專利名稱：制備抗氧化劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是申請(qǐng)?zhí)枮?9806848.6、申請(qǐng)日為1998年5月6號(hào)的發(fā)明名稱和本發(fā)明相同的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及制備抗氧化劑的方法。
抗氧化劑防止、抑制或降低可氧化介質(zhì)的氧化速率。具體地說(shuō)，抗氧化劑用于食品保藏，特別是當(dāng)所述食品是脂肪或包含脂肪時(shí)。典型的化學(xué)抗氧化劑包括芳香胺類、取代的酚類和硫化合物。用于食物成品的抗氧化劑的實(shí)例是聚乙烯聚吡咯烷酮、二硫蘇糖醇、二氧化硫、合成γ-維生素E、δ-維生素E、L-抗壞血酸、L-抗壞血酸鈉、L-抗壞血酸鈣、抗壞血酸棕櫚酸酯、沒(méi)食子酸丙酯、沒(méi)食子酸辛酯、沒(méi)食子酸十二酯、卵磷脂、二苯胺乙氧喹和2，6-二叔丁基對(duì)甲酚。二種常用的抗氧化劑是GRINDOX 142(得自Danisco A/S)和GRINDOX1029(得自Danisco A/S)。
通常將抗氧化劑加入食品，例如飲料。
例如，抗氧化劑用于制備諸如啤酒、蘋(píng)果汁、淡色啤酒等的酒精飲料。具體地說(shuō)，抗氧化劑在制備葡萄酒中有廣泛的用途。在此方面，Butzke和Bisson在Agro-Food-Industry HiTech(1996年7月/8月第26-30頁(yè))中發(fā)表了葡萄酒生產(chǎn)的綜述。
按照Butzke和Bisson(出處同上)“葡萄酒是葡萄果汁或汁的自然發(fā)酵產(chǎn)物。在紅葡萄酒的情況下，在初始發(fā)酵期間存在葡萄皮，以從葡萄皮中提取色素和重要的風(fēng)味和香味成分。術(shù)語(yǔ)“果汁”指壓碎的整葡萄。在生產(chǎn)白葡萄酒的情況下，在發(fā)酵前除去葡萄皮，僅僅汁液得以保留和加工?！瓘奶镩g收獲葡萄并直接送到葡萄酒廠。然后在葡萄酒廠壓碎葡萄，將果汁或者轉(zhuǎn)移至用于發(fā)酵的罐中(紅葡萄酒)或者壓榨以將汁液與葡萄皮和葡萄籽分離(白葡萄酒)。在后一種情況下，然后將汁液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中。所述罐或者用酵母菌屬(Sacharomyces)的市售葡萄酒菌株接種，或者使其進(jìn)行自然或未接種發(fā)酵。在自然發(fā)酵中，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)野生型(非酵母菌屬)酵母和細(xì)菌的數(shù)量大大超過(guò)酵母菌屬細(xì)胞。在所述發(fā)酵結(jié)束時(shí)，酵母菌屬占支配地位，絕大多數(shù)情況下是唯一可以分離的生物體。用市售葡萄酒菌株或用發(fā)酵葡萄汁液或果汁接種改變了不同微生物數(shù)量的起始比例，使得酵母菌屬更早地支配所述發(fā)酵。
葡萄酒中微生物的代謝活性導(dǎo)致產(chǎn)生香味和風(fēng)味化合物，其中一些化合物對(duì)消費(fèi)者是非常有害的，并且所有的這些化合物都與對(duì)所述葡萄酒的各種特性負(fù)責(zé)的化合物不同。…加入二氧化硫防止了化學(xué)氧化反應(yīng)，在此意義上，二氧化硫是天然葡萄香味和風(fēng)味的重要的穩(wěn)定劑。可以將二氧化硫加入所述果汁或汁液以保持風(fēng)味，不一定要做為抗微生物劑加入。但是，當(dāng)選擇將被遺傳修飾以生產(chǎn)葡萄酒的菌株時(shí)，必須考慮二氧化硫的抗微生物活性?！币虼?，在葡萄酒生產(chǎn)中使用了潛在有害的化學(xué)物質(zhì)，例如二氧化硫。
本發(fā)明尋求克服與用抗氧化劑制備食品的現(xiàn)有技術(shù)方法相關(guān)聯(lián)的任何問(wèn)題。
按照本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供制備包含抗氧化劑和至少一種其它組分的介質(zhì)的方法，所述方法包括在所述介質(zhì)中原位制備所述抗氧化劑；并且其中通過(guò)使用重組DNA技術(shù)從葡聚糖制備所述抗氧化劑。
按照本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供制備包含抗氧化劑和至少一種其它組分的介質(zhì)的方法，所述方法包括在所述介質(zhì)中原位制備所述抗氧化劑；并且其中通過(guò)使用重組葡聚糖裂合酶制備所述抗氧化劑。
按照本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供通過(guò)按照本發(fā)明的方法制備的介質(zhì)。
本發(fā)明的其它方面包括使用果糖酐(anhydrofructose)做為介質(zhì)的抗氧化劑，所述介質(zhì)包含至少一種其它組分，其中所述果糖酐在所述介質(zhì)中原位制備。
使用果糖酐做為賦予或改進(jìn)植物逆境耐性的手段，其中所述果糖酐在所述植物中原位制備。
使用果糖酐做為賦予或改進(jìn)葡萄轉(zhuǎn)化的手段，其中所述果糖酐在所述葡萄中原位制備。
使用果糖酐做為提高食品(優(yōu)選為水果或蔬菜，更優(yōu)選為新鮮水果或新鮮蔬菜)中抗氧化劑水平的手段，其中所述果糖酐在所述食品中原位制備。
使用果糖酐做為食品中的藥物，其中所述果糖酐在所述食品中原位制備。
給予包含果糖酐的食品的方法，其中所述果糖酐處于藥用可接受的量，并做為藥物起作用；并且其中已在所述食品中原位制備所述果糖酐。
使用果糖酐做為食品中的營(yíng)養(yǎng)藥，其中所述果糖酐在所述食品中原位制備。
給予包含果糖酐的食品的方法，其中所述果糖酐處于營(yíng)養(yǎng)藥可接受的量，并做為營(yíng)養(yǎng)藥起作用；并且其中已在所述食品中原位制備所述果糖酐。
使用葡聚糖裂合酶做為賦予或改進(jìn)植物逆境耐性的手段，其中所述葡聚糖裂合酶在所述植物中原位制備。
使用葡聚糖裂合酶做為賦予或改進(jìn)葡萄轉(zhuǎn)化的手段，其中所述葡聚糖裂合酶在所述葡萄中原位制備。
使用葡聚糖裂合酶做為提高食品(優(yōu)選為水果或蔬菜，更優(yōu)選為新鮮水果或新鮮蔬菜)中抗氧化劑水平的手段，其中所述葡聚糖裂合酶在所述食品中原位制備。
使用葡聚糖裂合酶制備食品中的藥物，其中所述葡聚糖裂合酶在所述食品中原位制備。
給予包含抗氧化劑的食品的方法，其中所述抗氧化劑處于藥用可接受的量，并做為藥物起作用；并且其中已在所述食品中從葡聚糖裂合酶制備所述抗氧化劑。
使用葡聚糖裂合酶制備食品中的營(yíng)養(yǎng)藥，其中所述葡聚糖裂合酶在所述食品中原位制備。
給予包含抗氧化劑的食品的方法，其中所述抗氧化劑處于營(yíng)養(yǎng)藥可接受的量，并做為營(yíng)養(yǎng)藥起作用；并且其中已在所述食品中從葡聚糖裂合酶原位制備所述果糖酐。
使用編碼葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做為賦予或改進(jìn)植物逆境耐性的手段，其中所述核苷酸序列在所述植物中原位表達(dá)。
使用編碼葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做為賦予或改進(jìn)葡萄轉(zhuǎn)化的手段，其中所述核苷酸序列在所述葡萄中原位表達(dá)。
使用編碼葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做為提高食品(優(yōu)選為水果或蔬菜，更優(yōu)選為新鮮水果或新鮮蔬菜)中抗氧化劑水平的手段，其中所述核苷酸序列在所述食品中原位表達(dá)。
使用編碼葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做為在食品中產(chǎn)生藥物的手段，其中所述核苷酸序列在所述食品中原位表達(dá)。
給予包含抗氧化劑的食品的方法，其中所述抗氧化劑處于藥用可接受的量，并做為藥物起作用；并且其中已在所述食品中借助編碼葡聚糖裂合酶的核苷酸序列制備所述抗氧化劑。
使用編碼葡聚糖裂合酶的核苷酸序列做為在食品中產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)藥的手段，其中所述核苷酸序列在所述食品中原位表達(dá)。
給予包含抗氧化劑的食品的方法，其中所述抗氧化劑處于營(yíng)養(yǎng)藥可接受的量，并做為營(yíng)養(yǎng)藥起作用；并且其中已在所述食品中借助編碼葡聚糖裂合酶的核苷酸序列制備所述抗氧化劑。
術(shù)語(yǔ)“營(yíng)養(yǎng)藥”指可以做為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(即，它適于例如口服)起作用、又可以表現(xiàn)出藥學(xué)效果和/或化妝品效果的化合物。
與加入抗氧化劑介質(zhì)的常用方法相反(所述介質(zhì)諸如食品)，我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)可以在所述介質(zhì)中原位制備特定的抗氧化劑。
原位制備抗氧化劑特別優(yōu)越，因?yàn)樾枰蛩鼋橘|(zhì)中加入較少的其它抗氧化劑或不需要加入其它抗氧化劑，所述介質(zhì)諸如食品。
本發(fā)明由于提供改進(jìn)植物逆境耐性的方法，因此也被認(rèn)為是優(yōu)越的。
由于本發(fā)明提供能生存發(fā)育的轉(zhuǎn)化葡萄，因此也是優(yōu)越。
本發(fā)明是更加優(yōu)越的，因?yàn)樗艿檬称分械目寡趸瘎┧教岣摺＿\(yùn)可能具有有益的健康意義。在此方面，近期的報(bào)道(例如Biotechnology Newswatch 1997年4月21日“在咖啡中發(fā)現(xiàn)的與水果中同樣有效的抗氧化劑”，Marjorie Shaffer)提出抗氧化劑例如在防止或抑制癌形成方面具有藥物的益處。
以前Badiani等在Agro-Food-Industry Hi-Tech(1996年3月/4月，第21-26頁(yè))中以及綜述了在植物中一般性原位制備抗氧化劑。但是注意到該綜述沒(méi)有提及從葡聚糖原位制備抗氧化劑，更不用說(shuō)利用重組葡聚糖裂合酶原位制備抗氧化劑。
優(yōu)選地，所述葡聚糖包含α-1，4鍵。
優(yōu)選地，所述葡聚糖是淀粉或淀粉的單位。
優(yōu)選地，所述葡聚糖是重組酶的底物，使得所述葡聚糖與所述重組酶的接觸產(chǎn)生所述抗氧化劑。
優(yōu)選地，所述酶是葡聚糖裂合酶。
優(yōu)選地，所述酶是α-1，4葡聚糖裂合酶。
優(yōu)選地，所述酶包含SEQ ID No 1-6所示序列的任何一個(gè)序列，或其變異體、同源物或片段。
優(yōu)選地，所述酶是SEQ ID No 1-6所示序列的任何一個(gè)序列。
優(yōu)選地，所述酶由包含SEQ ID No 7-12所示序列的任何一個(gè)序列的核苷酸序列或其變異體、同源物或片段編碼。
優(yōu)選地，所述酶由具有SEQ ID No 7-12所示序列的任何一個(gè)序列的核苷酸序列編碼。
優(yōu)選地，所述抗氧化劑是果糖酐。
優(yōu)選地，所述抗氧化劑是1，5-D-果糖酐。
優(yōu)選地，所述介質(zhì)是食品，或用于制備食品。
優(yōu)選地，所述食品是飲料。
優(yōu)選地，所述飲料是酒精飲料。
優(yōu)選地，所述飲料是葡萄酒。
優(yōu)選地，所述抗氧化劑在所述組分中原位制備，然后釋放進(jìn)入所述介質(zhì)中。
優(yōu)選地，所述組分是植物或其一部分。
優(yōu)選地，所述組分是谷類作物或水果的整體或一部分。
優(yōu)選地，所述組分是葡萄的整體或其一部分。
所述介質(zhì)可以用作食品或用于制備食品，所述食品包括飲料?；蛘?，所述介質(zhì)可以用于聚合物化學(xué)。在此方面，所述原位產(chǎn)生的抗氧化劑可以因此做為在例如聚合物合成的過(guò)程中的氧清除劑，所述聚合物的合成諸如生物可降解塑料的合成。
按照本發(fā)明，在所述介質(zhì)中原位制備所述抗氧化劑(優(yōu)選為果糖酐)。換言之，在所述介質(zhì)中原位制備的所述抗氧化劑(優(yōu)選為果糖酐)用作所述介質(zhì)中的抗氧化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述介質(zhì)中原位制備的所述抗氧化劑(優(yōu)選為果糖酐)用作所述介質(zhì)中的主要的抗氧化劑。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“在所述介質(zhì)中原位”包括由所述組分表達(dá)的重組酶對(duì)葡聚糖的作用制備抗氧化劑，該葡聚糖是所述酶的底物。該術(shù)語(yǔ)亦包括通過(guò)由所述組分表達(dá)的重組酶對(duì)所述組分內(nèi)的葡聚糖作用制備抗氧化劑和所述抗氧化劑的后續(xù)產(chǎn)生。該術(shù)語(yǔ)亦包括由所述組分表達(dá)所述重組酶并且然后將其釋放進(jìn)入所述介質(zhì)中，該酶作用于存在于所述介質(zhì)中的葡聚糖，以在所述介質(zhì)中形成所述抗氧化劑，其中該葡聚糖是所述酶的底物。該術(shù)語(yǔ)亦包括在所述介質(zhì)中存在另一組分或?qū)⒘硪唤M分加入所述介質(zhì)，該組分然后表達(dá)重組核苷酸序列，導(dǎo)致所述介質(zhì)的一部分或全部暴露于抗氧化劑，所述抗氧化劑可以是由另一組分表達(dá)和釋放的重組酶或重組蛋白質(zhì)，或可以是在已暴露于所述重組酶或重組蛋白質(zhì)的介質(zhì)中的葡聚糖的產(chǎn)物，該葡聚糖是所述酶的底物。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“通過(guò)使用重組DNA技術(shù)”包括通過(guò)使用作用于所述葡聚糖的重組酶或重組蛋白質(zhì)得到任何抗氧化劑。該術(shù)語(yǔ)亦包括通過(guò)使用作用于重組葡聚糖的酶或蛋白質(zhì)得到的抗氧化劑。
與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“淀粉”包括天然淀粉、降解淀粉、改性淀粉，包括其組分直鏈淀粉和支鏈淀粉以及其葡萄糖單位。
與所述酶相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“變異體”、“同源物”或“片段”包括所述序列的一個(gè)(或多個(gè))氨基酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或添加，只要產(chǎn)生的氨基酸序列具有α-葡聚糖裂合酶活性，優(yōu)選至少具有與如SEQ ID No 1-6所示酶的任何一個(gè)的相同的活性。具體地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“同源物”包括結(jié)構(gòu)和/或功能方面的同源性，只要產(chǎn)生的酶具有α-葡聚糖裂合酶活性。關(guān)于序列同源性，與SEQ ID No 1-6所示序列的任何一個(gè)的同源性優(yōu)選地為至少75％，更優(yōu)選為至少85％，更加優(yōu)選為至少90％。與SEQ ID No 1-6所示序列的任何一個(gè)的同源性更加優(yōu)選為至少95％，更加優(yōu)選為至少98％。
與編碼所述酶的核苷酸序列相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“變異體”、“同源物”或“片段”包括所述序列的一個(gè)(或多個(gè))核酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或添加，只要產(chǎn)生的核苷酸序列編碼具有α-葡聚糖裂合酶活性的酶，該酶優(yōu)選至少具有與如SEQ ID No 1-6所示酶的任何一個(gè)的相同的活性。具體地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“同源物”包括結(jié)構(gòu)和/或功能方面的同源性，只要產(chǎn)生的核苷酸序列編碼酶具有α-葡聚糖裂合酶活性的酶。關(guān)于序列同源性，與SEQ ID No 7-12所示序列的任何一個(gè)的同源性優(yōu)選地為至少75％，更優(yōu)選為至少85％，更加優(yōu)選為至少90％。與SEQ ID No 7-12所示序列的任何一個(gè)的同源性更加優(yōu)選為至少95％，更加優(yōu)選為至少98％。
上述術(shù)語(yǔ)與所述序列的等位變異同義。
本發(fā)明亦包括可以與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
與本發(fā)明相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“核苷酸”包括cDNA。
按照本發(fā)明，因此提供了在可氧化介質(zhì)中原位制備抗氧化劑的方法。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗氧化劑是果糖酐，更優(yōu)選是1，5-D-果糖酐。1，5-D-果糖酐已經(jīng)被化學(xué)合成(Lichtenthaler，載于Tetrahedron Letters第21卷第1429-1432頁(yè))。在WO 95/10616、WO95/10618和GB-B-2294048中進(jìn)一步討論了1，5-D-果糖酐。
使用1，5-D-果糖酐做為抗氧化劑的主要優(yōu)點(diǎn)是，它是一種天然產(chǎn)物、是不可代謝的、容易制造、是水溶性的，并且它一般無(wú)毒。
按照WO 95/10616、WO 95/10618和GB-B-2294048，可以通過(guò)利用α-1，4-葡聚糖裂合酶對(duì)基于α-1，4-葡聚糖的底物進(jìn)行酶修飾而制備1，5-D-果糖酐。典型的基于α-1，4-葡聚糖的底物是淀粉。
目前，淀粉在工業(yè)中有廣泛的用途，主要是因?yàn)樗橇畠r(jià)的原材料。在本領(lǐng)域中有許多有關(guān)淀粉的參考資料。例如，Salisbury和Ross在Plant Physiology(第4版，1991，Wadsworth PublishingCompany出版，特別是第11.7節(jié))。然而，簡(jiǎn)言之，淀粉是植物主要的能量?jī)?chǔ)備之一。常常在許多植物的無(wú)色質(zhì)體(造粉體)中、在貯藏組織中和在葉綠體的基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)淀粉。淀粉是多糖碳水化合物。它包含二種主要成分直鏈淀粉和/或支鏈淀粉。直鏈淀粉和/或支鏈淀粉均由α(1，4)-連接的葡萄糖單位(即糖基殘基)直鏈組成，但是支鏈淀粉還包含α(1，6)分枝的葡萄糖單位。
在WO 95/10616和WO 95/10618中討論的適于從淀粉產(chǎn)生1，5-D-果糖酐的一些葡聚糖裂合酶以SEQ I.D.No 1-4顯示。在GB-B-2294048中討論的適于從淀粉產(chǎn)生1，5-D-果糖酐的一些葡聚糖裂合酶以SEQ I.D.No 5-6顯示。
一些編碼在WO 95/10616和WO 95/10618中討論的適于從淀粉產(chǎn)生1，5-D-果糖酐的葡聚糖裂合酶的核苷酸序列如SEQ I.D.No 7-10所示。一些編碼在GB-B-2294048中討論的適于從淀粉產(chǎn)生1，5-D-果糖酐的葡聚糖裂合酶的核苷酸序列如SEQ I.D.No 11-12所示。
在WO 94/09122中討論了再一種葡聚糖裂合酶。
可以從諸如真菌(優(yōu)選為中肋羊肚菌(Morchella costata)或普通羊肚菌(Morchella vulgaris))的來(lái)源、或從真菌感染的藻類(優(yōu)選為Gracilariopsis lemaneiformis)、或僅從藻類(優(yōu)選為Gracilariopsislemaneiformis)克隆編碼所述酶的重組核苷酸序列。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)用重組α-1，4-葡聚糖裂合酶處理α-1，4-葡聚糖制備α-1，5-果糖酐，所述葡聚糖裂合酶諸如SEQ I.D.No 1-6所示的任何一個(gè)。
可以在WO 95/10616、WO 95/10618和GB-B-2294048的敘述中找到怎樣制備如SEQ I.D.No 1-6所示的酶的詳細(xì)評(píng)述。同樣，可以在WO 95/10616、WO 95/10618和GB-B-2294048的敘述中找到怎樣分離和克隆核苷酸序列SEQ I.D.No 7-12的詳細(xì)評(píng)述。
如果所述葡聚糖包含不同于α-1，4-鍵的鍵或者在α-1，4-鍵之外還有其它的鍵，則可以將所述重組α-1，4-葡聚糖裂合酶與可以打斷這種其它鍵的合適的試劑聯(lián)合使用，所述合適的試劑例如重組水解酶，它優(yōu)選為重組葡聚糖水解酶。
在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis T.(編輯)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約1989中找到重組DNA技術(shù)的一般敘述。
為表達(dá)核苷酸序列，宿主生物可以是原核生物或真核生物。合適的原核生物宿主的實(shí)例包括大腸桿菌和枯草桿菌。原核宿主轉(zhuǎn)化的敘述在本領(lǐng)域中已充分記載，例如參見(jiàn)Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)。如果使用原核宿主，則在轉(zhuǎn)化之前可能需適當(dāng)修飾所述基因，例如通過(guò)除去內(nèi)含子而修飾。
在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主生物可以是曲霉屬(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。通過(guò)遵循Rambosek，J.和Leach，J.1987(絲狀真菌的重組DNA進(jìn)展和展望。CRC Crit.Rev.Biotechnol.6357-393)、Davis R.W.1994(曲霉屬中的異源基因表達(dá)和蛋白分泌。載于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(編輯)曲霉屬50年。Progress inindustrial microbiology第29卷。Elsevier Amsterdam 1994.第525-560頁(yè))、Balance，D.J.1991(絲狀真菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和真菌基因結(jié)構(gòu)總覽。載于Leong，S.A.，Berka R.M.(編輯)分子工業(yè)真菌學(xué).絲狀真菌的系統(tǒng)和應(yīng)用。Marcel Dekker Inc.New York 1991.第1-29頁(yè))和Turner G.1994(遺傳操作載體。載于Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(編輯)曲霉屬50年。Progress in industrial microbiology第29卷。ElsevierAmsterdam 1994.第641-666頁(yè))的敘述，可以制備轉(zhuǎn)基因曲霉屬。不過(guò)，以下評(píng)述提供了那些制備轉(zhuǎn)基因曲霉屬的敘述的概要。
近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，絲狀真菌已廣泛地應(yīng)用于許多類型的工業(yè)中以生產(chǎn)有機(jī)化合物和酶。例如，傳統(tǒng)日本酒曲和醬油的發(fā)酵就使用了曲霉屬菌種(Aspergillus sp)。在本世紀(jì)，黑曲霉亦被用于生產(chǎn)有機(jī)酸，特別是檸檬酸，并用于生產(chǎn)在工業(yè)中使用的各種酶。
絲狀真菌在工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用的原因主要有二個(gè)。首先，絲狀真菌可以產(chǎn)生大量的胞外產(chǎn)物，例如酶和諸如抗生素或有機(jī)酸的有機(jī)化合物。其次，絲狀真菌可以在低成本底物上生長(zhǎng)，例如谷物、糠、甜菜粕等。同樣的原因使得絲狀真菌成為異源表達(dá)按照本發(fā)明的重組酶的宿主的有吸引力的生物。
為制備所述轉(zhuǎn)基因曲霉屬，通過(guò)將需要的核苷酸序列插入設(shè)計(jì)用于在絲狀真菌中表達(dá)的構(gòu)建物中，制備表達(dá)構(gòu)建物。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種類型的用于異源表達(dá)的構(gòu)建物。這些構(gòu)建物可以包含一個(gè)在真菌中有活性的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的實(shí)例包括高度表達(dá)的胞外酶的真菌啟動(dòng)子，例如葡糖淀粉酶啟動(dòng)子或α-淀粉酶啟動(dòng)子。可以將所述核苷酸序列與信號(hào)序列融合，所述信號(hào)序列指導(dǎo)由所述核苷酸序列編碼的蛋白的分泌。通常使用真菌來(lái)源的信號(hào)序列。在真菌中有活性的終止子位于表達(dá)系統(tǒng)末端。
在真菌中已開(kāi)發(fā)了另一種類型的表達(dá)系統(tǒng)，其中可以將所述核苷酸序列融合至編碼穩(wěn)定蛋白的真菌基因的較小部分或較大部分。這樣可以穩(wěn)定由所述核苷酸序列編碼的蛋白。在這種系統(tǒng)中，可以將特定蛋白酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)導(dǎo)入所述真菌蛋白和由所述核苷酸序列編碼的蛋白之間，使得可以由所述特定蛋白酶在該位置酶切產(chǎn)生的融合蛋白，由此釋放由所述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。作為實(shí)例，可以導(dǎo)入由在至少一些曲霉屬菌中發(fā)現(xiàn)的KEX-2樣肽酶識(shí)別的位點(diǎn)。這種融合導(dǎo)致體內(nèi)酶切，產(chǎn)生對(duì)所述表達(dá)產(chǎn)物的保護(hù)，而不是對(duì)較大的融合蛋白的保護(hù)。
已報(bào)道了幾種編碼細(xì)菌、真菌、脊椎動(dòng)物和植物蛋白質(zhì)的基因在曲霉屬中的異源表達(dá)。如果所述核苷酸序列未與信號(hào)序列融合，則所述蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)。這種蛋白將在細(xì)胞質(zhì)中積累，并且通常不會(huì)糖基化，這對(duì)一些細(xì)菌蛋白是有利的。如果所述核苷酸序列配有信號(hào)序列，則所述蛋白質(zhì)將在胞外累積。
對(duì)于產(chǎn)物穩(wěn)定性和宿主菌株的修飾而言，一些異源蛋白質(zhì)當(dāng)分泌進(jìn)入真菌培養(yǎng)液中時(shí)不是非常穩(wěn)定。大多數(shù)真菌產(chǎn)生降解異源蛋白質(zhì)的幾種胞外蛋白酶。為避免這種問(wèn)題，已經(jīng)使用了幾種降低了蛋白酶產(chǎn)生的特定真菌菌株做為異源生產(chǎn)的宿主。
為轉(zhuǎn)化絲狀真菌，已針對(duì)許多絲狀真菌開(kāi)發(fā)了幾種轉(zhuǎn)化方案(Ballance 1991，出處同上)。許多這些方案都是基于制備原生質(zhì)體和使用PEG和Ca2+離子將DNA導(dǎo)入所述原生質(zhì)體。然后再生所述轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，并使用各種選擇性標(biāo)記選擇所述轉(zhuǎn)化的真菌。用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)記之中有一些是營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記(例如argB、trpC、niaD和pyrG)、抗生素抗性標(biāo)記例如苯菌靈抗性、潮霉素抗性和腐草霉素抗性。常用的轉(zhuǎn)化標(biāo)記是構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)的amdS基因，其為高拷貝數(shù)，允許所述真菌以丙烯酰胺做為唯一氮源而生長(zhǎng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因生物可以是酵母菌。在這方面，酵母菌也已被廣泛地用作異源基因表達(dá)的載體。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)有長(zhǎng)期的工業(yè)應(yīng)用歷史，包括其用于異源基因表達(dá)。Goodey等(1987，Yeast Biotechnology，D R Berry等編輯，第401-429頁(yè)，Allen and Unwin，London)和King等(1989，酵母的分子和細(xì)胞生物學(xué)，E F Walton和G T Yarronton編輯，第107-133頁(yè)，Blackie，Glasgow)已經(jīng)綜述了異源基因在釀酒酵母中的表達(dá)。
由于幾個(gè)原因，釀酒酵母很適于異源基因表達(dá)。首先，它對(duì)人類無(wú)致病性，并且不會(huì)產(chǎn)生某些內(nèi)毒素。其次，它有幾個(gè)世紀(jì)的各種目的的商用使用的很長(zhǎng)的安全使用歷史。這使得它有廣泛的公眾接受性。第三，對(duì)該生物體的廣泛商業(yè)應(yīng)用和研究已經(jīng)產(chǎn)生有關(guān)釀酒酵母的遺傳學(xué)和生理學(xué)以及大規(guī)模發(fā)酵特征的大量知識(shí)。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“做為異源基因表達(dá)載體的酵母”，酵母，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison編輯，第2版，Academic Press Ltd.)給出了在釀酒酵母中異源基因表達(dá)和基因產(chǎn)物分泌的原則的綜述。
可以得到幾種類型的酵母載體，包括整合型載體，其需要與宿主基因組重組以保持它們，還有自主復(fù)制型質(zhì)粒載體。
為制備轉(zhuǎn)基因酵母屬菌，通過(guò)將所述核苷酸序列插入設(shè)計(jì)用于在酵母中表達(dá)的構(gòu)建物中，制備表達(dá)構(gòu)建物。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種類型的用于異源表達(dá)的構(gòu)建物。所述構(gòu)建物包含融合至所述核苷酸序列的在酵母中有活性的啟動(dòng)子，通常使用酵母來(lái)源的啟動(dòng)子，例如GAL1啟動(dòng)子。通常使用酵母來(lái)源的信號(hào)序列，例如使用了編碼SUC2信號(hào)肽的序列。在酵母中有活性的終止子位于所述表達(dá)系統(tǒng)末端。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于酵母轉(zhuǎn)化的幾種轉(zhuǎn)化方案。例如，可以通過(guò)遵循Hinnen等所述(1978，Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)制備轉(zhuǎn)基因酵母屬菌。
使用各種選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的標(biāo)記之中有許多營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記(諸如LEU2、HIS4和TRP1)，以及顯性抗生素抗性標(biāo)記例如氨基糖苷抗生素標(biāo)記，例如G418。
另一種宿主生物是植物。在此方面，本領(lǐng)域有充實(shí)的制備轉(zhuǎn)基因植物的參考資料。二個(gè)提供可以使用以制備轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)類型的背景評(píng)述的文件是EP-B-0470145和CA-A-2006454，其一部分評(píng)述在下文提供。
遺傳修飾植物構(gòu)建的基本原則是，將遺傳信息插入到所述植物的基因組中，使得可以穩(wěn)定地保持插入的遺傳物質(zhì)。
有幾種插入遺傳信息的技術(shù)，二條主要的原則是直接導(dǎo)入所述遺傳信息和通過(guò)使用載體系統(tǒng)導(dǎo)入所述遺傳信息?？梢栽赑otrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3/4月17-27)的文章中找到一般技術(shù)的綜述。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)攜帶重組核苷酸序列并且可以將所述核苷酸序列導(dǎo)入諸如植物的生物體的基因組，其中所述核苷酸序列可以在原位產(chǎn)生抗氧化劑。
所述載體系統(tǒng)可以包含一個(gè)載體，但是它可以包含至少二個(gè)載體。在二個(gè)載體的情況下，通常將所述載體系統(tǒng)稱為雙載體系統(tǒng)。在Gynheung An等(1980)，雙載體，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19中進(jìn)一步詳細(xì)描述了雙載體系統(tǒng)。
一種廣泛使用的用指定啟動(dòng)子或核苷酸序列或構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的系統(tǒng)，基于使用源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti質(zhì)?；蛟醋悦r(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri質(zhì)粒(An等(1986)，Plant Physiol.81，301-305和Butcher D.N.等(1980)，植物病理學(xué)家的組織培養(yǎng)方法，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208)。
已經(jīng)構(gòu)建了幾種不同的Ti和Ri質(zhì)粒，所述質(zhì)粒適于構(gòu)建上述植物或植物細(xì)胞構(gòu)建物。
本發(fā)明的核苷酸序列應(yīng)優(yōu)選在T-DNA的邊界序列之間或鄰近T-DNA序列插入所述Ti質(zhì)粒，以避免破壞緊接T-DNA邊界的序列，因?yàn)榭磥?lái)這些區(qū)域中的至少一個(gè)對(duì)于將修飾的T-DNA插入植物基因組是必需的。
從上述解釋可以理解，如果所述生物體是植物，則本發(fā)明的載體系統(tǒng)優(yōu)選為包含感染植物所必需的序列(例如，vir區(qū))，并且包含T-DNA序列的至少一個(gè)邊界部分，所述邊界部分與所述遺傳構(gòu)建物位于同一個(gè)載體上。優(yōu)選地，所述載體系統(tǒng)是根癌農(nóng)桿菌Ti-質(zhì)?；蛎r(nóng)桿菌Ri-質(zhì)?；蚱溲苌铮?yàn)檫@些質(zhì)粒在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物方面是眾所周知的并得到廣泛應(yīng)用的，許多現(xiàn)有的載體系統(tǒng)都是基于這些質(zhì)粒或其衍生物。
在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建物或載體可以首先在微生物中構(gòu)建，在所述微生物中，在插入所述植物之前，所述載體可以復(fù)制并且所述微生物易于操作。有用的微生物的實(shí)例是大腸桿菌，但是也可以使用具有上述性質(zhì)的其它微生物。當(dāng)如上述定義的載體系統(tǒng)的載體已在大腸桿菌中構(gòu)建后，如果需要，就將其轉(zhuǎn)移進(jìn)入合適的農(nóng)桿菌菌株，例如根癌農(nóng)桿菌。因此包含本發(fā)明的第一核苷酸序列或構(gòu)建物的Ti-質(zhì)粒優(yōu)選地轉(zhuǎn)移進(jìn)入合適的農(nóng)桿菌菌株，例如根癌農(nóng)桿菌，以得到包含本發(fā)明的啟動(dòng)子或核苷酸序列或構(gòu)建物的農(nóng)桿菌細(xì)胞，所述DNA接著轉(zhuǎn)移進(jìn)入欲修飾的所述植物細(xì)胞。
如CA-A-2006454中所報(bào)道的，可以得到大量的克隆載體，它們含有大腸桿菌中的復(fù)制系統(tǒng)和允許選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)記。所述載體包括例如pBR322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC 184等。如此，本發(fā)明的啟動(dòng)子或核苷酸或構(gòu)建物可以導(dǎo)入所述載體中的合適限制位置。所述包含的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將所述大腸桿菌細(xì)胞在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后收獲和溶菌。然后回收所述質(zhì)粒并且進(jìn)行分析，例如通過(guò)以下技術(shù)的任何一種或多種進(jìn)行分析序列分析、限制性分析、電泳和其它生化-分子生物學(xué)方法。在每次操作之后，可以將使用的DNA進(jìn)行限制酶切或通過(guò)PCR計(jì)數(shù)選擇性擴(kuò)增，并且與下一個(gè)DNA序列連接。每個(gè)序列可以在同一質(zhì)粒或不同的質(zhì)粒中克隆。
遵循將按照本發(fā)明的核苷酸序列或構(gòu)建物或載體導(dǎo)入植物的每個(gè)方法后，可能必需存在和/或插入其它DNA序列。如果，例如，使用Ti-或Ri-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，則可以連接所述Ti-和Ri-質(zhì)粒T-DNA的至少右邊界、經(jīng)常是右邊界和左邊界，做為導(dǎo)入基因的側(cè)翼區(qū)域。已深入研究了使用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，在EP-A-120516；Hoekema，載于雙載體植物載體系統(tǒng)分支-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam.1985，第5章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等，EMBO J.(1985)4277-284中進(jìn)行了描述。
用農(nóng)桿菌直接感染植物組織是簡(jiǎn)單的技術(shù)，該技術(shù)已被廣泛使用，在Butcher D.N.等(1980)，植物病理學(xué)家的組織培養(yǎng)方法，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208進(jìn)行了描述。對(duì)于運(yùn)一主題的其它敘述請(qǐng)參見(jiàn)Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3/4月17-27)。使用運(yùn)一技術(shù)，可以在所述植物的某一部分或組織進(jìn)行植物的感染，即，在所述植物的葉、根、莖或其它部分的一部分上進(jìn)行感染。
通常，使用攜帶所述第一核苷酸序列或構(gòu)建物的農(nóng)桿菌直接感染植物組織時(shí)，在欲感染的植物上制造創(chuàng)傷，例如，通過(guò)用刀片切割所述植物或用針頭針刺所述植物或用摩擦性物質(zhì)摩擦所述植物。然后用所述農(nóng)桿菌接種傷口。然后讓已接種的植物或植物部分在合適的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
當(dāng)構(gòu)建植物細(xì)胞時(shí)，按照眾所周知的組織培養(yǎng)方法，在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和可選地保持這些細(xì)胞，例如通過(guò)在添加了諸如氨基酸、植物激素、維生素等的必需生長(zhǎng)因子的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，但是其中該培養(yǎng)基包含按照本發(fā)明的一種組分。所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成為遺傳修飾的植株可以通過(guò)使用從細(xì)胞或組織培養(yǎng)再生植株的方法完成，例如通過(guò)選擇轉(zhuǎn)化的苗并在含有適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物、植物激素等的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)所述苗。
可以在EP-A-0449375中找到植物轉(zhuǎn)化的其它敘述。
甚至可以參考Spngstad等(1995 Plant Cell Tissue Organ Culture 40第1-15頁(yè))，因?yàn)檫@些作者提供了轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建的一般性概述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物是葡萄藤。在本領(lǐng)域中有一些關(guān)于怎樣制備轉(zhuǎn)化葡萄藤的敘述。例如，可以參考Baribault等(J Exp Bot41(229)1990 1045-1050)、Baribault等(Plant Cell Rep 8(3)1989 137-140)、Scorza等(J Am Soc Horticultural Science 121(4)1996 616-619)、Kikkert等(Plant Cell Reports 15(5)1996 311-316)、Golles等(ActaHortic 1997第447卷號(hào)體外培養(yǎng)和育種的園藝生物技術(shù)第265-275頁(yè))、Gray和Scorza(WO-A-97/49277)和Simon Robinson等(“21世紀(jì)的生物技術(shù)-食品和健康”中提交的會(huì)議摘要和論文，Adelaide，澳大利亞，1998)。做為實(shí)例，Robinson等(出處同上)公開(kāi)了轉(zhuǎn)化葡萄藤的方法，其中在從另一種組織形成的愈傷組織上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，使用農(nóng)桿菌感染將靶基因轉(zhuǎn)移進(jìn)所述胚組織。
可以進(jìn)一步參考Andrew Walker在Nature Biotechnology(14卷，1996年5月，第582頁(yè))中的敘述，表述為“葡萄做為世界上最重要的水果植物之一，非常難以進(jìn)行工程改造，因?yàn)樗懈咚降镊焚|(zhì)和酚，它們干擾細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化；所述化合物快速氧化并促使葡萄細(xì)胞腐爛?！痹谕黄贜ature Biotechnology中，Perl等(第624-628頁(yè))報(bào)道了使用聚乙烯聚吡咯烷酮和二硫蘇糖醇的組合改進(jìn)農(nóng)桿菌感染時(shí)葡萄轉(zhuǎn)化的生存力。
由此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化葡萄的替代方法。在此方面，按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的葡萄原位產(chǎn)生的抗氧化劑改進(jìn)了農(nóng)桿菌感染時(shí)葡萄轉(zhuǎn)化的生存力。
因此，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了原位制備的抗氧化劑用于有效轉(zhuǎn)化葡萄的用途。
在一些情況下，需要使所述重組酶或蛋白質(zhì)容易地分泌進(jìn)入所述培養(yǎng)基以做為其中的抗氧化劑起作用或在其中產(chǎn)生抗氧化劑。在這種情況下，將編碼所述重組酶的DNA融合至特別是源自選定宿主的合適的信號(hào)序列、適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和適當(dāng)?shù)慕K止子。
例如，為在黑曲霉中表達(dá)，將gpdA(源自構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)啟動(dòng)子和信號(hào)序列融合至編碼所述成熟裂合酶的DNA的5’末端。將源自黑曲霉trpC基因的終止子序列置于所述基因的3’(Punt，P.J.等，1991-(1991)J.Biotech.17，19-34)。將此構(gòu)建物插入含有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和選擇起點(diǎn)以及黑曲霉的選擇標(biāo)記的載體。黑曲霉的選擇標(biāo)記的實(shí)例是amdS基因、argB基因、pyrG基因、hygB基因、BmlR基因，它們都已被用于選擇轉(zhuǎn)化體。該質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)化進(jìn)入黑曲霉，可以從所述轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基中回收成熟的裂合酶。最終可以將此構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進(jìn)入蛋白酶缺陷型菌株，以降低所述裂合酶在培養(yǎng)基中的蛋白酶水解降解(Archer D.B.等1992-Biotechnol.Lett.14，357-362)。
另外，如上述表明的，除了使用黑曲霉做為宿主外，還有其它工業(yè)上重要的微生物可以用作表達(dá)系統(tǒng)。這些其它宿主的實(shí)例包括米曲霉(Aspergillus oryzae)、曲霉屬菌種(Aspergillus sp.)、木霉屬菌種(Trichoderma sp.)、釀酒酵母、克魯維酵母屬菌種(Kluyveromycessp.)、漢遜酵母屬菌種(Hansenula sp.)、畢赤酵母屬菌種(Pichia sp.)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、芽孢桿菌屬菌種(Bacillus sp.)、鏈霉菌屬菌種(Streptomyces sp.)或大腸桿菌。
按照本發(fā)明，可以將合適的標(biāo)記或選擇工具導(dǎo)入欲用所述核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主。合適的標(biāo)記或選擇工具的實(shí)例在以下文獻(xiàn)中的任何一個(gè)中都有描述WO-A-93/05163、WO-A-94/20627、GB專利申請(qǐng)第9702591.0號(hào)(1997年2月7日申請(qǐng))、GB專利申請(qǐng)地9702576.1號(hào)(1997年2月7日申請(qǐng))、GB專利申請(qǐng)第9702539.9號(hào)(1997年2月7日申請(qǐng))、GB專利申請(qǐng)地9702510.0號(hào)(1997年2月7日申請(qǐng))和GB專利申請(qǐng)第9702592.8號(hào)(1997年2月7日申請(qǐng))。
簡(jiǎn)言之，本發(fā)明涉及包括制備一種包含抗氧化劑和至少一種其它組分的介質(zhì)的方法，該方法包括在所述介質(zhì)中原位制備所述抗氧化劑；并且其中所述抗氧化劑通過(guò)使用重組DNA技術(shù)從葡聚糖制備和/或所述抗氧化劑通過(guò)使用重組葡聚糖裂合酶制備。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備包括抗氧化劑和至少一種其它組分的介質(zhì)的方法，所述方法包括在所述介質(zhì)中原位制備所述抗氧化劑；并且其中所述抗氧化劑通過(guò)使用重組葡聚糖裂合酶由葡聚糖制備。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備包含抗氧化劑和至少一種其它組分的介質(zhì)的方法，所述方法包括在所述介質(zhì)中原位制備所述抗氧化劑；其中所述抗氧化劑通過(guò)使用重組葡聚糖裂合酶由葡.聚糖制備；并且其中所述抗氧化劑是果糖酐。
現(xiàn)在僅通過(guò)實(shí)施例描述本發(fā)明。
轉(zhuǎn)基因葡萄按照Perl等(出處同上)的敘述制備轉(zhuǎn)基因葡萄，但是其中使用聚乙烯聚吡咯烷酮和二硫蘇糖醇的組合是可選的。在這些研究中，用如SEQ ID No 7-12提出的任何一個(gè)核苷酸序列轉(zhuǎn)化所述葡萄。所述轉(zhuǎn)化導(dǎo)致原位制備1，5-D-果糖酐。由于前述的一個(gè)或多個(gè)理由，所述轉(zhuǎn)化的葡萄是有益的。
這些研究的細(xì)節(jié)如下。
轉(zhuǎn)化研究的組織培養(yǎng)系統(tǒng)從葡萄優(yōu)質(zhì)無(wú)核栽培品種(Vitis vinifera CV Superior Seedless)的花藥營(yíng)養(yǎng)組織發(fā)育出長(zhǎng)期體細(xì)胞胚發(fā)生(somatic embryogenic)愈傷組織培養(yǎng)物。先前描述了花藥培養(yǎng)、誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生和胚胎培養(yǎng)物的保持方法(Perl等，1995，Plant Sci 104193-200)。簡(jiǎn)言之，將胚胎發(fā)生愈傷組織保持在固化(0.25％脫乙酰吉蘭糖膠)MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962，Physiol Plant 15473-497)上，該MS培養(yǎng)基添加了6％蔗糖、2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、5mg/L吲哚-3-天冬氨酸(IASP)、0.2mg/L 6-芐基腺嘌呤(BAP)和1mg/L脫落酸(ABA)。將所述愈傷組織轉(zhuǎn)移至添加了同樣的植物激素但用2mg/L 2-萘氧基乙酸(NOA)取代了2，4-D的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)原胚發(fā)生愈傷組織。該階段用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
農(nóng)桿菌菌株為研究葡萄胚胎發(fā)生愈傷組織對(duì)存在不同農(nóng)桿菌菌株的敏感性、或者為進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，使用以下根癌農(nóng)桿菌菌株嘗試協(xié)同培養(yǎng)EHA 101-p492(Perl等1993，Bio/Technology 11715-718)；LBA4404-pGPTV(Becker等，1992，Plant Mol Biol 201195-1197)；和GVE3101-pPCV91(Vancanneyt等，1990，Mol Gen Genet 220245-250)。這些菌株帶有分別賦予對(duì)卡那霉素(nptII)、basta(bar)和潮霉素(hpt)抗性的雙載體，它們均在胭脂氨酸合酶(NOS)啟動(dòng)子和終止子的控制之下。將細(xì)菌在液體LB培養(yǎng)基中與抗生素一起于28℃、200rpm下培養(yǎng)24小時(shí)。
協(xié)同培養(yǎng)為研究葡萄胚胎發(fā)生愈傷組織對(duì)不同農(nóng)桿菌菌株的敏感性，從農(nóng)桿菌菌株的過(guò)夜培養(yǎng)物制備具有不同光密度(于630nm時(shí)為0.1-0.7)的細(xì)菌培養(yǎng)物。將細(xì)菌于5000rpm離心5分鐘，再懸浮于無(wú)抗生素McCown Woody植物培養(yǎng)基(WPM)(Lloyd和McCown，1981，Int PlantProp Soc Proc 30421-427)。將3克鮮重的胚胎發(fā)生愈傷組織(轉(zhuǎn)移至含有NOA的培養(yǎng)基7天后)再懸浮于10ml過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌懸浮液5分鐘，吸干并轉(zhuǎn)移至含有再生培養(yǎng)基[基礎(chǔ)WPM培養(yǎng)基，添加噻苯隆(TDZ)(0.5mg/L)、玉米素核苷(ZR)(0.5mg/L)和蔗糖(3％)]的培養(yǎng)皿。用脫乙酰吉蘭糖膠(0.25％w/v)固化所述再生培養(yǎng)基，所述愈傷組織在起始時(shí)排干多余的細(xì)菌后，于25℃于黑暗中協(xié)同培養(yǎng)不同的時(shí)間(從5分鐘至7天)。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，從LBA 4404或GVE 3101的過(guò)夜培養(yǎng)物制備接種物(于630nm時(shí)OD 0.6)。將細(xì)菌于5000rpm離心5分鐘，再懸浮于無(wú)抗生素WPM培養(yǎng)基中。將胚胎發(fā)生愈傷組織(3克鮮重)再懸浮于10ml細(xì)菌中5分鐘，吸干并轉(zhuǎn)移至含有固化(0.25％w/v)脫乙酰吉蘭糖膠再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)基添加了不同的抗氧化劑。所述愈傷組織于25℃于黑暗中協(xié)同培養(yǎng)48小時(shí)。
選擇性培養(yǎng)協(xié)同培養(yǎng)48小時(shí)后，將所述胚胎發(fā)生愈傷組織在含有抗氧化劑的再生培養(yǎng)基上于黑暗中保持7天。接著，將愈傷組織收集在無(wú)菌金屬網(wǎng)上，在40μE/m2/s(白色熒光管)下于25℃轉(zhuǎn)移至新鮮WPM再生培養(yǎng)基。所有的再生培養(yǎng)基都添加了400mg/L頭孢噻肟、1.5g/L麥芽汁和不同的選擇標(biāo)記卡那霉素(50-500mg/L)、潮霉素(15mg/L)和Basta(1-10mg/L)。使用了潮霉素濃度的周期性增加。將推測(cè)的轉(zhuǎn)化愈傷組織在添加了15mg/L潮霉素的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每二周將再生的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分別添加了20和25mg/L潮霉素的新鮮培養(yǎng)基上。亦將對(duì)照、未轉(zhuǎn)化的葡萄愈傷組織在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并周期性地暴露于升高的潮霉素濃度。將在選擇性再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)8-10周的愈傷組織上發(fā)育的綠色不定胚轉(zhuǎn)移至發(fā)芽培養(yǎng)基。如所述(Perl等，1995，Plant Sci 104193-200)，在WPM上誘導(dǎo)胚胎發(fā)芽、生根和后續(xù)小植物的發(fā)育，所述WPM添加了25mg/L潮霉素或10mg/Lbasta。使用如所述(Perl等，1995，Plant Sci 104193-200)添加了0.1mg/L NAA的固化WPM培養(yǎng)基，得到玻璃化異常小植物向正常外表葡萄小植物的轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可以在我們的共同未決的專利申請(qǐng)PCT/EP96/03053、PCT/EP96/03052和PCT/EP94/01082(每個(gè)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中找到馬鈴薯轉(zhuǎn)化的一般敘述。
對(duì)于目前的研究，采用了以下程序。
質(zhì)粒構(gòu)建將含有輔助vir質(zhì)粒pRAL4404(Hoekema等，1983 Nature 303第179-180頁(yè))的解除武裝(disarmed)的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA 4404，在含有100mg l-1利福平和500mg l-1硫酸鏈霉素的YMB瓊脂(K2HPO4.3H2O660mg l-1，MgSO4200mg l-1，NaCl 100mg l-1，甘露醇10g l-1，酵母膏400mg l-1，0.8％w/v瓊脂，pH 7.0)上培養(yǎng)。使用Holters等的凍融法(1978Mol Gen Genet 163 181-187)，用pVICTOR IV GNG E35S nagBIV2’或pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2’或pVICTOR IV GNG E35SnagB’(各對(duì)應(yīng)于pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2或pVICTOR IVGNG rbc nagB IV2或pVICTOR IV GNG E35S nagB，但是其中那些質(zhì)粒的每一個(gè)亦含有與功能性啟動(dòng)子可操作地連接的如SEQ ID No 7-12所示的任何一個(gè)核苷酸序列)完成轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化體在含有100mg l-1利福平和500mg l-1鏈霉素和50mg l-1硫酸慶大霉素的YMB瓊脂上選擇。
植物轉(zhuǎn)化將馬鈴薯Saturna栽培品種(Solanum tuberosum cv Saturna)的苗培養(yǎng)物在含有Murashige Skoog基礎(chǔ)鹽(Sigma M6899)(Murashige和Skoog，1965，Physiol Plant 15 473-497)、具有2μM硫代硫酸銀和如Linsmaier和Skoog(1965 Physiol Plant 18 100-127)描述的營(yíng)養(yǎng)物和維生素的LS瓊脂上保持。以每日16小時(shí)光周期于25℃保持所述培養(yǎng)物。約40天后，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在此期間除去葉，將苗切成約8mm長(zhǎng)的單節(jié)段。
將約40天成熟度(5-6cm高)的苗培養(yǎng)物切成8mm的節(jié)間段，將其放置在液體LS培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有用pVICTOR IV GNG E35SnagB IV2’或pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2’或pVICTOR IV GNGE35S nagB’轉(zhuǎn)化的根癌農(nóng)桿菌(A660＝0.5，光程1cm)。于室溫溫育30分鐘后，通過(guò)將所述節(jié)間段于無(wú)菌濾紙上吸干干燥，轉(zhuǎn)移至含有2mg l-12，4-D和500μg l-1反式玉米素的LS瓊脂(0.8％w/v)。用濾紙覆蓋所述外植體，用LS培養(yǎng)基濕潤(rùn)，用紗布于25C覆蓋3天。該處理后，用含有800mg l-1羧芐青霉素的液體LS培養(yǎng)基洗滌所述節(jié)段，轉(zhuǎn)移至含有1mg l-1反式玉米素、100μg l-1赤霉酸(GA3)、具有做為選擇劑的蔗糖(例如7.5g l-1)和葡糖胺(例如2.5g l-1)的LS瓊脂(0.8％w/v)。
每3-4周將所述節(jié)段繼代培養(yǎng)至新鮮基質(zhì)。在3-4周內(nèi)，從所述節(jié)段發(fā)育出苗，新苗的形成持續(xù)3-4個(gè)月。
再生苗生根將再生的苗轉(zhuǎn)移至包含LS-基質(zhì)、瓊脂(8g/l)和羧芐青霉素(800mg/l)的生根基質(zhì)。
通過(guò)按照Hodal，L.等所述(P1.Sci.(1992)，87115-122)對(duì)共導(dǎo)入的β-葡糖醛酸酶基因進(jìn)行GUS檢測(cè)，可以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因植物。
或者，通過(guò)進(jìn)行NPTII檢測(cè)(Radke，S.E.等，Theor.Appl.Genet.(1988)，75685-694)或通過(guò)按照Wang等所述(1993，NAR21第4153-4154頁(yè))進(jìn)行PCR分析，可以確認(rèn)所述再生苗的轉(zhuǎn)基因基因型。
轉(zhuǎn)移至土壤將新生根的植株(高度約2-3cm)從生根基質(zhì)移植至土壤，置于生長(zhǎng)室中(21℃，16小時(shí)光照200-400uE/m2/秒)。當(dāng)所述植株已經(jīng)確立后，將其轉(zhuǎn)移至溫室，它們?cè)跍厥抑猩L(zhǎng)至發(fā)育出塊莖，并且植株上部衰老。
收獲約3個(gè)月后收獲馬鈴薯。
轉(zhuǎn)基因玉米植株介紹自從1983年首次發(fā)表轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生(Leemans，1993Biotechnology 11 s22)以來(lái)，有許多產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的公告，包括特別是雙子葉作物。
直至最近，幾乎沒(méi)有成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉作物的報(bào)道。單子葉植物的這種相對(duì)較慢的進(jìn)展有二個(gè)原因。首先，直至二十世紀(jì)80年代早期，從單子葉植物的培養(yǎng)細(xì)胞和組織有效再生植株一直是非常困難的。通過(guò)將來(lái)自保留形態(tài)發(fā)生潛力的未成熟和胚胎發(fā)生組織的外植體在含有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，最終解決了這個(gè)問(wèn)題。其次，單子葉植物不是根癌農(nóng)桿菌的天然宿主，意味著在雙子葉植物中使用它們的天然載體根癌農(nóng)桿菌成功開(kāi)發(fā)的技術(shù)多年來(lái)在單子葉植物中是不成功的。
不過(guò)，現(xiàn)在可以使用諸如以下的方法成功地轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生育性轉(zhuǎn)基因玉米植株(1)碳化硅晶須；(2)粒子轟擊；(3)PEG處理的原生質(zhì)體攝入DNA；或(4)在組織電穿孔中攝入DNA?？梢允褂妹總€(gè)這些方法制備特別是按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米，Thompson綜述了這些方法(1995 Euphtytica 85第75-80頁(yè))。
具體地說(shuō)，粒子槍方法已經(jīng)成功地用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化。不過(guò)，EP-A-0604662報(bào)道了轉(zhuǎn)化單子葉植物的不同方法。所述方法包括在去分化下或去分化后用含有使用潮霉素抗性基因做為選擇性標(biāo)記的超級(jí)雙載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的培養(yǎng)組織。使用潮霉素選擇證明轉(zhuǎn)基因愈傷組織和植株的產(chǎn)生?？梢允褂迷摲椒ㄖ苽涮貏e是按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米。
在EP-A-0604662的方法之后，EP-A-0672752報(bào)道了非去分化的未成熟胚。在此方面，同時(shí)使用了潮霉素抗性和PPT抗性基因做為選擇標(biāo)記，PPT產(chǎn)生10％或更多的獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株?？梢允褂迷摲椒ㄖ苽涮貏e是按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米。
迄今為止，看來(lái)可以從容易培育的變種-例如近交系A(chǔ)188成功地產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植株。在此方面，請(qǐng)參見(jiàn)Ishida等的敘述(1996 NatureBiotechnology 14第745-750頁(yè))?？梢允褂糜蛇@些研究工作者公開(kāi)的方法制備特別是按照本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米植株。
Vasil(1996 Nature Biotechnology 14 702-703頁(yè))發(fā)表了玉米轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步的綜述文章。盡管可以使用例如粒子槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化制備轉(zhuǎn)化的玉米，但是對(duì)于本研究采用了以下的程序。
質(zhì)粒構(gòu)建將含有輔助vir質(zhì)粒pRAL4404(Hoekema等，1983 Nature 303 179-180頁(yè))的解除武裝的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA 4404，在含有100mg l-1利福平和500mg l-1硫酸鏈霉素的YMB瓊脂(K2HPO4.3H2O 660mg l-1，MgSO4200mg l-1，NaCl 100mg l-1，甘露醇10g l-1，酵母膏400mg l-1，0.8％w/v瓊脂，pH 7.0)上培養(yǎng)。使用Holters等的凍融法(1978Mol GenGenet 163 181-187)，用pVICTOR IV GNG E35S nagB IV2’或pVICTOR IV GNG rbc nagB IV2’或pVICTOR IV GNG E35S nagB’完成轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化體在含有100mg l-1利福平和500mg l-1鏈霉素和50mg l-1硫酸慶大霉素的YMB瓊脂上選擇。
分離和協(xié)同培養(yǎng)外植體分離尺寸為1.5-2.5mm的例如玉米品系A(chǔ)188的未成熟胚，于25℃在光照下與N6-AS中的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA 4404協(xié)同培養(yǎng)2-3天。其后，用含有250mg/l的氨噻肟頭孢霉素的無(wú)菌水洗滌所述胚，并將所述胚轉(zhuǎn)移至LS培養(yǎng)基和250mg/l的氨噻肟頭孢霉素和濃度高至100mg/l的葡糖胺(所述培養(yǎng)基此后稱為L(zhǎng)SS1)選擇轉(zhuǎn)基因植物的條件將所述外植體在LSS1培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周，然后轉(zhuǎn)移至含有葡糖胺和氨噻肟頭孢霉素的LS培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)基上3周后，分離綠色的苗。
轉(zhuǎn)化苗生根將轉(zhuǎn)化的苗轉(zhuǎn)移至含有2mg/l的MS培養(yǎng)基以生根。在此培養(yǎng)基上4周后，將小植株轉(zhuǎn)移至裝有無(wú)菌土壤的盆中馴化。
轉(zhuǎn)基因瓜爾豆植株按照J(rèn)oersbo和Okkels所述(PCT/DK95/00221)，使用攜帶合適質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化瓜爾豆的子葉外植體。
按照本發(fā)明可以轉(zhuǎn)化其它植物，諸如其它水果、其它蔬菜和其它諸如咖啡植物、茶樹(shù)的植物等等。
對(duì)本發(fā)明的其它修飾對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
序列表<110>DANISCO A/S<120>一種制備抗氧化劑的方法<130>Danisco<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1088<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述氨基酸序列<400>1Met Phe Ser Thr Leu Ala Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Ser1 5 10 15Thr Phe Val Gly Ala Glu Val Arg Ser Asn Val Arg Ile His Ser Ala20 25 30Phe Pro Ala Val His Thr Ala Thr Arg Lys Thr Asn Arg Leu Asn Val35 40 45Ser Met Thr Ala Leu Ser Asp Lys Gln Thr Ala Thr Ala Gly Ser Thr50 55 60Asp Asn Pro Asp Gly Ile Asp Tyr Lys Thr Tyr Asp Tyr Val Gly Val65 70 75 80Trp Gly Phe Ser Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly Ser85 90 95Ser Thr Pro Gly Gly Ile Thr Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val Asn100 105 110
Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Ile Thr Val Gln His Pro Val Gln115 120 125Val Gln Val Thr Ser Tyr Asn Asn Asn Ser Tyr Arg Val Arg Phe Asn130 135 140Pro Asp Gly Pro Ile Arg Asp Val Thr Arg Gly Pro Ile Leu Lys Gln145 150 155 160Gln Leu Asp Trp Ile Arg Thr Gln Glu Leu Ser Glu Gly Cys Asp Pro165 170 175Gly Met Thr Phe Thr Ser Glu Gly Phe Leu Thr Phe Glu Thr Lys Asp180 185 190Leu Ser Val Ile Ile Tyr Gly Asn Phe Lys Thr Arg Val Thr Arg Lys195 200 205Ser Asp Gly Lys Val Ile Met Glu Asn Asp Glu Val Gly Thr Ala Ser210 215 220Ser Gly Asn Lys Cys Arg Gly Leu Met Phe Val Asp Arg Leu Tyr Gly225 230 235 240Asn Ala Ile Ala Ser Val Asn Lys Asn Phe Arg Asn Asp Ala Val Lys245 250 255Gln Glu Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Glu Val Asn Cys Lys Tyr Gln Asp260 265 270Thr Tyr Ile Leu Glu Arg Thr Gly Ile Ala Met Thr Asn Tyr Asn Tyr275 280 285Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Trp Asp Leu Arg Pro Pro His His Asp290 295 300Gly Ala Leu Asn Pro Asp Tyr Tyr Ile Pro Met Tyr Tyr Ala Ala Pro305 310 315 320Trp Leu Ile Val Asn Gly Cys Ala Gly Thr Ser Glu Gln Tyr Ser Tyr325 330 335Gly Trp Phe Met Asp Asn Val Ser Gln Ser Tyr Met Asn Thr Gly Asp
340 345 350Thr Thr Trp Asn Ser Gly Gln Glu Asp Leu Ala Tyr Met Gly Ala Gln355 360 365Tyr Gly Pro Phe Asp Gln His Phe Val Tyr Gly Ala Gly Gly Gly Met370 375 380Glu Cys Val Val Thr Ala Phe Ser Leu Leu Gln Gly Lys Glu Phe Glu385 390 395 400Asn Gln Val Leu Asn Lys Arg Ser Val Met Pro Pro Lys Tyr Val Phe405 410 415Gly Phe Phe Gln Gly Val Phe Gly Thr Ser Ser Leu Leu Arg Ala His420 425 430Met Pro Ala Gly Glu Asn Asn Ile Ser Val Glu Glu Ile Val Glu Gly435 440 445Tyr Gln Asn Asn Asn Phe Pro Phe Glu Gly Leu Ala Val Asp Val Asp450 455 460Met Gln Asp Asn Leu Arg Val Phe Thr Thr Lys Gly Glu Phe Trp Thr465 470 475 480Ala Asn Arg Val Gly Thr Gly Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ser Val Phe485 490 495Glu Trp Ala His Asp Lys Gly Leu Val Cys Gln Thr Asn Ile Thr Cys500 505 510Phe Leu Arg Asn Asp Asn Glu Gly Gln Asp Tyr Glu Val Asn Gln Thr515 520 525Leu Arg Glu Arg Gln Leu Tyr Thr Lys Asn Asp Ser Leu Thr Gly Thr530 535 540Asp Phe Gly Met Thr Asp Asp Gly Pro Ser Asp Ala Tyr Ile Gly His545 550 555 560Leu Asp Tyr Gly Gly Gly Val Glu Cys Asp Ala Leu Phe Pro Asp Trp565 570 575
Gly Arg Pro Asp Val Ala Glu Trp Trp Gly Asn Asn Tyr Lys Lys Leu580 585 590Phe Ser Ile Gly Leu Asp Phe Val Trp Gln Asp Met Thr Val Pro Ala595 600 605Met Met Pro His Lys Ile Gly Asp Asp Ile Asn Val Lys Pro Asp Gly610 615 620Asn Trp Pro Asn Ala Asp Asp Pro Ser Asn Gly Gln Tyr Asn Trp Lys625 630 635 640Thr Tyr His Pro Gln Val Leu Val Thr Asp Met Arg Tyr Glu Asn His645 650 655Gly Arg Glu Pro Met Val Thr Gln Arg Asn Ile His Ala Tyr Thr Leu660 665 670Cys Glu Ser Thr Arg Lys Glu Gly Ile Val Glu Asn Ala Asp Thr Leu675 680 685Thr Lys Phe Arg Arg Ser Tyr Ile Ile Ser Arg Gly Gly Tyr Ile Gly690 695 700Asn Gln His Phe Gly Gly Met Trp Val Gly Asp Asn Ser Thr Thr Ser705 710 715 720Asn Tyr Ile Gln Met Met Ile Ala Asn Ash Ile Asn Met Asn Met Ser725 730 735Cys Leu Pro Leu Val Gly Ser Asp Ile Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Asp740 745 750Asn Glu Asn Gln Arg Thr Pro Cys Thr Gly Asp Leu Met Val Arg Tyr755 760 765Val Gln Ala Gly Cys Leu Leu Pro Trp Phe Arg Asn His Tyr Asp Arg770 775 780Trp Ile Glu Ser Lys Asp His Gly Lys Asp Tyr Gln Glu Leu Tyr Met785 790 795 800Tyr Pro Asn Glu Met Asp Thr Leu Arg Lys Phe Val Glu Phe Arg Tyr805 810 815
Arg Trp Gln Glu Val Leu Tyr Thr Ala Met Tyr Gln Asn Ala Ala Phe820 825 830Gly Lys Pro Ile Ile Lys Ala Ala Ser Met Tyr Asn Asn Asp Ser Asn835 840 845Val Arg Arg Ala Gln Asn Asp His Phe Leu Leu Gly Gly His Asp Gly850 855 860Tyr Arg Ile Leu Cys Ala Pro Val Val Trp Glu Asn Ser Thr Glu Arg865 870 875 880Glu Leu Tyr Leu Pro Val Leu Thr Gln Trp Tyr Lys Phe Gly Pro Asp885 890 895Phe Asp Thr Lys Pro Leu Glu Gly Ala Met Asn Gly Gly Asp Arg Ile900 905 910Tyr Asn Tyr Pro Val Pro Gln Ser Glu Ser Pro Ile Phe Val Arg Glu915 920 925Gly Ala Ile Leu Pro Thr Arg Tyr Thr Leu Asn Gly Glu Asn Lys Ser930 935 940Leu Asn Thr Tyr Thr Asp Glu Asp Pro Leu Val Phe Glu Val Phe Pro945 950 955 960Leu Gly Asn Asn Arg Ala Asp Gly Met Cys Tyr Leu Asp Asp Gly Gly965 970 975Val Thr Thr Asn Ala Glu Asp Asn Gly Lys Phe Ser Val Val Lys Val980 985 990Ala Ala Glu Gln Asp Gly Gly Thr Glu Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asp99510001005Cys Tyr Glu Tyr Val Phe Gly Gly Pro Phe Tyr Val Arg Val Arg Gly101010151020Ala Gln Ser Pro Ser Asn Ile His Val Ser Ser Gly Ala Gly Ser Gln1025 103010351040Asp Met Lys Val Ser Ser Ala Thr Ser Arg Ala Ala Leu Phe Asn Asp
104510501055Gly Glu Asn Gly Asp Phe Trp Val Asp Gln Glu Thr Asp Ser Leu Trp106010651070Leu Lys Leu Pro Asn Val Val Leu Pro Asp Ala Val Ile Thr Ile Thr107510801085<210>2<211>1091<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述氨基酸<400>2Met Tyr Pro Thr Leu Thr Phe Val Ala Pro Ser Ala Leu Gly Ala Arg1 5 10 15Thr Phe Thr Cys Val Gly Ile Phe Arg Ser His Ile Leu Ile His Ser20 25 30Val Val Pro Ala Val Arg Leu Ala Val Arg Lys Ser Asn Arg Leu Asn35 40 45Val Ser Met Ser Ala Leu Phe Asp Lys Pro Thr Ala Val Thr Gly Gly50 55 60Lys Asp Asn Pro Asp Asn Ile Asn Tyr Thr Thr Tyr Asp Tyr Val Pro65 70 75 80Val Trp Arg Phe Asp Pro Leu Ser Asn Thr Asn Trp Phe Ala Ala Gly85 90 95Ser Ser Thr Pro Gly Asp Ile Asp Asp Trp Thr Ala Thr Met Asn Val100 105 110Asn Phe Asp Arg Ile Asp Asn Pro Ser Phe Thr Leu Glu Lys Pro Val115 120 125
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<223>人工序列的描述氨基酸<400>6Met Thr Asn Tyr Asn Tyr Asp Asn Leu Asn Tyr Asn Gln Pro Asp Leu1 5 10 15
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<223>人工序列的描述核酸<400>7atgttttcaa cccttgcgtt tgtcgcacct agtgcgctgg gagccagtac cttcgtaggg 60gcggaggtca ggtcaaatgt tcgtatccat tccgcttttc cagctgtgca cacagctact 120cgcaaaacca atcgcctcaa tgtatccatg accgcattgt ccgacaaaca aacggctact 180gcgggtagta cagacaatcc ggacggtatc gactacaaga cctacgatta cgtcggagta 240tggggtttca gccccctctc caacacgaac tggtttgctg ccggctcttc taccccgggt 300ggcatcactg attggacggc tacaatgaat gtcaacttcg accgtatcga caatccgtcc 360atcactgtcc agcatcccgt tcaggttcag gtcacgtcat acaacaacaa cagctacagg 420gttcgcttca accctgatgg ccctattcgt gatgtgactc gtgggcctat cctcaagcag 480caactagatt ggattcgaac gcaggagctg tcagagggat gtgatcccgg aatgactttc 540acatcagaag gtttcttgac ttttgagacc aaggatctaa gcgtcatcat ctacggaaat 600ttcaagacca gagttacgag aaagtctgac ggcaaggtca tcatggaaaa tgatgaagtt 660ggaactgcat cgtccgggaa caagtgccgg ggattgatgt tcgttgatag attatacggt 720aacgctatcg cttccgtcaa caagaacttc cgcaacgacg cggtcaagca ggagggattc 780tatggtgcag gtgaagtcaa ctgtaagtac caggacacct acatcttaga acgcactgga 840atcgccatga caaattacaa ctacgataac ttgaactata accagtggga ccttagacct 900ccgcatcatg atggtgccct caacccagac tattatattc caatgtacta cgcagcacct 960tggttgatcg ttaatggatg cgccggtact tcggagcagt actcgtatgg atggttcatg 1020
gacaatgtct ctcaatctta catgaatact ggagatacta cctggaattc tggacaagag 1080gacctggcat acatgggcgc gcagtatgga ccatttgacc aacattttgt ttacggtgct 1140gggggtggga tggaatgtgt ggtcacagcg ttctctcttc tacaaggcaa ggagttcgag 1200aaccaagttc tcaacaaacg ttcagtaatg cctccgaaat acgtctttgg tttcttccag 1260ggtgttttcg ggacttcttc cttgttgaga gcgcatatgc cagcaggtga gaacaacatc 1320tcagtcgaag aaattgtaga aggttatcaa aacaacaatt tccctttcga ggggctcgct 1380gtggacgtgg atatgcaaga caacttgcgg gtgttcacca cgaagggcga attttggacc 1440gcaaacaggg tgggtactgg cggggatcca aacaaccgat cggtttttga atgggcacat 1500gacaaaggcc ttgtttgtca gacaaatata acttgcttcc tgaggaatga taacgagggg 1560caagactacg aggtcaatca gacgttaagg gagaggcagt tgtacacgaa gaacgactcc 1620ctgacgggta cggattttgg aatgaccgac gacggcccca gcgatgcgta catcggtcat 1680ctggactatg ggggtggagt agaatgtgat gcacttttcc cagactgggg acggcctgac 1740gtggccgaat ggtggggaaa taactataag aaactgttca gcattggtct cgacttcgtc 1800tggcaagaca tgactgttcc agcaatgatg ccgcacaaaa ttggcgatga catcaatgtg 1860aaaccggatg ggaattggcc gaatgcggac gatccgtcca atggacaata caactggaag 1920acgtaccatc cccaagtgct tgtaactgat atgcgttatg agaatcatgg tcgggaaccg 1980atggtcactc aacgcaacat tcatgcgtat acactgtgcg agtctactag gaaggaaggg 2040atcgtggaaa acgcagacac tctaacgaag ttccgccgta gctacattat cagtcgtggt 2100ggttacattg gtaaccagca tttcgggggt atgtgggtgg gagacaactc tactacatca 2160aactacatcc aaatgatgat tgccaacaat attaacatga atatgtcttg cttgcctctc 2220gtcggctccg acattggagg attcacctca tacgacaatg agaatcagcg aacgccgtgt 2280accggggact tgatggtgag gtatgtgcag gcgggctgcc tgttgccgtg gttcaggaac 2340cactatgata ggtggatcga gtccaaggac cacggaaagg actaccagga gctgtacatg 2400tatccgaatg aaatggatac gttgaggaag ttcgttgaat tccgttatcg ctggcaggaa 2460gtgttgtaca cggccatgta ccagaatgcg gctttcggaa agccgattat caaggctgct 2520tcgatgtaca ataacgactc aaacgttcgc agggcgcaga acgatcattt ccttcttggt 2580ggacatgatg gatatcgcat tctgtgcgcg cctgttgtgt gggagaattc gaccgaacgc 2640gaattgtact tgcccgtgct gacccaatgg tacaaattcg gtcccgactt tgacaccaag 2700cctctggaag gagcgatgaa cggaggggac cgaatttaca actaccctgt accgcaaagt 2760gaatcaccaa tcttcgtgag agaaggtgcg attctcccta cccgctacac gttgaacggt 2820gaaaacaaat cattgaacac gtacacggac gaagatccgt tggtgtttga agtattcccc 2880ctcggaaaca accgtgccga cggtatgtgt tatcttgatg atggcggtgt gaccaccaat 2940gctgaagaca atggcaagtt ctctgtcgtc aaggtggcag cggagcagga tggtggtacg 3000gagacgataa cgtttacgaa tgattgctat gagtacgttt tcggtggacc gttctacgtt 3060cgagtgcgcg gcgctcagtc gccgtcgaac atccacgtgt cttctggagc gggttctcag 3120gacatgaagg tgagctctgc cacttccagg gctgcgctgt tcaatgacgg ggagaacggt 3180gatttctggg ttgaccagga gacagattct ctgtggctga agttgcccaa cgttgttctc 3240ccggacgctg tgatcacaat tacctaa 3267<210>8<211>3276<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述核酸<400>8atgtatccaa ccctcacctt cgtggcgcct agtgcgctag gggccagaac tttcacgtgt 60gtgggcattt ttaggtcaca cattcttatt cattcggttg ttccagcggt gcgtctagct 120gtgcgcaaaa gcaaccgcct caatgtatcc atgtccgctt tgttcgacaa accgactgct 180gttactggag ggaaggacaa cccggacaat atcaattaca ccacttatga ctacgtccct 240gtgtggcgct tcgaccccct cagcaatacg aactggtttg ctgccggatc ttccactccc 300ggcgatattg acgactggac ggcgacaatg aatgtgaact tcgaccgtat cgacaatcca 360tccttcactc tcgagaaacc ggttcaggtt caggtcacgt catacaagaa caattgtttc 420agggttcgct tcaaccctga tggtcctatt cgcgatgtgg atcgtgggcc tatcctccag 480cagcaactaa attggatccg gaagcaggag cagtcgaagg ggtttgatcc taagatgggc 540ttcacaaaag aaggtttctt gaaatttgag accaaggatc tgaacgttat catatatggc 600aattttaaga ctagagttac gaggaagagg gatggaaaag ggatcatgga gaataatgaa 660gtgccggcag gatcgttagg gaacaagtgc cggggattga tgtttgtcga caggttgtac 720ggcactgcca tcgcttccgt taatgaaaat taccgcaacg atcccgacag gaaagagggg 780ttctatggtg caggagaagt aaactgcgag ttttgggact ccgaacaaaa caggaacaag 840tacatcttag aacgaactgg aatcgccatg acaaattaca attatgacaa ctataactac 900aaccagtcag atcttattgc tccaggatat ccttccgacc cgaacttcta cattcccatg 960tattttgcag caccttgggt agttgttaag ggatgcagtg gcaacagcga tgaacagtac 1020tcgtacggat ggtttatgga taatgtctcc caaacttaca tgaatactgg tggtacttcc 1080tggaactgtg gagaggagaa cttggcatac atgggagcac agtgcggtcc atttgaccaa 1140cattttgtgt atggtgatgg agatggtctt gaggatgttg tccaagcgtt ctctcttctg 1200caaggcaaag agtttgagaa ccaagttctg aacaaacgtg ccgtaatgcc tccgaaatat 1260gtgtttggtt actttcaggg agtctttggg attgcttcct tgttgagaga gcaaagacca 1320gagggtggta ataacatctc tgttcaagag attgtcgaag gttaccaaag caataacttc 1380cctttagagg ggttagccgt agatgtggat atgcaacaag atttgcgcgt gttcaccacg 1440aagattgaat tttggacggc aaataaggta ggcaccgggg gagactcgaa taacaagtcg 1500gtgtttgaat gggcacatga caaaggcctt gtatgtcaga cgaatgttac ttgcttcttg 1560agaaacgaca acggcggggc agattacgaa gtcaatcaga cattgaggga gaagggtttg 1620tacacgaaga atgactcact gacgaacact aacttcggaa ctaccaacga cgggccgagc 1680gatgcgtaca ttggacatct ggactatggt ggcggaggga attgtgatgc acttttccca 1740gactggggtc gaccgggtgt ggctgaatgg tggggtgata actacagcaa gctcttcaaa 1800attggtctgg atttcgtctg gcaagacatg acagttccag ctatgatgcc acacaaagtt 1860ggcgacgcag tcgatacgag atcaccttac ggctggccga atgagaatga tccttcgaac 1920ggacgataca attggaaatc ttaccatcca caagttctcg taactgatat gcgatatgag 1980aatcatggaa gggaaccgat gttcactcaa cgcaatatgc atgcgtacac actctgtgaa 2040tctacgagga aggaagggat tgttgcaaat gcagacactc taacgaagtt ccgccgcagt 2100tatattatca gtcgtggagg ttacattggc aaccagcatt ttggaggaat gtgggttgga 2160gacaactctt cctcccaaag atacctccaa atgatgatcg cgaacatcgt caacatgaac 2220atgtcttgcc ttccactagt tgggtccgac attggaggtt ttacttcgta tgatggacga 2280aacgtgtgtc ccggggatct aatggtaaga ttcgtgcagg cgggttgctt actaccgtgg 2340ttcagaaacc actatggtag gttggtcgag ggcaagcaag agggaaaata ctatcaagaa 2400
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<223>人工序列的描述核酸
<400>10atggcaggat tatccgaccc tctcaatttc tgcaaagcag aggactacta cgctgctgcc 60aaaggctgga gtggccctca gaagatcatt cgctatgacc agacccctcc tcagggtaca 120aaagatccga aaagctggca tgcggtaaac cttcctttcg atgacgggac tatgtgtgta 180gtgcaattcg tcagaccctg tgtttggagg gttagatatg accccagtgt caagacttct 240gatgagtacg gcgatgagaa tacgaggact attgtacaag actacatgac tactctggtt 300ggaaacttgg acattttcag aggtcttacg tgggtttcta cgttggagga ttcgggcgag 360tactacacct tcaagtccga agtcactgcc gtggacgaaa ccgaacggac tcgaaacaag 420gtcggcgacg gcctcaagat ttacctatgg aaaaatccct ttcgcatcca ggtagtgcgt 480ctcttgaccc ccctggtgga ccctttcccc attcccaacg tagccaatgc cacagcccgt 540gtggccgaca aggttgtttg gcagacgtcc ccgaagacgt tcaggaaaaa cttgcatccg 600cagcataaga tgttgaagga tacagttctt gatattatca agccggggca cggagagtat 660gtgggttggg gagagatggg aggcatcgag tttatgaagg agccaacatt catgaattat 720ttcaactttg acaatatgca atatcagcag gtctatgcac aaggcgctct tgatagtcgt 780gagccgttgt atcactctga tcccttctat ctcgacgtga actccaaccc agagcacaag 840aacattacgg caacctttat cgataactac tctcagattg ccatcgactt tgggaagacc 900aactcaggct acatcaagct gggtaccagg tatggcggta tcgattgtta cggtatcagc 960gcggatacgg tcccggagat tgtgcgactt tatactggac ttgttgggcg ttcgaagttg 1020aagcccaggt atattctcgg agcccaccaa gcttgttatg gataccagca ggaaagtgac 1080ttgcatgctg ttgttcagca gtaccgtgac accaagtttc cgcttgatgg gttgcatgtc 1140gatgtcgact ttcaggacaa tttcagaacg tttaccacta acccgattac gttccctaat 1200cccaaagaaa tgtttaccaa tctaaggaac aatggaatca agtgttccac caacatcacc 1260cctgttatca gtatcagaga tcgcccgaat gggtacagta ccctcaatga gggatatgat 1320aaaaagtact tcatcatgga tgacagatat accgagggga caagtgggga cccgcaaaat 1380gttcgatact ctttttacgg cggtgggaac ccggttgagg ttaaccctaa tgatgtttgg 1440gctcggccag actttggaga caattatgac ttccctacga acttcaactg caaagactac 1500ccctatcatg gtggtgtgag ttacggatat gggaatggca ctccaggtta ctaccctgac 1560cttaacagag aggaggttcg tatctggtgg ggattgcagt acgagtatct cttcaatatg 1620ggactagagt ttgtatggca agatatgaca accccagcga tccattcatc atatggagac 1680atgaaagggt tgcccacccg tctgctcgtc accgccgact cagttaccaa tgcctctgag 1740aaaaagctcg caattgaaag ttgggctctt tactcctaca acctccataa agcaaccttc 1800cacggtcttg gtcgtcttga gtctcgtaag aacaaacgta acttcatcct cggacgtggt 1860agttacgccg gtgcctatcg ttttgctggt ctctggactg gagataacgc aagtacgtgg 1920gaattctgga agatttcggt ctcccaagtt ctttctctag gtctcaatgg tgtgtgtata 1980gcggggtctg atacgggtgg ttttgagccc gcacgtactg agattgggga ggagaaatat 2040tgcagtccgg agctactcat caggtggtat actggatcat tccttttgcc atggcttaga 2100aaccactacg tcaagaagga caggaaatgg ttccaggaac catacgcgta ccccaagcat 2160cttgaaaccc atccagagct cgcagatcaa gcatggcttt acaaatctgt tctagaaatt 2220tgcagatact gggtagagct aagatattcc ctcatccagc tcctttacga ctgcatgttc 2280caaaacgtgg tcgatggtat gccacttgcc agatctatgc tcttgaccga tactgaggat 2340acgaccttct tcaatgagag ccaaaagttc ctcgataacc aatatatggc tggtgacgac 2400atccttgtag cacccatcct ccacagccgt aacgaggttc cgggagagaa cagagatgtc 2460tatctccctc tattccacac ctggtacccc tcaaacttga gaccgtggga cgatcaggga 2520gtcgctttag ggaatcctgt cgaaggtggc agcgttatca actacactgc caggattgtt 2580
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<223>人工序列的描述核酸<400>11atgtttccta ccctgacctt catagcgccc agcgcgctgg ccgccagcac ctttgtgggc 60gcggatatcc gatcgggcat tcgcattcaa tccgctcttc cggccgtgcg caacgctgtg 120cgcaggagca aacattacaa tgtatccatg accgcattgt ctgacaagca aaccgctatc 180agtattggcc ctgacaatcc ggacggtatc aactaccaaa actacgatta catccctgta 240gcgggcttta cgcccctctc caacaccaac tggtatgctg ccggctcttc cactccgggc 300ggcatcaccg actggaccgc taccatgaat gtcaaattcg accgcattga caatccgtcg 360tactccaata accatcctgt tcagattcag gtcacgtcgt acaacaacaa cagcttcagg 420attcgcttca accctgatgg ccccattcgt gacgtctctc gaggacctat cctgaaacag 480caactcactt ggattcgaaa ccaggagctg gcgcagggat gtaatccgaa catgagcttc 540tctcctgaag gttttttgtc ttttgaaacc aaagacctaa acgttataat ctacggcaac 600tgcaagatga gagtcacgaa gaaggatggc tacctcgtca tggagaatga cgagtgcaac 660tcgcaatcag atggcaataa gtgtagagga ttgatgtacg ttgaccggct atacggtaat 720gctattgctt ccgtacaaac gaattttcac aaagacactt ctcggaacga gaaattctat 780ggtgcaggtg aagtcaactg tcgctatgag gagcagggta aggcgccgac ttatgttcta 840gaacgctctg gactcgccat gaccaattac aattacgaca acttgaacta caaccaacca 900gacgtcgttc ctccaggtta tcccgaccat cccaactact acattccaat gtactacgca 960gcaccgtggt tggtcgttca gggatgcgcg gggacatcga agcaatactc gtacggttgg 1020tttatggaca atgtctctca gtcgtacatg aacactggag atacggcgtg gaactgcgga 1080caggaaaacc tggcatacat gggcgcgcaa tacgggccat ttgatcagca ctttgtgtat 1140ggtgatggag atggccttga agatgtcgtc aaagcgttct cctttcttca aggaaaggag 1200ttcgaagaca aaaaactcaa caagcgttct gtaatgcctc cgaagtacgt gtttggtttc 1260ttccagggtg ttttcggtgc actttcactg ttgaagcaga atctgcctgc cggagagaac 1320aacatctcag tgcaagagat tgtggagggt taccaggata acgactaccc ctttgaaggg 1380
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<223>人工序列的描述核酸<400>12atgacaaact ataattatga caatttgaac tacaatcaac cggacctcat cccacctggc 60catgattcag atcctgacta ctatattccg atgtactttg cggcaccatg ggtgatcgca 120
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1.在包含一種為植物或其一部分的組分的介質(zhì)中產(chǎn)生抗氧化劑的方法，該方法包括在所述植物或其一部分中表達(dá)重組葡聚糖裂解酶，該重組葡聚糖裂解酶作用于存在于所述介質(zhì)和/或所述植物或其一部分中的葡聚糖底物以產(chǎn)生所述的抗氧化劑，其中所述的抗氧化劑是果糖酐。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述葡聚糖包含α-1，4鍵。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述葡聚糖是淀粉。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是α-1，4-葡聚糖裂解酶。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述酶是如SEQ ID No 1-6所示的任何一個(gè)序列或者與SEQ ID No 1-6所示的任何一個(gè)序列具有至少75％同源性的序列。
6.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述酶由包含如SEQ ID No 7-12所示的任何一個(gè)序列或者與SEQ ID No 7-12所示的任何一個(gè)序列具有至少90％同源性的序列的核苷酸序列編碼。
7.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述酶由具有如SEQ ID No 7-12所示的任何一個(gè)序列的核苷酸序列編碼。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述抗氧化劑在所述植物或其一部分中產(chǎn)生，然后釋放進(jìn)入所述介質(zhì)。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述抗氧化劑是1，5-D-果糖酐。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述介質(zhì)是食品或用于制備食品。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其中所述食品是飲料。
12.按照權(quán)利要求11的方法，其中所述飲料是酒精飲料。
13.按照權(quán)利要求11的方法，其中所述飲料是葡萄酒。
14.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述組分是谷物或水果的整體或一部分。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述組分是葡萄的整體或一部分。
16.果糖酐作為包含至少一種為植物或其一部分的組分的介質(zhì)的抗氧化劑的用途，其中所述果糖酐是通過(guò)在植物中原位表達(dá)編碼重組葡聚糖裂解酶的核苷酸序列而在所述介質(zhì)中原位制備的。
17.果糖酐作為在植物中改進(jìn)逆境耐性的手段的用途，其中所述果糖酐是通過(guò)在植物中原位表達(dá)編碼重組葡聚糖裂解酶的核苷酸序列而在所述植物中原位制備的。
18.果糖酐作為改進(jìn)葡萄轉(zhuǎn)化的手段的用途，其中所述果糖酐是通過(guò)在植物中原位表達(dá)編碼重組葡聚糖裂解酶的核苷酸序列而在所述葡萄中原位制備的。
19.葡聚糖裂解酶作為在植物中改進(jìn)逆境耐性的手段的用途，其中所述葡聚糖裂解酶是通過(guò)在植物中原位表達(dá)編碼重組葡聚糖裂解酶的核苷酸序列而在所述植物中原位制備的。
20.葡聚糖裂解酶作為改進(jìn)葡萄轉(zhuǎn)化的手段的用途，其中所述葡聚糖裂解酶是通過(guò)在植物中原位表達(dá)編碼重組葡聚糖裂解酶的核苷酸序列而在所述葡萄中原位制備的。
21.權(quán)利要求16-20任一項(xiàng)的用途，其中所述葡聚糖裂解酶包含如SEQ ID No 1-6所示的任何一個(gè)序列或者與SEQ ID No 1-6所示的任何一個(gè)序列具有至少75％同源性的序列。
全文摘要
描述了制備抗氧化劑的方法。所述方法包括制備包含抗氧化劑和至少一種其它組分的介質(zhì)。所述方法包括在所述介質(zhì)中原位制備所述抗氧化劑。通過(guò)或者使用重組DNA技術(shù)從果糖酐制備所述抗氧化劑和/或者通過(guò)使用重組葡聚糖裂合酶制備所述抗氧化劑。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1554765SQ20041004567
公開(kāi)日2004年12月15日 申請(qǐng)日期1998年5月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月6日
發(fā)明者A·布克特－拉森, I·馬庫(kù)森, A 布克特-拉森, 饃 申請(qǐng)人:生物股份有限公司