專利名稱：用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術領域。
背景技術：
目前雜草生物防治已成為研究熱門，各國已篩選出許多生防潛力菌，主要為真菌，有的已開發(fā)成雜草生防制劑。稗草是稻田中主要雜草，近10年來，國內(nèi)外許多機構(gòu)均開展了稗草生物防治研究，從感病稗草上分離得到許多病原菌，尤其是病原真菌尖角突臍孢(Exserohilum monoceras)和內(nèi)臍孺孢(Drechslera monoceras)為最有潛力開發(fā)成稗草生防制劑的菌株。真菌生防制劑主要是利用其子實體——孢子來感染靶標物，使其感病致死，從而達到防治有害生物的目的。因此，潛力菌的產(chǎn)孢量是決定該菌開發(fā)和應用前景的主要因素之一。而國內(nèi)外目前的研究成果還無法達到能實際推廣應用的滿意效果，主要是產(chǎn)孢量偏低。如國際水稻所對E.monoceras菌孢子在22種農(nóng)業(yè)物質(zhì)上的固體發(fā)酵產(chǎn)孢情況進行研究，結(jié)果最大產(chǎn)孢量是在玉米葉上，每克干玉米葉產(chǎn)孢量為1.8×106個孢子；越南研究了該菌株在27種農(nóng)業(yè)物質(zhì)上的產(chǎn)孢量，最大產(chǎn)孢量出現(xiàn)在谷糠，二次培養(yǎng)產(chǎn)孢之和為每克谷糠2.05×105個孢子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是在現(xiàn)有技術基礎上，對稗草生防菌孢子的生產(chǎn)進一步開發(fā)研究，以克服產(chǎn)孢量低而無法普遍使用的缺陷，采用稗草為培養(yǎng)基質(zhì)，提供一種利用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法。
用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，從感病稗草上分離得到稗草生防菌原始菌株，該菌株培養(yǎng)后制得接種體，接種到培養(yǎng)基中，其特征在于包括以下工藝步驟1)采用稗草為培養(yǎng)基質(zhì)，將稗草植株切割成小段、干燥，備用。
2)按干稗草基質(zhì)∶蔗糖∶KNO3∶K2HPO4∶MgSO4.7H2O∶CaCO3＝100∶3-9∶0.3-0.9∶0.2-0.6∶0.2-0.6∶0.2-0.6的比例配制，加水浸泡24-36小時，然在121℃、0.11MPa/cm2高溫、高壓消毒15-30分鐘，冷卻后制得稗草基質(zhì)培養(yǎng)基，用于接種、產(chǎn)孢。
3)在無菌條件下將稗草生防菌接種體接種到培養(yǎng)基中，充分攪拌至混合均勻，然后均勻攤放，在25-29℃恒溫、黑暗、通空氣條件下培養(yǎng)7-10天，隨后在25-30℃常溫，經(jīng)嚴格消毒環(huán)境條件下培養(yǎng)10-15天即可收獲孢子。
該生產(chǎn)方法所采用的稗草，其生命力和生長力極強，人工種植方便，因此原料廉價、易得，生產(chǎn)工藝簡單易行，可大規(guī)模開發(fā)生產(chǎn)，其產(chǎn)孢量高，達到國外同類產(chǎn)品的3.75-33.07倍.
具體實施方案從感病稗草上分離得到稗草生防菌原始菌株，所述的稗草生防菌菌株為病原真菌尖角突臍孢(Exserohilum monoceras)或內(nèi)臍孺孢(Drechsleramonoceras)或互格交鏈孢(Alternaria alternata)彎孢(Curvularia lunata)。具體分離方法為常規(guī)公知技術，在此不再贅述。
稗草基質(zhì)培養(yǎng)基的制備乳熟期的稗草植株齊泥割下，包括莖、葉和籽粒，并切割成0.1-0.5cm長小段，曬或烘干至水分14％以下備用。按前述配比和方法制得稗草基質(zhì)培養(yǎng)基，配制中最好加入少量維生素C。
稗草生防菌接種體的制備稗草生防菌原始菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，在25-29℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)6-8天，形成一級接種體，一級接種體可直接用于少量產(chǎn)孢接種。如用于大規(guī)模生產(chǎn)，則需培養(yǎng)二級接種體，具體有兩種方法1)將一級接種體接種在改良Fries液體培養(yǎng)基或馬鈴薯、蔗糖液體培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵培養(yǎng)15-20天得到菌絲，將菌絲搗碎后制得二級接種體。2)將一級接種體接種在經(jīng)高溫、高壓消毒的稗草籽粒上，最好為黃熟-成熟期稗籽，在25-29℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)10-14天，待產(chǎn)生大量孢子和菌絲體后即得二級接種體。所述的改良Fries液體培養(yǎng)基配比為蔗糖30克、酒石酸胺5.0克、NH4NO31.0克、K2HPO41.0克、MgSO40.5克、NaCL0.1克、CaCL20.1克、水解酪朊0.5克、酵母提取物(yeast extraact)1.0克、無菌水1000毫升。所述的馬鈴薯、蔗糖液體培養(yǎng)基為去皮馬鈴薯200-300克、蔗糖10-20克、無菌水1000毫升，再經(jīng)高溫、高壓消毒。其中的蔗糖可用葡萄糖代替。
將二級接種體接種到上述消毒冷卻后的稗草基質(zhì)、有機鹽和微量元素的固體培養(yǎng)基中，充分攪拌使接種體與培養(yǎng)基成分均勻混合，然后均勻攤于消毒過的鋁盤或磁盤或簸箕中，以上操作需在無菌條件下進行。在25-29℃恒溫、黑暗、有空氣條件下培養(yǎng)7-10天，每2-3天充分攪動一次，使菌快速、均勻生長。隨后可在25-30℃常溫、經(jīng)嚴格消毒的環(huán)境下培養(yǎng)。10-15天即可收獲孢子。如采用洗滌法收獲，收獲后的培養(yǎng)基質(zhì)濾干水分后，可直接用作二次培養(yǎng)，同樣可生產(chǎn)大量孢子。在培養(yǎng)量少的情況下，用菌塊接種和孢子懸液接種效果相差不大，但在大規(guī)模接種培養(yǎng)時，以孢子懸液接種為佳。
權(quán)利要求
1.用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，從感病稗草上分離得到稗草生防菌原始菌株，該菌株培養(yǎng)后制得接種體，接種到培養(yǎng)基中，其特征在于包括以下工藝步驟1)采用稗草為培養(yǎng)基質(zhì)，將稗草植株切割成小段、干燥，備用，2)按干稗草基質(zhì)∶蔗糖∶KNO3∶K2HPO4∶MgSO4.7H2O∶CaCO3＝100∶3-9∶0.3-0.9∶0.2-0.6∶0.2-0.6∶0.2-0.6的比例配制，加水浸泡24-36小時，然后在121℃、0.11MPa/cm2高溫、高壓消毒15-30分鐘，冷卻后制得稗草基質(zhì)培養(yǎng)基，用于接種、產(chǎn)孢，3)在無菌條件下將稗草生防菌接種體接種到培養(yǎng)基中，充分攪拌至混合均勻，然后均勻攤放，在25-29℃恒溫、黑暗、通空氣條件下培養(yǎng)7-10天，隨后在25-30℃常溫，經(jīng)嚴格消毒環(huán)境條件下培養(yǎng)10-15天即可收獲孢子。
2.如權(quán)利要求1所述的用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，其特征在于稗草培養(yǎng)基中加有少量的維生素C。
3.如權(quán)利要求1所述的用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，其特征在于稗草生防菌菌株為病原真菌尖角突臍孢(Exserohilum monoceras)或內(nèi)臍孺孢(Drechslera monoceras)或互格交鏈孢(Alternaria alternata)或彎孢(Curvularia lunata)。
4.如權(quán)利要求1所述的用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，其特征在于稗草生防菌接種體的制備稗草生防菌原始菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，在25-29℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)6-8天，形成一級接種體，再將一級接種體接種在改良Fries液體培養(yǎng)基或馬鈴薯、蔗糖液體培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵培養(yǎng)15-20天得到菌絲，將菌絲搗碎后制得二級接種體。
5.如權(quán)利要求1所述的用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，其特征在于稗草生防菌接種體的制備稗草生防菌原始菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，在25-29℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)6-8天，形成一級接種體，再將一級接種體接種在經(jīng)高溫、高壓消毒的稗草籽粒上，在25-29℃恒溫、黑暗條件下培養(yǎng)10-14天，待產(chǎn)生大量孢子和菌絲體后，即得二級接種體。
6.如權(quán)利要求4所述的用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，其特征在于所述的改良Fries液體培養(yǎng)基配比為蔗糖30克、酒石酸胺5.0克、NH4NO31.0克、K2HPO41.0克、MgSO40.5克、NaCL0.1克、CaCL20.1克、水解酪朊0.5克、酵母提取物(yeast extraact)1.0克、無菌水1000毫升。
7.如權(quán)利要求4所述的用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，其特征在于所述的馬鈴薯、蔗糖液體培養(yǎng)基為去皮馬鈴薯200-300克、蔗糖10-20克、無菌水1000毫升，再經(jīng)高溫、高壓消毒。
8.如權(quán)利要求4或7所述的用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，其特征在于所述的馬鈴薯、蔗糖液體培養(yǎng)中的蔗糖可用葡萄糖代替。
全文摘要
用稗草基質(zhì)生產(chǎn)稗草生防菌孢子的方法，屬于生物農(nóng)藥技術領域。從感病稗草上分離得到稗草生防菌原始菌株，該菌株培養(yǎng)后制得接種體，將稗草植株切割成小段、干燥，按比例配以碳、氮源及有機鹽，高溫，高壓消毒，冷卻后制得稗草基質(zhì)培養(yǎng)基。在無菌條件下將接種體接種到培養(yǎng)基中，經(jīng)嚴格消毒環(huán)境條件下培養(yǎng)。采用的稗草廉價、易得，生產(chǎn)工藝簡單易行，可大規(guī)模開發(fā)生產(chǎn)，其產(chǎn)孢量高，達到國外同類產(chǎn)品的3.75－33.07倍。
文檔編號A01N63/04GK1438312SQ0210297
公開日2003年8月27日 申請日期2002年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月10日
發(fā)明者黃世文, 余柳青, 段桂芳 申請人:中國水稻研究所