專利名稱：作為芥酸生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因油菜的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物育種，特別是利用基因工程技術(shù)改變油菜籽粒脂肪酸合成途徑，以利用油菜作為芥酸的生物反應(yīng)器。
背景技術(shù)：
除食用外，世界上生產(chǎn)的植物油近三分之一用于非食用制品。從油料植物種子中分離和提取各種油脂化合物非常簡便，避免了對環(huán)境有害物質(zhì)的產(chǎn)生[1，2]。
芥酸是重要的化工原料。油菜種子含有約40％(w/w)的油脂，是所有油料作物中油脂含量最高的[3]，其中芥酸含量的理論最高值占油脂的66.6％(w/w)。以油菜作為芥酸的生物反應(yīng)器，培育高芥酸特種工業(yè)用油菜品種，不僅為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)開辟了一個嶄新的領(lǐng)域，也為工業(yè)生產(chǎn)提供了廉價、可再生的原料。目前美國、加拿大、德國等主要油菜生產(chǎn)國家都投入巨資，應(yīng)用基因工程技術(shù)培育超高芥油菜[4]?，F(xiàn)已取得的主要研究結(jié)果有1.篩選到了具有高芥酸含量的植物材料高芥品種油菜其籽粒的芥酸含量占所含油脂總量的50％左右，而生長在太平洋西北地區(qū)的一年生草本植物草地泡沫(Limnanthesa1b1)種子貯藏脂中C20脂肪酸和C22脂肪酸之和大于95％，在美國已開始進(jìn)行該植物的培育、選種、種質(zhì)評價和油的開發(fā)利用等方面的研究。此外，海甘蘭(Crambe abyssinica，芥酸含量為油脂量的55～63％)、鍛花(Lunaria annua，)、旱金蓮(Tropaeolum majus，芥酸含量為油脂量的78％，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一芥酸含量高于66％的植物資源)等也很有研究價值[5]。目前海甘蘭在中國的四川省已有小規(guī)模種植，并進(jìn)行開發(fā)和研究[6]。
B、對芥酸生物合成途徑及相關(guān)酶系、基因有了較為完整的了解在油菜種子的發(fā)育過程中，光合器官合成的碳源轉(zhuǎn)運(yùn)到種子細(xì)胞后，通過糖酵解途徑經(jīng)磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)等前體，轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A，進(jìn)入脂肪酸合成途徑。在質(zhì)體中經(jīng)乙酰Co-A羧化酶(ACCase)將乙酰Co-A合成為丙二酸單酰Co-A，在脂肪酸合成酶系復(fù)合體(FAS)作用下，經(jīng)多次聚合，形成C181脂肪酸；碳鏈的延伸在?；?ACP硫脂酶的作用下終止。C181脂肪酸從質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中，在酮酯酰Co-A合成酶(KCS，即延伸酶)的作用下，C181脂肪酸轉(zhuǎn)化成C221脂肪酸，最后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上通過三種不同的?；D(zhuǎn)移酶，即甘油3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(G3PAT)、溶磷脂?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DAGAT)，分別在甘油上附連脂肪酸以合成甘油三酯(TAG)[7， 8，9，10，11，12]。該“從頭合成”途徑的多個關(guān)鍵酶基因已被克隆，其中PEP基因參與籽粒蛋白質(zhì)、油脂含量比率調(diào)控；LPAAT基因調(diào)控芥酸與3-磷酸甘油結(jié)合成TAG的能力；而KCS基因與油菜籽粒貯藏脂中芥酸含量有很直接的關(guān)系[13，14，15，16]。綜上所述，可以認(rèn)為，油菜籽粒中芥酸的高含量積累，主要依賴于如下幾個方面的因素1、籽粒油脂的高含量積累；2、C181脂肪酸向芥酸的高效轉(zhuǎn)化能力；3、合成的芥酸與3-磷酸甘油各位高效結(jié)合形成甘油三酯的能力。
C、探明了制約油菜芥酸含量的限制因素自然界的油菜，其芥酸的最高含量均在66％以下，這是由于十字花科植物中的溶磷脂?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)對181脂肪酸具有很強(qiáng)的底物特異性，不能在3-磷酸甘油的sn-2位上插入芥酸，使油菜籽粒中芥酸含量占油脂量的理論最高值為66.6％[17]。必須在油菜中導(dǎo)入能在3-磷酸甘油sn-2位置上插入芥酸的LPAAT基因，才能使其芥酸含量極限值從66.6％提高至100％。這樣的基因已在池花屬植物草地泡沫(Limnanthes alba)和酵母中發(fā)現(xiàn)并被克隆，導(dǎo)入該基因的油菜轉(zhuǎn)化植株其油脂sn-2位上的芥酸含量的確明顯提高，最高可占芥酸總量的22.3％[18，19，20]。
雖然利用基因工程技術(shù)培育超高芥油菜的研究已有諸多報道，但獲得的轉(zhuǎn)基因油菜，其油脂中芥酸含量也都在60％以下。國外現(xiàn)有高芥酸油菜(HEAR)品種其油脂中芥酸含量一般在53％左右，油脂量則約為42％，均為常規(guī)育種方法選育而成。國內(nèi)有關(guān)工業(yè)用高芥酸油菜的育種近年來已開始受到重視，并通過常規(guī)育種途徑育成多個高芥酸油菜新品種，其油酯中芥酸含量為53～55％，但其籽粒油脂含量較低，一般在37％～40％之間。
綜上所述，可以認(rèn)為，油菜籽粒中的芥酸含量(％)＝籽粒油脂含量(％)×油脂中芥酸含量(％)。油菜籽粒中芥酸的高含量積累，主要依賴于以下幾個方面的因素1)籽粒油脂的高含量積累；2)C181脂肪酸向芥酸的高效轉(zhuǎn)化能力；3)合成的芥酸與3-磷酸甘油各位高效結(jié)合形成貯藏酯的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在篩選的高芥酸油菜基因組中導(dǎo)入新的基因，并增強(qiáng)或抑制其原有基因的表達(dá)，獲得一種油菜品系，以提高其油脂合成能力并使之特異地高效合成和積累芥酸，使其籽粒中能超量蓄積芥酸，使這種油菜成為芥酸的生物反應(yīng)器。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案其一是包括篩選高芥酸油菜品種，其特殊之處是采用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，并將其構(gòu)建成Anti-PEP基因植物表達(dá)載體，②運(yùn)用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將所述的Anti-PEP基因?qū)胗筒嘶蚪M，獲得籽粒具有油脂高效合成特性的“高油”油菜，③制取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，并與植物表達(dá)載體中啟動子正向連接，構(gòu)建成LPAAT基因植物表達(dá)載體，④運(yùn)用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將所述的LPAAT基因?qū)胗筒嘶蚪M，獲得籽粒具有芥酸與3-磷酸甘油高效結(jié)合特性的“高芥酸”油菜，⑤將所述的“高油”油菜和“高芥酸”油菜雜交，產(chǎn)生具有“高油”+“高芥酸”的“雙高”特性的F1代油菜植株。
本發(fā)明可以對所述的F1代植株進(jìn)行篩選，以獲得穩(wěn)定表達(dá)LPAAT基因和Anti-PEP基因的油菜植株。
所述的制取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，可以是人工合成該基因，也可以是從低等生物克隆該基因。
所述的籽粒具有油脂高效合成特性的“高油”油菜，是指經(jīng)導(dǎo)入Anti-PEP基因，使油菜合成油脂/蛋白質(zhì)過程中產(chǎn)生調(diào)控性，具有比原先更高效地合成油脂的特性所獲得的油脂含量高的油菜。
所述的“高芥酸”油菜，是指經(jīng)導(dǎo)入LPAAT基因，油菜合成的芥酸能與3-磷酸甘油sn-2位高效結(jié)合所獲得的芥酸含量高的油菜。
所述的Anti-PEP基因?qū)胗筒?，此油菜?yōu)選的是人工篩選的籽粒油脂含量相對高的油菜，所述的LPAAT基因?qū)胗筒?，此油菜?yōu)選的是人工篩選的芥酸含量相對高的油菜。
本發(fā)明的技術(shù)方案其二是包括篩選高芥酸油菜品種，其特殊之處是采用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，并將其構(gòu)建成Anti-PEP基因植物表達(dá)載體，②制取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，并與植物表達(dá)載體中啟動子正向連接，構(gòu)建成LPAAT基因植物表達(dá)載體，③將Anti-PEP基因、LPAAT基因轉(zhuǎn)入同一高芥酸油菜基因組，獲得其種子能超量合成和積累芥酸的雙轉(zhuǎn)基因油菜。
所述的制取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，可以是人工合成該基因，也可以是從低等生物克隆該基因。
所述的同一油菜，優(yōu)選的是人工篩選的籽粒油脂和芥酸含量相對高的油菜。
具體地說，首先篩選出油脂含量相對高的油菜品種，在這種油菜中導(dǎo)入Anti-PEP基因，調(diào)控籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比率，使更多糖酵解產(chǎn)物流入油脂合成途徑，以提高油菜種子油脂含量，獲得所述的“高油”油菜；篩選出芥酸含量相對高的油菜品種，以利用其高活性的KCS酶活性，使油菜籽粒能高效合成芥酸，在這種油菜菜中導(dǎo)入人工合成或從低等生物中克隆的能將芥酸連接到3-磷酸甘油sn-2位的LPAAT基因，使油菜籽粒中合成的芥酸能高效合成三芥酰甘油。Anti-PEP轉(zhuǎn)基因高油油菜與LPAAT轉(zhuǎn)基因高芥酸油菜雜交產(chǎn)生F1代油菜可同時表達(dá)anti-PEP基因與LPAAT基因，同時具有油脂高效合成能力、芥酸高效合成能力和將芥酸高效結(jié)合成三芥酰甘油的能力，因此能夠超量蓄積芥酸。將Anti-PEP基因、LPAAT基因轉(zhuǎn)入同一油菜基因組，獲得雙轉(zhuǎn)基因油菜種子具有超量合成和積累芥酸的特性。
通過對油菜基因組進(jìn)行的上述改造，可大幅度提高油菜種子中芥酸的含量，使之成為芥酸的生物反應(yīng)器。
本發(fā)明所述的人工篩選的籽粒油脂含量相對高的油菜和芥酸含量相對高油菜可通過常規(guī)育種途徑或轉(zhuǎn)基因途徑獲得。
本發(fā)明所述的PEP基因或其片段包括全基因，3｀或5｀端非翻譯區(qū)，內(nèi)含子序列或編碼序列。所述的基因或其片段可以用市售的DNA合成儀人工合成。或者從油菜基因文庫篩選得到?；蛘卟捎肞CR法擴(kuò)增得到。優(yōu)選的是套組PCR。PCR所用的引物是根據(jù)油菜PEP基因序列設(shè)計的。
本發(fā)明所述的LPAAT基因可為全基因?？蓮牡偷壬锘蛭膸熘泻Y選得到，或者是經(jīng)PCR擴(kuò)增出的DNA、DNA片段，或采用人工合成的方法獲得。
本發(fā)明所述的構(gòu)建anti-PEP基因植物表達(dá)載體和LPAAT基因植物表達(dá)載體包括從亞克隆中酶切出目的基因片段，電泳回收后與植物表達(dá)載體，例如pIG121或pBI121連接成轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌例如E.coliHB101感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選。參見(Sambrook，T，TanaKa K，Monma T.Molecular CloningA LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory après，New York，1989)。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因方法，可采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法或花粉管引入法。其中，優(yōu)選農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(參見，Sambrook T，TanaKaK，Monma T.Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory après，New York，1989)。經(jīng)由農(nóng)桿菌感染的油菜外植體(如無菌苗下胚軸)再生為正常植株(參見文獻(xiàn)22)。
本發(fā)明用于作為anti-PEP基因、LPAAT基因轉(zhuǎn)化受體親本的芥酸含量相對高的油菜可以是同一品種或不同品種，也可是雜交油菜組合。
具體實(shí)施例方式
以下舉例詳細(xì)說明利用本發(fā)明的實(shí)施方案，但本發(fā)明不限于下面提供的應(yīng)用，以下描述不對本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何意義上的限定。
材料植物材料采用油脂和芥酸含量相對高的甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)品種。
菌株和質(zhì)粒E.coli HB101、E.coli JM109、根癌農(nóng)桿菌A.Tumefaciens EHA101、質(zhì)粒pBS SK+、pUC19、超級雙元載體pIG121和pBI121。
酶和化學(xué)試劑限制性內(nèi)切酶、小牛腸堿性磷酸酶、T4-DNA連接酶、TaqDNA聚合酶購自MBI公司，DNA分子量標(biāo)記λDNA/HindIII、PCR Marker購自華美生物技術(shù)公司，PCR引物由Sangon生物技術(shù)公司合成，X-gal、IPTG、X-glue購自Sigma公司，隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購自TaKaRa公司，γ-32PdCTP購自亞輝生物工程公司。
分子生物學(xué)技術(shù)除非另有說明，所有分子生物學(xué)技術(shù)一般按Sambrook T等在分子克隆實(shí)驗手冊(Sambrook T，TanaKa K，Monma T.MolecularCloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratoryaprès，New York，1989)中提供的方法進(jìn)行。
步驟與結(jié)果1.PEP基因片段的克隆根據(jù)Yanai等(Biosci Biotech Biochem，58(5)147-159)報道的油菜PEP基因序列，設(shè)計內(nèi)外兩組引物Primer PEP1(5’-引物)5’-GGAATCTAAAGTAAACCGGC-3’(20-mer)Primer PEP2(5’-引物)5’-CTCTCTGAATCCTTCTGTAG-3’(20-mer)
Primer PEP3(3’-引物)5’-AACCGACGGCCGTGACTGTA-3’(20-mer)。
PCR反應(yīng)條件50μl的反應(yīng)體系中，含10×PCR buffer5μl，25mmol/L Mg2+3μl，2mmol/L dNTP5μl，Primer5’-、Primer3’各2.5μl，Taq DNA聚合酶1U，模板DNA50μg，94℃預(yù)變性10min后，94℃、30S，55℃、30S，72℃、30S，經(jīng)30輪循環(huán)后，72℃延伸5min。
先用外側(cè)引物(Primer1，Primer3)擴(kuò)增到了約610bp的DNA片段，再以此為模板，用內(nèi)側(cè)引物(Primer2，Primer3)擴(kuò)增到了一個530bp的DNA片段，與預(yù)期片段長度相符。擴(kuò)增片段經(jīng)T4DNA聚合酶補(bǔ)平3′端，用平端克隆法克隆至載體pBS SK+，用CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli JM109株感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子在含Amp、X-gal/IPTG的選擇平板上37℃生長過夜，挑取白色陽性重組菌落。提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，進(jìn)行瓊脂糖制備性電泳。挑選克隆片段長度正確的重組子，進(jìn)行Sanger的末端終止法(MBI公司370測序儀)DNA測序。其中一重組子的外源DNA片段序列與報道的油菜PEP基因相應(yīng)的序列完全一致，以此重組子pPEP8作為進(jìn)一步工作之用。
2.Anti-PEP(反義PEP)基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建選擇Xbal位點(diǎn)定向。在從pPEP8質(zhì)粒中分離PEP基因片段時，先用內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物的5′粘性末端用T4-DNA聚合酶補(bǔ)平，再用XbaI酶切3′末端。用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收所需片段。同理，用內(nèi)切酶SmaI切開超級雙元載體pIG121產(chǎn)生平端，然后用XbaI酶切其3′末端。用T4DNA聚合酶將這兩個片段連接。這樣構(gòu)建的重組質(zhì)粒保證了PEP基因片段位于CaMV35S啟動子下游、GUS報告基因下上游，并與35S啟動子反向連接，得到重組質(zhì)粒pPEPA5。
3.LPAAT基因的人工合成參照酵母LPAA(S)基因編碼的氨基酸序列，根據(jù)草地泡沫LPAAT(M)芥酸結(jié)合位點(diǎn)序列特征，改變活性部位氨基酸，使產(chǎn)生的溶磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶在3一磷酸甘油sn-2位具有強(qiáng)的芥酸結(jié)合活性；選擇油菜偏好密碼子，設(shè)計并人工合成LPAAT基因，并在5′端和3′分別加上BamH I限制性酶切位點(diǎn)。將合成產(chǎn)物克隆到pUC19的BamH I位點(diǎn)，用CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli JM109株感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子在含Amp、X-gal/IPTG的LB選擇平板上37℃生長過夜，挑取白色陽性重組菌落。小量提取質(zhì)粒，經(jīng)BamHI酶切，瓊脂糖電泳驗證。挑選克隆片段長度正確的重組子，采用Sanger的末端終止法用MBI公司370測序儀進(jìn)行DNA測序。挑選外源DNA片段序列與預(yù)期的LPAAT基因序列完全一致的重組子作為進(jìn)一步工作之用。
4.LPAAT基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建超級雙元載體pBI121含有由35S啟動子驅(qū)動的GUS基因及NOS啟動子驅(qū)動的NPTII基因，在其35S啟動子中加入種子特異性和發(fā)育調(diào)控元件SDRE，改造成種子特異表達(dá)載體質(zhì)粒p189。質(zhì)粒p189帶有籽粒特異表達(dá)啟動子ProSDRE，該質(zhì)粒用Hind III+BamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳后回收含ProSDRE的DNA片段F189(長度為1.1kb)；質(zhì)粒pLPAAT用BamHI酶切，0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，回收LPAAT基因片段FLPAAT(長度為～900bp)；FLPAAT用小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)脫磷，F(xiàn)189、FLPAAT采用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物亞克隆到SK+載體；LPAAT-A基因5′端375位有一Bgl II酶切位點(diǎn)，小量提取各重組子質(zhì)粒，用Hind III+Bgl II雙酶切，獲得1.4～1.5kb長度DNA片段的質(zhì)粒為連接方向正確的重組子，選擇該重組子(pLPAAT2)作為后繼工作之用。
質(zhì)粒pLPAAT2用Hind III+Sac I雙酶切，酶切產(chǎn)物用0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，回收啟動子ProSDRE與LPAAT基因的連接片段(2.1kb)。植物表達(dá)載體pIG121用Hind III+Sac I雙酶切，切除載體原有的35S啟動子+GUS基因部分，酶切產(chǎn)物用0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，回收21kb片段，回收產(chǎn)物用CIAP脫磷。脫磷后的載體與ProSDRE+LPAAT基因片段用T4DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒。用以上重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli HB101感受態(tài)細(xì)胞，在含100μg/ml Km的LB平板上進(jìn)行抗性篩選，陽性克隆用PCR法進(jìn)行鑒定。分別在pLPAAT中籽粒特異表達(dá)啟動子部分和LPAAT基因中選擇部分序列來設(shè)計PCR引物。
Primer LPAAT 1(5’-引物)5’-CACCAACTCAACCCATCA-3’(18-mer)，Primer LPAAT 2(3’-引物)5’-GGGTCTATATACTACTCT-3’(18-mer)。
經(jīng)PCR鑒定為正確的重組子(命名為pLPAAT)，即為LPAAT基因籽粒特異表達(dá)載體。用三親交配法將pLPAAT導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA101，獲得EHA101/pLPAAT，用作進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化。
5.Antu-PEP、LPAAT基因?qū)胗筒嘶蚪M①植物表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌用堿法從大腸桿菌HB101/pPEPA5和HB101/pLPAAT中分別提取質(zhì)粒pPEPA5和pLPAAT。
用電擊法將pPEPA5導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA101，獲得EHA101/pPEPA5，將pLPAAT導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA101，獲得EHA101/pLPAAT，將pPEPA5和pLPAAT同時導(dǎo)入同一根癌農(nóng)桿菌EHA101，獲得EHA101/pPEPA5+pLPAAT；以上導(dǎo)入植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌分別用作油菜轉(zhuǎn)化。
②油菜的轉(zhuǎn)化及植株再生載體pIG121帶有由35S啟動子驅(qū)動的GUS基因和潮霉素抗性基因及NOS啟動子驅(qū)動的NPTII基因，因此轉(zhuǎn)基因油菜植株可用潮霉素進(jìn)行篩選，并可通過GUS基因的檢測來判斷外源基因的整合。超級雙元載體pBI121含有由35S啟動子驅(qū)動的GUS基因及NOS啟動子驅(qū)動的NPTII基因，轉(zhuǎn)化油菜植株可用潮霉素進(jìn)行篩選，后代可通過PCR方法檢測。以生長8天的油菜無菌苗下胚軸為轉(zhuǎn)化外源基因的受體，用生長至對數(shù)期限的農(nóng)桿菌EHA101/pPEPA5(或EHA101/pLPAAT或EHA101/pPEPA5+pLPAAT)感染外植體，共培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)至含500mg/L羧芐青霉素(Cb)的MS培養(yǎng)基上，一周后轉(zhuǎn)到含500mg/LCb和10mg/L潮霉素(hgr)的MS分化培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選。經(jīng)3～4周的培養(yǎng)，下胚軸兩端長出小愈傷，并逐漸產(chǎn)生綠色的抗性芽和白色的非抗性芽。待芽長至1cm高，轉(zhuǎn)入含相同抗生素的生根培養(yǎng)基，2周后出根長成完整小植株。小植株經(jīng)煉苗后，移栽入土中，植株可進(jìn)一步生長，發(fā)育并產(chǎn)生種子。
6.轉(zhuǎn)基因油菜的鑒定PCR方法可以快速地測定外源基因在轉(zhuǎn)化再生植株中的整合。
Anti-PEP轉(zhuǎn)基因植株的PCR擴(kuò)增由于油菜本身帶有內(nèi)源PEP基因，因此，在用PCR方法檢測anti-PEP轉(zhuǎn)基因植株時，不能用PEP基因本身的序列來設(shè)計引物。本研究采用GUS報告基因的兩端引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
Primer GUS1(5’-引物)5’-CGTAAGGGATGACGCACAAT-3’(20-mer)，Primer GUS2(3’-引物)5’-CGCAAGACCGGCAACAGG-3’(18-mer)。
提取再生植株總DNA，以此為模板，進(jìn)行PCR。Anti-PEP轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出了與含Anti-PEP基因的重組質(zhì)粒PEPA5擴(kuò)增片段相同分子量的條帶，而對照植株未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。
LPAAT基因轉(zhuǎn)基因植株的PCR擴(kuò)增分別在pLPAAT中籽粒特異表達(dá)啟動子部分和LPAAT基因中選擇部分序列來設(shè)計PCR引物。
Primer LPAAT 1(5’-引物)5’-CACCAACTCAACCCATCA-3’(18-mer)，Primer LPAAT2(3’-引物)5’-GGGTCTATATACTACTCT-3’(18-mer)。
LPAAT轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出了與含LPAAT基因的重組質(zhì)粒pLPAAT擴(kuò)增片段相同分子量的條帶，而對照植株未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。
Anti-PEP基因、LPAAT基因雙價雙轉(zhuǎn)植株的PCR檢測由于質(zhì)粒pLPAAT中不帶有GUS基因，對GUS引物和LPAAT引物PCR擴(kuò)增均為陽性的植株同時具有Anti-PEP基因和LPAAT基因。
7.Anti-PEP轉(zhuǎn)基因油菜×LPAAT轉(zhuǎn)基因油菜雜交法以Anti-PEP轉(zhuǎn)基因油菜和LPAAT轉(zhuǎn)基因油菜分別為父母本，進(jìn)行雜交制種。
制種技術(shù)①掌握父母本的行比母本適當(dāng)密植，促使開花集中，并抑制后期再發(fā)可育分枝。父母本行比均以2∶3較為適宜。父本行株距33cm×33cm，母本行株距26-33×13-17cm，父母本間行距40cm。
②適當(dāng)調(diào)整播種期，促使父母本花期相遇。
③對母本進(jìn)行輔助授粉，提高制種量花期采取推株并壟，使父母本花序接近。在上午10-12時，撥動父本花序使花粉散落于母本花序上?？善鸬捷o助授粉、提高結(jié)實(shí)率的作用。
④成熟時在母本行收F1代雜交種子。
雙價雙轉(zhuǎn)油菜的篩選收獲的F1代種子播種后，用PCR方法對F1代植株進(jìn)行篩選，對GUS引物和LPAAT引物PCR擴(kuò)增均為陽性的植株為Anti-PEP×LPAAT雙價雙轉(zhuǎn)油菜。
8.LPAAT-A/anti-PEP基因雙轉(zhuǎn)法將采用上述步驟與結(jié)果中1.-4.所述方法構(gòu)建的pPEPA5和p LPAAT用電擊法導(dǎo)入同一根癌農(nóng)桿菌EHA101，采用5.-②所述方法，用帶有pPEPA5和pLPAAT兩個雙元載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化高芥酸油菜，并采用6.所述方法進(jìn)行PCR檢測對GUS引物和LPAAT引物PCR擴(kuò)增均為陽性的植株同時具有Anti-PEP基因和LPAAT基因，為LPAAT-A/anti-PEP基因雙價雙轉(zhuǎn)油菜。
9.轉(zhuǎn)基因油菜種子油脂、芥酸含量的測定種子含油量測定 采用改良索氏法測定。
種子芥酸含量測定 按GB10219，采用氣相色譜法測定。
表1.Anti-PEP轉(zhuǎn)基因油菜含油量株系含油量(％干重) 含油量提高值(％)對照141.7超油2-1 52.826.6超油2-2 51.824.2超油2-3 51.523.5超油2-4 51.122.5表2.LPAAT轉(zhuǎn)基因油菜芥酸含量株系芥酸含量(W/W) 芥酸提高值(％)對照245.48超芥1-1 53.9418.6超芥1-2 52.1114.6超芥1-3 51.6013.5超芥1-4 50.9612.0
以上以舉例方式詳細(xì)描述了本發(fā)明的實(shí)施過程，但對本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說，顯而易見的是，在實(shí)施過程中可進(jìn)行許多等效的修改和替換。因此，本發(fā)明的范圍僅以權(quán)利要求書的限定為準(zhǔn)。
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權(quán)利要求
1.作為芥酸生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因油菜的生產(chǎn)方法，其特征是采用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，并將其構(gòu)建成Anti-PEP基因植物表達(dá)載體，②運(yùn)用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將所述的Anti-PEP基因?qū)胗筒嘶蚪M，獲得籽粒具有油脂高效合成特性的“高油”油菜，③制取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，并與植物表達(dá)載體中啟動子正向連接，構(gòu)建成LPAAT基因植物表達(dá)載體，④運(yùn)用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將所述的LPAAT基因?qū)胗筒嘶蚪M，獲得籽粒具有芥酸與3-磷酸甘油高效結(jié)合特性的“高芥酸”油菜，⑤將所述的“高油”油菜和“高芥酸”油菜雜交，產(chǎn)生具有“高油”+“高芥酸”的“雙高”特性的F1代油菜植株。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是對所述的F1代植株進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)LPAAT基因、Anti-PEP基因的油菜植株。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是所述的制取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，是指人工合成該基因或從低等生物克隆該基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是供Anti-PEP基因?qū)氲挠筒耸侨斯ずY選的籽粒油脂合成量相對高的油菜，供LPAAT基因?qū)氲挠筒耸侨斯ずY的籽粒芥酸含量相對高的油菜。
5.作為芥酸生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因油菜的生產(chǎn)方法，其特征是采用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenopyruvatecarboxylase；EC.4.1.1.31)基因PEP片段，并將其構(gòu)建成Anti-PEP基因植物表達(dá)載體，②制取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，并與植物表達(dá)載體中啟動子正向連接，構(gòu)建成LPAAT基因植物表達(dá)載體，③將Anti-PEP基因、LPAAT基因轉(zhuǎn)入同一油菜基因組，獲得籽粒具有“雙高”特性的雙轉(zhuǎn)基因油菜。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述的制取能將芥酸高效連接到3-磷酸甘油sn-2位的溶磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，是指人工合成該基因或從低等生物克隆該基因。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所述的同一油菜是人工篩選的籽粒油脂和芥酸含量相對高的油菜。
全文摘要
作為芥酸生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因油菜的生產(chǎn)方法，采用步驟①克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因PEP片段，將其構(gòu)建成Anti－PEP基因植物表達(dá)載體，②運(yùn)用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將Anti－PEP基因?qū)胗筒嘶蚪M，獲得籽粒具有油脂高效合成特性的“高油”油菜，③制取能將芥酸高效連接到3－磷酸甘油sn－2位的溶磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)基因，并與植物表達(dá)載體中啟動子正向連接，構(gòu)建LPAAT基因植物表達(dá)載體，④運(yùn)用基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將LPAAT基因?qū)胗筒嘶蚪M，獲得籽粒具有芥酸與3－磷酸甘油高效結(jié)合特性的“高芥酸”油菜，⑤將“高油”油菜和“高芥酸”油菜雜交，產(chǎn)生具有“高油”+“高芥酸”特性的F
文檔編號A01H1/02GK1436849SQ0210297
公開日2003年8月20日 申請日期2002年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月9日
發(fā)明者陳錦清, 黃銳之, 朗春秀, 劉智宏, 胡張華 申請人:浙江綠洲農(nóng)業(yè)股份有限公司