CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，F(xiàn).Ausubel，et al.，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1987)(″Ausubel″)。
突變cbh2核酸序列的方法 本領(lǐng)域中已知的可以引入突變的任何方法，均被本發(fā)明所預(yù)期。
本發(fā)明涉及CBH2變異體的表達(dá)、純化和/或分離和應(yīng)用。這些酶優(yōu)選地通過利用紅褐肉座菌的cbh2基因的重組方法來制備。發(fā)酵肉湯可以在純化或不純化的情況下被使用。
在紅褐肉座菌的cbh2基因被分離和克隆之后，本領(lǐng)域中已知的其它方法，如定點(diǎn)誘變，被用于在對應(yīng)于表達(dá)的CBH2變異體中取代氨基酸的位置進(jìn)行替代、添加或者刪除。此外，定點(diǎn)誘變和在DNA水平上實(shí)現(xiàn)在表達(dá)蛋白中引入氨基酸變化的其它方法，可以在Sambrook，et al和Ausubel，et al中找到。
編碼紅褐肉座菌CBH2的氨基酸序列變異體的DNA是通過本領(lǐng)域中已知的各種方法制備的。這些方法包括但不限于，通過對早先制備的編碼紅褐肉座菌CBH2的DNA進(jìn)行定點(diǎn)(或者寡核苷酸介導(dǎo))誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。
定點(diǎn)誘變是制備替代型變異體的優(yōu)選方法。此技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的(參見，例如Carter et al.Nucleic Acids Res.134431-4443(1985)and Kunkel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488(1987))。簡言之，進(jìn)行DNA的定點(diǎn)誘變時，起始DNA是通過首先將編碼所需突變的寡核苷酸和此起始DNA的單鏈雜交來改變的。雜交后，以雜交的寡核苷酸作為引物，以起始DNA的單鏈作為模板，應(yīng)用DNA聚合酶合成完整的第二鏈。由此，編碼所需突變的寡核苷酸被并入到得到的雙鏈DNA中。
PCR誘變也適用于制備起始多肽即紅褐肉座菌CBH2的氨基酸序列變異體。參見，Higuchi，PCR Protocols，pp.177-183(Academic Press，1990)；和Vallette et al.，Nuc.Acids Res.17723-733(1989)。還參見例如Cadwell et al.，PCR Methods andApplications，Vol 2，28-33(1992)。簡言之，當(dāng)小量的DNA模板在PCR中被用作起始物質(zhì)時，在序列上與模板DNA的對應(yīng)區(qū)域略微不同的引物可以被用于生成相對大量的特定DNA片段，這樣的DNA片段僅在引物不同于模板的位置處不同于模板序列。
用于制備變異體的另一種方法，盒式誘變，是基于Wells et al.，Gene 34315-323(1985)所描述的技術(shù)。起始材料是含有要被突變的起始多肽DNA的質(zhì)粒(或者其它載體)。要被突變的起始DNA中的密碼子被鑒定。在鑒定的突變位點(diǎn)的每一側(cè)，必須存在特有的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果不存在這樣的限制性位點(diǎn)，可以應(yīng)用上述的寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法生成它們，以在起始多肽DNA的合適位置導(dǎo)入這樣的位點(diǎn)。質(zhì)粒DNA在這些位點(diǎn)被切割，以使之線性化。編碼限制性位點(diǎn)之間的DNA序列但包含所需突變的雙鏈寡核苷酸，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法被合成，其中寡核苷酸的兩條鏈分別被合成，然后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法被雜交在一起。此雙鏈寡核苷酸被稱為序列盒。將此序列盒設(shè)計(jì)為具有與線性化質(zhì)粒的末端相容的5’和3’末端，這樣，可以將其直接連接入質(zhì)粒。至此，此質(zhì)粒含有突變的DNA序列。
選擇地，或者附加地，編碼CBH2變體的所需氨基酸序列可以被確定，編碼這樣的氨基酸序列變異體的核酸序列可以通過合成方法來生成。
這樣制備的CBH2變體可以被進(jìn)一步修飾，這時常是取決于纖維素酶的目的用途。這樣的修飾可以涉及氨基酸序列的進(jìn)一步變化、與異源多肽的融合和/或共價修飾。
V.Cbh2核酸和CBH2多肽A.變異cbh2型核酸 野生型紅褐肉座菌cbh2的核酸序列被示于
圖1中。本發(fā)明包括編碼本文所描述的纖維素酶變體的核酸分子。所述核酸可以是DNA分子。
在cbh2的分離和克隆后，本領(lǐng)域中已知的其它方法，例如定點(diǎn)突變，被用于制備相應(yīng)于表達(dá)的CBH2變體中的取代的氨基酸的取代、添加或刪除。此外，定點(diǎn)突變和其它在DNA水平上在表達(dá)的蛋白質(zhì)中摻入氨基酸變化的方法可以在Sambrook，et al.和Ausubel，et al.中找到。
在編碼CBH2變異體的DNA序列克隆入DNA構(gòu)建物之后，將該DNA轉(zhuǎn)化到微生物中。根據(jù)本發(fā)明，用于表達(dá)變異體CBH2的要被轉(zhuǎn)化的微生物，可以包括來源于木霉某種的菌株，這是較為有利的。因此，根據(jù)本發(fā)明，用于制備變異體CBH2纖維素酶的優(yōu)選方式包括，用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化木霉宿主細(xì)胞，所述的DNA構(gòu)建物包括編碼變異體CBH2的部分或者全部的DNA的至少一個片段。DNA構(gòu)建物通常功能性地連接于啟動子。然后，被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在一定條件下生長，表達(dá)所需的蛋白。隨后，所需的蛋白產(chǎn)物可以被純化至基本同質(zhì)。
然而，可能的事實(shí)是，編碼變異體CBH2的特定DNA的最佳表達(dá)媒介可能不同于紅褐肉座菌。因此，在與變異體CBH2的來源生物體種系發(fā)生相似的轉(zhuǎn)化宿主中表達(dá)蛋白，可能會最有利。在一種可以選擇的實(shí)施方案中，黑曲霉可以被用作表達(dá)媒介。關(guān)于黑曲霉的轉(zhuǎn)化技術(shù)的描述，參見WO98/31821，其公開內(nèi)容通過引用方式整體并入。
因此，在此對木霉某些種(Trichoderma spp.)表達(dá)系統(tǒng)的描述，僅僅是提供用作闡釋的目的，為表達(dá)本發(fā)明變異體CBH2提供一個選擇。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼變異體CBH2的DNA，假若合適的話，并且應(yīng)該理解，在確定最佳表達(dá)宿主時，變異體CBH2的來源應(yīng)該被考慮。另外地，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠應(yīng)用本領(lǐng)域中可利用的手段，通過常規(guī)技術(shù)選擇針對特定基因的最佳表達(dá)系統(tǒng)。
B.變體CBH2多肽
圖1顯示了野生型紅褐肉座菌CBH2的氨基酸序列。變體CBH2多肽包括，在對應(yīng)于下列殘基中的一個或者多個的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基V94、P98、G118、M120、M134、T142、L144、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、S210、I212、T214、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426和/或A429。
在一個方面，本發(fā)明涉及Cel6A家族的分離的CBH2酶，所述CBH2酶在這樣的區(qū)中具有至少一個氨基酸殘基取代或刪除，所述區(qū)選自(1)從位置92到100、(2)115-123、(3)140-155、(4)160-180、(5)198-218、(6)228-235、(7)240-260、(8)275-295、(9)305-318、(10)322-335、(11)340-350、(12)360-370、(13)378-390和(14)410-430。在另一個方面，本發(fā)明涉及Cel6A家族的分離的CBH2酶，所述CBH2酶在這樣的區(qū)中具有至少一個氨基酸殘基取代，所述區(qū)選自(1)從位置92到100、(2)115-123、(3)140-155、(4)160-180、(5)198-218、(6)228-235、(7)240-260、(8)275-295、(9)305-318、(10)322-335、(11)340-350、(12)360-370、(13)378-390和(14)410-430。
本發(fā)明的變異體CBH2具有衍生于前體紅褐肉座菌CBH2氨基酸序列的氨基酸序列。通過對前體氨基酸序列的一個或者多個氨基酸的取代、刪除或者插入，CBH2變異體的氨基酸序列不同于前體CBH2氨基酸序列。
圖1顯示了紅褐肉座菌CBH2的成熟氨基酸序列。因此，本發(fā)明所涉及的CBH2變異體在與紅褐肉座菌CBH2中具體鑒定的殘基等價的位置含有氨基酸殘基。如果CBH2變異體的殘基(氨基酸)與紅褐肉座菌CBH2的特定殘基或殘基的一部分同源(即，在一級結(jié)構(gòu)或者三級結(jié)構(gòu)中的位置相對應(yīng))或者功能上類似(即，在化學(xué)或者結(jié)構(gòu)的組合、反應(yīng)或者相互作用方面具有相同或者相似的功能能力)，那么CBH2變異體的該殘基(氨基酸)便等價于紅褐肉座菌CBH2的該殘基。如此處所應(yīng)用，編號是對應(yīng)于如
圖1所示的成熟CBH2氨基酸序列的編號。除了前體CBH2內(nèi)的位置，在前體CBH2中對應(yīng)于與該前體CBH2在熱應(yīng)激時的不穩(wěn)定性有聯(lián)系的氨基酸位置處的特定殘基在此被鑒定，以用于取代或者缺失。氨基酸位置編號(例如，+51)是指針對
圖1顯示的成熟紅褐肉座菌CBH2序列設(shè)計(jì)的編號。
優(yōu)選地，應(yīng)用“序列比較算法”來進(jìn)行氨基酸序列的聯(lián)配，以確定同源性。用于比較的序列的最佳聯(lián)配可以通過下列方法或算法來進(jìn)行例如，Smith &Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法(local homologyalgorithm)，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性聯(lián)配算法，Pearson & Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性搜索方法，這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，視覺觀察(visual inspection)，視覺觀察可以利用圖形包，諸如例如Chemical ComputingGroup，Montreal Canada的MOE。
適合于確定序列相似性的算法的一個例子是BLAST算法，在Altschul，et al.，J.Mol Biol.215403-410(1990)中有描述。用于實(shí)施BLAST分析的軟件可以通過美國國家生物技術(shù)信息中心(www.ncbi.nim.nih.gov)公開得到。此算法涉及，首先通過鑒別待詢序列(query sequence)中長度為W的短的字串來確定高分序列對(high scoring sequence pairs，HSPs)，所述高分序列對在與數(shù)據(jù)庫序列中同樣長度的字串聯(lián)配時，匹配或者滿足某個正值的閾值T。這些初始的鄰近字串被用作起始點(diǎn)以發(fā)現(xiàn)包含有它們的更長的HSPs。所述字串沿著被比較的這兩個序列中的每一個向兩個方向延伸，只要累積的聯(lián)配分?jǐn)?shù)在增加。出現(xiàn)下面情況時，字串的延伸便停止累積的聯(lián)配分?jǐn)?shù)由達(dá)到的最大值下降了數(shù)量X；累積分?jǐn)?shù)達(dá)到0或者0以下；或者延伸到了任一序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了聯(lián)配的靈敏度和速率。BLASTN程序使用的默認(rèn)的是字串長度(W)為11，BLOSUM62記分矩陣(參見Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))，聯(lián)配(B)為50，期望值(E)為10，M’5，N’-4，對兩條鏈進(jìn)行比較。
然后，BLAST算法進(jìn)行兩個序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如，Karlin & Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一種相似性量度是最小合計(jì)概率(smallest sum probability，P(N))，其表示兩個核苷酸或者氨基酸序列間的匹配將偶然發(fā)生的概率。例如，如果在受測氨基酸序列和蛋白酶氨基酸序列的比較中，最小合計(jì)概率是小于大約0.1，更優(yōu)選地小于大約0.01，最優(yōu)選地小于大約0.001，便認(rèn)為該氨基酸序列與蛋白酶相似。
為了本發(fā)明的目的，利用本領(lǐng)域中已知的計(jì)算機(jī)程序，例如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)中提供的GAP，采用多肽序列比較的具有下列設(shè)定值的GAP5.0的GAP產(chǎn)生罰分(GAP creationpenalty)和0.3的GAP延長罰分(GAP extension penalty)，同一性的程度可以被合適地確定。
當(dāng)評價相對于GeneBank DNA Sequences和其它公共數(shù)據(jù)庫中的核酸序列的給定核酸序列時，使用BLASTN程序典型地進(jìn)行序列檢索。BLASTX對于相對于GeneBank DNA Sequences和其它公共數(shù)據(jù)庫檢索這樣的核酸序列是優(yōu)選的，所述核酸序列在所有的閱讀框被翻譯。使用開放空位罰分11.0的默認(rèn)參數(shù)，以及延長的空位罰分1.0，進(jìn)行BLASTN和BLASTX，并采用BLOSUM-62矩陣(參見例如Altschul，et al.，1997)。
下面提供了用于改變CBH2纖維素酶的穩(wěn)定性的另外的具體策略 (1)減少主鏈去折疊的熵可以導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性。例如，脯氨酸殘基的導(dǎo)入可以通過降低去折疊的熵而顯著地穩(wěn)定蛋白(參見，例如，Watanabe，et al.，Eur.J.Biochem.226277-283(1994))。相似地，甘氨酸殘基沒有β-碳，因此與任何其它殘基相比，具有大得多的骨架構(gòu)象自由度。取代甘氨酸，優(yōu)選地應(yīng)用丙氨酸進(jìn)行取代，可以降低去折疊的熵而改善穩(wěn)定性(參見，例如，Matthews，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84；6663-6667(1987))。此外，通過縮短外部環(huán)結(jié)構(gòu)(loops)，可能改善穩(wěn)定性。已經(jīng)觀察到，由極端嗜熱菌產(chǎn)生的蛋白與它們的嗜溫同源物相比，具有更短的外部環(huán)結(jié)構(gòu)(參見，例如，Russel，et al.，Current Opinions in Biotechnology6370-374(1995))。二硫鍵的導(dǎo)入也可以有效地穩(wěn)定相互關(guān)聯(lián)的不同的三級結(jié)構(gòu)。因此，在可接近已存在的半胱氨酸的殘基位置處導(dǎo)入半胱氨酸，或者導(dǎo)入可以形成二硫鍵的成對半胱氨酸，可以改變CBH2變異體的穩(wěn)定性。
(2)通過增加側(cè)鏈?zhǔn)杷詠頊p少內(nèi)部空腔，可以改變酶的穩(wěn)定性。通過最大化疏水作用和減少堆積缺陷(packing defect)來降低內(nèi)部空腔的數(shù)量和體積，可以增加酶的穩(wěn)定性(參見，例如，Matthews，Ann.Rev.Biochem.62139-160 (1993)；Burley，et al.，Science 22923-29(1985)；Zuber，Biophys.Chem.29171-179(1988)；Kellis，et al.，Nature 333784-786(1988))。已知來自嗜熱生物的多聚體蛋白與其嗜溫的對應(yīng)物相比，常常具有更多的疏水亞基界面，具有更大程度的表面互補(bǔ)(Russel，et al.，supra)。認(rèn)為此原則也適用于單聚體蛋白的結(jié)構(gòu)域界面。特定的取代可以通過增加疏水性而改善穩(wěn)定性，包括賴氨酸變?yōu)榫彼?、絲氨酸變?yōu)楸彼?、蘇氨酸變?yōu)楸彼?Russel，et al.，supra)。取代為丙氨酸或者脯氨酸的修飾可以增加側(cè)鏈的尺寸，導(dǎo)致減少的空腔、更好的堆積和增加的疏水性?？梢詼p小腔的尺寸、增加疏水性和改善CBH2結(jié)構(gòu)域之間的界面互補(bǔ)的取代，可以改善酶的穩(wěn)定性。特別地，將這些位置的特定殘基改變?yōu)檫x自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的不同殘基，可以改善性能。
(3)在剛性的二級結(jié)構(gòu)即α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角中平衡電荷，可以改善穩(wěn)定性。例如，用天冬氨酸上的負(fù)電荷中和α-螺旋N末端的部分正電荷，可以改善該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性(參見，例如，Eriksson，et al.，Science 255178-183(1992))。相似地，用正電荷中和螺旋C末端的部分負(fù)電荷，可以改善穩(wěn)定性。去除正電荷與β-轉(zhuǎn)角的肽N末端的相互作用，應(yīng)該可以有效地賦予三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。用非正電荷殘基進(jìn)行取代，可以去除不適宜的正電荷與轉(zhuǎn)角中酰胺氮的相互作用。
(4)通過導(dǎo)入鹽鍵和氫鍵來穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)，可以是有效的。例如，離了對相互作用，例如，在天冬氨酸或谷氨酸和賴氨酸、精氨酸或組氨酸之間的相互作用，可以引起強(qiáng)烈的穩(wěn)定效應(yīng)，并且可以被用來粘附不同的三級結(jié)構(gòu)元件，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性增加。此外，帶電荷殘基/不帶電荷殘基氫鍵作用數(shù)目的增加，和氫鍵數(shù)目的增加，通?？梢愿纳茻岱€(wěn)定性(參見，例如，Tanner，et al.，Biochemistry 352597-2609(1996))。用天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或者谷氨酰胺進(jìn)行取代，可以導(dǎo)入與骨架酰胺的氫鍵。用精氨酸進(jìn)行取代，可以改善鹽橋和導(dǎo)入氫鍵到碳骨架碳?；?。
(5)避免耐敏性殘基通常可以增加熱穩(wěn)定性。例如，在高溫下天冬酰胺和谷氨酰胺易發(fā)生脫酰胺作用，半胱氨酸易發(fā)生氧化。減少這些殘基在敏感部位的數(shù)量，可以導(dǎo)致改善的熱穩(wěn)定性(Russel，et al.，supra)。由除谷氨酰胺或者半胱氨酸之外的任意殘基造成的取代或者缺失，可以通過避免熱敏性殘基而增加穩(wěn)定性。
(6)配體結(jié)合的穩(wěn)定化和去穩(wěn)定化致使CBH2變異體的穩(wěn)定性發(fā)生改變。例如，在應(yīng)用了本發(fā)明的CBH2變異體的基質(zhì)中，一種成分可以結(jié)合于CBH2變異體的特定表面活性劑敏感位點(diǎn)/熱敏性位點(diǎn)。通過借助于取代來修飾該位點(diǎn)，該成分與變異體的結(jié)合可以被加強(qiáng)或者減弱。例如，CBH2結(jié)合裂隙中的非芳香族殘基，可以被苯丙氨酸或者酪氨酸取代，以導(dǎo)入芳香族側(cè)鏈穩(wěn)定化作用，其中，纖維素底物的作用可以和苯環(huán)順利地發(fā)生，從而增加了CBH2變異體的穩(wěn)定性。
(7)增加任意的表面活性劑/熱敏感配體的電負(fù)性，可以改善在表面活性劑或者熱應(yīng)激條件下的穩(wěn)定性。例如，用苯丙氨酸或者酪氨酸取代，可以通過改善對溶液的遮蔽而增加D(天冬氨酸)殘基的電負(fù)性，從而改善穩(wěn)定性。
VI.重組CBH2變體的表達(dá) 本發(fā)明的方法依賴于應(yīng)用細(xì)胞來表達(dá)變異體CBH2，不要求CBH2表達(dá)的特定方法。CBH2優(yōu)選地從所述細(xì)胞分泌。
本發(fā)明提供了用含有編碼變異體CBH2的核酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)條件，如溫度、pH和類似條件，是在轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染之前用于親代宿主細(xì)胞的那些條件，這對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯然的。
在一種方法中，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染絲狀真菌細(xì)胞或者酵母細(xì)胞，所述的表達(dá)載體具有能在宿主細(xì)胞系中發(fā)揮作用的啟動子或者生物活性啟動子片段或者一個或多個(例如，一系列)增強(qiáng)子，其可操縱性連接于編碼CBH2的DNA片段，這樣，CBH2表達(dá)于該細(xì)胞系中。
A.核酸構(gòu)建物/表達(dá)載體 編碼CBH2的天然或者合成的多核苷酸片段(“編碼CBH2的核酸序列”)可以被并入異源的核酸構(gòu)建物或者載體，它們能夠?qū)氲浇z狀真菌或者酵母細(xì)胞中并在其中復(fù)制。此處公開的載體和方法適于在宿主細(xì)胞中應(yīng)用以便表達(dá)CBH2。任何載體都可以被應(yīng)用，只要它能夠在導(dǎo)入的細(xì)胞中復(fù)制和存活。大量的合適載體和啟動子對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的，并且是商業(yè)上可得到的。在Sambrook etal.，1989，Ausubel FM et al.，1989和Strathern et al.，The Molecular Biology of theYeast Saccharomyces，1981中也描述了克隆載體和表達(dá)載體，其每一個在此特意地并入作為參考。van den Hondel，C.A.M.J.J.et al.(1991)InBennett，J.W.andLasure，L. L.(eds.)More Gene Manipulations in Fungi.Academic Press，pp.396-428中描述了用于真菌的合適表達(dá)載體。通過各種方法，可以將合適的DNA序列插入質(zhì)?；蛘咻d體(此處統(tǒng)稱為“載體”)。一般地，通過標(biāo)準(zhǔn)方法，將DNA序列插入合適的限制性酶切位點(diǎn)。相信這樣的方法和相關(guān)的亞克隆方法是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。
通過將含有變異體CBH2的編碼序列的異源核酸構(gòu)建物導(dǎo)入經(jīng)選擇的絲狀真菌株系的細(xì)胞中，可以產(chǎn)生包含變異體CBH2的編碼序列的重組絲狀真菌。
一旦獲得所需纖維素酶核酸序列的期望形式，其可以通過各種方法被修飾。當(dāng)該序列包括非編碼側(cè)翼區(qū)域時，側(cè)翼區(qū)域可以被切除、突變等等。因此，轉(zhuǎn)換、顛換、刪除和插入可以在天然發(fā)生的序列上被進(jìn)行。
選出的變異體cbh2的序列可以按照已知的重組技術(shù)插入到合適的載體中，并用于轉(zhuǎn)化能夠表達(dá)CBH2的絲狀真菌。由于遺傳密碼的固有簡并性，編碼基本上相同的或者功能上等價的氨基酸序列的其它核酸序列，可以被用來克隆和表達(dá)變體CBH2。因此，應(yīng)該理解到，編碼區(qū)域中的這種取代在本發(fā)明覆蓋的序列變異體的范圍內(nèi)?？梢砸院捅疚闹袑τ诰幋a親代CBH2的核酸序列所述的相同的方法，使用任何和所有這些序列變異體。
本發(fā)明也包括重組核酸構(gòu)建物，其包含如上所描述的一個或者多個編碼變異體CBH2的核酸序列。所述構(gòu)建物包括載體，例如質(zhì)粒載體或者病毒載體，本發(fā)明的序列被插入其中，方向?yàn)檎蚧蛘叻聪颉?br> 異源核酸構(gòu)建物可以包括變異體cbh2的編碼序列，該編碼序列可以處于如下的狀態(tài)(i)處于分離狀態(tài)；(ii)與另外的編碼序列組合，例如融合蛋白或者信號肽編碼序列，其中cbh2的編碼序列是主導(dǎo)的編碼序列；(iii)與非編碼序列組合，例如內(nèi)含子和調(diào)控元件，如啟動子和終止子元件或者5’和/或3’非翻譯區(qū)，它們對編碼序列在合適宿主中的表達(dá)是有影響的；和/或(iv)在載體或者宿主環(huán)境中，其中cbh2編碼序列是異源基因。
在本發(fā)明的一個方面，應(yīng)用異源核酸構(gòu)建物，在體外將變異體CBH2的編碼核酸序列轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，已確立的絲狀真菌和酵母系是優(yōu)選的。對于變異體CBH2的長期生產(chǎn)，穩(wěn)定的表達(dá)是優(yōu)選的。遵循的原則是，可以有效地生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子的任何方法都可以被用于實(shí)施本發(fā)明。
合適的載體典型地帶有編碼選擇性標(biāo)記的核酸序列、插入位點(diǎn)和合適的控制元件，如啟動子和終止序列。載體可以包括調(diào)節(jié)序列，包括，例如，非編碼序列，如內(nèi)含子和調(diào)控元件，即，啟動子和終止元件或者5’和/或3’非翻譯區(qū)，它們對宿主細(xì)胞中(和/或在修飾的可溶性蛋白抗原編碼序列不被正常表達(dá)的載體或者宿主細(xì)胞環(huán)境中)編碼序列的表達(dá)是有影響的，并可操作性地連接于編碼序列。大量的合適載體和啟動子對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，它們中的許多可以從商業(yè)渠道獲得和/或描述于Sambrook，et al.，(見上)。
代表性的啟動子包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子，其例子包括CMV啟動子、SV-40早期啟動子、RSV啟動子和EF-1α啟動子，在tet開啟和tet關(guān)閉系統(tǒng)中含有tet應(yīng)答元件(TRE)的啟動子(ClonTech and BASF)、β-肌動蛋白啟動子和金屬硫蛋白啟動子，其可以通過加入某些金屬鹽而被上調(diào)。啟動子序列是用于表達(dá)目的而被特定的絲狀真菌識別的DNA序列。它可操作性連接于編碼變異體CBH2多肽的DNA序列。這樣的連接包括在所公開的表達(dá)載體中將啟動子相對于編碼變異體CBH2多肽的DNA序列的起始密碼子進(jìn)行定位。啟動子序列含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，其介導(dǎo)變異體CBH2多肽的表達(dá)。例子包括來自下列基因的啟動子黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或α-葡糖苷酶編碼基因；構(gòu)巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙脈孢菌cbh1或trp1基因；黑曲霉或Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶編碼基因；紅褐肉座菌(里氏木霉)cbh1、cbh2、egl1、egl2或其他纖維素酶編碼基因。
合適的選擇性標(biāo)記的選擇將取決于宿主細(xì)胞，不同宿主細(xì)胞的合適的標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的。典型的選擇性標(biāo)記基因包括argB，來自構(gòu)巢曲霉或紅褐肉座菌；amdS，來自構(gòu)巢曲霉；pyr4，來自粗糙脈孢菌或紅褐肉座菌；pyrG，來自黑曲霉或構(gòu)巢曲霉。其他的示范性選擇性標(biāo)記包括但不限于trpc、trp1、oliC31、niaD或leu2，它們可以被納入用于轉(zhuǎn)化突變菌株諸如trp-、pyr-、leu-和類似菌株的異源核酸構(gòu)建物中。
這樣的選擇性標(biāo)記賦予轉(zhuǎn)化子利用通常不被絲狀真菌代謝的代謝物的能力。例如，紅褐肉座菌的編碼乙酰胺酶的amdS基因使得轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以以乙酰胺作為氮源來生長。選擇性標(biāo)記(如pyrG)可以恢復(fù)營養(yǎng)缺陷型突變菌株在選擇性基本培養(yǎng)基中生長的能力，或者選擇性標(biāo)記(如olic31)可以賦予轉(zhuǎn)化子在抑制性藥物或抗生素存在的條件下生長的能力。
使用本領(lǐng)域中通常使用的方法，將選擇性標(biāo)記的編碼序列克隆到任何合適的質(zhì)粒中。示范性的質(zhì)粒包括pUC18、pBR322、pRAX和pUC100。pRAX質(zhì)粒包含來自構(gòu)巢曲霉的AMA1序列，這使得它能在黑曲霉中進(jìn)行復(fù)制。
除非另有指明，本發(fā)明的實(shí)踐將應(yīng)用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)，它們在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的描述。參見，例如，Sambrook et al.，1989；Freshney，Animal Cell Culture，1987；Ausubel，et al.，1993和Coligan et al.，Current Protocols in Immunology，1991。
B.用于產(chǎn)生CBH2的宿主細(xì)胞和培養(yǎng)條件(1)絲狀真菌 因此，本發(fā)明提供了絲狀真菌，其包括已經(jīng)被修飾、選擇和培養(yǎng)的細(xì)胞，所述修飾、選擇和培養(yǎng)的方式為，相對于對應(yīng)的非轉(zhuǎn)化親代真菌，有效地產(chǎn)生或表達(dá)變異體CBH2。
可以被處理和/或修飾以表達(dá)變異體CBH2的親代絲狀真菌的種系的例子包括但不限于，木霉例如里氏木霉、長枝木霉、綠色木霉、康寧木霉；青霉菌屬某種(Penicillium sp.)、腐質(zhì)霉屬某種(Humicola sp.)包括異常腐質(zhì)霉；曲霉屬某種(Aspergillus sp.)、金孢菌某種(Chrysosporium sp.)、鐮孢菌某種(Fusarium sp.)、肉座菌某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)。
將表達(dá)CBH2的細(xì)胞在典型地用于培養(yǎng)親代真菌株系的條件下培養(yǎng)。通常地，將細(xì)胞在含有生理鹽和營養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如Pourquie，J.et al.，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，eds.Aubert，J.P.et al.，AcademicPress，pp.71-86，1988和llmen，M.et al.，Appl.Environ.Microbiol.631298-1306，1997中所描述。培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的，例如，將培養(yǎng)物在28℃，在振蕩培養(yǎng)器或者發(fā)酵器中培育，直至獲得所需水平的CBH2表達(dá)。
對于給定的絲狀真菌的優(yōu)選培養(yǎng)條件可以在科學(xué)文獻(xiàn)中找到，和/或從真菌的來源處例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC；www.atcc.org)找到。真菌的生長條件被確立后，將細(xì)胞暴露于可有效引起或允許變異體CBH2表達(dá)的環(huán)境中。
當(dāng)CBH2的編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動子的調(diào)控之下時，誘導(dǎo)劑例如糖、金屬鹽或者抗生素，被加入到培養(yǎng)基，其濃度足以有效誘導(dǎo)CBH2的表達(dá)。
在一種實(shí)施方案中，菌株包括黑曲霉，該菌株是獲得過量表達(dá)的蛋白質(zhì)的有用菌株。例如，已經(jīng)知道，黑曲霉泡盛變種(A.niger var awamori)dgr246分泌數(shù)量提高的分泌型纖維素酶(Goedegebuur et al，Curr.Genet(2002)4189-98)。黑曲霉泡盛變種的其他菌株，諸如GCDAP3、GCDAP4和GAP3-4也是已知的，參見Ward等(Ward，M，Wilson，L.J.and Kodama，K.H.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.39738-743)。
在另一實(shí)施方案中，菌株包括里氏木霉，其是獲得過量表達(dá)的蛋白質(zhì)的有用菌株。例如，已經(jīng)知道，被Sheir-Neiss，et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.2046-53(1984)描述的RL-P37分泌數(shù)量提高的纖維素酶。RL-P37的功能等同物包括里氏木霉菌株RUT-C30(ATCC號56765)和菌株QM9414(ATCC號26921)。預(yù)期這些菌株在過量表達(dá)變異體CBH2方面，也是有用的。
當(dāng)希望在沒有潛在不利的天然纖維素水解活性的情況下獲得變異體CBH2時，在導(dǎo)入含有編碼變異體CBH2的DNA片段的DNA構(gòu)建物或質(zhì)粒之前，獲得一個或多個纖維素酶基因已被剔除的宿主細(xì)胞是有用的。此類菌株可以用美國專利5,246,853和WO92/06209中公開的方法制備得到，其公開內(nèi)容通過引用方式并入本文。通過在缺失一種或多種纖維素酶基因的宿主微生物中表達(dá)變異體CBH2，鑒定和隨后的純化程序可以被簡化。已經(jīng)被克隆的來自木霉屬某種的任何基因可以被剔除，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因以及編碼EGIII和/或EGV蛋白的那些基因(分別參見例如美國專利5,475,101和WO94/28117)。
基因的剔除可以這樣來完成應(yīng)用本領(lǐng)域中已知的方法，將待剔除或破壞的基因的一種形式插入質(zhì)粒。然后，將該剔除質(zhì)粒(deletion plasmid)在位于基因編碼區(qū)域內(nèi)部的合適的限制性酶切位點(diǎn)(多個)處進(jìn)行切割，并用選擇性標(biāo)記置換該基因編碼序列或者其部分。待剔除或破壞的基因的基因座的側(cè)翼DNA序列——優(yōu)選地在大約0.5至2.0kb——位于選擇性標(biāo)記基因的兩側(cè)。合適的剔除質(zhì)粒通常具有獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)，這樣的位點(diǎn)的存在使得含有包括側(cè)翼DNA序列在內(nèi)的被剔除基因和選擇性標(biāo)記基因可以作為單個線性片段被移走。
選擇性標(biāo)記的選擇必須能夠便于檢測轉(zhuǎn)化的微生物。任何在選擇的微生物中表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因是合適的。例如，對于曲霉，選擇性標(biāo)記的選擇要保證該選擇性標(biāo)記在轉(zhuǎn)化子中的存在不會明顯影響其性質(zhì)。這樣的選擇性標(biāo)記可以是編碼可測定的產(chǎn)物的基因。例如，一種曲霉基因的功能拷貝可以被使用，如果在宿主菌株中缺少該基因拷貝，則會導(dǎo)致宿主菌株表現(xiàn)出營養(yǎng)缺陷型表型。類似地，對于木霉屬某種，同樣存在選擇性標(biāo)記。
在一種實(shí)施方案中，用功能性pyrG基因轉(zhuǎn)化曲霉的pyrG-衍生株，這便提供了在轉(zhuǎn)化中有用的選擇性標(biāo)記。pyrG-衍生株可以通過對氟乳清酸(FOA)有抗性的曲霉菌株進(jìn)行選擇而獲得。pyrG基因編碼乳清苷-5’-單磷酸脫羧酶，這是生物合成尿嘧啶核苷所需的一種酶。帶有完整的pyrG基因的菌株在缺乏尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基中生長，但是對氟乳清酸敏感。通過對FOA抗性的選擇，便有可能選出缺乏功能性乳清苷單磷酸脫羧酶的pyrG-衍生株，這樣的衍生株需要尿嘧啶核苷才能生長。應(yīng)用FOA選擇技術(shù)，也可能獲得需要尿嘧啶核苷、缺乏功能性的焦磷酸核糖乳清酯轉(zhuǎn)移酶(orotate pyrophosphoribosyl transferase)的菌株。用編碼此酶的基因的功能性拷貝轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞是可能的(Berges & Barreau，Curr.Genet.19359-365(1991)和van Hartingsveldte et al.，(1986)Development of a homologoustransformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene.Mol.Gen.Genet.20671-75)。使用上面提及的FOA抗性技術(shù)，容易地進(jìn)行衍生菌株的選擇，因此，pyrG基因優(yōu)選用作選擇性標(biāo)記物。
在另一種實(shí)施方案中，用功能性pyr4基因轉(zhuǎn)化肉座菌屬某種(肉座菌屬某種(木霉屬某種))的pyr4-衍生株，這便提供了對于轉(zhuǎn)化有用的選擇性標(biāo)記。Pyr4-衍生株可以通過對抵抗氟乳清酸(FOA)的肉座菌屬(木霉屬)菌株進(jìn)行選擇而獲得。pyr4基因編碼乳清苷-5’-單磷酸脫羧酶，這是生物合成尿嘧啶核苷所需的一種酶。帶有完整的pyr4基因的菌株在缺乏尿嘧啶核苷的培養(yǎng)基中生長，但是對氟乳清酸敏感。通過對FOA抗性的選擇，便有可能選出缺乏功能性乳清苷單磷酸脫羧酶的pyr4-衍生株，這樣的衍生株需要尿嘧啶核苷才能生長。應(yīng)用FOA選擇技術(shù)，也可能獲得需要尿嘧啶核苷、缺乏功能性的焦磷酸核糖乳清酯轉(zhuǎn)移酶(orotatepyrophosphoribosyl transferase)的菌株。用編碼此酶的基因的功能性拷貝轉(zhuǎn)化這些細(xì)胞是可能的(Berges & Barreau，1991)。使用上面提及的FOA抗性技術(shù)，容易地進(jìn)行衍生菌株的選擇，因此，pyr4基因優(yōu)選用作選擇性標(biāo)記物。
為了轉(zhuǎn)化pyrG-曲霉屬某種或肉座菌屬某種(木霉屬某種)，以便它不能表達(dá)一種或多種纖維素酶基因，包含被破壞或剔除的纖維素酶基因的單個DNA片段從剔除質(zhì)粒中分離出來，并用于轉(zhuǎn)化合適的pyr-曲霉或pyr-木霉宿主。然后基于它們分別表達(dá)pyrG或pyr4基因產(chǎn)物和改變宿主菌株尿苷營養(yǎng)缺陷型的能力，鑒定和選擇轉(zhuǎn)化子。然后對所獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA印跡分析，以鑒定和確認(rèn)雙交換整合(double crossover integration)事件的發(fā)生，在該事件中合適的pyr選擇性標(biāo)記替換了待剔除的基因的基因組拷貝的部分或所有的編碼區(qū)域。
盡管上面描述的特定質(zhì)粒載體是涉及pyr-轉(zhuǎn)化子的制備，但本發(fā)明不限于這些載體。應(yīng)用上面的技術(shù)，可以對曲霉某種或肉座菌屬某種(木霉屬某種)的菌株中的各種基因進(jìn)行剔除和替換。此外，如上面所討論，可以使用任何可利用的選擇性標(biāo)記。事實(shí)上，應(yīng)用上面描述的策略，可以將已被克隆和鑒定的任何宿主例如曲霉屬某種或肉座菌屬某種的基因從基因組中剔除。
如上所述，所使用的宿主菌株可以是肉座菌屬某種(木霉屬某種)的衍生菌株，其缺少或者具有與所選的選擇性標(biāo)記相對應(yīng)的一種或多種非功能基因。例如，如果選擇用于曲酶屬某種的pyrG選擇性標(biāo)記，那么特定的pyrG-衍生菌株在轉(zhuǎn)化程序中用作接受體。此外，例如，如果選擇pyr4選擇性標(biāo)記用于肉座菌屬某種，那么特定的pyr4-衍生菌株在轉(zhuǎn)化程序中用作接受體。類似地，也可使用包括肉座菌屬某種(木霉屬某種)基因的選擇性標(biāo)記，該基因等同于構(gòu)巢曲霉基因amdS、argB、trpC、niaD。相應(yīng)的接受體菌株因此必須是衍生菌株，諸如分別是argB-、trpC-、niaD-。
然后，編碼CBH2變異體的DNA被制備，用于插入到合適的微生物中。根據(jù)本發(fā)明，編碼CBH2變異體的DNA包括編碼具有功能性纖維水解活性的蛋白所必需的DNA。編碼CBH2變異體的DNA片段可以功能性地連接于真菌啟動子序列，例如，在曲酶屬中的glaA基因的啟動子或在木霉屬中的cbh1或egl1基因的啟動子。
也考慮到，編碼CBH2變異體的DNA的多于一個的拷貝可以被再組合到菌株中以幫助過量表達(dá)。編碼CBH2變異體的DNA可以通過攜帶編碼變異體的DNA的表達(dá)載體的構(gòu)建而制備。攜帶編碼所需纖維素酶的插入DNA片段的表達(dá)載體，可以是能夠在特定宿主生物體中自我復(fù)制或者能夠整合入宿主DNA的任何載體，典型地為質(zhì)粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于獲得基因的表達(dá)的兩類表達(dá)載體被考慮。第一類含有DNA序列，其中啟動子、基因編碼區(qū)域和終止子序列均起源于將要被表達(dá)的基因。如果需要的話，可以通過刪除不需要的DNA序列(例如，編碼不需要的結(jié)構(gòu)域的DNA序列)，以留下將要表達(dá)的結(jié)構(gòu)域使其處于它自己的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列的控制之下，由此獲得截短的基因。選擇性標(biāo)記物也可以被包含在載體中，以便整合到宿主中的多個拷貝的新基因序列得以選擇。
第二類表達(dá)載體是預(yù)先裝配的，并且含有高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列和選擇性標(biāo)記。已預(yù)期到，基因的編碼區(qū)域或其一部分可以被插入到這種通用的表達(dá)載體中，這樣，它便處于表達(dá)序列盒啟動子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。
例如，在曲酶屬中，pRAX是這樣的一種通用表達(dá)載體?；蚧蛘咂湟徊糠挚梢员徊迦氲絞laA強(qiáng)啟動子的下游。
例如，在肉座菌屬中，pTEX是這樣的一種通用表達(dá)載體?；蚧蛘咂湟徊糠挚梢员徊迦氲絚bh1強(qiáng)啟動子的下游。
在該載體中，編碼本發(fā)明的變異體CBH2的DNA序列可以被可操作性連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯序列，即，合適的啟動子序列和處于結(jié)構(gòu)基因的閱讀框架中的信號序列。啟動子可以是在宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可以是來自編碼與宿主細(xì)胞同源或者異源的蛋白的基因?？扇芜x的信號肽可用來使變異體CBH2在細(xì)胞外產(chǎn)生。編碼信號肽的DNA優(yōu)選是，與所要表達(dá)的基因有天然聯(lián)系的DNA，然而，來自任何合適來源的信號序列，例如來自木霉屬的外切纖維二糖水解酶或內(nèi)切葡聚糖酶，均在本發(fā)明的考慮中。
用于連接編碼本發(fā)明的變異體CBH2的DNA序列和啟動子、并插入合適的載體中的方法，在本領(lǐng)域中是已知的。
根據(jù)已知的技術(shù)例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、生物彈道轟擊(biolisticbombardment)和類似技術(shù)，可以將上面描述的DNA載體或者構(gòu)建物導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。
在優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)中，必須考慮到，透過細(xì)胞壁到肉座菌屬某種(木霉屬某種)的DNA是非常低。因此，期望的DNA序列、基因或基因片段的攝取頂多為最少量。存在許多方法來在轉(zhuǎn)化過程之前增加衍生株(即，缺乏相應(yīng)于所使用的選擇標(biāo)記的功能基因)中肉座菌屬某種(木霉屬某種)細(xì)胞壁的滲透性。
本發(fā)明中制備用于轉(zhuǎn)化的曲霉屬某種或肉座菌屬某種(木霉屬某種)的優(yōu)選方法，包括由真菌菌絲體制備原生質(zhì)體。參見，Campbell et al.Improvedtransformation efficiency of A.niger using homologous niaD gene for nitrate reductase.Curr.Genet.1653-56；1989。菌絲體可以從出芽的營養(yǎng)孢子獲得。用消化細(xì)胞壁的酶處理菌絲體，得到原生質(zhì)體。然后，通過在懸浮培養(yǎng)基中加入滲壓穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體得以被保護(hù)。這些穩(wěn)定劑包括山梨糖醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和類似物。通常地，這些穩(wěn)定劑的濃度在0.8M到1.2M之間變化。優(yōu)選地在懸浮培養(yǎng)液中應(yīng)用大約1.2M的山梨醇溶液。
宿主菌株(曲霉屬某種或肉座菌屬某種(木霉屬某種))對DNA的攝取，依賴于鈣離了濃度。通常大約10mM CaCl2至50mM CaCl2之間的CaCl2被應(yīng)用于攝取溶液中。在該攝取溶液中，除了對鈣離子的需求之外，通常被納入的其它物質(zhì)是緩沖系統(tǒng)如TE緩沖液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或者10mM MOPS，pH 6.0緩沖液(嗎啉代丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇的作用被認(rèn)為是融合細(xì)胞膜，從而使培養(yǎng)基的成分傳送到宿主細(xì)胞——作為例子，曲酶屬某種或肉座菌屬某種的菌株——的胞漿，并且質(zhì)粒DNA被傳送至核。該融合常常使得多拷貝的質(zhì)粒DNA整合入宿主染色體。
通常地，在轉(zhuǎn)化中使用含有曲霉屬某種的原生質(zhì)體或者細(xì)胞的懸浮液，所述的原生質(zhì)體或者細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷過滲透性處理，密度為105至106/mL，優(yōu)選2×105/mL。類似地，在轉(zhuǎn)化中使用含有肉座菌屬某種(木霉屬某種)的原生質(zhì)體或者細(xì)胞的懸浮液，所述的原生質(zhì)體或者細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷過滲透性處理，密度為108至109/mL，優(yōu)選2×108/mL。體積為100μl的含有這些原生質(zhì)體或者細(xì)胞的合適溶液(例如，1.2M山梨醇；50mM CaCl2)與所需DNA混合。通常地，高濃度的PEG被加入到攝取溶液。0.1至1倍體積的25％PEG 4000可以被加入到原生質(zhì)體懸浮液。然而，優(yōu)選地向原生質(zhì)體懸浮液中加入大約0.25個體積。添加劑如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀和類似物質(zhì)，也可以被加入到該攝取溶液，并協(xié)助轉(zhuǎn)化。
通常地，然后在大約0℃溫育該混合物，持續(xù)10至30分鐘。之后，將另外的PEG加入該混合物，以進(jìn)一步增強(qiáng)所需基因或DNA序列的攝取。通常地，將25％PEG4000以等同于轉(zhuǎn)化混合物的體積的5至15倍的體積加入；然而，更大或者更小的體積可以是適合的。25％PEG4000的體積優(yōu)選是轉(zhuǎn)化混合物體積的大約10倍。將PEG加入之后，在加入山梨醇和CaCl2溶液之前，將轉(zhuǎn)化混合物在室溫或者冰上溫育。然后，將原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)一步加入到生長培養(yǎng)基的熔化等份試樣中。此生長培養(yǎng)基僅允許轉(zhuǎn)化子生長。適于培養(yǎng)所需的轉(zhuǎn)化子的任何生長培養(yǎng)基可以被用于本發(fā)明。然而，如果正在選擇的是Pyr+轉(zhuǎn)化子，則優(yōu)選地使用不含有尿嘧啶核苷的生長培養(yǎng)基。隨后獲得的克隆被轉(zhuǎn)移到剔除尿苷的生長培養(yǎng)基中，并被純化。
在此階段，可以將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子與不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子區(qū)分開來，前者具有更快的生長速度，并且例如在木霉屬中，在缺乏尿苷的固體培養(yǎng)基上所形成的環(huán)狀克隆具有平滑的而非粗糙的輪廓。此外，在一些情形下，可以對穩(wěn)定性作進(jìn)一步的測試，這通過在非選擇性固體培養(yǎng)基(即，含有尿嘧啶核苷)上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子、從該培養(yǎng)基中收獲孢子并測定這些孢子隨后在缺乏尿嘧啶核苷的選擇性培養(yǎng)基中出芽并生長的百分?jǐn)?shù)來完成。
在上述方法的具體實(shí)施方案中，作為CBH2變體合適的翻譯后加工的結(jié)果，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)之后，從宿主細(xì)胞中回收活性形式的CBH2變異體(一種或多種)。
(ii)酵母 本發(fā)明也考慮了將酵母細(xì)胞用作用于CBH2生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。編碼水解酶的幾個其它的基因已經(jīng)被在釀酒酵母的各種菌株中表達(dá)。這些包括編碼來自里氏木霉的兩種內(nèi)切葡聚糖酶(Penttila et al.，Yeast vol.3，pp 175-185，1987)、兩種纖維二糖水解酶(Penttila et al.，Gene，63103-112，1988)和一種β-葡糖苷酶(Cummingsand Fowler，Curr.Genet.29227-233，1996)的序列，編碼來自出芽短梗霉(Aureobasidlium pullulans)的木聚糖酶的序列(Li and Ljungdahl，Appl.Environ.Microbiol.62，no.1，pp.209-213，1996)，編碼來自小麥的α-淀粉酶的序列(Rothsteinet al.，Gene 55353-356，1987)，等等。此外，編碼溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)[β]-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶(END1)、黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)纖維二糖水解酶(CBH1)、生黃瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)纖維糊精酶(CEL1)和Endomyces fibrilizer纖維二糖酶(Bgl1)的纖維素酶基因序列盒在釀酒酵母的實(shí)驗(yàn)室菌株中被成功表達(dá)(Van Rensburg et al.，Yeast，vol.14，pp.67-76，1998)。
C.將編碼CBH2的核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞 本發(fā)明進(jìn)一步提供了細(xì)胞和細(xì)胞組合物，其已經(jīng)經(jīng)過遺傳修飾而含有外源提供的編碼變體CBH2的核酸序列。親代細(xì)胞或細(xì)胞系可以利用克隆載體或表達(dá)載體來進(jìn)行遺傳修飾(即，被轉(zhuǎn)導(dǎo)、被轉(zhuǎn)化或者被轉(zhuǎn)染)。載體可以是，例如，質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等的形式，如上面描述的。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)化載體的全部或者部分被穩(wěn)定地整合到絲狀真菌的基因組中。然而，轉(zhuǎn)化也可以導(dǎo)致自我復(fù)制的染色體外轉(zhuǎn)化載體的維持，這也被本發(fā)明預(yù)期。
許多標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法可以被用來產(chǎn)生表達(dá)大量異源蛋白的里氏木霉細(xì)胞系。用于將DNA構(gòu)建物導(dǎo)入木霉的產(chǎn)纖維素酶菌株的一些已公開的方法包括，Lorito，Hayes，DiPietro and Harman，1993，Curr.Genet.24349-356；Goldman，VanMontagu and Herrera-Estrella，1990，Curr.Genet.17169-174；Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen and Knowles，1987，Gene 6155-164，對于曲霉菌，Yelton，Hamerand Timberlake，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811470-1474，對于鐮刀菌，Bajar，Podila and Kolattukudy，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888202-8212，對于鏈霉菌，Hopwood et al.，1985，The John Innes Foundation，Norwich，UK，以及對于芽孢桿菌，Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi and Matteuzzi，1990，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.55135-138。
將異源核酸構(gòu)建物(表達(dá)載體)引入絲狀真菌(例如，紅褐肉座菌)中的其它方法包括但不限于顆?；蚧驑尩氖褂?、在轉(zhuǎn)化過程之前絲狀真菌細(xì)胞的滲透化處理(例如，利用高濃度堿例如0.05M到04M CaCl2或乙酸鋰)、原生質(zhì)體融合或土囊桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。通過用聚乙二醇和CaCl2處理原生質(zhì)體或原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化絲狀真菌的示例性方法被描述于Campbell，E.I.et al.，Curr.Genet.1653-56，1989和Penttila，M.et al.，Gene，6311-22，1988。
用于將外源核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何已知的方法都可以被應(yīng)用。這些方法包括應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、凝聚胺法(polybrene)、原生質(zhì)體融合、電穿孔、生物彈射、脂質(zhì)體、微注射、等離子體載體、病毒載體和用于將克隆的基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其它外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何其它已知的方法(參見，例如，Sambrook et al.，supra)。也可以應(yīng)用美國專利6,255,115中描述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法。這里的要求僅是所使用的具體遺傳工程方法能夠成功地將至少1個基因?qū)肽軌虮磉_(dá)該異源基因的宿主細(xì)胞。
此外，含有編碼變體CBH2的核酸序列的異源核酸構(gòu)建物可以在體外被轉(zhuǎn)錄，得到的RNA通過已知的方法被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，例如，通過注射。
本發(fā)明進(jìn)一步包括新的和有用的絲狀真菌轉(zhuǎn)化子，例如紅褐肉座菌和黑曲霉轉(zhuǎn)化子，它們可用于生產(chǎn)真菌纖維素酶組合物。本發(fā)明包括絲狀真菌的轉(zhuǎn)化子，特別是包含編碼變體CBH2的序列或者剔除了內(nèi)源性cbh編碼序列的真菌。
在導(dǎo)入包含所述變體cbh2的編碼序列的異源核酸構(gòu)建物之后，可以在被改性成適合活化啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼變體CBH2的核酸序列表達(dá)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該遺傳修飾的細(xì)胞。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH和類似條件，是以前用于所選擇的用來表達(dá)的宿主細(xì)胞的那些條件，并且對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是明顯的。
已經(jīng)導(dǎo)入此類異源核酸構(gòu)建物的子代細(xì)胞通常被認(rèn)為包含在所述異源核酸構(gòu)建物中發(fā)現(xiàn)的編碼變體CBH2的核酸序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包括新的和有用的絲狀真菌轉(zhuǎn)化子，所述絲狀真菌例如用于產(chǎn)生真菌纖維素酶組合物的紅褐肉座菌。黑曲酶也可以用于產(chǎn)生變體CBH2。本發(fā)明包括絲狀真菌的轉(zhuǎn)化子，尤其是包含變體cbh2編碼序列或內(nèi)源性cbh2編碼序列缺失的真菌的轉(zhuǎn)化子。
絲狀真菌的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子通?？梢耘c不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子區(qū)分開來，前者具有更快的生長速度，并且例如在木霉屬中，在固體培養(yǎng)基上所形成的環(huán)狀克隆具有平滑的而非粗糙的輪廓。此外，在一些情形下，可以對穩(wěn)定性作進(jìn)一步的測試，這通過在非選擇性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子、從該培養(yǎng)基中收獲孢子，并測定這些孢子隨后在選擇性培養(yǎng)基中出芽并生長的百分?jǐn)?shù)來完成。
VII.對CBH2核酸編碼序列和/或蛋白表達(dá)的分析 在用編碼變體CBH2的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)化細(xì)胞系之后，為了評價該細(xì)胞系對變體CBH2的表達(dá)，可以在蛋白水平、RNA水平進(jìn)行分析，或者應(yīng)用特異于纖維二糖水解酶活性和/或產(chǎn)生的功能性生物分析進(jìn)行分析。
在本文描述的變體CBH2核酸和蛋白序列的一個代表性應(yīng)用中，絲狀真菌例如里氏木霉的遺傳修飾菌株，被加以改造以產(chǎn)生增加量的CBH2。這樣的遺傳修飾的絲狀真菌對產(chǎn)生纖維水解能力大大增強(qiáng)的纖維素酶產(chǎn)物是有用的。在一種方法中，這是通過將cbh2的編碼序列導(dǎo)入合適的宿主來完成的，合適的宿主例如絲狀真菌，如黑曲霉。
因此，本發(fā)明包括用于在絲狀真菌或者其它合適的宿主中表達(dá)變體CBH2的方法，這可以通過將含有編碼變體CBH2的DNA序列的表達(dá)載體導(dǎo)入絲狀真菌或者其它合適的宿主的細(xì)胞中來實(shí)現(xiàn)。
在另一個方面，本發(fā)明包括用于修飾CBH2在絲狀真菌或者其它合適的宿主中的表達(dá)的方法。這樣的修飾包括，降低或者消除內(nèi)源性CBH2的表達(dá)。
一般地，用來分析變體CBH2的表達(dá)的試驗(yàn)包括，RNA印跡(Northernblotting)、斑點(diǎn)印跡(DNA或者RNA分析)、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或者原位雜交，應(yīng)用被恰當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)和傳統(tǒng)的DNA印跡(Southern blotting)和放射自顯影。
此外，可以在樣品中直接測定變體CBH2的產(chǎn)生和/或表達(dá)，例如，分析纖維二糖水解酶活性、表達(dá)和/或產(chǎn)生。這樣的試驗(yàn)描述于，例如Karlsson，J.et al.(2001)，Eur.J.Biochem，268，6498-6507，Wood，T.(1988)，Methods in Enzymology，Vol.160.Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose(Wood，W.& Kellog，S.Eds.)，pp.19-25，Academic Press，San Diego，CA，USA)中，以及對于PAHBAH試驗(yàn)，被描述于(Lever，M.(1972)Analytical Biochemistry，47，273，Blakeney，A.B.& Mutton，L.L.(1980)Journal of Science of Food and Agriculture，31，889，Henry，RJ.(1984)Journalof the Institute of Brewing，90，37中。用于分析纖維二糖水解酶活性、內(nèi)切葡聚糖酶活性或者β-葡糖苷酶活性的有用底物包括，晶體狀纖維素、纖維紙、磷酸溶脹纖維素(phosphoric acid swollen cellulose)、纖維寡糖、甲基傘形酯乳糖苷(methylumbelliferyl lactoside)、甲基傘形酯纖維二糖苷(methylumbelliferylcellobioside)、鄰硝基苯基乳糖苷(orthonitrophenyl lactoside)、對硝基苯基乳糖苷(paranitrophenyl lactoside)、鄰硝基苯基纖維二糖苷(orthonitrophenylcellobioside)、對硝基苯基纖維二糖苷(paranitrophenyl cellobioside)。
此外，蛋白表達(dá)，可以通過免疫學(xué)方法來加以評價，例如細(xì)胞、組織切片的免疫組織化學(xué)染色或者組織培養(yǎng)基的免疫測定分析，如，蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)或者ELISA。這樣的免疫分析可以被用于定性和定量地評價CBH2變體的表達(dá)。這些方法的細(xì)節(jié)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，用于實(shí)踐這些方法的許多試劑是商業(yè)渠道可獲得的。
所需CBH2變體的純化形式可以被用于產(chǎn)生特異于該被表達(dá)的蛋白的單克隆或者多克隆抗體，它們可以用于各種免疫分析。(參見，例如，Hu et al.，Mol CellBiol，vol.11，no.11，pp.5792-5799，1991)。代表性的分析包括ELISA、競爭性免疫測定、放射免疫測定、蛋白質(zhì)印跡、間接免疫熒光測定和類似的方法?？傊ㄟ^商業(yè)渠道獲得的抗體和/或試劑盒可以被用于纖維二糖水解酶蛋白的表達(dá)水平的定量免疫測定。
VIII.重組CBH2蛋白的分離和純化 一般地，在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的變體CBH2蛋白被分泌入培養(yǎng)基，并且可以被純化或分離，例如，將細(xì)胞培養(yǎng)基中不需要的成分除去。然而，在一些情形下，變體CBH2蛋白可以以細(xì)胞內(nèi)的形式產(chǎn)生，這就使得必須從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回收。在這樣的情形下，應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)應(yīng)用的技術(shù)，將變體CBH2蛋白從產(chǎn)生它的細(xì)胞中純化出來。例子包括但不限于，親和層析(Tilbeurgh et al.，F(xiàn)EBS Lett.16215，1984)、離子交換層析方法(Goyal et al.，Bioresource Technol.3637-50，1991；Fliess et al.，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17314-318，1983；Bhikhabhai et al.，J.Appl.Biochem.6336-345，1984；Ellouz et al，J.Chromatography396307-317，1987)，包括應(yīng)用了具有高分辨能力的材料的離子交換層析(Medve etal.，J.Chromatography A 808153-165，1998)、疏水作用層析(Tomaz and Queiroz，J.Chromatography A 865123-128，1999)和兩相分配(two-phase partitioning)(Brumbauer，et al.，Bioseparation 7287-295，1999)。
典型地，變體CBH2蛋白被分級，以分離出具有選擇的性質(zhì)的蛋白，所述的性質(zhì)例如對特定的結(jié)合試劑如抗體或受體的結(jié)合親和性；或者具有選擇的分子量范圍或等電點(diǎn)范圍。
一旦實(shí)現(xiàn)了給定變體CBH2蛋白的表達(dá)，由此產(chǎn)生的變體CBH2蛋白從細(xì)胞或者細(xì)胞培養(yǎng)物中純化出來。適于這樣的純化的代表性方法包括抗體-親和柱層析、離子交換層析；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅上或在陽離子交換樹脂如DEAE上進(jìn)行的層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸氨沉淀；以及應(yīng)用例如Sephadex G-75的凝膠過濾?？梢詰?yīng)用各種蛋白純化方法，這些方法在本領(lǐng)域中是已知的，在例如Deutscher，Methods in Enzymology，vol.182，no.57，pp.779，1990；Scopes，Methods Enzymol.90479-91，1982中有描述。所選擇的純化步驟將取決于，例如，所使用的生產(chǎn)工藝的性質(zhì)和所產(chǎn)生的具體蛋白。
IX.Cbh2和CBH2的效用 應(yīng)該了解，變體cbh核酸、變體CBH2蛋白和含有變體CBH2蛋白活性的組合物，在廣泛的各種用途中具有應(yīng)用價值，下面描述了其中的一些。
含有變化量的BG型、EG型和變體CBH型纖維素酶的新的和改進(jìn)的纖維素酶組合物在洗滌劑組合物中是有用的，其表現(xiàn)出增強(qiáng)的清洗能力、充當(dāng)柔軟劑和/或改善棉織物的手感(例如，“石洗”或者“生物拋光”)，它們還可以用在將木漿降解為糖的組合物中(例如，用于生物乙醇生產(chǎn))，和/或用在飼料組合物中。對每種類型的纖維素酶的分離和表征使得能夠控制這樣的組合物的各個方面。
發(fā)現(xiàn)具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的變體(或突變)CBHs在所有上述領(lǐng)域中是有用的，原因在于它們在升高的溫度下保持活性的能力。
具有降低的熱穩(wěn)定性的變體(或突變)CBHs在某些情況中是有用的，例如，需要該酶的活性在較低溫度時便被中和，以便可能存在的其它酶不受影響。此外，酶可以在纖維質(zhì)的限制性轉(zhuǎn)變中起作用，例如，可以用于控制結(jié)晶程度和纖維素鏈長度。在達(dá)到所需的轉(zhuǎn)變程度之后，糖化過程的溫度可以升至該去穩(wěn)定化的CBH的存活溫度以上。由于CBH2活性對于晶體狀纖維素的水解是必需的，所以晶體狀纖維素的轉(zhuǎn)變在升高的溫度下會停止。
在一種方法中，本發(fā)明的纖維素酶用于洗滌劑組合物或者織物的處理，以改善手感和外觀。
由于纖維素產(chǎn)品的水解速率可以通過使用具有至少一個額外拷貝的、插入基因組的cbh基因的轉(zhuǎn)化子來增加，所以含有纖維素或者雜多糖的產(chǎn)品可以以更快的速度和更大的程度被降解。在垃圾中由纖維素制成的產(chǎn)品如紙、棉布、纖維質(zhì)尿布和類似物可以被更有效的降解。因此，從多個轉(zhuǎn)化子或者單獨(dú)的轉(zhuǎn)化子獲得的發(fā)酵產(chǎn)物可以被用于組合物中，以通過液化的方法來幫助降解加入在過度擁擠的填埋垃圾中的各種纖維素產(chǎn)品。
分開進(jìn)行的糖化和發(fā)酵過程可以用來將存在于生物物質(zhì)例如玉米秸稈中的纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，隨后酵母菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖肌Ｍ瑫r進(jìn)行的糖化和發(fā)酵過程可以將存在于生物物質(zhì)例如玉米秸稈中的纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?，同時在同一反應(yīng)器中，酵母菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖?。因此，在另一種方法中，本發(fā)明的變體CBH型纖維素酶可以在將生物物質(zhì)降解為乙醇的過程中起作用。利用可容易地獲得的纖維素來源進(jìn)行乙醇生產(chǎn)，提供了穩(wěn)定的、可更新的燃料資源。
基于纖維素的供給料由農(nóng)業(yè)廢物、草和木材和其它低價值的生物物質(zhì)如城市廢物(例如，回收紙、院落修剪物等等)組成。乙醇可以通過對任何這些纖維素質(zhì)供給料進(jìn)行發(fā)酵而產(chǎn)生。然而，在轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖贾?，纖維素必須首先轉(zhuǎn)變?yōu)樘恰?br> 各種不同的供給料可以與本發(fā)明的變體CBH聯(lián)合應(yīng)用，具體選擇哪一種可能取決于實(shí)施轉(zhuǎn)變過程的地區(qū)。例如，在美國中西部，農(nóng)業(yè)廢物如麥桿、玉米莖和甘蔗渣可能是主要的，而在加利福尼亞，稻桿可能是主要的。然而，應(yīng)該理解，任何可獲得的纖維素質(zhì)生物物質(zhì)可以被用于任何地區(qū)。
含有增加數(shù)量的纖維二糖水解酶的纖維素酶組合物，在乙醇生產(chǎn)中有用。由該方法獲得的乙醇可以進(jìn)一步用作辛烷助劑或者直接作為替代汽油的燃料，這是有優(yōu)勢的，因?yàn)橐掖甲鳛槿剂蟻碓矗仁脱苌a(chǎn)品更加環(huán)保。已知知道，乙醇的應(yīng)用會改善空氣質(zhì)量，并且可能降低局部臭氧水平和煙霧。而且，乙醇替代汽油的應(yīng)用在緩沖由不可再生能源和石油化學(xué)品供應(yīng)的突然變化造成的影響方面，具有戰(zhàn)略上的重要性。
利用纖維素質(zhì)生物物質(zhì)例如樹、草本植物、城市固體廢物和農(nóng)業(yè)殘留物及林業(yè)殘留物的糖化和發(fā)酵過程可以產(chǎn)生乙醇。然而，由微生物產(chǎn)生的天然發(fā)生的纖維素酶混合物中各纖維素酶的比例對于生物物質(zhì)中的纖維素至葡萄糖的快速轉(zhuǎn)變，可能不是最有效的。已知，內(nèi)切葡聚糖酶的作用是，生成新的纖維素鏈末端，而這樣的末端本身又是纖維二糖水解酶的作用底物，由此可以改善整個纖維素酶系統(tǒng)的水解效率。因此，應(yīng)用增加的和優(yōu)化的纖維二糖水解酶活性，可以大大提高乙醇的產(chǎn)量。
因此，本發(fā)明的纖維二糖水解酶可以用于將纖維素水解為其糖組分。在一種實(shí)施方案中，在加入發(fā)酵生物之前，將變體纖維二糖水解酶加入到生物物質(zhì)中。在第二種實(shí)施方案中，變體纖維二糖水解酶與發(fā)酵生物體同時被加到生物物質(zhì)中。可任選地，在每種實(shí)施方案中，可以存在其它的纖維素酶成分。
在另一種實(shí)施方案中，纖維素質(zhì)的供給料可以被預(yù)處理。預(yù)處理可以是通過升高溫度和加入稀酸、濃酸或者稀堿溶液中的任意一種。加入預(yù)處理溶液處理一段時間，使其足以至少部分地水解半纖維素成分，然后再進(jìn)行中和。
CBH2對纖維素的作用的主要產(chǎn)品是纖維二糖，其對于通過BG活性轉(zhuǎn)化成葡萄糖是可利用的(例如在真菌纖維素酶產(chǎn)物中)。或通過纖維質(zhì)生物物質(zhì)的預(yù)處理或通過對所述生物物質(zhì)的酶促作用，除了葡萄糖和纖維二糖之外，其它糖，可以通過所述生物物質(zhì)制得。所述生物物質(zhì)的半纖維素含量可以被轉(zhuǎn)化(通過半纖維素酶)成糖例如木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。因此，在生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，酶促糖化可以產(chǎn)生對于生物轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化成其它中間體或終產(chǎn)物可利用的糖。因此，除了乙醇生產(chǎn)之外，發(fā)現(xiàn)從生物物質(zhì)產(chǎn)生的糖在許多過程中有用。此類轉(zhuǎn)化的例子是葡萄糖發(fā)酵成乙醇(如在M.E.Himmel et al.pp2-45，″Fuels andChemicals from Biomass″，ACS Symposium Series 666，ed B.C.Saha and J.Woodward，1997中所綜述)以及葡萄糖向2，5-二酮-D-葡糖酸鹽(美國專利6,599,722)、乳酸(R.Datta and S-P.Tsai pp224-236，同前)、琥珀酸鹽(R.R.Gokarn，M.A.Eiteman andJ.Sridhar pp237-263，同前)、1，3-丙二醇(A-P.Zheng，H.Biebl and W-D.Deckwerpp264-279，同前)、2，3-丁二醇(CS.Gong，N.Cao and GT.Tsao pp280-293，同前)的其它生物轉(zhuǎn)化，以及木糖向木糖醇的化學(xué)和生物轉(zhuǎn)化(B.C.Saha and R.J.Bothastpp307-319，同上)。還參見例如WO98/21339。
除了纖維素酶組合物(不論纖維二糖水解酶的含量為多少，即，沒有纖維二糖水解酶、基本上沒有纖維二糖水解酶，或者具有增加的纖維二糖水解酶)，本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以使用表面活性劑，包括陰離子、非離子和兩性表面活性劑、水解酶、增潔劑、漂白劑、藍(lán)色漂白劑和熒光染料、抗結(jié)塊劑、增溶劑、陽離子表面活性劑和類似物。所有這些成分在洗滌劑領(lǐng)域中是已知的。上面描述的纖維素酶組合物可以被加入洗滌劑組合物，以液體稀釋液、顆粒、乳劑、凝膠、漿糊或者類似的任意形式加入。這些形式對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。當(dāng)使用的是固體洗滌劑組合物時，纖維素酶組合物優(yōu)選地被配制為顆粒。優(yōu)選地，配制的顆?？梢院欣w維素酶保護(hù)劑。對于更全面的討論，參見美國專利6,162,782，標(biāo)題是“Detergent compositions containing cellulase compositions deficient in CBH2 typecomponents”，在此并入作為參考。
優(yōu)選地，被使用的纖維素酶組合物相對于整個洗滌劑組合物的重量百分?jǐn)?shù)為大約0.00005至大約5。更優(yōu)選地，被使用的纖維素酶組合物相對于整個洗滌劑組合物的重量百分?jǐn)?shù)為大約0.0002至大約2。
另外，變體CBH2核酸序列可以用于鑒定和表征相關(guān)的核酸序列?？梢杂糜诖_定(預(yù)測或證實(shí))相關(guān)基因或基因產(chǎn)物的功能的眾多技術(shù)包括但不限于，(A)DNA/RNA分析，如(1)過量表達(dá)、異常表達(dá)和在其它物種中的表達(dá)；(2)基因敲除(反向遺傳學(xué)(Reverse gentics)、靶向敲除(targeted knock-out)、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS，參見Baulcombe，，100 Years of Virology，Calisher and Horzinek eds.，Springer-Verlag，New York，NY 15189-201，1999)；(3)基因甲基化狀況的分析，特別是側(cè)翼調(diào)控區(qū)域；和(4)原位雜交；(B)基因產(chǎn)物分析，諸如(1)重組蛋白表達(dá)；(2)抗血清產(chǎn)生；(3)免疫定位；(4)催化活性或其他活性的生物化學(xué)測定；(5)磷酸化作用狀況；和(6)通過酵母雙雜交分析與其他蛋白質(zhì)的相互作用；(C)通路分析，諸如基于基因過量表達(dá)的表型或與相關(guān)基因的序列同源性，將基因或基因產(chǎn)物置于特定的生物化學(xué)或信號通路中；和(D)其他分析，也可以被實(shí)施以便確定或證實(shí)分離出的基因和它的產(chǎn)物參與特定的代謝或信號通路的情況，并幫助確定基因功能。
本文所提及的所有專利、專利申請、文章和出版物被因此明確引入本文作為參考。
實(shí)施例 下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例的意圖并不在于以任何方式限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。附圖被認(rèn)為是本發(fā)明的說明書和描述的一個完整部分。所有引用的參考文獻(xiàn)在此特意地并入作為參考，用于在此描述的所有內(nèi)容。
實(shí)施例1已知Cel6A纖維素酶的比對 通過使用結(jié)構(gòu)信息和建模程序首先比對紅褐肉座菌Cel6A至八(8)家族成員，確定幾種突變的選擇。圖3顯示了衍生白異常腐質(zhì)霉(Q9C1S9)、Acremoniumcellulotyticus(093837)、雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)(P49075)、康寧肉座菌(AF315681)、黃孢原毛平革菌(S76141)、Talaromyces emersonii(Q8N1B5)、香菇(Lentinula edodes)(AF244369)、紅褐肉座菌(P07987)的CBH2分子的比對。利用Vector NTI Suite軟件程序，通過Clustal W進(jìn)行比對，其中空位罰分為10。
基于該比對，通過位點(diǎn)突變，在蛋白質(zhì)中進(jìn)行各種單個和多個氨基酸突變。通過使用共有序列，鑒定可能提高酶的熱穩(wěn)定性的可能突變。參見圖3。進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)的視覺檢測，以檢查它們與所述結(jié)構(gòu)的相容性。由于空間原因不適合CBH2分子或者接近活性位點(diǎn)的所有變化在初始突變組中被省略。
通過如本文所述比對CBH2序列，確定CBH2的共有序列。圖3的比對作為確定所謂的共有序列的基礎(chǔ)。比對的共有序列是這樣的序列其在每個位置具有這樣的氨基酸，所述氨基酸在大多數(shù)氨基酸序列中被發(fā)現(xiàn)，所述氨基酸序列被用于創(chuàng)建該比對。其中共有序列從CBH2里氏木霉氨基酸序列偏離的那些位置通過分析蛋白(PDB代碼1QK2)的3D結(jié)構(gòu)而被評價。使用計(jì)算機(jī)程序BRAGI(D.Schomburg，J.Reichelt，J.Mol.Graphics，Vol 6，16l-165(1988))，在Silicon GraphicsIndigo2 Solid Impact計(jì)算機(jī)上，進(jìn)行圖形檢測。根據(jù)3D模型，那些毫無障礙地?cái)M合到所述結(jié)構(gòu)并可能提高酶穩(wěn)定性的那些突變被選擇作為置換，以便提高紅褐肉座菌CBH2的熱穩(wěn)定性。在一些情況下，CBH2分子的3D結(jié)構(gòu)的視覺檢測使得紅褐肉座菌CBH2的非保守殘基被另一種氨基酸而不是序列比對所建議的氨基酸取代成為必須。糖基化位置——其基于該比對而被研究，為S109和N310。這些位置不變。在位置V94，纈氨酸被谷氨酸殘基取代，因?yàn)樗赡芊€(wěn)定與位置213和/或237上的一個或兩個精氨酸的電荷相互作用。在位置T142，我們決定引入脯氨酸，根據(jù)序列比對其可能適合。該氨基酸在許多比對的序列上被發(fā)現(xiàn)，并可以穩(wěn)定化，原因在于脯氨酸的熵效應(yīng)。在位置L179，我們決定檢測引入丙氨酸的效應(yīng)，其是在該比對中，在CBH2中唯一可選的氨基酸。在位置Q204，我們決定用谷氨酸殘基，而不是共有序列中所建議的丙氨酸取代谷氨酰胺，因?yàn)樵摫彼岬囊肟赡芷茐氖杷诵闹械挠欣嗷プ饔茫ㄟ^電荷由Q到E突變的引入應(yīng)該能改善該分子表面上的電荷網(wǎng)絡(luò)。我們用亮氨酸取代V206，因?yàn)樵谑杷诵闹械倪m合度似乎優(yōu)于擬合異亮氨酸。在V250的情況下，由于空間限制原因，我們決定用亮氨酸，而不是用稍微更大的異亮氨酸取代它。在位置N285，我們通過用谷氨酰胺取代天冬酰胺研究了側(cè)鏈長度對穩(wěn)定性的影響。在位置S291，我們決定檢測引入甘氨酸的影響，其是在該比對中，在CBH2中唯一可選的氨基酸。在位置S316，我們決定檢測引入脯氨酸的影響，其是在該比對中，在CBH2中唯一可選的氨基酸。在位置S343，我們決定引入脯氨酸，原因在于其對骨架的穩(wěn)定效應(yīng)以及這樣的事實(shí)該氨基酸是在該比對中在該位置頻率最高的一個。在位置T349，蘇氨酸被亮氨酸，而不是共有序列所建議的纈氨酸取代。在位置S413，我們決定通過用酪氨酸取代絲氨酸檢測在該位置芳族殘基對穩(wěn)定性的影響。
實(shí)施例2cbh2構(gòu)建物的制備 在圖2中所描述的CBH2的cDNA序列作為擴(kuò)增該基因的模板。它還作為引入突變的模板。
下面的DNA引物被構(gòu)建，以用在從分離自各種微生物的基因組DNA中擴(kuò)增突變體cbh2基因。本文中所使用的蛋白質(zhì)和DNA序列的所有符號對應(yīng)于IUPACIUB Biochemical Nomenclature Commission(生物化學(xué)命名委員會)代碼。
基于來自里氏木霉的cbh2序列，開發(fā)出同源5′(FRG361)和3′(FRG362)引物。兩種引物在引物的5′端都包含Invitrogen的Gateway克隆序列。引物361含有attB1序列，而引物FRG362含有attB2序列。
無attB1的FRG361序列
ATGATTGTCGGCATTCTCAC(這起始該基因的5′端，所述基因編碼紅褐肉座菌CBH2的信號序列)(SEQ ID NO3)無attB2的FRG362序列TTACAGGAACGATGGGTTTGCG(這起始該基因的3′端，所述基因編碼紅褐肉座菌CBH2的催化結(jié)構(gòu)域)(SEQ ID NO4) 紅褐肉座菌cbh2的cDNA作為模板。所使用的cDNA來源于如Pamela K.Foreman et al，Journal of Biological Chemistry Vol 278 No 342003 page 31989所述制備的cDNA文庫。利用下面的引物，用特異的CBH2催化域探針篩選該文庫表1
PCR條件如下10μL 10×反應(yīng)緩沖液(10×反應(yīng)緩沖液，包含100mM Tris HCl，pH8-8.5；250nM KCl；50mM(NH4)2SO4；20mM MgSO4)；dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0.2mM(終濃度)，1μL 100ng/μL基因組DNA，0.5μL 1單位/μL的PWO聚合酶(Boehringer Mannheim，Cat#1644-947)，0.2μM每種引物FRG361和FRG362(終濃度)，4μl DMSO，以及加水到100μL。
e 通過瓊脂糖凝膠，使用Qiagen Gel Extaction KIT，純化編碼所述變體的片段。利用Invitrogen的GatewayTMTechnology指導(dǎo)手冊(版本C)——因此被引入本文作為參考，純化的片段被用于進(jìn)行與Invitrogen的pDONRTM201載體的克隆酶反應(yīng)。因此制備的pENTRYCBH2克隆在圖4中給出。
在紅褐肉座菌CBH2的各個位點(diǎn)可能與所述變體的熱穩(wěn)定性有關(guān)，并且紅褐肉座菌cbh2基因因此經(jīng)受使用如下所述的引物和反應(yīng)試劑的突變。
每一反應(yīng)(單位點(diǎn)突變、隨機(jī)突變、區(qū)域突變或組合)的循環(huán)參數(shù)是相同的表2
如下所述分離和表征擴(kuò)增產(chǎn)物(參見實(shí)施例3-6)。
然后，將具有正確序列的基因(變體或野生型)從該ENTRY載體轉(zhuǎn)移到目標(biāo)載體(pRAXdes2)，以獲得表達(dá)載體pRAXdesCBH2。
用含有編碼CBH2纖維素酶變體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。根據(jù)Cao et al(Cao Q-N，Stubbs M，Ngo KQP，Ward M，Cunningham A，Pai EF，Tu G-C and HofmannT(2000)Penicillopepsin-JT2 a recombinant enzyme from Penicillium janthinellum andcontribution of a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science 9991-1001)所述的方法，該構(gòu)建物被轉(zhuǎn)化進(jìn)黑曲霉泡盛變種。
實(shí)施例3定點(diǎn)突變(Site Directed Mutagenesis) 基于實(shí)施例1所描述的基本原理，用下面的5’磷酸化引物制備定點(diǎn)CBH2突變體，該5’磷酸化引物通過使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)開發(fā)和合成表3單定點(diǎn)突變體的引物


編碼突變的密碼子加下劃線并以粗體表示。
為開發(fā)定點(diǎn)突變體，QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA；Cat#200513)被使用。
使用下面的反應(yīng)試劑，進(jìn)行突變反應(yīng)。
表4
擴(kuò)增產(chǎn)物被回收(從引物、核苷酸、酶、礦物油、鹽和其它雜質(zhì)純化)，并用Dpn1消化。一微升Dpn1(10U/μl)被加到PCR混合物中并在37℃下溫育90分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒(250)(Qiagen，Cat.No.28106)，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。洗脫體積為35μl洗脫緩沖液。
為除去雙鏈未突變的DNA，用Dpn1限制性酶消化洗脫的樣品第二時間。1μl Invitrogen的Dpn1(Cat.No.15242-019)和4μl反應(yīng)緩沖液(反應(yīng)4由10×溶液的Dpn1補(bǔ)給；在最終的反應(yīng)混合物中1∶10稀釋)被加入到樣品，并在37℃下溫育90分鐘。兩微升反應(yīng)樣品被用于轉(zhuǎn)化10μl One-ShotTop10電感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Cat.No.C4040-50)。在37℃下在SOC培養(yǎng)基中生長1小時后(參見Hanahan(1983)J.Mol.Biol.166557-580)，所述細(xì)胞已經(jīng)被種到卡那霉素選擇板上，并在37℃下溫育過夜。
陽性克隆在含100μg/ml氨芐青霉素的2*TY培養(yǎng)基中生長，以及用QIAprepSpin Miniprep Kit(Cat.No.27106)分離質(zhì)粒DNA。對該質(zhì)粒進(jìn)行測序，以確認(rèn)突變序列已被正確地?fù)饺搿?br> 根據(jù)Gateway Cloning Procedure(Invitrogen；Cat No.11791019)，用LR反應(yīng)，將具有正確序列的突變體轉(zhuǎn)移到黑曲酶表達(dá)載體pRAXdest#2。在表達(dá)克隆經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化到黑曲酶AP4后，篩選具有改變的熱穩(wěn)定性的定點(diǎn)突變體(Site DirectedMutants，SDM)(表14)。
實(shí)施例4組合文庫 兩個QuikChange文庫(QC2C和QC2D)被開發(fā)出，這基于在SDM篩選中鑒定的單位點(diǎn)突變的結(jié)果98、134、206、212、312、316、411和413。
采用快速改變法(quick-change，QC)，突變P98L、M134V、V206L、I212V、T312S、S316P、F411Y和S413Y在文庫中被隨機(jī)組合。為開發(fā)QC文庫，使用Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Cat#200513，來自Strategene)。
引物如下表所列制備表5
如下制備引物混合物 將30微升引物98和134(參見上表)與10μl的每一種其它引物(參見上表)混合。兩種不同的引物濃度被檢測，導(dǎo)致兩個文庫，其中一個文庫中每分子含有平均2個氨基酸取代，而第二個文庫中每分子含有6個氨基酸取代。
使用下面的反應(yīng)試劑，進(jìn)行突變反應(yīng)。
表6

擴(kuò)增產(chǎn)物用Dpn1消化。1微升Dpn1(10U/μl)被加到PCR混合物中并在37℃下溫育90分鐘。使用QIAquick PCR純化試劑盒(250)(Qiagen，Cat.No.28106)，根據(jù)制造商的指導(dǎo)，純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物。洗脫體積為35μl洗脫緩沖液。
為除去雙鏈未突變的DNA，用Dpn1限制性酶消化洗脫的樣品第二時間。1μl Invitrogen的Dpn1(Cat.No.15242-019)和4μl反應(yīng)緩沖液(反應(yīng)4由10×溶液的Dpn1補(bǔ)給；在最終的反應(yīng)混合物中以1∶10稀釋)被加入到樣品，并在37℃下溫育90分鐘。2微升反應(yīng)樣品被用于轉(zhuǎn)化10μl One-Shot Top10電感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Cat.No.C4040-50)。在37℃下在SOC培養(yǎng)基中生長1小時后(參見Hanahan(1983)J.Mol.Biol.166557-580)，所述細(xì)胞已經(jīng)被接種到卡那霉素選擇板上，并在37℃下溫育過夜。
將陽性克隆在含100μg/ml氨芐青霉素的2*TY培養(yǎng)基中生長，以及用QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106)分離質(zhì)粒DNA。對該質(zhì)粒進(jìn)行測序，以確認(rèn)突變序列已被正確地?fù)饺搿?br> 根據(jù)Gateway Cloning Procedure(Invitrogen；Cat No.11791019)，用LR反應(yīng)，將具有正確序列的突變體轉(zhuǎn)移到黑曲酶表達(dá)載體pRAXdest#2。在表達(dá)克隆經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化到黑曲酶AP4后，針對改變的熱穩(wěn)定性對QC文庫進(jìn)行篩選(Site DirectedMutants，SDM)(表15、16)。
實(shí)施例5區(qū)域突變(Regional Mutagenesis) 如下所述，基于在SDM篩選期間鑒定的單位點(diǎn)突變的結(jié)果，在CBH2的3D結(jié)構(gòu)中區(qū)域被鑒定，在熱穩(wěn)定性試驗(yàn)中被隨機(jī)突變和篩選。組成這樣的空間區(qū)域的氨基酸是(在各組中)[210，214]、[253，255，257，258]、[411，413，415]、[412，414，416]、[312，313]、323、[212，149，152]、[134，144]和98。
在上述位置(即[210，214]、[253，255，257，258]、[411，413，415]、[412，414，416]、[312，313]、323、[212，149，152]、[134，144]和98)處的完全隨機(jī)文庫被篩選。在上面的名單中在括號之間的氨基酸(例如[210，214])被一起隨機(jī)化，氨基酸323和98被單獨(dú)隨機(jī)化。變體CBH2-S316P或CBH2-V206L-S316P作為這些文庫的骨架。
NNS引物被構(gòu)建并從Invitrogen訂購
表7
根據(jù)下面的方案，用Pfu Ultra DNA聚合酶(Stategene；Cat.No.600380)進(jìn)行PCR表8

將PCR片段置于1％LMT凝膠上，并用Qiagen Gel Extraction Kit(StategeneCat.No.28706)純化。純化的片段與Pfu Ultra(參上)和具有attB側(cè)翼序列的cbh2引物融合。
根據(jù)手冊(Invitrogen；Cat.No.11789013)，使用BP反應(yīng)，將純化的cbh2基因轉(zhuǎn)移進(jìn)Gateway Entry-Vector pDON201。用卡那霉素(50μg/ml)在2*TY板上選擇陽性克隆，并刮擦所述板，以制備質(zhì)粒，所述質(zhì)粒利用Gateway LR反應(yīng)(Invitrogen；Cat.No.11791019)轉(zhuǎn)移到pRAXdest#2(表達(dá)載體)。該載體用Notl消化，以最優(yōu)化LR反應(yīng)的轉(zhuǎn)化頻率。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化已被用于在黑曲酶AP4中建立9個CBH2區(qū)域文庫(CBH2 Regional Libraries)，其被篩選以獲得改變的熱穩(wěn)定性(表17)。
實(shí)施例6多點(diǎn)突變體(Mutiple Mutants) 基于單位點(diǎn)突變的表達(dá)和熱穩(wěn)定性結(jié)果，設(shè)計(jì)一組多點(diǎn)突變，其僅在搖瓶中被產(chǎn)生。
來自CBH2變體FCA557(P98L/M134V/S316P/S413Y)(來自QC文庫，實(shí)施例4)的突變與來自CBH2變體FCA564(S316P/V323Y)、FCA568(V206L/S210R/T214Y/S316P)和FCA570(M134L/L144R/S316P)(來自區(qū)域文庫，實(shí)施例5)的那些突變組合，以獲得具有改善的熱穩(wěn)定性的CBH2分子。
表9
引物被構(gòu)建并從Invitrogen訂購表10
使用表11(下面)中的反應(yīng)試劑，進(jìn)行PCR，以獲得構(gòu)建所有9種CBH2組合所需的所有片段(A-M)。使用DNA聚合物Phusion(Finnzymes；Cat.No.F-530)。引物濃度為10μM。循環(huán)條件在表2(上面)中給出。
表11

將PCR片段置于1％LMT凝膠上，并用Qiagen Gel Extraction Kit(StategeneCat.No.28706)純化。使用Phusion DNA聚合酶(參上)，用CBH2-attB引物(如上)，融合純化的片段，以獲得表12的完整CBH2組合。
表12
通過1％LMT瓊脂糖純化完整的CBH2-attB分子，并轉(zhuǎn)移到黑曲酶AP4表達(dá)載體pRAXdest#2。所使用的方法是“將attB-PCR產(chǎn)物直接克隆進(jìn)目標(biāo)載體的One-tube Protocol”(根據(jù)Invitrogen手冊)。
根據(jù)手冊，3μl反應(yīng)樣品被用于轉(zhuǎn)化100μl DH5α最大效率感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen Cat.No.18258012)。在37℃下在SOC培養(yǎng)基中生長1小時后，所述細(xì)胞被鋪平板于卡那霉素選擇板上，并在37℃下溫育過夜。陽性克隆在2*TY培養(yǎng)基和100μg/ml氨芐青霉素中生長。以及用QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106)分離質(zhì)粒DNA并測序。
根據(jù)Gateway Cloning Procedure(Invitrogen；Cat No.11791019)，用LR反應(yīng)，將具有正確序列的突變體轉(zhuǎn)移到黑曲酶表達(dá)載體pRAXdest#2。在表達(dá)克隆經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化到黑曲酶AP4后，多點(diǎn)突變體被表達(dá)和分離(如在實(shí)施例7中所述)，并分析熱穩(wěn)定性(表17、18)。
實(shí)施例7來自搖瓶生長的CBH2和其變體的表達(dá)和分離 為提供在熱變性研究(實(shí)施例9)中用于Tm測量的材料，使表達(dá)克隆在搖瓶中生長，然后CBH2分子被純化，如下 用含有編碼CBH2纖維素酶變體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。進(jìn)根據(jù)Cao etal(Cao Q-N，Stubbs M，Ngo KQP，Ward M，Cunningham A，Pai EF，Tu G-C andHofmann T(2000)Penicillopepsin-JT2 a recombinant enzyme from Penicilliumjanthinellum and contribution of a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science9991-1001)所述的方法，該構(gòu)建物被轉(zhuǎn)化進(jìn)黑曲霉泡盛變種。
黑曲霉泡盛變種轉(zhuǎn)化子在缺乏尿嘧啶的基本培養(yǎng)基上生長(Balance et al.1983)。如Cao et al.(2000)所述，通過在37℃將1cm2來自孢子萌發(fā)生長瓊脂板的孢子懸液接種到100ml搖瓶中3天，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，然后篩選纖維素酶活性。
CBH2活性測定是基于磷酸溶漲纖維素(PASC0.5％PASC，在0.5mM醋酸鈉中，pH4.85)的水解。通過PAHBAH測定測量還原糖。(PAHBAH2.975gPAHBAH，9.75g Na-K-酒石酸鹽，在195ml 2％NaOH中)。PASC(Karlsson，J.et al.(2001)，Eur.J.Biochem，268，6498-6507，Wood，T.(1988)in Methods in Enzymology，Vol.160.Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose(Wood，W.& Kellog，S.Eds.)，pp.19-25，Academic Press，San Diego，CA，USA)以及PAHBAH(Lever，M.(1972)Analytical Biochemistry，47，273，Blakeney，A.B.& Mutton，L.L.(1980)Journal ofScience of Food and Agriculture，31，889，Henry，R.J.(1984)Journal of the Institute ofBrewing，90，37)。
然后，通過疏水相互作用層析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，經(jīng)由下面兩個步驟的一個，從這些培養(yǎng)液的無細(xì)胞上清中純化Cel6A野生型和變體 對于SDM變體(實(shí)施例3)，Bio-RAD Poly-Prep Columns CAT#731-1550被使用，采用Pharmacia Phenyl Sepharose樹脂(1.6ml＝1ml柱)CAT#17-0973-05。該樹脂在用1-2柱體積(column volume，CV)水洗滌之前被設(shè)置，然后，用5 CV 0.020M磷酸鈉、0.5M硫酸銨、pH6.8(緩沖液A)平衡。將4M硫酸銨加到上清液中，終濃度達(dá)到約0.5M。2 CV上清液被上樣，然后在用4CV 0.020M pH6.8的磷酸鈉洗脫之前，用5CV緩沖液A洗滌柱子。濾液包含純化的CBH2。
對于多點(diǎn)突變(實(shí)施例6)，使用由Applied Biosystems制備的Poros20 HP2樹脂，在Novagen真空岐管(Vacuum Manifold)上運(yùn)行柱子。用5CV緩沖液A平衡HIC柱。將硫酸銨加到上清液中，終濃度達(dá)到約0.5M，并且調(diào)節(jié)pH到6.8。在過濾后，上清液被上樣，用10 CV緩沖液A洗滌柱子，然后用10 CV的0.020M pH6.8的磷酸鈉洗脫。級分被收集，并在CBH2存在的基礎(chǔ)上被富集，如通過還原性SDS-PAGE凝膠分析所檢測。
當(dāng)需要時，根據(jù)所提供的步驟(Sigma-Aldrich)，通過用內(nèi)切糖苷酶H處理上清液，在純化之前CBH2分子被去糖基化。
實(shí)施例8通過熱失活的CBH2變體的熱穩(wěn)定性 通過測量在嚴(yán)格條件下、在升高的溫度中溫育之前和之后的無細(xì)胞上清等分試樣的PASC活性，鑒定與野生型CBH2相比具有改變的穩(wěn)定性到不可逆熱失活的CBH2分子。所應(yīng)用的嚴(yán)格條件為在61℃或65℃下(如所示)在0.1M pH4.85的乙酸鈉中1∶1稀釋的上清液溫育1小時，隨后在冰上冷卻10分鐘。通過將殘留活性除以初始活性(在嚴(yán)格溫育之前CBH2對PASC的活性)計(jì)算殘留活性％(在升高的條件下溫育后的剩余活性％)。
根據(jù)下面的步驟，進(jìn)行CBH2變體和野生型的穩(wěn)定性到熱失活的篩選A.溶液和培養(yǎng)基 下面的溶液/培養(yǎng)基被用于測定CBH2突變體穩(wěn)定性至不可逆熱失活1.如表13所示，制備加麥芽糖基本培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基)表13用于黑曲酶的基本培養(yǎng)基+麥芽糖


2.0.5％PASC溶液，在50mM NaAc中，pH4.85i.將5克Avicel PH101(Fluka 11365)加入到1升燒杯，并加入～12ml水，以制備稠的漿液。
ii.將燒杯置于冰上。
iii.加入150ml冰冷的85％正磷酸(Art.1000573 Merck)并用ultra turrax高速(防止噴灑)混合約1小時。
iv.加入100ml冰冷的丙酮，其導(dǎo)致非晶型纖維素緩慢沉淀成非常稠的漿液。最后使用抹刀(spatula)，以便更好混合。
v.用水將該非常稠的漿液稀釋到～1升，以使其的流動性足以將其轉(zhuǎn)移到6×250ml Sorvall容器中。
vi.在10k下離心15分鐘，并棄上清。
vii.用燒杯所能夠容納的水混合沉淀小球，并再次離心。
viii.重復(fù)步驟5和6至少3次，直到pH增加到pH4.0-5.0。
ix.為增強(qiáng)磷酸的洗滌，一滴4N NaOH可以被加入到水中。
x.用水混合最終的沉淀小球到～300ml并均化。
xi.采用干重測量，測定所述漿液的濃度。
在121℃下對所述漿液滅菌20分鐘。冷卻并儲存在冰箱中。
3.如下制備PAHBAH試劑1.5g PAHBAH+5g酒石酸-鈉-鉀，在100ml 2％NaOH中。
4.纖維二糖儲液；在MQ水中制備0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.7和1mg/ml溶液。
B.樣品制備1.在軌道式搖床(225rpm)上，在每孔含有200μl基本培養(yǎng)基+麥芽糖(見上)的96W filter MTP′s(Millipore，#MAGVS2210)中，于33℃生長黑曲酶變體7天，濕度為80-90％。
2.在生長溫育之后，使用真空歧管過濾培養(yǎng)基，在新的96W flat MTP′s(Greiner，#655101)中收集濾液(上清)，在4℃下儲存。
C.在升高的溫度下的嚴(yán)格溫育1.每孔用60μl 100mM pH4.85的NaAc稀釋60μl上清(sup)(1∶1)。(任選的當(dāng)剩余的上清需要被檢查殘留糖時，每孔加入190μl 100mM pH4.8的NaAc到10μl上清，并將20μl該稀釋的上清轉(zhuǎn)移到150μl PAHBAH試劑，進(jìn)行PAHBAH還原糖實(shí)驗(yàn)(參見E))。
2.將20μl該稀釋的上清轉(zhuǎn)移到新的flat 96W MTP，并在4℃下儲存(用于初始活性)3.在61℃下(或65℃)溫育剩余的稀釋的上清(約100μl)1小時(用于殘留活性)4.在冰上冷卻10′。
D.PASC溫育；小規(guī)模轉(zhuǎn)化(small scale conversion，SSC)試驗(yàn)1.在新的flat MTP′s中制備180μl/孔的、在50mM pH4.85的NaAc中的充分?jǐn)嚢璧?.5％的PASC溶液。
2a.在一個設(shè)計(jì)用于測量殘留活性的板中，在預(yù)溫育后將每孔20μl的處理的稀釋上清(sup)轉(zhuǎn)移(伴隨上下混合)到PASC-MTP′s。
2b.在設(shè)計(jì)用于測量初始活性的第二個板中，將每孔180μl的PASC溶液轉(zhuǎn)移(伴隨上下混合)到儲存的20μl未處理的稀釋上清。
3.密封sup-PASC MTP′s，并在50℃下溫育2小時，以900rpm攪拌。
4.在冰上冷卻10′。
5.將sup-PASC混合物轉(zhuǎn)移到新的MTP，在真空歧管中過濾并收集濾液。
E.PAHBAH還原糖測定1.制備具有每孔150μl PAHBAH試劑的新96W flat MTP。
2.將20μl的sup-PASC濾液轉(zhuǎn)移到PAHBAH(上下混合)。
3.在第一MTP中的柱1中設(shè)置校準(zhǔn)線；20μl的纖維二糖儲存液(參見上面的A4)。
4.在69℃、900rpm下溫育1小時，冷卻到室溫，并在2000rpm下離心2′。
5.在SpectraMax分光光度計(jì)(Spectra，Sunnyvale，CA，U.S.A.)中，直接測量MTP讀數(shù)的端點(diǎn)OD410。
F.數(shù)據(jù)處理(Spad-it)1.由纖維二糖稀釋孔的讀數(shù)，以mg/ml纖維二糖對OD40，繪制纖維二糖校正線2.使用校正曲線以及樣品孔的讀數(shù)，計(jì)算以mg/ml纖維二糖計(jì)的每一上清的初始值和殘留值3.計(jì)算殘留活性％。
定點(diǎn)突變的CBH2變體的殘留活性測量表14Cel6A野生型和變體殘留活性


每一野生型(w.t.)和變體的殘留活性％數(shù)為3個測定值的均值。stdev＝計(jì)算的測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
上表示出了在61℃或在65℃下1小時的嚴(yán)格溫育后單定點(diǎn)突變體(SDM，實(shí)施例3)的剩余的殘留活性％。在數(shù)據(jù)的每一個亞組中示出了WT克隆的殘留活性(在每一個板上都有一個WT參考)。WT的平均值分別為61℃下21.4％和65℃下6.6％。清楚的是，具有比WT更高的殘留活性的每一突變體是在篩選條件下具有改善的熱穩(wěn)定性的分子。
CBH2組合突變體的殘留活性測量 表15和16中的兩個結(jié)果欄示出了實(shí)施例4所產(chǎn)生的變體在兩個不同的溫度下溫育后的殘留活性％。
兩個表(表15和16)被描述如下，因?yàn)檫@些值在兩個獨(dú)立的試驗(yàn)中產(chǎn)生。
清楚的是，具有比WT更高的殘留活性的每一突變體是在篩選條件下具有改善的熱穩(wěn)定性的分子。
表15Cel6A野生型和變體的殘留活性

除非另外說明，平均殘留活性％由4個測定值計(jì)算。如所示出地，“(8)”，進(jìn)行8次測定。 stdev＝計(jì)算的測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表16 Cel6野生型和變體的殘留活性

平均殘留活性％通過括號中所述的測定值數(shù)量計(jì)算。stdev＝計(jì)算的測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
區(qū)域突變的CBH2變體的殘留活性測量 表17示出了實(shí)施例5所產(chǎn)生的變體在61℃下溫育后的殘留活性％。
表17Cel6A野生型和變體的殘留活性

除非另外說明，每一個殘留活性％值是3個測定值的平均值。如所示出地，“(32)”，進(jìn)行32次測定。stdev＝計(jì)算的測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
明顯的是，具有比WT和/或S316P更高殘留活性的每一突變體是在篩選條件下具有改善的熱穩(wěn)定性的分子。
實(shí)施例9通過Tm測量的CBH2變體的熱穩(wěn)定性 CBH2纖維素酶被如上克隆、表達(dá)和純化(實(shí)施例7)。在來自Microcal(Nothampton，Massachusetts，US)的VP-DSC顯微量熱器上采集熱變性數(shù)據(jù)。緩沖條件為50mM Bis Tris Propane/50mM乙酸銨/冰醋酸，pH5.5或pH5.0，如所示。蛋白質(zhì)濃度為大約0.25mgs/ml。在90(℃/hr)的掃描速率下從25℃-80℃進(jìn)行三次熱掃描。第一掃描示出了CBH2的熱變性，并且被用于確定熱變性的表觀中間點(diǎn)(apparent mid-point)Tm。儀器軟件產(chǎn)生了Cp(卡/℃)對溫度(℃)曲線，并且從該曲線手工確定Tm。在所有情況下熱變性是不可逆的，如在第二和第三熱掃描中不存在熱變性的情況所顯示。
表18在pH5.5下通過DSC測定的Tm


所有的變體數(shù)據(jù)參照依然糖基化的FAC500(rCBH2野生型)Tm?！癟m G”＝對所純化的重組蛋白測量的Tm?！癟m DG”＝對在被純化之前用EdoH去糖基化的重組蛋白測量的Tm。
表19在pH5.0下通過DSC測定的Tm

所有的變體數(shù)據(jù)參照依然糖基化的FAC500(rCBH2野生型)Tm?！癟m G”＝對所純化的重組蛋白測量的Tm。“Tm DG”＝對在被純化之前用EdoH去糖基化的重組蛋白測量的Tm。
與野生型相比，引入CBH2纖維素酶突變體的突變影響突變體CBH2纖維素酶的熱穩(wěn)定性。
采用本領(lǐng)域中已知的用于去除N-連接多糖的方法，制備在本實(shí)施例和下面的實(shí)施例中使用的去糖基化蛋白(參見例如Biochem.J.(2001)358423-430)。還參見Tai，T.，et al.J.Biol.Chem.(1975)250，8569。
實(shí)施例10CBH2變體對PASC的比活性 與已經(jīng)克隆到黑曲酶中的野生型紅褐肉座菌CBH2相比，本實(shí)施例研究了CBH2變體對磷酸溶漲纖維素的特異性能。
磷酸溶漲纖維素(PASC)——根據(jù)在Walseth(1971) Tappi 35228(1971)和Wood Biochem J.121353(1971)中描述的方法，通過Avicel制備PASC。用緩沖液和水稀釋該材料，達(dá)到1％w/v的混合物，使得乙酸鈉的終濃度為50mM，pH5.0。
通過本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，確定這些變體對纖維素底材的相對特異性能。例如參見Baker et al，Appl Biochem Biotechnol 1998 Spring；70-72()395-403。
標(biāo)準(zhǔn)的纖維素轉(zhuǎn)化在試驗(yàn)中被使用。參見在前的Baker。在該試驗(yàn)中，酶和緩沖的底物被置于容器中，并在某一溫度下溫育一段時間。用足夠的100mM pH11.0的Glycine結(jié)束反應(yīng)，以使反應(yīng)混合物的pH達(dá)到至少pH10.0。一旦反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)混合物的等分試樣通過0.2微米膜過濾，以除去固體。然后，根據(jù)Baker et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.70-72395-403(1998)中描述的方法，通過HPLC測定過濾的溶液的可溶性糖。
在53℃下，用在50mM pH5.0的NaOAc中的1％PASC，測定這些變體的相對比活性，這在1400rpm搖動下進(jìn)行3.5小時。酶劑量為0.75、1.5和3mg/克纖維素。如在Leach和Scheraga 1960(J.Am.Chem.Soc.824790-4792)中所述，通過OD280確定蛋白濃度。被比較的變體為FCA500.3、FCA523、FCA536和FCA540-550。為簡化起見，圖8僅示出了FCA540、FCA542、FCA545、FCA547、FCA549和FCA550。所有其它變體樣品具有由FCA542和FCA545結(jié)果確定的線所限制的比活。
溫度穩(wěn)定性篩選得到的幾個新CBH2變體具有與野生型一樣的活性。
為了比較上面的劑量依賴性數(shù)據(jù)的數(shù)(如圖8所示)，在相同的劑量下，由變體產(chǎn)生的(平均)總糖與由FCA500.3(野生型)產(chǎn)生的(平均)總糖的比率被平均。圖9中描述的這些比率都非常類似，除了活性低許多的FCA547、FCA549和FCA550。誤差條形圖是所述比率的平均值的單標(biāo)準(zhǔn)偏差(single standarddeviation)。比率1將表示，所述變體在該試驗(yàn)中具有與野生型相似的活性。所有穩(wěn)定化的變體保持對該底物的活性。
實(shí)施例11CBH2變體對PCS的比活性 本實(shí)施例比較了CBH2變體對預(yù)處理的玉米秸稈(pretreated corn stover)的比活，如與已被克隆進(jìn)黑曲酶的野生型紅褐CBH2。
預(yù)處理玉米秸稈(PCS)——如Schell，D.et al.，J.Appl.Biochem.Biotechnol.10569-86(2003)中所述，用2％w/w H2SO4預(yù)處理玉米秸稈，隨后用去離子水多次洗滌，以獲得pH4.5的糊。然后，加入醋酸鈉緩沖液(pH5.0)(終濃度為50mM醋酸鈉)，并且，如果必要，該混合物隨后用1N NaOH滴定到pH5.0。在該反應(yīng)混合物中纖維素濃度大約為7％。在53℃下，在700rpm下20小時，使用PCS檢測CBH2的特異性能。三個不同劑量的CBH2變體，0.75、1.5和2.5mg/g纖維素(在PCS中)，被加到8.5mg CBH2缺失纖維素酶菌株肉湯/g纖維素。(對于在紅褐肉座菌(也稱為里氏木霉)中刪除CBH2基因的討論，參見美國專利第5,861,271和5,650,322。)結(jié)果被示于
圖10中。CBH2缺失菌株(無CBH2被添加回)的基線活性被示出。在重構(gòu)的完整纖維素酶對PCS中，CBH2變體與CBH2野生型具有相似的活性。這表明，當(dāng)被添加回缺失的菌株時，野生型給予所述缺失菌株如上的一些活性。在相似的條件下所述變體達(dá)到大概相同的活性。
如上所述，對其它變體進(jìn)行相似的試驗(yàn)。在每一劑量下對重復(fù)兩次的總糖的值求平均，然后將該值除以相應(yīng)的FCA500.3(野生型)重復(fù)兩次的平均值。
圖11中描述的這些比率都非常類似，除了活性低得多的FCA547、FCA549和FCA550。誤差條形圖是在不同劑量下所述比率的單標(biāo)準(zhǔn)偏差。比率1將表示，所述變體在該試驗(yàn)中具有與野生型相似的活性。所有穩(wěn)定化的變體保持對該底物的活性。
實(shí)施例12在不同溫度下CBH2變體的比活性 本實(shí)施例證明了，每一種酶(穩(wěn)定化變體和野生型)在不同溫度下保持活性多長時間。
實(shí)施例10中描述的試驗(yàn)經(jīng)如下修改后被用在本實(shí)施例中。由CBH2(0.5mg/g纖維素)在1％PASC中，于53、65和75℃下并伴隨著300PRM的搖動，經(jīng)過不同的溫育時間而產(chǎn)生的總糖，被用于確定每一種酶(穩(wěn)定化變體和野生型)在這些溫度下保持活性多長時間。
在53℃下，所述變體隨著時間變化具有與野生型酶大致相同的活性(參見
圖12)。由于在53℃下酶的穩(wěn)定性，所述酶的半衰期不能從該數(shù)據(jù)確定。在65℃，由FCA543和FCA500產(chǎn)生的總糖顯示，F(xiàn)CA543比FCA500具有更長時間的活性(
圖13)。所述變體的半衰期被確定為大約24小時，而野生型半衰期為約4小時。然后，兩種酶都在72小時的溫育時間內(nèi)開始失效。在75℃時，在第一小時中FCA543比FCA500產(chǎn)生更多的糖(參見
圖14)。
實(shí)施例13與其它纖維素酶一起的CBH2變體比活性 本實(shí)施例說明了變體(即，穩(wěn)定化的)CBH2結(jié)合其它纖維素酶在生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化中的使用。
在標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，使用PCS作為底物(參見實(shí)施例11)，在5mg/g纖維素和10mg/g纖維素下以及在38、53和65℃下，檢測具有嗜酸耐熱菌(Acidothermuscellulolyticus)E1核心加上野生型CBH 1和2(分別為FCA301和FCA500)或穩(wěn)定化的CBH 1和2(分別為FCA469和FCA543)的三種酶混合物(參見WO05/093050)。在第一天、第二天和第五天時淬滅樣品。
CBH1變體在美國專利公開第20050054039號中被描述，其被引入于此作為參考。來自嗜酸耐熱菌的E1酶在美國專利第5,712,142中被公開。參考下列專利文件WO91/05039；WO93/15186；US專利第5,275,944號；WO96/02551；US專利第5,536,655號和WO00/70031。還參考GenBank U33212。
結(jié)果顯示，在38℃下，所述變體混合物的特異性能與野生型混合物大致相同(見
圖15)。在53℃下，觀察到相似的性能模式(數(shù)據(jù)未示出)。
在65℃下，穩(wěn)定化變體混合物顯示出相比于野生型混合物顯著增強(qiáng)的特異性能。(參見
圖16) 使用如實(shí)施例11所述的相同標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，在56、59和62℃下以及在5和10mg/g纖維素下檢測所述穩(wěn)定化變體混合物的特異性能，并且在24、48和120小時時淬滅樣品。在所有三種時間下，56℃比其它更高的溫度更好。參見
圖17。在所有檢測的時間下，最適溫度為59℃以下。
本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯然的，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明以具體的優(yōu)選實(shí)施方式作為對象進(jìn)行描述，但是應(yīng)該理解，要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)該過多地受到這些具體實(shí)施方式
的限制。事實(shí)上，用于實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各種修改——其對分子生物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯然的，都意欲包含在權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列中的一個或多個殘基的位置處的取代或者缺失來自紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的CBH2(SEQ ID NO2)中的殘基V94、P98、G118、M120、M134、T142、L144、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、S210、I212、T214、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426和/或A429。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的V94E、P98L、G118P、M120L、M134(G/L/V)、T142V、L144(G/R/S)、M145L、T148Y、T154A、L179A、Q204E、V206L、S210(L/R)、I212V、T214(M/Y)、L215I、G231N、T232V、V250I、Q276L、N285Q、S291G、G308A、T312S、S316P、V323(L/N/Y)、N325D、I333L、G334A、S343P、T349L/V、G360R、S380T、A381T、S386P、F411Y、S413Y、A416G、Q426E和/或A429T。
3.CBH2纖維素酶變體，其中所述變體在對應(yīng)于下列殘基中的一個或多個的位置處的取代來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的V94、P98、G118、M120、M134、T142、L144、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、I212、T214、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426和/或A429。
4.CBH2纖維素酶變體，其中所述變體包含在對應(yīng)于選自下述殘基的位置處的取代來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的V94E、P98L、G118P、M120I、M134V、T142V、L144R、M145L、T148Y、T154A、L179A、Q204E、V206L、S210R、I212V、T214Y、L215I、G231N、T232V、V250I、Q276L、N285Q、S291G、G308A、T312S、S316P、V323(N/Y)、N325D、I333L、G334A、S343P、T349L、G360R、S380T、A381T、S386P、F411Y、S413Y、A416G、A429T和Q426E。
5.CBH2纖維素酶變體，其中所述變體CBH2主要由選自下列的突變組成來自紅褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO2)中的i.I212V/S316P/F411Y；ii.M134G/L144G/S316P；iii.M134L/L144R/S316P；iv.M134L/L144S/S316P；v.M134V/V206L/I212V/T312S/S316P/F411Y/S413Y；vi.P98L/M134L/L144R/S210L/T214Y/S316P/N323Y/S413Yvii.P98L/M134L/L144R/S210R/T214Y/S316P/V323Y/S413Yviii.P98L/M134L/L144R/S316P/S413Yix.P98L/M134L/L144F/S316P/N323Y/S413YxP98L/M134L/L144R/V206L/S210R/T214Y/S316P/S413Yxi.P98L/M134L/L144R/V206L/S210F/T214Y/S316P/V323Y/S413Yxii.P98L/M134V/l212V/S316P/S413Yxiii.P98L/M134V/I212V/T312S/S316P/S413Yxiv.P98L/M134V/S316Pxv.P98L/M134V/S316P/S413Yxvi.P98L/M134V/S316P/V323Y/S413Yxvii.P98L/M134V/T154A/1212V/S316P/F411Y/S413Yxviii.P98L/M134V/T154A/I212V/S316P/S413Yxix.P98L/M134V/T154A/I212V/T312S/S316P/S413Yxx.P98L/M134V/T154A/T312Sxxi.P98L/M134V/T154A/V206L/1212V/S316P/F411Y/S413Yxxii.P98L/M134V/T154A/V206L/S316Pxxiii.P98L/M134V/V206L/F411Yxxiv.P98L/M134V/V206L/I212V/S316P/F411Yxxv.P98L/M134V/V206L/I212V/T312S/S316P/S413Yxxvi.P98L/M134V/V206L/S210R/T214Y/S316P/S413Yxxvii.P98L/M134V/V206L/S210R/T214Y/S316PN323Y/S413Yxxviii.P98L/M134V/V206L/S316P/S413Yxxix.P98L/T154A/I212V/F411Yxxx.P98L/V206L/I212V/T312S/S316P/F411Y/S413Yxxxi.S316P/S413Yxxxii.S316P/V323Lxxxiii.S316P/V323Yxxxiv.V206L/I212V/S316Pxxxv.V206L/I212V/T312S/S316Pxxxvi.V206L/I212V/T312S/S316P/F411Y/S413Yxxxvii.V206L/I212V/T312S/S316P/S413Yxxxviii.V206L/I212V/T312S/S316P/S413YxxxIx.V206L/S210L/T214M/S316PxI.V206L/S210R/S316PxIi.V206L/S210R/T214Y/S316P；和xIiiV206L/S316P。
6.核酸，所述核酸編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的CBH2變體。
7.核酸，所述核酸編碼根據(jù)權(quán)利要求4所述的CBH2變體。
8.核酸，所述核酸編碼根據(jù)權(quán)利要求5所述的CBH2變體。
9.載體，所述載體包含權(quán)利要求6所述的編碼CBH2變體的核酸。
10.載體，所述載體包含權(quán)利要求7所述的編碼CBH2變體的核酸。
11.載體，所述載體包含權(quán)利要求8所述的編碼CBH2變體的核酸。
12.宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求9所述的載體轉(zhuǎn)化。
13.宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求10所述的載體轉(zhuǎn)化。
14.宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求11所述的載體轉(zhuǎn)化。
15.產(chǎn)生CBH2變體的方法，所述方法包括步驟(a)在合適的條件下，在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生CBH2變體；(b)獲得所述產(chǎn)生的CBH2變體。
16.產(chǎn)生CBH2變體的方法，所述方法包括步驟(a)在合適的條件下，在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生CBH2變體；(b)獲得所述產(chǎn)生的CBH2變體。
17.產(chǎn)生CBH2變體的方法，所述方法包括步驟(a)在合適的條件下，在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生CBH2變體；(b)獲得所述產(chǎn)生的CBH2變體。
18.洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和CBH2變體，其中所述CBH2變體包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的CBH2變體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的洗滌劑，其中所述洗滌劑是洗衣洗滌劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的洗滌劑，其中所述洗滌劑是盤碟洗滌劑。
21.飼料添加劑，其含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的CBH2變體。
22.處理木漿的方法，其包括用根據(jù)權(quán)利要求1所述的CBH2變體接觸所述木漿。
23.將生物物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖類的方法，其包括用根據(jù)權(quán)利要求1所述的CBH2變體接觸所述的生物物質(zhì)。
全文摘要
本文描述了紅褐肉座菌(H.jecorina)CBH2——Cel6A酶的變體。本發(fā)明提供了具有改變的熱穩(wěn)定性的新型纖維二糖水解酶。
文檔編號A23K1/165GK101094917SQ200580045497
公開日2007年12月26日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者W·埃勒, R·M·考德威爾, L·丹克梅椰爾, F·格德蓋布, B·R·凱萊門, C·米奇森, P·內(nèi)菲, P·特尼塞恩 申請人:金克克國際有限公司