專利名稱：緩慢釋放的蛋白質(zhì)聚合物的制作方法
背景技術：
本發(fā)明涉及持續(xù)釋放的藥物遞送的生物可降解組合物和借助這些組合物將生物活性物質(zhì)給藥的方法。
在遺傳工程和生物技術領域中的快速發(fā)展已經(jīng)導致開發(fā)越來越多數(shù)目的可用作為藥物試劑的蛋白質(zhì)和多肽。所以，研制這些新的藥物試劑給藥的方法變得越來越重要。
大多數(shù)蛋白質(zhì)具有相當短的半衰期，需要經(jīng)常給藥以達到有效的血液水平。為了通過在治療范圍內(nèi)保持血液水平而給病人增加方便和提高效率和安全性，蛋白質(zhì)藥物的順利釋放的可注射的儲存制劑是非常令人滿意的。
通過允許在病人的全身更慢和更穩(wěn)定地釋放分子，最新的聚合物研制工作已經(jīng)改善了遞送蛋白質(zhì)和多肽的能力。但是，在許多情況下，蛋白質(zhì)的活性形式是難于配制成可生物降解的聚合物的。合成的物質(zhì)，如可生物降解的水凝膠也已經(jīng)開發(fā)用于遞送蛋白質(zhì)。盡管可得到的聚合物和水凝膠提供了優(yōu)點，但蛋白質(zhì)向全身和局部循環(huán)的遞送仍然相當快速，在一些病列中，由于太快以至于不能利用這一給藥途徑。
發(fā)明概要本發(fā)明的特征在于遞送生物活性物質(zhì)(下文中“BAS”)的制品，和制備這樣的制品的方法。本發(fā)明的制品通過將BAS配制為不溶形式而提高BAS的生物可利用性。本發(fā)明還提供了利用遞送BAS的制品治療動物的方法。
因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了傳遞BAS的生物可相容治療制品，它包括一種高聚體，優(yōu)選地排除蛋白質(zhì)的一種分子或分子混合物，以及BAS，在包括一種高聚體，優(yōu)選排除蛋白質(zhì)的一種分子，或分子的混合物和BAS的該制品配制完成后，其中BAS是不溶形式。
在本發(fā)明的第一方面的優(yōu)選的實施方案中，正如通過干重測量的，該生物可相容的治療制品至少具有一個下面的特征BAS小于15％的聚集；該制品至少含有10％的高聚體和至少5％的BAS，如測得的干重；5％的可釋放BAS從該制品中釋放的時間大于1/16的t50；或t50大于或等于5/8的t80。更具體地說，該生物可相容的治療制品至少具有上面的特征。最優(yōu)選的是，生物可相容的治療制品具有所有上面的特征。
在本發(fā)明的第一個方面的另一個實施方案中，優(yōu)先地排除蛋白質(zhì)的分子是高聚體，聚(乙二醇)，透明質(zhì)酸，或聚(乙烯吡咯烷酮)。在另一個實施方案中，高聚體是水凝膠。仍然在另一個實施方案中，在包括高聚體，優(yōu)先地排除蛋白質(zhì)的分子和BAS的制品中的蛋白質(zhì)的溶解性小于5-10mg/ml，更優(yōu)選地小于1mg/ml。
在本發(fā)明的第一方面的另一實施方案中，當pH是使蛋白質(zhì)帶負電的值時，該分子混合物含有攜帶帶正電的離子的試劑，例如，三乙醇胺或Tris。仍然在另一個實施方案中，當pH是使蛋白質(zhì)帶正電時，該分子混合物含有攜帶帶負電的離子的試劑，如十二烷基硫酸鈉。還在另一個實施方案中，該分子混合物含有表面活性劑，例如，吐溫20，吐溫80，或泊咯沙姆F68。在第二個方面，本發(fā)明提供了制備遞送BAS的治療制品的方法，包括(a)將BAS與優(yōu)選地排除蛋白質(zhì)的分子或分子混合物結合；(b)將在步驟(a)中形成的混合物與高聚體結合，其中BAS是不溶的形式，并且在與優(yōu)選地排除蛋白質(zhì)的分子或分子的混合物以及高聚體結合后仍然是不溶的；(c)在步驟(b)中形成的結合體形成混合物；和(d)將該混合物聚合形成制品。
在本發(fā)明的第二個方面的一個實施方案中，步驟(a)和(b)是與單一的結合步驟合并的。
在本發(fā)明的第二個方面的優(yōu)選的實施方案中，該生物可相容的治療制品至少具有下面的特性之一BAS小于15％聚集；該制品至少含有10％的高聚體和至少5％的BAS，正如通過干重所測量的；5％的可釋放BAS從本制品中釋放的時間大于t50的1/16；或t50大于或等于t80的5/8。更優(yōu)選的是，該生物可相容的治療制品至少具有兩個上面的特征。最優(yōu)選的是，該生物可相容的治療制品具有所有上面的特性。
在本發(fā)明的第二個方面的另一個實施方案中，優(yōu)先排除蛋白質(zhì)的分子是高聚體，聚(乙二醇)，透明質(zhì)酸，或聚(乙烯吡咯烷酮)。在另一個實施方案中，高聚體是水凝膠。在另一個實施方案中，包括高聚體，優(yōu)先地排除蛋白質(zhì)的分子和BAS的制品中的蛋白質(zhì)的溶解性小于5-10mg/ml，更優(yōu)選地小于1mg/ml。
在本發(fā)明的第二個方面的另一個實施方案中，當pH是使蛋白質(zhì)帶負電的值時，該分子混合物含有攜帶帶正電離子的試劑，例如三乙醇胺。在另一個實施方案中，當pH是使蛋白質(zhì)帶正電荷的值時，該分子混合物含有攜帶帶正電的離子的試劑，如十二烷基硫酸鈉。在另一個實施方案中，該混合物含有表面活性劑，例如吐溫20，吐溫80，或泊絡沙母F68。
在第三個方面，本發(fā)明提供了治療動物的方法，包括將本發(fā)明的第一方面的生物可相容的制品對哺乳動物給藥。優(yōu)選地，哺乳動物是嚙齒動物，最優(yōu)選地哺乳動物是人。
在一個優(yōu)選的實施方案中，將本制品對哺乳動物的肺給藥，或靜脈內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)，口服或鼻內(nèi)給藥。
在本發(fā)明的上面的任何方面的優(yōu)選實施方案中，高聚體包括(a)形成中心核的區(qū)域；(b)至少兩個附著于核心的可降解的區(qū)域；和(c)至少兩個可聚化的末端基團，其中可聚化末端基團附著于可降解的區(qū)域。在優(yōu)選的實施方案中，形成中心核的區(qū)域是水可溶區(qū)域。水可溶區(qū)域可以是聚(乙二醇)，聚(乙烯氧化物)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(ethlyloxazoline)，聚(乙烯氧化物)-共-聚(丙烯氧化物)嵌段共聚物，多糖，碳水化合物，蛋白質(zhì)和他們的結合體?？山到鈪^(qū)域是選自下列組聚(α-羥基酸)，聚(內(nèi)酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(原酸酯)，聚(原碳酸)，和聚(磷酯)。優(yōu)選地，聚(α-羥基酸)是聚(乙醇酸)，聚(DL-乳酸)，或聚(L-乳酸)，和聚(內(nèi)酯)是聚(ε-己內(nèi)酯)，聚(δ-戊內(nèi)酯)，或聚(γ-丁內(nèi)酯)。在另一個實施方案中，可降解區(qū)域包括聚(己內(nèi)酯)。在另一個實施方案中，多聚化末端基團含有能夠聚合高聚體的碳-碳雙鍵。
在本發(fā)明的上面的各方面的其他實施方案中，高聚體包括(a)含有三個臂的聚(乙二醇)，分子量為3,000到6,000道爾頓的水可溶區(qū)；(b)附著于(a)區(qū)的乳酸酯基團；和(c)在(b)中的區(qū)域上加帽的丙烯酸基團。在另一個或選方案中，高聚體可以包括(a)含有聚(乙二醇)，分子量為2000或3,400道爾頓的水可溶區(qū)；(b)在(a)中的區(qū)域的一側(cè)上的乳酸酯基團；和(c)在(b)中的區(qū)域的一側(cè)加帽的丙烯酸基團。在另一個或選方案中，高聚體可以包括(a)含有聚(乙二醇)，分子量為3,400道爾頓的水可溶區(qū)；(b)在(a)中的區(qū)域的一側(cè)上的己內(nèi)酯；和(c)在(b)中的區(qū)域的一側(cè)加帽的丙烯酸基團。
仍然在本發(fā)明的上面的任何方面的其他實施方案中，該制品至少包括干重為5％，更優(yōu)選地10％，和最優(yōu)選地20-30％的活性物質(zhì)。在另一個實施方案中，該制品是可生物降解的。
在本發(fā)明的上面的任何方面的更優(yōu)選的實施方案中，高聚體包括水可溶區(qū)域，它包括三臂的PEG，分子量為4,200到5,400道爾頓；PEG的各個臂的一個末端的乳酸酯基團；和有乳酸酯基團加帽的丙酸基團。
仍然在本發(fā)明的上面各方面的另一個更優(yōu)選的實施方案中，高聚體是由丙烯酸-聚(乳酸)-PEG-丙烯酸-聚(乳酸)-丙烯酸的三單元ABA嵌段共聚物制成的。PEG具有MW3,400道爾頓；在兩側(cè)的聚(乳酸)的每側(cè)具有平均約5個乳酸酯單元；所以，本文的高聚體稱為“3.4kL5”。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，更低分子量的PEG，如MW2,000道爾頓PEG用于替代MW3,400PEG，得到的高聚體縮寫為”2kL5“。
在本發(fā)明的上面各方面的另一個更優(yōu)選的實施方案中，高聚體是丙烯酸-PCL-PEG-PCL-丙烯酸高聚體。PEG具有分子量為3,400道爾頓，在兩側(cè)具有聚己內(nèi)酯，每側(cè)平均約6個caproyl單元。高聚體本文稱為“3.4kC6”。
在其他優(yōu)選的實施方案中，BAS是蛋白質(zhì)或肽。更優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是選自包括激素，抗體，分化因子，血管生成因子，酶，細胞因子，趨化因子，干擾素，集落刺激因子，和生長因子的組。最優(yōu)選地，蛋白質(zhì)是激素，如人生長激素，或肽，如LHRH。
在本發(fā)明的第二和第三方面的其他實施方案中，在大于t50的11/4倍的時間內(nèi)，該治療制品至少釋放了80％的BAS。該治療制品的至少80％可以具有小于約80微米的顆粒大小。水可溶區(qū)基本含有分子量約為500到20,000道爾頓的PEG，更優(yōu)選地，分子量在1,000和10,000道爾頓之間?？山到鈪^(qū)可以含有至少兩個不同聚合物的混合體。另外，高聚體可以是非降解的。
在本發(fā)明的第二和第三個方面的其他實施方案中，該治療制品能夠在至少大于t50的2倍的時期內(nèi)釋放BAS。該制品也能夠在至少大于t50的11/4倍的時間內(nèi)遞送治療劑量的BAS。
“高聚體”是指具有下面三個成分的聚合物(1)生物可相容的，水溶性區(qū)；(2)生物可降解/可水解的區(qū)，和(3)至少兩個可多聚化的區(qū)域。
“生物活性物質(zhì)”或“BAS”是指天然存在或人工起源的化合物，它摻入在制品中，可以釋放和遞送到一個位點。生物活性物質(zhì)可以包括例如肽，多肽，蛋白質(zhì)，合成有機分子，天然存在的有機分子，核酸分子和其成分。
“優(yōu)選地排除蛋白質(zhì)的分子或分子混合物”指天然存在或人工起源的分子或分子混合物，當加入溶液時，使蛋白質(zhì)或多肽在所述溶液中的溶解性水平更低。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)的溶解性將降低50倍，更優(yōu)選地100倍，最優(yōu)選地約200倍。優(yōu)選地，包括優(yōu)選地排除蛋白質(zhì)的所述分子或分子的混合物的溶液中的蛋白質(zhì)的溶解性小于5-10mg/ml，更優(yōu)選地小于1mg/ml。
“基本純的多肽”或“蛋白質(zhì)”指已經(jīng)從自然伴隨的成分分離的多肽或蛋白質(zhì)。術語多肽和蛋白質(zhì)可以相互交換利用。通常，當它至少60％的重量，無蛋白質(zhì)和天然有關的天然存在的有機分子時，多肽基本上是純的。例如，通過從天然來源(例如，表達需要的多肽的細胞)，通過從編碼需要的多肽的重組核酸，或通過化學合成多肽提取時，可以得到基本純的多肽。通過任何適當?shù)姆椒?，例如，通過柱成析，聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖電泳，光密度，或HPLC分析可以測試純度。
當從天然狀態(tài)伴隨的污染中分離時，蛋白質(zhì)基本上是無天然相關成分的。所以，蛋白質(zhì)是在不同的細胞系統(tǒng)中化學合成或產(chǎn)生的，該細胞系統(tǒng)與它天然起源的細胞不同，這樣的蛋白質(zhì)是基本上無天然相關成分的。因此，基本純的多肽包括起源于真核生物體，但在大腸桿菌或其他原核生物中合成的那些。
“純化的核酸”指沒有那些在本發(fā)明的核酸起源的生物體的天然存在的基因組中側(cè)接該基因的基因的核酸。所以，該術語例如包括摻入載體；摻入自我復制的質(zhì)?；虿《?；或原核或真核生物的基因組的；或作為獨立于其他序列的分離分子(例如，cDNA或基因組通過PCR或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的或cDNA片段)存在的重組DNA。它也包括是編碼另外的多肽序列的雜合體基因的一部分的重組DNA。
“生物可相容”指將對受試者，細胞，或組織給藥的任何化合物或物質(zhì)用于治療，替代，或加強受試者，細胞或組織的功能，并且對所述的功能是無害的。
“不溶”是指化合物的溶解性在溶液中小于1g/100ml。溶液可以是水溶液，有機溶劑，如二甲亞砜，或水溶液和有機溶劑的混合物。正如本文所用，在完成遞送BAS的治療制品的配制后BAS可以是不溶的形式。BAS在遞送治療制品到病人時，仍然是不溶形式，然后慢慢在控制速度釋放，對病人定位或系統(tǒng)地遞送。正如本文所用，“聚集”是指BAS可以作為單個分子釋放。在聚集的制品中的BAS的百分數(shù)可以例如通過SEC-HPLC確定。
“治療劑量”，當指BAS時，是指最小的有效水平和毒性水平之間的血漿水平。
“混合物”指其含有的所有化合物均勻分散的一種組合物。
正如本文所用，“孔大小”指高聚體，高聚體的成分，或BAS潛在地可以通過的完整聚合物中的空間結構。正如它在特定的實施方案中存在的(例如蛋白質(zhì)分子，或其聚集體)，作為本發(fā)明的一部分利用的孔大小是那些比BAS小的。
正如本文所用，“釋放時期”指從制品中釋放特定百分數(shù)的BAS所花的時間的長度。釋放的時期可以例如通過測量50％或80％的BAS從制品中釋放所花的時間來評估。
“低突發(fā)效應”指從制品中釋放的BAS的量在一段時間內(nèi)相對穩(wěn)定地，而不是在開始快速接著慢速地釋放。例如，當釋放5％的可釋放BAS的時間大于t50的1/6，或當t50大于或等于t80的5/8時，BAS在從制品中釋放時的突發(fā)效應是低的(例如，小于或等于20％的突發(fā))。與低突發(fā)制品相反，在小于1/18的t50，高突發(fā)制品(例如，其快速釋放30％的BAS)可以釋放5％的可釋放BAS，并且具有的t50等于t80的1/2。
本發(fā)明的低突發(fā)產(chǎn)物的特定例子是，對于用于設計在10天內(nèi)釋放BAS的產(chǎn)物，在第一天產(chǎn)生了小于20％的BAS。
“t50”指50％的BAS原初負載已經(jīng)釋放需要的時間。正如本文所用，在大于t50的1/16的時間優(yōu)選地釋放5％的可釋放BAS，或t50大于或等于t80的5/8。
“t80”指80％的原初負載BAS已經(jīng)釋放需要的時間。正如本文所用，優(yōu)選地在大于t50的1/16的時間內(nèi)釋放5％的可釋放BAS，或t50大于或等于t80的5/8。
附圖的簡要說明


圖1是用沉淀的hGH制成的小球體的釋放方案。
圖2是從2kL5小球體釋放hGH的方案。
圖3是描述從4.2kL3-A3小球體釋放噴霧干燥的bSA的圖。
圖4是生物活性顆粒大小對從30％3.4kL5釋放小牛血清白蛋白(bSA)的影響。
圖5是生物活性顆粒大小和蛋白質(zhì)負載對從3.4kL5釋放研細的bSA(10％負載)和各種結晶顆粒(1-10％負載)的影響。
圖6是生物活性顆粒大小對從30％3.4kL5釋放人生長激素(hGH)的影響。
圖7是小球體孔徑大小對從制品釋放微?；痟GH的影響。
詳細敘述本發(fā)明提供不溶形式的生物活性物質(zhì)(BAS)的給藥方法和給藥組合物。本發(fā)明的組合物通過配制不溶形式的BAS提高了BAS的生物可得性。這些方法和組合物提供了受控制的，持續(xù)遞送的極大量的這些物質(zhì)，其突發(fā)效果低。
高聚體本發(fā)明的高聚體至少有一個形成中心核的區(qū)域，至少有一個可降解的(例如，可水解的)區(qū)域，和至少一個可聚合的區(qū)域。高聚體可以是水溶性的或水不溶性的。優(yōu)選地，形成中心核心的區(qū)域是水可溶的。如果需要，高聚體可以聚合形成水凝膠，用于以可控制的速度遞送摻入物質(zhì)。配制高聚體和賦予他們形狀形成制品的方法例如在引入作為參考的WO99/03454中敘述了。高聚體的一個重要方面是可聚合區(qū)域至少由一個可降解的區(qū)域分開。這種分開有助于體內(nèi)的均一的降解。
高聚體的中心核區(qū)和可水解的區(qū)域之間的比例決定了高聚體的許多共性。例如，高聚體的水溶解性可以通過改變組成疏水的可降解基團的高聚體的百分數(shù)來控制。
本發(fā)明的高聚體有幾種不同的變化。例如，可聚合區(qū)可以直接附著于可降解的區(qū)域；或者，他們可以間接地通過水可溶的非降解區(qū)域附著，而可聚合區(qū)域由可降解區(qū)域分開。例如，如果高聚體含有一個與可降解區(qū)域偶聯(lián)的水可溶區(qū)域，一個可聚合的區(qū)域可以附著于水可溶區(qū)域，其他附著于可降解的區(qū)域。
在另一個實施方案中，水可溶區(qū)域形成了高聚體的中心核，并且至少具有兩個附著的可降解區(qū)域。在可降解區(qū)域至少附著了兩個可聚合的區(qū)域，以至于在降解時，可聚合區(qū)，特別是聚合的凝膠形式是分開的?；蛘撸绻呔垠w的中心核是通過可降解區(qū)域形成的，那么在核心上至少可以附著兩個水可溶區(qū)域，而且聚合區(qū)域是附著于各個水可溶區(qū)域的。
仍然在另一個實施方案中，高聚體具有水可溶主鏈區(qū)域，可降解區(qū)附著于高聚體主鏈。在可降解區(qū)至少附著兩個可聚合區(qū)，從而在降解的時候他們分開，導致凝膠產(chǎn)物溶解。在另一個實施方案中，高聚體主鏈區(qū)域是由具有作為分支或嫁接支附著于可降解主鏈的水可溶區(qū)的可降解主鏈區(qū)域形成的。有兩個或多個可聚合區(qū)域附著于水可溶分支或嫁接支上。
在另一個變化形式中，高聚體主鏈可能具有多個臂；例如，它可以是星形或梳形。主鏈可以包括水可溶區(qū)，生物可降解區(qū)，水可溶性的的，生物可降解區(qū)。可聚合區(qū)是附著于這一主鏈的。另外，可聚合區(qū)必須在某一點上被可降解區(qū)分開。
在整個說明書中，有時利用下面的縮寫描述本發(fā)明的特定的高聚體。在三個特定的實施例中，具有一個水可溶區(qū)的高聚體由分子量為4,000道爾頓的PEG組成，在這一區(qū)的每一側(cè)面有5個乳酸酯基團，每一側(cè)有丙烯酸酯基團的帽子，稱為“4kL5”。同樣，具有水可溶區(qū)的高聚體，由分子量為3,400道爾頓的PEG組成，在這一區(qū)的每一側(cè)具有6個己內(nèi)酯基團，每側(cè)有丙烯酸酯基團的帽子，稱為“3.4kC6”。同樣，具有水可溶區(qū)的高聚體由分子量為5,400道爾頓的PEG和3個臂組成，每個臂含有3個乳酸酯基團，從這一區(qū)域延伸出來，在每一側(cè)有丙烯酸酯基團的帽子，稱為“4.2kL3-A3”。
水可溶區(qū)在優(yōu)選的實施方案中，中心核是水可溶區(qū)。高聚體的這一水可溶區(qū)可能包括聚(乙二醇)，聚(環(huán)氧乙烷)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙基噁唑啉)，聚(環(huán)氧乙烷)-共-聚(環(huán)氧丙烷)嵌段共聚物，多糖，碳水化合物，或蛋白質(zhì)，或他們的結合體。
高聚體優(yōu)選地含有包括PEG的水可溶核心區(qū)，因為PEG具有高親水性和水溶解性，并且包括好的生物相容性性。PEG區(qū)優(yōu)選地具有約400到約40,000道爾頓的分子量，更優(yōu)選地具有約1,000到約30,000道爾頓，約1,000到約20,000道爾頓，或約2,000到約10,000道爾頓的分子量。
可降解區(qū)高聚體的可降解區(qū)例如可以含有聚(α-羥酸)，聚(內(nèi)酯)，聚(氨基酸)，聚(酐)，聚(鄰酯)，聚(鄰碳酸酯)或聚(磷酯)，或這些聚合物的混合或共聚物。
舉例的聚(α-羥酸)包括聚(乙醇酸)，聚(DL-乳酸)，和聚(L-乳酸)。舉例的聚(內(nèi)酯)包括聚(ε-己內(nèi)酯)，聚(δ-戊內(nèi)酯)，聚(γ丁內(nèi)酯)，聚(1，5-dioxepan-2-one)，和聚(環(huán)丙烷碳酸酯)。
可降解區(qū)可以含有至少兩個不同的聚合物的混合體。共聚物的例子包括己內(nèi)酯和乙醇酸的共聚物；和己內(nèi)酯和乳酸的共聚物。
可聚合區(qū)高聚體的可聚合區(qū)優(yōu)選地含有能夠聚合高聚體的碳-碳雙鍵。選擇適當?shù)目删酆匣鶊F允許快速聚合和形成凝膠。含有丙烯酸酯的可聚合區(qū)是優(yōu)選的，因為它們?nèi)缦旅嫠懻摰目梢岳脦讉€啟動系統(tǒng)聚合。丙烯酸酯的例子包括丙烯酸酯，異丁烯酸酯，和異丁烯酸甲酯。
高聚體的聚合作用如果需要，本發(fā)明的高聚體可以在長波紫外光，可見光，熱能或氧化還原系統(tǒng)的影響下利用聚合起始物聚合。聚合可以在室溫，或在更低的溫度下，例如小于20℃的溫度下進行。在聚合過程中，將如蛋白質(zhì)的物質(zhì)物理地摻入得到的水凝膠聚合系統(tǒng)。
高聚體的聚合作用可以通過波長320nm或更長的光在原位啟動。當可聚合區(qū)含有丙烯酸酯基團，起始物可以是任何適當?shù)娜玖?，如黃嘌呤染料，丫啶染料，噻嗪染料，吩嗪染料，樟腦醌染料，苯乙酮染料，或具有三乙醇胺的曙紅染料，2，2-二甲基-2-苯樟腦醌，和2-甲氧基-2-苯樟腦醌。
聚合作用也可以在沒有光時進行。例如，聚合作用可以利用本領域的技術人員已知的技術，用氧化還原系統(tǒng)啟動。在一些情況下，利用本發(fā)明的氧化還原系統(tǒng)聚合高聚體是有利的，因為原子團起始物的生產(chǎn)是在一個寬的溫度范圍以合理的速度進行的。
可以在氧化還原系統(tǒng)中利用的起始物包括，但不限于，過氧化物，如乙?；?，苯甲?；?，枯基和t-丁基；過氧化氫如t-丁基和枯基，過酸酯如t-丁基過苯甲酸；?；?烷基磺酰過氧化物，二烷基過二碳酸酯，二過縮酮，酮過氧化物，偶氮化物如2，2’-偶氮(雙)異丁腈(AIBN)，二硫化物，和四氮烯。
制品的形狀本發(fā)明的制品可以形成任何需要的形狀。例如，這些制品可以形成適于特定的體腔的形狀。它們也可以形成薄的，片的或顆粒的，如微球體?；蛘撸@些制品可以構型，然后在使用之前加工成需要的形狀，或研磨成微細的顆粒。制品的需要的形狀取決于本說明書。
高聚體顆?？梢岳帽绢I域已知的技術制備，包括單個和雙乳劑蒸發(fā)，噴灑干燥，和溶劑提取。正如本文所用，術語“顆粒”包括，但不限于微球體。在微球體中，BAS是分散在顆粒中的。顆粒具有光滑的或不規(guī)則的表面，并且可以是固體或多孔的。制造微球體的方法如美國專利號，4,272,398中所述，Mathiowitz和Langer(控制釋放雜志，513-22(1987))；Mathiowitz等人(反應聚合物6275-283(1987))；Mathiowitz等人.(J.Appl.Polymer Sci.35755-774(1988))；Mathiowitz等人(掃描顯微術4329-340(1990))；Mathiowitz等人(J.Appl.Polymer Sci.，45125-134(1992))；和Benita等人(J.Pharm.Sci.731721-1724(1984))，引入本文作為參考。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，微球體形成水凝膠小滴形狀。
在溶劑的蒸發(fā)中，例如在Mathiowitz等人，(1990)，Benita等人(1984)，和美國專利號4,272,398中所述，聚合物是溶解于揮發(fā)性有機溶劑中的，如二氯甲烷。在聚合物溶液中選擇性地加入待摻入的試劑，所述試劑是可溶形式或分散成微細顆粒形式。混合物懸浮于含有表面活性劑如聚(乙烯醇)的水相中。攪拌得到的乳液，直到大多數(shù)有機溶劑蒸發(fā)，留下固體微球體，可以用水洗滌，并且在凍干器中干燥過夜。
在溶劑的除去中，如Park等人(控制釋放雜志55181-191(1998))中所述，治療或診斷試劑是分散或溶解于揮發(fā)性有機溶劑如二氯甲烷中的選定的聚合物的溶液中的。然后，混合物可以懸浮于油，如硅油中，通過攪拌形成乳劑。當將溶劑分散進油相中時，溶劑小滴變硬成固體聚合物小球體。
如PCT WO97/41833中描述了制備生物分子的超微細顆粒的方法，包括通過將大分子的液體溶液原子化，干燥在原子化步驟中形成的小滴，和收集顆粒，所述文獻引入本文作為參考。
噴霧干燥是通過將均相的BAS混合物，如治療劑，和用于形成水凝膠的可聚合高聚體通過一個嘴，旋轉(zhuǎn)盤或等當?shù)难b置原子化混合物形成微細的小滴來完成的。可以在溶液或懸浮液中，如水溶液中。提供該物質(zhì)和可聚合的高聚體。將微細的小滴暴露在光下，導致高聚體的聚合和形成摻入該物質(zhì)的水凝膠小滴。水凝膠可以根據(jù)引入本文作為參考的美國專利5,410,016中所述的方法，或聚合物化學領域已知的其他技術來形成。
在另一個實施方案中，通過油包水乳化方法制備水凝膠顆粒，其中可聚合的高聚體和待摻入的物質(zhì)懸浮于油包水乳液中，暴露在光下聚合高聚體形成水凝膠摻入該物質(zhì)，如BAS。通常，聚合可以在室溫下進行。
將利用上述技術制備的微球體冷凍干燥，以便它們具有長的半衰期(沒有生物降解)并且BAS仍然具有生物活性。在用于可注射配方之前，在適當?shù)娜芤褐腥琨}水或其他液體中再構建微球體。對于肺遞送，可以利用冷凍干燥或再構建顆粒。
高聚體的特性本發(fā)明的制品是可生物降解的。生物降解發(fā)生在延伸的寡聚體內(nèi)部的鍵中，導致產(chǎn)生非毒性的容易從身體中除去的和/或身體中的正常的，安全的化學中間產(chǎn)物的片段。這些物質(zhì)特定地可用于遞送親水物質(zhì)，因為聚合物的水可溶區(qū)允許水到達聚合物捕獲的物質(zhì)。
高聚體的用途高聚體可以構型成顆粒，例如微球體，并且這些制品能夠在體內(nèi)條件下以允許控制釋放摻入的物質(zhì)的速度降解。釋放這樣的物質(zhì)可能是通過在降解之前從聚合物擴散該物質(zhì)和/或當它降解時從該聚合物擴散該物質(zhì)而發(fā)生的。降解聚合物簡化了通過逐步水解末端酯鍵在體內(nèi)最終控制地釋放游離的大分子的過程。所以，在配制的范圍內(nèi)，避免有時與其他的釋放系統(tǒng)相關的突發(fā)效果。
釋放BAS的速度取決于許多因子，例如，水可溶區(qū)的組成，高聚體的聚合程度。釋放BAS的速度也取決于高聚體的可降解區(qū)的降解速度。例如，乙醇酸酯導致了非?？焖俚慕到?，乳酸酯導致了更慢的降解，和己內(nèi)酯導致了非常慢速的降解。當可降解區(qū)包括聚乙醇酸時，釋放期小于1星期。當可降解區(qū)包括聚(乳酸)時，釋放期約1星期。當可降解區(qū)包括己內(nèi)酯和乳酸的共聚物時或環(huán)丙烷碳酸酯和乳酸的共聚物時，釋放期是2到4星期。當可降解區(qū)包括聚(環(huán)丙烷碳酸酯)或己內(nèi)酯和環(huán)丙烷碳酸酯的共聚物時，釋放期是約3到8個星期。當可降解區(qū)包括聚(環(huán)丙烷碳酸酯)或聚(己內(nèi)酯)，釋放期約大于5個星期。
從顆粒釋放BAS的準確速度可以另外通過改變顆粒的親水和疏水成分的比例來修正。例如，在聚合后，非?？扇艿母呔垠w將產(chǎn)生親水的凝膠；親水的水凝膠已經(jīng)顯示比疏水的降解更快。親水的高聚體(例如，4kL5)和疏水的水不溶高聚體(3.4kC6)的混合體可用于形成聚合的水凝膠。這一水凝膠的釋放速度在僅含有乳酸的水凝膠和僅含有己內(nèi)酯的水凝膠的釋放速度之間?？山到鈪^(qū)是己內(nèi)酯和乳酸的共聚物的高聚體的釋放速度也將在僅含有乳酸的水凝膠和僅含有己內(nèi)酯作為最初的可降解基團的水凝膠的釋放速度之間。同樣，該活性物質(zhì)的親水性也影響B(tài)AS的釋放速度，親水活性物質(zhì)通常釋放速度比疏水物質(zhì)更快。
從治療性物質(zhì)釋放給定的BAS的速度取決于負載的物資的量，如最后的產(chǎn)物的配方的百分數(shù)。例如，通常認為，在聚合物場中，當大量的BAS負載產(chǎn)生了更長期的治療劑量的遞送，它也導致大的突發(fā)效果。所以，用大量的BAS負載和展示低的突發(fā)效果的顆粒將是最佳的顆粒。本發(fā)明的顆粒具有這些特性。
影響B(tài)AS從物質(zhì)中釋放的速度的其他因子是BAS的聚集和溶解性。為了本發(fā)明的制品具有最佳的遞送BAS的釋放方案，聚集的BAS的百分數(shù)應該是低的。本發(fā)明的制品含有的BAS優(yōu)選地聚集小于15％。在優(yōu)選的實施方案中，甚至當它們至少含有2.5％干重的BAS，更優(yōu)選地5％，最優(yōu)選地20或40％的干重的BAS時，制品還具有低聚集的特征。
如上所述，影響B(tài)AS從制品中釋放的速度的另一個因素是支配中的BAS的溶解性。在聚合物化學領域，通常認為導航摻入本發(fā)明的高聚體中時，水可溶物質(zhì)，如BAS將產(chǎn)生均相的系統(tǒng)。還認為，在形成本發(fā)明的高聚體的時間內(nèi)不溶的物質(zhì)將產(chǎn)生異相的系統(tǒng)。當在異相系統(tǒng)中的突發(fā)量利用含有小顆粒的特殊的懸浮液減小時，通常認為，制品應該是在聚合物遞送系統(tǒng)中最適的遞送的水可溶形式。本發(fā)明的制品含有不溶形式的BAS，這些顆粒具有低的突發(fā)效果，一個出乎意料的結果。
影響B(tài)AS從制品中釋放的速度的另一個因素是BAS的顆粒大小。例如，本發(fā)明的制品的特征是，BAS已經(jīng)研磨，并且篩選分離了在任意方向上比約75微米更小的微細顆粒。這些顆粒用于產(chǎn)生微球體，并且測量了從微球體釋放BAS。將釋放的速度與同樣的BAS從同樣的微球體釋放的速度比較，但該BAS是沒有微細研磨的。這些研究的結果表明微細研磨的BAS導致的釋放速度更低，并且具有低的突發(fā)影響。調(diào)整上面討論的因子，降解和控制釋放可以在非常寬的范圍內(nèi)變化。例如，釋放可以設計成在小時，天，或月內(nèi)發(fā)生的。
本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生行為如均相藥物遞送系統(tǒng)的顆粒。由于本發(fā)明的顆粒的均相的特性，沒有釋放物質(zhì)的最初的突發(fā)。另外，均一的一致性使摻入相當高的量的蛋白質(zhì)，同時減小突發(fā)效果成為可能。
本發(fā)明其他的特征是不溶的高聚體。這些高聚體至少含有一個水可溶區(qū)，至少含有一個可降解(例如，可水解)區(qū)，和至少含有一個可聚合區(qū)?？山到鈪^(qū)含有乙醇酸，乳酸，己內(nèi)酯，環(huán)丙烷碳酸酯的聚合物，或它們的混合物或共聚物?？山到鈪^(qū)必須是水不溶的。例如，可以制備具有含有15-20個交酯單位的可降解區(qū)的高聚體；這一高聚體將提供相當快的釋放速度。具有含有6個己內(nèi)酯單位的可降解區(qū)的高聚體將提供相當?shù)偷尼尫潘俣?。具有含?個己內(nèi)酯單位，4個交酯單位和4個乙醇酸單位的共聚物的可降解區(qū)的高聚體將提供快的釋放速度，并且具有含有3個交酯單位和7個環(huán)丙烷碳酸酯單位的共聚物的可降解區(qū)的高聚體將提供中度的釋放速度。
這些高聚體的水可溶區(qū)優(yōu)選地是PEG。水可溶區(qū)可以有多個臂；例如，它可以是星形或梳形，如美國專利5,410,016所述，引入本文作為參考。水可溶區(qū)優(yōu)選地具有3，4，6或8個臂，分子量為500到20,000，優(yōu)選地為1,000到10,000道爾頓。
提高蛋白質(zhì)沉淀的方法通過將具有蛋白質(zhì)以外的一個分子，混合物或多個分子的BAS和一個高聚體結合，形成這些試劑的混合物，并且聚合混合物可以將本發(fā)明的制品制成含有不溶形式的BAS。優(yōu)選地蛋白質(zhì)以外的分子或混合物或多個分子可以用于形成提高蛋白質(zhì)沉淀的制品。優(yōu)選地蛋白質(zhì)以外的分子的例子包括，但不限于高聚體，聚(乙烯醇)，透明質(zhì)酸，和聚(乙烯吡咯烷酮)。攜帶正或負離子電荷的試劑可以用于形成本發(fā)明的制品，以便提高混合物中BAS的沉淀，然后聚合形成本發(fā)明制品。利用的最佳試劑取決于受混合物的pH影響的蛋白質(zhì)的電荷。優(yōu)選地排除蛋白質(zhì)的分子的混合物的例子包括，但不限于含有正電荷例子攜帶試劑的分子的混合物，例如三乙醇胺或Tris(例如，當pH是使蛋白質(zhì)帶負電荷時)；也不限于含有帶負電離子的試劑，如十二烷基硫酸鈉的分子的混合物(例如，當pH是使蛋白質(zhì)帶正電荷時)含有表面活性劑例如，吐溫20，吐溫80，或泊咯沙姆F68的混合物也可以用于提高蛋白質(zhì)的沉淀。
高負載和低突發(fā)特征治療劑例如BAS可以容易地以高含量摻入本文所述的制品。例如制品可以制備成至少含有5％干重的活性物質(zhì)。優(yōu)選地，制品至少含有10％，25％或40％的干重。
正如上文所討論的，當與高聚體結合并且形成制品時，本發(fā)明的BAS是不溶形式的。制品中的活性物質(zhì)高負載并且不溶形式給制品提供緩慢釋放的特性，初始突發(fā)小。在聚合物領域這些結果是令人吃驚的，該領域認為含有不溶活性物質(zhì)的制品將具有活性物質(zhì)的大的初始突發(fā)。
包含在本發(fā)明的制品中的BAS是不溶的。通過混合BAS和PEG，然后將這些試劑與需要的高聚體結合可以獲得含有不溶BAS的制品的配方。
通過將它與高聚體結合并且并且使制品成型可以測量加載進微球體的BAS的量。然后，將該制品放置于適當?shù)娜軇┲?，例如磷酸緩沖釋放介質(zhì)(0.01％NaN3，0.05M PBS，pH7.4)并且通過本領域可得的方法如光譜儀測量存在的BAS的量。
生物活性物質(zhì)可以摻入本發(fā)明的制品中的BAS包括治療性的，診斷性的和預防性的試劑。它們可以是天然存在的化合物，合成性的有機化合物，或無機化合物?？梢該饺氡景l(fā)明的制品中物質(zhì)包括蛋白質(zhì)，多肽，碳水化合物，無機物質(zhì)，抗生素，抗癌劑，局部麻醉劑，抗生血管劑，血管活性劑，抗凝劑，免疫調(diào)節(jié)劑，細胞毒劑，抗病毒劑，抗體，神經(jīng)遞質(zhì)，心理藥物，寡聚核苷酸，脂，細胞，組織，組織或細胞聚集物，和它們的結合。
治療劑的例子包括生長激素，例如，人生長激素，降鈣素，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，甲狀旁腺激素，和囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)基因。其他特定的治療劑包括甲狀旁腺激素相關的多肽，促生長素抑制素，睪酮，孕酮，雌二醇，尼古丁，芬太尼，炔諾酮，可樂丁，天仙子堿，水楊酸，沙美特羅，formeterol，albeterol，和安定。
可以利用治療肺的藥物，包括羥乙磺酸噴他脒。治療肺病如氣喘的藥物可以利用，包括硫酸舒喘寧，β-激動劑，硫酸異丙喘寧，倍氯米松dipropionate，乙酰氨基曲安西龍，布地奈德丙酮化合物，異丙托溴胺，氟尼縮松，色甘酸鈉，酒石酸麥角胺，和蛋白質(zhì)或多肽藥物如TNF拮抗劑或白介素拮抗劑。
其他治療劑包括癌癥化學治療劑，如細胞因子，趨化因子，淋巴因子和基本純化的核酸，和疫苗如減毒流感病毒?？梢該饺氲幕炯兓暮怂岚ɑ蚪M核酸序列，編碼蛋白質(zhì)，表達載體，反義分子，結合互補的核酸序列抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯的反義分子，和核酶的cDNA。例如，可以給藥治療疾病如囊性纖維化的基因。也可以給藥多糖如肝素。
其他治療劑包括組織纖溶酶原激活物(t-PA)，超氧化物歧化酶，過氧化氫酶黃體激素釋放激素(LHRH)拮抗劑，IL-11血小板因子，IL-4受體，enbrel，IL-1受體拮抗劑，TNF受體融合蛋白質(zhì)，巨核細胞生長和發(fā)育因子(MGDF)，stemgen，抗-HER-2和抗-VEGF人化單克隆抗體，抗Tac抗體，GLP-1糊精，和GLP-1糊精類似物。
其他的治療劑包括心肽素，心房肽，β-人絨膜促性腺激素，堿性成纖維生長因子，小牛生長激素，骨形態(tài)發(fā)生蛋白，B細胞刺激因子-1，B細胞刺激因子-2，小牛促生長素，癌阻斷因子，軟骨誘導因子，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子，菌落刺激因子，分化因子-1，內(nèi)皮細胞生長因子，類紅細胞分化因子，延長因子1-α，表皮生長因子，促紅細胞生成素，血小板生成素，胸腺生成素，成纖維細胞生長因子，促卵泡激素，粒細胞集落刺激因子，膠質(zhì)原纖維酸性蛋白，生長激素釋放因子，人α抗胰蛋白酶，人心房肽，人絨膜促性腺激素，人白血病抑制因子，促紅細胞生成素，肝細胞生長因子，人轉(zhuǎn)化生長因子，人甲狀腺刺激激素，干擾素，免疫球蛋白A，免疫球蛋白D，免疫球蛋白E，類胰島素生長因子-1，類胰島素生長因子-II，免疫球蛋白G，免疫球蛋白M，白介素-1，白介素-2，白介素-3，白介素-4白介素-5，白介素-6，腎纖溶酶原激活物，凝集素細胞黏連分子，黃體激素，白血病抑制因子，單克隆抗體，巨噬細胞激活因子，巨噬細胞毒性因子，巨噬細胞集落刺激因子，巨核細胞刺激因子，促黑素細胞刺激因子，嗜中性白細胞趨化因子，神經(jīng)生長因子，新的纖溶酶原激活物，非類固醇抗炎癥藥物，成骨因子提取物，抗腫瘤淋巴因子，前列腺特定抗原，抗血小板激活因子，纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑，血小板起源的生長因子，血小板起源的創(chuàng)傷愈合公式，原生質(zhì)人白介素誘導蛋白，腫瘤血管生成因子，組織控制因子，T細胞生長因子，T細胞調(diào)節(jié)肽，轉(zhuǎn)化生長因子，腫瘤生長抑制劑，腫瘤抑制因子，金屬蛋白酶的組織抑制劑，腫瘤壞死因子，組織纖維溶酶原激活物，血管內(nèi)皮生長因子，和血管活性腸肽。
優(yōu)選的BAS是基本純化的多肽或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)通常定義為含有100個氨基酸殘基或更多的；多肽是小于100個氨基酸殘基的。除非另有說法，術語蛋白質(zhì)在此處指蛋白質(zhì)和多肽。蛋白質(zhì)可以例如通過從天然來源分離或重組地產(chǎn)生。例子包括胰島素和其他激素，包括生長激素，如人生長激素和小牛生長激素。其他例子的蛋白質(zhì)包括FactorVIII，F(xiàn)actorIX，F(xiàn)actorVIIa，和抗炎癥試劑，如白介素，包括白介素-4。其他例子的蛋白質(zhì)包括酶，如Dnase和蛋白酶。其他蛋白質(zhì)包括細胞因子，干擾素，包括干擾素α，干擾素β，poetins，生血管因子，分化因子，集落刺激因子，生長因子，ceredase，赤霉素，生長素，和維生素，和它們的片段。生長因子的例子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，內(nèi)皮細胞生長因子(ECGF)，堿性成纖維生長因子(bFGF)，和血小板起源的生長因子(PDGF)。
蛋白質(zhì)在本發(fā)明的水凝膠中是穩(wěn)定的。例如，許多蛋白質(zhì)如下面的實施例中討論的是不會二聚體化或聚集的。蛋白質(zhì)或多肽的酶降解可以進一步通過共摻入肽酶-抑制劑來減弱。
用緩慢釋放蛋白質(zhì)聚合物治療動物通過遞送BAS到動物，可以利用本發(fā)明的聚合物制品治療動物，例如小鼠或人類。該制品可以含有如上所述的BAS?？梢岳酶鞣N給藥途徑遞送如下所述的本發(fā)明的制品。
用本文所述的含有BAS的治療制品治療動物的結果將根據(jù)遞送的BAS而變化。例如，如果通過本發(fā)明的治療制品遞送hGH，可以期望觀察到生長的增強，可以作為這樣的治療的結果。如果通過治療制品遞送紅細胞生成素，可以期望觀察到治療的結果是網(wǎng)織紅細胞的增加。如果通過治療制品遞送的是胰島素，那么治療的結果是血糖水平的降低。
本發(fā)明的制品使BAS的遞送最佳，因為它們是以控制的方式釋放的，突發(fā)效應低。這樣的遞送速度的結果是藥物在需要的時間段穩(wěn)定地釋放。遞送的更慢和更穩(wěn)定的速度可以依次導致BAS給藥動物所必須的頻率的降低。另外，低的突發(fā)效果在一個位點遞送太多的BAS對動物有害的一些情況下是非常需要的。
給藥物質(zhì)的途徑吸入利用本發(fā)明的水凝膠物質(zhì)可以加強將藥物遞送到肺。給藥到肺提供了藥物的遞送可以穿過非組織屏障運輸，進入循環(huán)系統(tǒng)，如WO99/03454所述。
將活性物質(zhì)遞送到肺存在的問題是肺巨噬細胞可以吸收物質(zhì)，從而阻止物質(zhì)進入系統(tǒng)和局部的循環(huán)。吸收發(fā)生在吸收到物質(zhì)的表面的蛋白質(zhì)結合樂巨噬細胞表面上的受體。為了防止吸收，本發(fā)明提供了非離子水凝膠，例如基于聚乙二醇與聚合物形成的。這些水凝膠吸收了低水平的蛋白質(zhì)，所以很少結合到細胞表面。陰離子水凝膠，例如與聚丙烯酸形成的也相對低水平地吸收蛋白質(zhì)，所以結合到細胞表面的很少。
在另一個實施方案中，可以形成有生物相容性的微膠囊，并且在表面上提供了水可溶的非離子聚合物如聚環(huán)氧乙烷(PEO)，產(chǎn)生對細胞黏連的抗性，如引入本文作為參考的美國專利號5,380,536中所述。
也可以選擇物質(zhì)的大小和密度來減小遞送到肺的BAS的量。例如，巨噬細胞將不會吸收大的顆粒如小的顆粒那樣有效。但是，大的顆粒不會如小的顆粒那樣遞送到肺的深層。為了克服這些矛盾的因子，本發(fā)明提供能夠如它們水合時那樣膨脹的小顆粒。這些顆粒如小的(即，1-5微米)，干，或稍微濕的顆粒那樣給藥到肺的深層；在水合的基礎上，它們膨脹，所以變成對肺巨噬細胞的吸收有抗性。膨脹可以發(fā)生在當顆粒從干的狀態(tài)水合時，和當顆粒從一種水合的狀態(tài)通過改變溫度，pH，酯濃度或存在其他溶劑時，例如依據(jù)水凝膠聚合物的化學和物理特性變成另一種狀態(tài)時。
如此處所用，術語“干”指粉末的顆粒具有水分含量使粉末容易擴散入吸入裝置形成汽霧。優(yōu)選地，顆粒的水分含量低于水重量的10％，更優(yōu)選地低于5％，或者約低于2％，或者更低。
顆粒的密度表示成tap密度的術語。Tap密度是包被質(zhì)量密度的標準測量。各向的顆粒的包被質(zhì)量密度定義為顆粒的質(zhì)量除可以包被顆粒的最小球體包被體積。利用GeoPyc(Micrometers Instrument Corp.，Norcross，GA)或AutoTap(Quantachrome Corp.，Boyton Beach，F(xiàn)L)測量的顆粒的密度。
例如，如下確定3.4kL5顆粒的密度。合并3.4kL5(1.0025g)，PBS中的200mM TEOA；pH7(1.0260g)，和1000ppm Eosin(0.1028g)。將200毫克該溶液與滑石粉(0.1015g)混合。將得到的懸浮液放置于100微升的玻璃移液管中和通過光聚合15秒(ILC Technology，Inc.Xenon Light Source with Fiber Optics)。拿出棒，放在鋁箔上，再聚合3.5分鐘。將變硬的棒凍干18小時(真空15E-3mbar，traptemp.-50℃)。將干的棒(水含量＜10％)切成小片，放置于庚烷中，用均漿器(Silverson L4RT-A)在5,000rpm磨成小顆粒。將濕的顆?？諝飧稍?，接著通過氮氣流。顆粒大小范圍是1微米到0.5mm。
1.645g這些顆粒放置于10ml的分級圓筒。將分級圓筒放置在Autotap密度計(Quantachrome)的頂部。將樣品拍100次，讀出顆粒的體積。重復這一過程直到體積再沒有變化。最后的體積是2.8ml。顆粒的tap密度是1.6435g/2.8ml＝0.5870g/ml。
除了顆粒，聚合物可以適于遞送到深層肺的其他形式提供。例如，將PEG乳液微球體放置于平板上，處于高壓和真空，形成非常輕非常薄的層，例如，具有雪片似的均一性，對流體旋轉(zhuǎn)力有不同的反應。得到的薄片可以例如是0.01微米，1微米，或10微米厚。
可以對呼吸系統(tǒng)給藥顆粒，單獨地，或在任何適當?shù)乃幬锟山邮苜x形劑中，如液體如酯，或粉末中。針對特定的治療應用可以選擇汽霧劑劑量，配方和遞送系統(tǒng)，如下所述Gonda(“遞送治療和診斷劑到呼吸道的汽霧劑“，在治療藥物載體系統(tǒng)中的重要綜述，6273-313，1990)；和Moren(“汽霧劑劑量形式和配方”，汽霧劑醫(yī)藥，原理，診斷和治療，Mopren，等人，Eds.，Elsevier，Amsterdam，1985)。
利用一些裝置，如液體霧化器，基于汽霧的計量劑量吸入器，和干粉分散裝置可以完成肺藥物的遞送。對于干粉分散裝置的利用，摻入治療劑的聚合物顆粒可以例如通過凍干或噴灑干燥配制成干粉。制備含有藥理可接受量的治療劑和載體的噴灑干燥的，基于藥物的干粉的方法在PCT WO96/32149中有敘述，該專利引入本文作為參考。
可以給藥到肺的BAS的例子包括，但不限于胰島素，抗胰蛋白酶，降鈣素，α干擾素，β干擾素，GLP-1和DNAse。
鼻遞送也可以將本發(fā)明的制品用于通過鼻將化合物給藥。例如，可以通過鼻將含有凍干的或再構建微球體的疫苗給藥。
肌肉內(nèi)和皮下給藥可以將本發(fā)明的制品通過肌肉內(nèi)注射或皮下注射給藥那些在幾天到3個月內(nèi)降解的微球體。
例如，可以皮下給藥生長激素；當降解時，激素把微球體留在注射位點。生長激素進入系統(tǒng)循環(huán)，在循環(huán)中依次它直接地發(fā)揮效果，和間接地通過在肝和其他組織中誘導生長調(diào)節(jié)素的產(chǎn)生來發(fā)揮效果。在本說明書中，可以利用大小達到0.5毫米的顆粒。
在其他實施方案中，活性劑是疫苗，如破傷風疫苗，其他蛋白質(zhì)或多肽，或更復雜的免疫原。疫苗在一段時間內(nèi)釋放，1星期到多星期，產(chǎn)生的對疫苗的免疫應答與大團的注射后，用同樣總量的免疫原一次或多次加強注射相比是提高了。不同類型的微球體的混合物可以導致初始的和加強注射類型的免疫。
靜脈內(nèi)給藥含有BAS的用于治療凝血紊亂的制品如用于治療血友病的FactorVIII或FactorIX可以通過靜脈內(nèi)注射給藥。BAS在幾天到幾星期內(nèi)釋放。維持治療水平的BAS能產(chǎn)生更好的臨床結果。另外，可以給藥相對更低總劑量的BAS，這樣經(jīng)濟上有益。這些途徑幫助促進病人的變應性。
在靜脈內(nèi)注射的情況中，將微球體配制成可接受的試劑，使微球體不聚集和堵塞血管是重要的。微球體必須是適當大小的，使它們不停留在毛細血管中。對于本說明書，顆粒大小為0.2-0.5微米是優(yōu)選的。
在許多炎癥情況中，作為選擇蛋白和ICAM表達/與嗜中性intravisation結合介導的炎癥過程的一部分，血管在炎癥位點有漏洞?？梢越o藥水凝膠微球體；這些微球體將在炎癥位點漏出，然后在一段時間內(nèi)局部地釋放它們的BAS有效負載。這一途徑可能有用的疾病病癥包括，但不限于炎癥性大腸疾病，氣喘，類風濕關節(jié)炎，骨關節(jié)炎，肺氣腫，和囊性纖維化(用Dnase作為酶藥物)。
可以通過靜脈內(nèi)注射給藥含有細胞因子，淋巴因子，或其他化合物的治療癌癥的水凝膠微球體。在大的固體腫瘤內(nèi)的血管通常有漏洞，其中的血流通常是慢的。所以，微球體可以停留在固體腫瘤內(nèi)，并局部地釋放它們的抗癌的BAS，直接殺死腫瘤細胞或通過激活局部的免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞?？梢詫⑦@一途徑例如與化合物如白介素2一起利用，其中系統(tǒng)的或局部的毒性受劑量的限制，而且產(chǎn)生的副作用是明顯的。
本發(fā)明的微球體可以相對慢地從循環(huán)中清除?；蛘撸梢酝ㄟ^漏的血管或通過更活性的靶機制，例如，受體介導的靶機制，靶擊微球體使它退出循環(huán)系統(tǒng)。
口服給藥在腸胃道的一些部分，有良好的蛋白質(zhì)的運輸，可以跨過腸粘膜進入系統(tǒng)和局部的循環(huán)。所以，可以口服給藥能夠保護含藥物的微球體不受酶的攻擊和上面的腸胃道發(fā)現(xiàn)的低的pH的攻擊的適當?shù)哪c的制劑的本發(fā)明的組合物，含有蛋白質(zhì)的凍干的微球體(非常小的顆粒大小)。這樣的腸制劑也可以利用幾個可得到的技術來設計，使它在腸膠囊穿過腸胃道時逐漸推出含有BAS的微球體。這在WO99/0345和在Mathiowitz等人(自然386410-414(1997))中有更詳細的敘述。
可以預料，這一途徑在口服遞送蛋白質(zhì)，和其他分子，甚至小分子時比其他途徑更具許多優(yōu)點。首先，PEG和蛋白質(zhì)是相容性的，所以可以避免其他藥物遞送途徑中存在的主要的制造和穩(wěn)定性的問題。其次，干的水凝膠是容易黏連到濕的組織上的。微球體將能夠很好地結合腸胃道，并且將通過腸胃循環(huán)運輸入系統(tǒng)，或在腸粘膜上釋放內(nèi)容；依次，藥物將進入系統(tǒng)的和腸胃的循環(huán)。利用特定的和非特定的生物運輸機制簡化穿過GI道到系統(tǒng)循環(huán)的化學增效劑或含有配方的組合物也包括在內(nèi)。
靶靶配體可以通過顆粒上的反應功能基團附著于顆粒上。靶配體允許顆粒與特定受體位點的結合相互作用，如在肺內(nèi)的那些或特異于身體的微管組織中的不同區(qū)域的內(nèi)皮細胞上的那些。靶配體應選擇與特定的靶特異地或非特異地結合的。靶配體的例子包括抗體和含有抗體可變區(qū)的其片段，凝集素，激素，或能夠特異地結合靶細胞表面上的受體的其他有機分子。其他配體在科學(279323-324(1998))中有敘述，該文獻引入作為參考。
可以用BAS和靶分子制造微球體。也可以制造雙微球體，其中內(nèi)部的球體含有藥物，外部的PEG殼含有靶分子或試劑。
賦形劑和載體提供的摻入治療劑或診斷劑的顆粒可以和本領域可得的一種或幾種藥物可接受的賦形劑結合，如PCT WO 95/31479中所述，該專利引入作為參考。賦形劑可以選擇在一些情況中能夠增強穩(wěn)定性，分散性，均一性的，并且膨脹以保證均一的肺遞送。賦形劑可以是例如人血清白蛋白(HAS)，膨脹劑如碳水化合物，氨基酸，多肽，pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液和酯。其他賦形劑包括鋅，抗壞血酸，甘露醇，蔗糖，海藻糖，環(huán)葡聚糖，聚乙二醇，和其他通常使用的藥物賦形劑，包括美國藥典協(xié)定公司1995年出版的美國藥典中所述的那些(參見例如，第2205-2207頁)。碳水化合物的例子包括單糖，如半乳糖，和二糖如乳糖。穩(wěn)定蛋白質(zhì)的賦形劑是特別有用的。
在一些情況中，賦形劑可用作載體，即它們用于調(diào)節(jié)活性物質(zhì)的釋放速度。例如，甘露醇可用于加速或延遲釋放。
下面是特別的實施例，敘述了本發(fā)明的組合物的制備和本發(fā)明的方法。提供這些實施例是用于敘述本發(fā)明的，不能構成對本發(fā)明的限制。
在下面的一些實施例中，利用了丙烯酸-PLA-PEG-PLA丙烯酸的三單元組大塊共聚物組成的高聚體。PEG具有3,400道爾頓的分子量，兩側(cè)的聚(乳酸)每側(cè)具有約5個乳酸單元；所以，在本文中稱為“3.4kL5”。當利用低分子量的PEG，如2,000道爾頓的時，得到的高聚體縮寫為“2kL5”。
在其他實施例中，利用了丙烯酸-PCL-PEG-PCL-丙烯酸高聚體。PEG具有3,400道爾頓的分子量，在兩側(cè)具有polycaprotacton，每側(cè)平均約6個caproyl單元。該聚合物稱為“3.4kC6”。
在其他實施例中，利用了3臂的高聚體。該高聚體是具有3個臂的PEG組成的，PEG的每個臂附著3個乳酸基團。PEG具有4,200道爾頓的分子量。聚合物稱為“4.2kL3-A3”。
實施例1高聚體溶液的一般制備過程稱出蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)中加入下面成分(i)90mMTEOA/PBS，pH8.0；(ii)35％n-乙烯吡咯烷酮(n-VP)；和(iii)1000ppm的Eosin。用小匙攪拌得到的混合物。將溶液保持在暗中10分鐘，或者直到高聚體吸收所有溶液，或直到溶液均一。
制備了具有下面成分的高聚體溶液。
實施例2hGH的制備和配制成水凝膠小球體在5mM的碳酸氫銨緩沖液中的100mg/ml的hGH溶液中加入77微升1300mM的三乙醇胺，pH8溶液。在上面的溶液中加入400mg的PEG2K后，形成了hGH的細微沉淀。在4000rpm離心樣品幾分鐘，并且除去0.9毫升上清液。在沉淀的混合物中，加入1克4.2kL5-A3高聚體，接著加入0.1ml的10mM的Eosin Y溶液。然后，在油相中乳化該混合物，形成微球體，然后利用氬激光器聚合。這一制劑的體外釋放特征顯示在
圖1。沒有觀察到突發(fā)，釋放至少繼續(xù)了5天。
實施例3凍干的人生長激素的微?；团渲瞥伤z小球體將10mg/ml的hGH乙酸銨溶液冷凍，凍干，得到干的純hGH蛋糕。制備下面的高聚體溶液1克2kL5，1.2克的磷酸緩沖鹽水(pH7)，溶于水中的25％的海藻糖和0.4％的F-68溶液0.4克，溶于四氫呋喃中的10％的2，2-二甲氧基2-苯基苯乙酮溶液0.24克。在這一溶液中加入0.2克冷凍干燥的hGH。在混合分散hGH后，通過1.5inch的20g針20次進一步將懸浮液中的hGH微粒化。然后在油相中乳化這一懸浮液，形成微球體，然后通過暴露于紫外光(365nm)下3分鐘聚合。這一微球體的體外釋放特征表示在圖2。
實施例4制品的形成將水凝膠形式的微球體放置于硅烷化的玻璃片上。利用許多片塑料片，厚度約0.4±0.2mm作為間隔，另一硅烷化玻璃片放置于頂部，用結合夾牢固地固定。
將光源(ILC技術公司，Xenon Light Source with Fiber Optics)調(diào)節(jié)到約5cm的距離。照盤的中心；盤的兩邊各照2分鐘，形成不透明的盤。
實施例5制備含有4.2kL3-A3高聚體和bSA的制品在1ml的50％的乙醇/水溶劑中，加入1克4.2kL3-A3的高聚體和7.8mg的2，2-二甲氧基-2-苯基-苯乙酮(DMPA)。在完全溶解高聚體和DMPA后，加入250mg的噴霧干燥的bSA，攪拌直到混合物均一。然后在溶于0.5％的重白礦質(zhì)油溶液中的0.5％卵磷脂200克中，以600rpm攪拌進行乳化。短時間后，在15分鐘的時間，用Black-RayB100AP UV燈光聚合分散的小滴。這一制劑的體外釋放方法表示在圖3，沒有顯示突發(fā)。
將可降解的高聚體(4.2kL3-A3)與bSA結合。基于干重，在20％的負載加載蛋白質(zhì)。用白色重礦質(zhì)油配制乳液。然后，通過噴灑干燥和UV聚合技術將高聚體聚合成水凝膠。
實施例6分析從高聚體釋放的生物活性物質(zhì)在如上所述，例如實施例4中制品形成后，移出盤，在一個清潔的，涂上焦油的硅烷化玻璃片上稱重。將盤子放置在熱封口的膜袋中，詳細敘述如下。在每個袋中放置一個20微升的盤。將袋熱封口，放置于2.0ml的磷酸緩沖鹽水釋放介質(zhì)中(0.01％NaN3，0.05M PBS；pH7.4)，放置于在100rpm轉(zhuǎn)動的有軌振搖器上，在39℃溫育。
在每個時間點，將袋放置于新鮮的2.0ml的PBS釋放介質(zhì)中。只要BAS持續(xù)釋放，每天收集樣品進行分析。
如下制備膜袋。將膜薄層切成約7×2.5cm的片。將膜薄層對半折疊。用Bunsen燃燒器或丙烷火炬，加熱小匙直到變紅。將膜薄層的邊對齊排列，用紅熱的鑷子切膜的邊并且封上邊。一旦將盤放置于袋中，用同樣的熱封技術封上最后的邊。
通過SEC-HPLC每天分析樣品。用這一方法可以檢測單體，二體，和可溶的聚集物。利用的移動相是60/40％CH3CN/H2O中0.08M TFA，pH調(diào)節(jié)至2.0，等度地，流速為1.5ml/min。在220納米的波長下檢測信號。利用的柱是用guard柱裝備的Bio-Rad Bio-SilSEC250，5微米的顆粒大小，300×7.8mm ID(Bio-Rad Bio-SilSEC250Guard，5微米顆粒大小，80×7.8mm ID)。注射體積是10微升。標準校準曲線是0，0.1，0.25，0.5，0.75和流動相中1mg/ml bST。
實施例7生產(chǎn)具有有效的蛋白質(zhì)負載量和低的突發(fā)效果的微球體圖3顯示了本發(fā)明的治療制品的高蛋白質(zhì)負載量和低突發(fā)特征的例子。該制品含有結合了bSA的4.2kL3-A3(單體或二體形式)并且用噴霧干燥技術形成了微球體。以計算的負載量20％負載bSA。如上所述測試從微球體釋放的bSA。以低的穩(wěn)定速度釋放，沒有突發(fā)后果。在9天的時期之后，從含有bSA的高聚體釋放低于30％的bSA。這些結果證明本發(fā)明的治療制品可以提供緩慢釋放的BAS，而突發(fā)效果小或沒有。
實施例8BAS的顆粒大小對從30％的3.4kL5釋放bSA的影響同樣確定了BAS的顆粒大小對它從制品例如小球體中釋放的影響。在液氮中將用于形成微球體的bSA研磨成小于75微米的微細顆粒，或不研磨。用如上所述的方法配制含有30％的3.4kL5和微細研磨或不研磨的bSA的微球體，測試bSA的釋放，以25％的干重加載。圖4說明了這些研究的結果。與含有不研磨的bSA的微球體相比，含有微細研磨的bSA的微球體在更長的時期釋放它的bSA。另外，含有微細研磨的bSA的微球體具有穩(wěn)定的釋放速度(在24小時內(nèi)釋放了低于20％總負載量的bSA)，沒有突發(fā)效果，而含有未研磨的bSA的微球體具有突發(fā)效果(在24小時內(nèi)釋放約50％的總負載量的bSA)。這些結果證明小顆粒大小的含有BAS的微球體提供了更慢的釋放和低的突發(fā)效果。
實施例9BAS顆粒大小和負載的蛋白質(zhì)對磨細的bSA(10％的負載)和各種結晶的顆短(1-10％的負載)從3.4kL5中釋放的影響同樣檢測了BAS的顆粒大小和蛋白質(zhì)負載對bSA從制品中釋放的影響(圖5)。用于形成微球體的bSA在液氮下研磨成小于75微米的微細顆粒，或不研磨。將研磨成細粉的bSA與3.4kL5結合形成負載10％bSA的30％的3.4kL5微球體，利用的方法如上所述。將含有各種顆粒大小的未研磨的bSA與3.4kL5結合形成負載1-10％bSA的30％的3.4kL5微球體。然后，測試微球體中bSA的釋放。圖5說明了這些研究的結果。與含有未研磨的bSA的微球體相比，負載10％的含有微細研磨的bSA的微球體在更長的時期釋放bSA。另外，含有微細研磨的bSA的微球體具有比未研磨的部分(在開始的24小時內(nèi)差不多釋放50％的總負載量的bSA)更低的突發(fā)效果(在開始的2 4小時內(nèi)釋放約20％的總負載量的bSA)。這些結果證明，小顆粒大小和高負載的含有BAS的微球體提供了比含有各種顆粒大小和更低負載BAS的微球體更令人滿意的BAS釋放方式。
實施例10蛋白質(zhì)顆粒大小對從30％的3.4kL5釋放hGH的影響用含有微細研磨或未研磨的hGH進一步檢測BAS的顆粒大小對它從微球體釋放的影響。在液氮下將用于形成微球體的hGH研磨成小于75微米的顆粒，或不研磨。用如上所述的方法配制含有30％3.4kL5和微細研磨或未研磨的hGH的微球體，測試負載25％干重和制造條件下10％的hGH的釋放。圖6說明了這些研究的結果。與含有未研磨的hGH的微球體相比，含有微細研磨的hGH的微球體在更長的時期釋放它的hGH。另外，含有微細研磨的hGH的微球體具有穩(wěn)定的釋放速度(在開始的24小時內(nèi)釋放小于40％的總負載量的hGH)，沒有突發(fā)結果，而含有未研磨的hGH的微球體具有高突發(fā)結果(在開始的24小時內(nèi)釋放了約70％的總負載hGH)。這些結果證明小顆粒大小的含有BAS的微球體提供了非常適于遞送治療用途的試劑的特征緩慢蛋白質(zhì)釋放和低突發(fā)結果。
實施例11微球體孔徑大小對從高聚體釋放hGH的影響同樣檢測了含有微細研磨的hGH的微球體的孔徑大小對hGH釋放速度的影響(圖7)。微球體含有負載25％干重和在制造條件下10％的hGH，和用如上所述的技術配制30％的2kL5或30％的3.4kL5。含有2kL5的微球體比含有3.4kL5的微球體的孔徑更小。然后，用如上所述的技術評估從這些微球體釋放hGH的速度。這些研究顯示微細研磨的hGH從含有2kL5的微球體釋放的速度比它從含有3.4kL5的微球體的釋放速度更慢。這些結果表明導致孔徑較小的微球體的高聚體比導致孔徑較大的微球體的高聚體釋放BAS的速度更慢。
實施例12小牛促生長激素在摘除垂體的大鼠中的控制釋放在摘除垂體的大鼠模型中證明了活性小牛促生長激素(MW20Kd)的控制釋放。從Taconic Labs(Germantown，NY)購買得到摘除垂體的雌性大鼠。每天早上稱重大鼠。在研究開始時，保留這些大鼠7天，證明沒有明顯的生長。在研究的第1天稱重大鼠。然后，將大鼠分成平均重量相同的3組。第1組不處理，作為陰性對照。組2接受在水凝膠中的bST植入物，水凝膠是3∶1的3.4KL5和二丙烯酸聚(乙二醇)酯混合物組成的(每個裝置含有0.9到1.1mg的bST)。組3的大鼠在研究過程中每天皮下注射100微克的bST。
在12天處理期結束時，分析大鼠在整個處理期的生長。組1的大鼠沒有明顯生長，組2和組3的大鼠生長速度比組1快，并且兩組大致相等。
實施例13
在大鼠中促紅細胞生成素的控制釋放在從Taconic Labs(Germantown，NY)購買的雄性Sprague-Dawley大鼠中證明了活性人促紅細胞生成素(EPO)的控制遞送。制造的水凝膠裝置中，每個裝置含有3000個單位的EPO。每個大鼠(組1)植入一個這樣的裝置。另一組同樣數(shù)目的大鼠(組2)接受每天皮下注射EPO(1000個單位)，一共3天。第3組大鼠(組3)沒有接受處理。
在植入裝置和開始皮下注射后第5天，從每個大鼠得到靜脈血樣，儲存在EDTA中。在用丫啶紅染色后，通過自動流式細胞計數(shù)器確定網(wǎng)織紅細胞(不成熟的紅血細胞)部分。組1中的大鼠有18％的網(wǎng)織紅細胞，組2中的大鼠有15％的網(wǎng)織紅細胞，組3中的大鼠有4％的網(wǎng)織紅細胞。
實施例14在糖尿病的大鼠中胰島素的控制釋放從Taconic Labs(Germantown，NY)購買Sprague-Dawley大鼠。用鏈脲菌素(65mg/kg，i.v.)處理誘導糖尿病并在48小時后由于血糖升高(＞300mg/dl)而證實。在用戊巴比妥(35mg/kg)麻醉大鼠后，在頸靜脈放置一個導管。在為了確定血糖濃度取基準血樣后，在皮下植入含有1單位的胰島素的水凝膠裝置。在植入裝置后15，30，60，120和180分鐘后取血樣，用于確定血糖水平。
植入水凝膠裝置的大鼠的血糖水平下降，證明該裝置能夠釋放活性形式的胰島素。
為了測試含胰島素的水凝膠顆粒的肺遞送系統(tǒng)，在中線切入打開大鼠的頸，并且通過解剖暴露氣管。在氣管中切出一小口，將一小的聚乙烯管探入肺。將小體積的含有胰島素的水凝膠微顆粒(總劑量3單位的胰島素)注入肺中，移去小管。取血樣，如上用于皮下裝置的方法進行分析。
在30分鐘內(nèi)血糖水平明顯下降，在至少180分鐘內(nèi)仍然是低的(低于150mg/dl)。
實施例15人生長激素在垂體摘除術后的大鼠中的控制釋放在垂體摘除的大鼠模型中證實了活性人生長激素(hGH，MW20Kd)的控制遞送。每天早上將從aconic Labs(Germantown，NY)購買的垂體摘除的雌性大鼠稱重。在開始研究之前，保留大鼠7天，證實沒有生長。將大鼠分成平均重量相等的3組。組1仍然未處理，作為陰性對照。組2接受了3∶1的3.4kL5和3.4kC6的混合組成的水凝膠中的hGH的植入(每個裝置含有約1mg的hGH)。在研究期間每天用100微克的hGH皮下注射組3的大鼠。
可以預料，未處理的對照組在研究期間不生長，組2和3的大鼠，在研究過程中分別接受了hGH水凝膠植入和每天100微克的hGH注射，他們顯示具有連續(xù)的生長。
實施例16含有人生長激素(hGH)的肺裝置在20ml的小瓶中，加入0.2559g的200mM的TEOA(在PBS緩沖液中，pH7.0)，0.2548g的3.4KL5，0.0206克的1000PPMeosin(在PBS中；pH7.0)，和0.0615g的hGH(Genentech的hGH可注射配方，Millipore CentriconTM)。攪拌得到的混合物，放置于10ml的玻璃管中。將試管暴露于Xenon光下10秒(ILC Technology，Inc.XenonLight Source with Fiber Optics)。將半干的水凝膠推出玻璃管，進一步聚合3.5分鐘。將干的水凝膠棒放入15毫升的庚烷中，并且用勻漿器(Silverson L4RT-A)以5000rpm研磨30秒，接著以3000rpm研磨30秒。潷棄庚烷，在氮下干燥粉末。將粉末用于肺，口服，或皮下遞送hGH。
實施例17蛋白質(zhì)釋放的口服配方利用如上所述的技術，將胰島素，人生長激素，人α干擾素，或促紅細胞生成素摻入高聚體顆粒。利用本領域已知的凍磨或其他研磨方法，產(chǎn)生非常小的微顆粒，優(yōu)選地平均大小小于約500納米。然后，在上面的大鼠GI道中用導管導入，將這樣的納米顆粒通過外科導入大鼠GI道。這樣的納米顆粒的劑量是根據(jù)假設約0.5％的納米顆粒的藥物在這樣的大鼠的血液中例如通過RIA，考慮每種藥物的特殊藥理是可以檢測出來的。
在胰島素的情況中，在t＝-15，0，30，60，90，120和180分鐘時取血樣，并且通過RIA檢測胰島素，通過glucometer檢測血糖(當給藥胰島素時，用患糖尿病的大鼠)。
對于其他藥物，利用正常的大鼠，利用RIA或ELISA技術在這些相同的時間點測量血液藥物水平。
除了上面的過程，可以修飾上面的含藥物的微球體來增強小腸中，直腸中，和GI道的其他適當?shù)膮^(qū)域中對它們的吸收。這樣的修飾包括在微膠囊周圍沉淀脂雙層，使它們表現(xiàn)為來自消化食物的類脂肪顆粒，與顆粒連接的分子如鐵蛋白，或在微顆粒的外側(cè)放帶電的層。
實施例18反相HPLC的評估通過首先在2毫升的溶于重碳酸銨中100mg/ml的hGH溶液中加入0.154ml的3M三乙醇胺溶液(pH8.0)(TEOA)，然后混合好，就可以制備微球體。然后加入約800毫克的固體PEG 2k，用小匙混合，溶液中產(chǎn)生了非常小量的沉淀hGH。然后以4000rpm離心樣品30分鐘，除去約1.8g的上清液。在每個離心管中加入約1g的高聚體(4.4k PEGTris(乳酸)3，三丙烯酸酯)，然后攪拌。其次，加入約0.1到0.15ml的TEOA，接著加入0.05ml的40mM的EosinY。然后以4000rpm離心樣品3分鐘。然后，如實施例4所述暴露到光下形成盤，或者與油(PPG2k)混合首先制成微乳液，然后如實施例4所述暴露于光可以聚合樣品。
通過反相HPLC(RP-HPLC)分析得到的微球體。首先用NaOH從微球體中提取hGH制備RP-HPLC的樣品。簡要地說，在1ml的NaOH(1N)/Tris(50mM，pH7.5)(1∶9 v/v)的溶液中加入10mg的微球體，在室溫下溫育5分鐘。利用5N HCl滴定溶液直到最后pH為7.5。然后，微離心樣品2分鐘并通過0.45微米的過濾器過濾。將100微升的hGH溶液注射到已平衡的Vydac C-4柱上(214TP54)，在等度的條件下以0,5ml/min的速度電泳。利用n-丙醇/Tris(50mM，pH7.5)(29∶71，v/v)作為溶劑。在柱溫度45℃時進行分離50分鐘，在220nm處進行UV檢測。在滯留時間33±3分鐘內(nèi)洗脫hGH。結果表示在表1。術語“％RP”指在單體峰中沒有發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的百分數(shù)(hGH)，可能也包括在市售hGH中通常沒有發(fā)現(xiàn)的，和活性安全的hGH的形式，如已氧化的和已脫酰基的形式。
表I
其他批次的微球體是通過首先在約2毫升的100mg/ml的溶于重碳酸銨中的hGH溶液中加入pH6.0的0.154ml的3M Tris緩沖液，然后混合好來制備的。在該溶液中，將800mg的PEG 10k以固體形式加入得到沉淀的蛋白質(zhì)。然后，以4000rpm離心樣品30分鐘，并且除去約1.8g的上清液。在每個離心管中加入約1g的高聚體(4.4k PEGtris(乳酸)3三丙烯酸酯)并且攪拌。然后，加入約0.1到0.15ml的TEOA，接著加入0.05ml的40mM的EosinY。然后以4000rpm離心樣品3分鐘。然后，如上在實施例4中所述，暴露于光形成盤，或首先與油混合(PPG2k)制成微乳液，然后，如實施例4所述暴露于光來聚合樣品，利用PEG20K制備的一個例子是樣品號27-50。
通過反相HPLC分析得到的微球體。RP-HPLC的樣品是通過如上所述的NaOH提取方法或通過下面的低溫研磨方法來制備的。結果表示在表II，也指明了樣品制備方法。在微離心管中稱約10mg的微球體樣品。將研杵放置于管中，然后將管放入液氮中約1分鐘。管仍然在液氮中，將樣品研磨約5分鐘。然后，除去管，允許在室溫停留約2分鐘。然后，在約1毫升的25mM的磷酸鉀緩沖液pH6.5中懸浮研磨的樣品。除去杵，在室溫下溫育樣品約10分鐘。然后，在15000rpm離心樣品約5分鐘，得到清晰的水相。將上清液通過0.45微米的過濾器過濾。在Vydac C＝18的柱上(218TP54)加入100微升的樣品進行RP-HPLC，在等度的條件下以1毫升/分鐘電泳，利用n-丙烷/磷酸鉀(25mM，pH6.5)(27∶73，v/v)作為溶劑。在柱溫度55℃進行分離30分鐘，用220nm的UV檢測。
表II
通過比較，用NaOH提取方法，沒有優(yōu)先排除蛋白質(zhì)的分子的微球體(表III中的“對照”)產(chǎn)生了53％的％RP值，而用低溫研磨方法，產(chǎn)生的值是23％。表III中同樣表現(xiàn)了兩個樣品制備方法的比較。
表III
其他實施方案根據(jù)前面的敘述，顯然對本文所述的發(fā)明可以做各種變化和修飾，并使本發(fā)明適用于各種用途和病癥。這樣的實施方案也在下面的權利要求的范圍內(nèi)。
本申請說明書書中提到的所有出版物和專利以同等程度的參考引入本文，就象各個出版物或?qū)＠翘囟ǖ刂该鞯模胱鳛閰⒖肌?br> 權利要求
1.一種生物相容性的治療制品，包括高聚體，一種生物活性物質(zhì)，和優(yōu)選地排除蛋白質(zhì)的分子或分子的混合物，其中所述的生物活性物質(zhì)在所述的制品中是不溶的。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的生物相容性活性物質(zhì)至少具有下面的特性之一所述的生物活性物質(zhì)有小于15％干重的聚集度；所述的制品含有至少10％干重的高聚體，和至少5％干重生物活性物質(zhì)；5％的可釋放生物活性物質(zhì)從所述的制品中釋放的時間大于1/16的t50；或t50大于或等于5/8的t80
3.根據(jù)權利要求2所述的生物相容性治療制品，其中所述的生物相容性治療制品至少具有兩個上面的特性。
4.根據(jù)權利要求2所述的生物相容性治療制品，其中所述的生物相容性治療制品具有所有的特性。
5.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的優(yōu)先排除蛋白質(zhì)的分子選自包括高聚體，聚(乙二醇)，透明質(zhì)酸，和聚(乙烯吡咯烷酮)的組。
6.根據(jù)權利要求5所述的生物相容性治療制品，其中所述的優(yōu)先排除蛋白質(zhì)的分子是聚(乙二醇)。
7.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的高聚體是水凝膠。
8.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的高聚體包括(a)形成中心核的區(qū)域；(b)至少有附著于所述的核心兩個可降解的區(qū)；和(c)至少兩個可聚合的基團，其中所述的可聚合末端基團附著于所述的可降解的區(qū)。
9.根據(jù)權利要求8所述的生物相容性治療制品，其中所述的中心核包括選自下組的聚合物聚(乙二醇)，聚(環(huán)氧乙烷)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙基噁唑啉)，聚(環(huán)氧乙烷)-co-聚(環(huán)氧丙烷)嵌段共聚物，多糖，碳水化合物，蛋白質(zhì)和它們的結合。
10.根據(jù)權利要求8所述的生物相容性治療制品，其中所述的可降解區(qū)包括選自下組的聚合物聚(α-羥基酸)，聚(內(nèi)酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(原酸酯)，聚(原碳酸)，和聚(磷酯)。
11.根據(jù)權利要求10所述的生物相容性治療制品，其中所述的聚(α羥酸)選自包括聚(乙醇酸)，聚(DL-乳酸)和聚(L-乳酸)的組。
12.根據(jù)權利要求10所述的生物相容性治療制品，其中所述的聚(內(nèi)酯)選自包括聚(選自包括聚(ε-己內(nèi)酯)，聚(δ-戊內(nèi)酯)，和聚(γ-丁內(nèi)酯)。
13.根據(jù)權利要求8所述的生物相容性治療制品，其中所述的可降解區(qū)包括聚(己內(nèi)酯)。
14.根據(jù)權利要求8所述的生物相容性治療制品，其中所述的聚合末端基團含有能夠聚合所述的高聚體的碳-碳雙鍵。
15.根據(jù)權利要求8所述的生物相容性治療制品，其中所述的高聚體包括(a)含有三個臂的分子量3,000到6,000道爾頓的聚(乙二醇)的水可溶區(qū)；(b)附著于(a)的區(qū)域的乳酸酯基團；和(c)該(b)中的區(qū)域加帽的丙烯酸酯基團。
16.根據(jù)權利要求8所述的生物相容性治療制品，其中所述的高聚體包括(a)含有分子量2,000或3,400道爾頓的聚(乙二醇)的水可溶區(qū)；(b)在(a)的區(qū)域的每一側(cè)的乳酸酯基團；和(c)在(b)中的區(qū)域的每一側(cè)加帽的丙烯酸酯基團。
17.根據(jù)權利要求8所述的生物相容性治療制品，其中所述的高聚體包括(a)含有分子量3,400道爾頓的聚(乙二醇)的水可溶區(qū)；(b)在(a)的區(qū)域的每一側(cè)的己內(nèi)酯基團；和(c)在(b)的區(qū)域的每側(cè)加帽的丙烯酸酯基團。
18.根據(jù)權利要求2所述的生物相容性治療制品，其中所述的制品至少含有5％干重的活性物質(zhì)。
19.根據(jù)權利要求18所述的生物相容性治療制品，其中所述的制品至少含有10％干重的活性物質(zhì)。
20.根據(jù)權利要求19所述的生物相容性治療制品，其中所述的制品至少含有30％干重的活性物質(zhì)。
21.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的制品是可生物降解的。
22.生產(chǎn)生物相容性的治療制品的方法，包括步驟(a)將所述的生物活性物質(zhì)與優(yōu)先排除蛋白質(zhì)的分子或分子混合物結合；(b)將步驟(a)中形成的混合物與高聚體結合，其中所述的生物活性物質(zhì)是不溶的，在與優(yōu)先排除蛋白質(zhì)的所述分子和所述高聚體結合時仍然是不溶的；和(c)形成步驟(b)中形成的結合的混合物，形成生物相容性的治療制品。
23.根據(jù)權利要求22所述的方法，包括步驟(d)聚合步驟(c)中形成的所述混合物。
24.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中步驟(a)和(b)合并成一個結合步驟。
25.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述的生物相容性治療制品至少具有下面的特性之一所述的生物活性物質(zhì)中聚集的小于15％；所述的制品至少含有10％干重的高聚體和至少5％干重的生物活性物質(zhì)；5％的可釋放生物活性物質(zhì)從所述的物質(zhì)中釋放的時間大于1/16的t50；或t50大于或等于5/8的t80。
26.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述的生物相容性治療制品至少具有2個所述的特性。
27.根據(jù)權利要求25所述的方法，其中所述的生物相容性治療制品具有所有的特性。
28.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述的優(yōu)先排除蛋白質(zhì)的分子選自包括高聚體，聚(乙二醇)，透明質(zhì)酸，和聚(乙烯吡咯烷酮)。
29.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述的優(yōu)先排除蛋白質(zhì)的分子是聚(乙二醇)。
30.根據(jù)利要求22所述的方法，其中所述的高聚體是水凝膠。
31.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述的治療制品至少包括5％干重的活性物質(zhì)。
32.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中所述的治療制品至少包括10％干重的活性物質(zhì)。
33.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中所述的治療制品至少含有30％干重的活性物質(zhì)。
34.一種治療動物的方法，所述的方法包括將權利要求1所述的生物相容性治療制品對哺乳動物給藥。
35.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中所述的哺乳動物是嚙齒動物。
36.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中所述的哺乳動物是人。
37.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中所述的高聚體包括(a)形成中心核的水可溶區(qū)；(b)至少兩個附著于所述核心的可降解區(qū)；和(c)至少兩個可聚合的末端基團，其中所述的聚合末端基團附著于所述的可降解區(qū)。
38.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述的水可溶區(qū)含有選自下組的聚合物聚(乙二醇)，聚(氧化乙烷)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙基噁唑啉)，聚(氧化乙烷)-co-聚(氧化丙烷)嵌段共聚物，多糖，碳水化合物，蛋白質(zhì)和它們的結合。
39.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述的可降解區(qū)包括選自下組的聚合物聚(α-羥酸)，聚(內(nèi)酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(原酸酯)，聚(原碳酸)和聚(磷酯)。
40.根據(jù)權利要求39所述的方法，其中所述的聚(α-羥酸)是選自包括聚(乙醇酸)，聚(DL-乳酸)，和聚(L-乳酸)的組。
41.根據(jù)權利要求39所述的方法，其中所述的聚(內(nèi)酯)選自包括聚(ε-己內(nèi)酯)，聚(δ-戊內(nèi)酯)，聚(γ-丁內(nèi)酯)。
42.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述的可降解區(qū)包括聚(己內(nèi)酯)。
43.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述的可聚合末端基團含有能夠聚合所述的高聚體的碳-碳雙鍵。
44.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述的高聚體包括(a)含有分子量為3,000到6,000道爾頓的三臂聚(乙二醇)的水可溶區(qū)。(b)在(a)的區(qū)的每一側(cè)上的乳酸酯基團；和(c)在(b)的區(qū)域上加帽的丙烯酸酯基團。
45.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述的高聚體包括(a)含有分子量為2,000或3,400道爾頓的聚(乙二醇)的水可溶區(qū)；(b)在(a)的區(qū)域的每一側(cè)上的乳酸酯基團；和(c)在(b)區(qū)的每一側(cè)加帽的丙烯酸酯基團。
46.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中所述的高聚體包括(a)含有分子量為3,400道爾頓的聚(乙二醇)的水可溶區(qū)；(b)在(a)區(qū)的每一側(cè)上的己內(nèi)酯基團；和(c)在(b)中的區(qū)域的每一側(cè)上加帽的丙烯酸酯基團。
47.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中以所述的治療制品對所述哺乳動物的肺給藥的。
48.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中所述的治療制品是通過選自下組的途徑給藥的靜脈內(nèi)，皮下，肌肉內(nèi)，口服和鼻。
49.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的生物活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)。
50.根據(jù)權利要求49所述的生物相容性治療制品，其中所述的蛋白質(zhì)選自下組激素，抗體，分化因子，生血管因子，酶，細胞因子，趨化因子，干擾素，集落刺激因子，和生長因子。
51.根據(jù)權利要求50所述的生物相容性治療制品，其中所述的蛋白質(zhì)是人生長激素。
52.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中所述的生物活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)。
53.根據(jù)權利要求52所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)選自下組激素，抗體，分化因子，生血管因子，酶，細胞因子，趨化因子，干擾素，集落刺激因子，和生長因子。
54.根據(jù)權利要求53所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是人生長激素。
55.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中所述的治療制品在大于11/4倍t50的時間內(nèi)至少釋放80％的生物活性物質(zhì)。
56.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中80％的所述顆粒具有的顆粒大小小于80微米。
57.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中所述的水可溶區(qū)基本含有分子量約1,000到10,000道爾頓的聚(乙二醇)。
58.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中所述的可降解區(qū)包括至少兩個不同的聚合物的混合物。
59.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中所述的高聚體是可降解的。
60.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中所述的治療制品能夠在至少大于2倍的t50的時期內(nèi)釋放所述的活性物質(zhì)。
61.根據(jù)權利要求22或34所述的方法，其中所述的治療制品在至少大于11/4倍的t50的時間內(nèi)遞送治療劑量的所述生物活性物質(zhì)。
62.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述的分子混合物包括當pH使蛋白質(zhì)帶負電時攜帶帶正電的離子的試劑。
63.根據(jù)權利要求62所述的方法，其中所述的帶正電的離子的試劑是三乙醇胺。
64.根據(jù)權利要求62所述的方法，其中所述的攜帶帶正電的離子的試劑是Tris。
65.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述的分子的混合物包括當pH使蛋白質(zhì)帶正電時攜帶負電離子的試劑。
66.根據(jù)權利要求65所述的方法，其中所述的攜帶正電離子的試劑是十二烷基硫酸鈉。
67.根據(jù)權利要求22所述的方法，其中所述的分子的混合物包括表面活性劑。
68.根據(jù)權利要求67所述的方法，其中所述的表面活性劑選自下組“吐溫20，吐溫80，和泊咯沙姆F68。
69.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的分子的混合物包括當pH使蛋白質(zhì)帶負電時攜帶正電離子的試劑。
70.根據(jù)權利要求69所述的生物相容性治療制品，其中所述的攜帶正電離子的試劑是三乙醇胺。
71.根據(jù)權利要求69所述的生物相容性治療制品，其中所述的攜帶正電的離子的試劑是Tris。
72.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的分子的混合物包括當pH是使蛋白質(zhì)帶正電時攜帶負電離子的試劑。
73.根據(jù)權利要求72所述的生物相容性治療制品，其中所述的攜帶負電離子的試劑是十二烷基硫酸鈉。
74.根據(jù)權利要求1所述的生物相容性治療制品，其中所述的分子混合物包括表面活性劑。
75.根據(jù)權利要求74所述的生物相容性治療制品，其中所述的表面活性劑選自下組吐溫20，吐溫80和泊咯沙姆F68。
全文摘要
本發(fā)明的特征是遞送生物活性物質(zhì)的制品，制造這一制品的方法，和利用該制品治療動物的方法。
文檔編號A01N37/18GK1606620SQ01806822
公開日2005年4月13日 申請日期2001年1月29日 優(yōu)先權日2000年1月28日
發(fā)明者S·C·羅維, K·伊姆, B·P·雷特納拉延, J·A·胡貝爾, D·安納瓦朱拉 申請人:因菲米德治療有限公司