專利名稱：：用于檢測a型流感病毒的基因芯片、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種用于檢測多A型流感病毒的基因芯片、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：流感是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一種傳染性強(qiáng)、傳播速度快的疾病。流感病毒基因組含有8個單股負(fù)鏈RNA病毒節(jié)段，目前分為16個血凝素(HA)和9個神經(jīng)氨酸酶(NA)亞型，其亞型鑒定主要依靠血凝抑制試驗和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗，這是世界衛(wèi)生組織(WHO)進(jìn)行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法?；蛐酒夹g(shù)是一種快速、并行、高通量的基因水平的診斷技術(shù)，可以應(yīng)用于并行的檢測數(shù)百個疾病相關(guān)分子，它的出現(xiàn)為禽流感病毒的快速檢測和分型提供了可能。基因芯片是研究生物大分子功能的新技術(shù)，具有高通量、微型化、連續(xù)化、自動化、快速和準(zhǔn)確等特點。作為一種高通量的基因檢測方法，該技術(shù)在微生物檢測和鑒定方面的應(yīng)用越來越多，具有巨大的應(yīng)用潛力。目前流感診斷主要依靠下述方法(1)病原分離和鑒定；(2)血清學(xué)方法檢測感者的抗體，常用的檢測抗體的技術(shù)包括血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗(AGP)、病毒中和試驗、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(NI)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等；(3)RT-PCR快速診斷技術(shù)。上述技術(shù)由于受到其自身特點限制，都不能實現(xiàn)快速、高通量處理樣品的要求，不適應(yīng)大規(guī)模檢疫、預(yù)報預(yù)測急性、烈性傳染病的需要。目前國際上已有關(guān)于基因芯片技術(shù)在流感亞型鑒別上應(yīng)用的報道。張海燕等建立了寡核苷酸芯片檢測技術(shù)，對甲型流感病毒及登革病毒進(jìn)行早期檢測及分型。方法根據(jù)Genebank中病毒基因組序列的保守區(qū)域，設(shè)計病毒的特異性檢測探針，制備病毒檢測芯片；利用限制性顯示技術(shù)標(biāo)記樣品中的病毒靶序列，將標(biāo)記產(chǎn)物與芯片雜交、清洗、掃描及結(jié)果分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法可以正確檢測到細(xì)胞培養(yǎng)所獲得的甲型(H1N1，H3N2)流感病毒和登革四型病毒。楊忠蘋等研制了可同時區(qū)分AIV的H5、H7、H9血凝素亞型及N1、N2神經(jīng)氨酸酶亞型的基因診斷芯片，結(jié)果顯示檢測探針可特異性地與相應(yīng)的標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交，呈現(xiàn)較強(qiáng)的雜交信號，且無交叉雜交。同時，用RT-PCR、雞胚接種和基因芯片方法對H1-H15亞型AIV參考毒株、30份人工感染樣品、21份現(xiàn)地疑似樣品進(jìn)行檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對人工感染樣品芯片檢測方法與雞胚接種和RT-PCR的符合率分別為100%和96%，現(xiàn)地樣品符合率為100%。楊林等根據(jù)豬流感病毒(SIV)的M基因序列設(shè)計了1對特異性引物M1/M2，擴(kuò)增出大小為229bp的目的片段。針對這個基因片段，再設(shè)計合成4條寡核苷酸探針，其中反向引物的5'端用熒光素Cy3標(biāo)記。以熒光標(biāo)記不對稱PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，通過將單鏈PCR產(chǎn)物與芯片雜交實現(xiàn)對SIV的檢測，建立SIV的基因芯片檢測方法。利用該方法對39份豬組織樣品進(jìn)行檢測，與RT-PCR檢測方法相比，本方法具有良好的特異性和敏感性。試驗結(jié)果表明，用該方法快速檢測組織中SIV是可行的，對該病的快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。GallA等通過RT-PCR方法和結(jié)合基因芯片技術(shù)，對流感病毒HA16種亞型進(jìn)行了分型研究，結(jié)果顯示通過基因芯片方法，加速了對禽流感病毒的分型診斷時間，準(zhǔn)確的對HA進(jìn)行了分型。由Li等研究制備的流感病毒cDNA分型芯片由24條cDNA探針(每個探針大約500mer)構(gòu)成，這些cDNA探針由4條HA、3條NA、兩個MP蛋白基因從五個不同的流感病毒株序列設(shè)計組成，將這24條cDNA探針制成cDNA芯片。用三個多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增靶核酸，每個多重PCR含有24條引物，擴(kuò)增時用Cy32dCTP進(jìn)行標(biāo)記。通過檢測熒光信號強(qiáng)度判斷雜交情況，由此對這五個流感進(jìn)行區(qū)分。Ivshina等用48條長度為1722mer的oligo探針制成芯片，以兩個多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增流感病毒的8個片段，成功鑒別了流感病毒的B/Beijing/184/93株和B/Shangdong/7/97株。Sengup等用476條21mer的oligo探針制成芯片，此芯片不僅能夠準(zhǔn)確區(qū)分不同的流感病毒型別及其亞型，而且能對流感病毒8個片段的存在情況進(jìn)行檢測。綜合檢索的相關(guān)文獻(xiàn)，關(guān)于流感病毒分型鑒定研究大多只涉及到了流感病毒的部分亞型，使用的方法有cDNA芯片，寡核苷酸探針芯片等技術(shù)，而應(yīng)用基因組芯片對流感病毒全部HA和NA亞型進(jìn)行鑒定尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測A型流感病毒并可對A型流感病毒進(jìn)行分型的基因芯片，以彌補現(xiàn)有技術(shù)的檢測方法存在的不足。本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供多種亞型流感病毒分型檢測基因芯片的制備方法。本發(fā)明還有一個目的是提供用于多種亞型流感病毒分型檢測的試劑盒。本發(fā)明提供一種用于檢測A型流感病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該載體上的寡聚核苷酸探針，所述寡聚核苷酸探針含有從一種或多種A型流感病毒的HA、NA和/或M基因中選取的DNA片段。其中，寡聚核苷酸探針包括檢測探針和質(zhì)量控制探針，所述質(zhì)量控制探針包括序列5'-cy3-ggtcactcgttacgaacgc-3'和5'_NH2(C6)gcgttcgtaacgagtgacc-3'，對整個芯片制備和雜交過程起到監(jiān)測作用)。所述固相載體是經(jīng)醛基化處理的玻璃片或硝酸纖維素膜等載體；所述寡聚核苷酸探針呈陣列式固定于所述固相載體上。另外，基因芯片上還含有對照與空白的點涂層。所述的從A型流感病毒M基因中選取的DNA片段具有如SEQIDN0:l-4所示的堿基序列；從H1-16種亞型A型流感病毒HA基因中選取的DNA片段具有如SEQIDNO:5-31所示的堿基序列；從Nl-9種亞型A型流感病毒NA基因中選取的DNA片段具有如SEQIDNO:32-45所示的堿基序列，如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>其中，SEQIDN06序列為2009年甲型H1N1流感病毒NA基因的特有序列探針，可對2009年甲型H1N1流感病毒進(jìn)行鑒定。上述述寡聚核苷酸探針以小分子連接臂連接，并在探針5'端加入帶氨基的六碳基團(tuán)(5'NH2C6)，例如小分子連接臂可以是poly(dT)15。本發(fā)明還提供制備用于檢測A型流感病毒的基因芯片的方法，包括如下步驟1)探針的合成將上述寡核苷酸探針進(jìn)行人工合成，然后純化；2)芯片的制備對芯片進(jìn)行打印點樣、水合固定和封閉后處理，即得。本發(fā)明還提供包含上述基因芯片的試劑盒。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于擴(kuò)增上述基因芯片的寡聚核苷酸探針的引物，其中，根據(jù)A型流感病毒M基因設(shè)計的引物選自具有SEQIDNO:46-47所示的堿基序列；根據(jù)H1-16種亞型A型流感病毒HA基因設(shè)計的引物選自具有SEQIDNO:48-79所示的堿基序列；從Nl_9種亞型A型流感病毒HA基因設(shè)計的引物選自具有SEQIDNO:80-97所示的堿基序列，參見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明還提供一種檢測A型流感病毒的方法，包括如下步驟1)使用上述用于擴(kuò)增基因芯片的寡聚核苷酸探針的引物，對待測樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)將擴(kuò)增產(chǎn)物與上述制備的基因芯片雜交；3)獲取雜交信號并分析鑒定雜交結(jié)果。其中，在檢測A型流感病毒的方法中，所述引物的熒光標(biāo)記物可以是HEX。所述雜交中使用的雜交液按質(zhì)量體積比(g/dl)包括1-5%甲酰胺、10_60%20XSSC(檸檬酸鈉緩沖液)和1-30%的10g/dlSDS(十二烷基磺酸鈉緩沖液)。優(yōu)選地，所述雜交中使用的雜交液包括2%甲酰胺、50%20XSSC和2X的10%SDS。具體而言，本發(fā)明制備A型流感病毒(多種亞型流感病毒分型檢測基因芯片)基因芯片的方法，包括以下步驟(1)探針的設(shè)計應(yīng)用生物信息學(xué)方法對NCBI數(shù)據(jù)庫中的A型流感病毒M基因、1-16種A型流感病毒HA基因、1-9種A型流感病毒NA基因序列比進(jìn)行分析，選擇出種內(nèi)保守性高、種間特異性高的序列作為探針，它們分別具有上述表1所述的堿基序列；(2)探針的合成將設(shè)計的寡核苷酸探針進(jìn)行人工合成，采用PACE方式純化；(3)芯片的制備包括芯片打印點樣、水合固定、封閉后處理等程序即得芯片。本發(fā)明針對流感病毒亞型多、變異性強(qiáng)、傳播迅速等瓶頸問題，通過對流感病毒全基因組進(jìn)行掃描和解析，并通過檢索權(quán)威數(shù)據(jù)庫，參考國內(nèi)外流行株新特點，所設(shè)計的探針能覆蓋HA、NA基因的全部序列，制備全基因組芯片，不僅可以對流感病毒進(jìn)行分型檢領(lǐng)"而且還可以對流感病毒HA、NA基因的變異情況進(jìn)行準(zhǔn)確評估。本發(fā)明為流感病毒分型鑒別診斷的研究提供全新思路，在流感病毒快速鑒別診斷和檢測方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明具有以下有益效果1)本發(fā)明的基因芯片可大規(guī)模生產(chǎn)，無污染。其質(zhì)量、精度、效率，比傳統(tǒng)細(xì)菌檢測方法均有提高，加工、操作，使用簡便；2)本發(fā)明的檢測方法操作方便，克服了現(xiàn)有檢測方式單一和費時費力的問題，可有效快速解決A型流感病毒的檢測問題，具有高效性、特異性、靈敏性的特點，提高了現(xiàn)有的檢測效率。3)本發(fā)明方法能在短時間內(nèi)檢測大量感染的臨床樣本，快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的信息，檢測效率是傳統(tǒng)檢測手段的數(shù)十倍。圖1微陣列；圖2基因芯片掃描結(jié)果。具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1—檢測A型流感病毒探針與引物的設(shè)計與合成登錄NCBI在GenBank檢索A型流感病毒M全基因、1_16種亞型A型流感病毒HA全基因、1-9種亞型A型流感病毒NA全基因。借助生物信息學(xué)軟件針對M基因、1-16種亞型A型流感病毒HA基因、l-9種亞型A型流感病毒NA基因，設(shè)計多套特異性引物，建立MRT-PCR檢測方法，設(shè)計多條特異性寡核苷酸探針。所述的探針，從A型流感病毒M基因的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQIDNO:1_4所示的堿基序列；從Hl-16種亞型A型流感病毒HA基因的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQIDNO:5-31所示的堿基序列；從Nl-9種亞型A型流感病毒NA基因的核苷酸序列中選取的DNA片段具有如SEQIDNO:32-45所示的堿基序列；所述的從A型流感病毒M基因設(shè)計的引物選自具有SEQIDNO:46-47所示的堿基序列。根據(jù)Hl-16種亞型A型流感病毒HA基因設(shè)計的引物選自具有SEQIDNO:48-79所示的堿基序列；從N1-9種亞型A型流感病毒HA基因設(shè)計的引物選自具有SEQIDNO:80-97所示的堿基序列。將設(shè)計的寡核苷酸探針，以poly(dT)15作為連接臂，并在探針5'端加入帶氨基的六碳基團(tuán)進(jìn)行人工合成，將設(shè)計引物的5'端加入HEX進(jìn)行熒光修飾，探針引物均采用PACE方式純化。二芯片點樣將合成好的探針干粉管首先進(jìn)行溶解。步驟如下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘(注意在離心前不要打開干粉管的蓋子)，加入雙蒸水，溶解至濃度為60M，用振蕩器棍勻后快速離心，將管壁上的液體離下。在室溫下放置1小時后，將探針加入到384孔板中相應(yīng)的位置，每孔加入lOi!L探針同時加入10LDMSO。醛基化玻片購自博奧芯片公司，利用自動點樣儀將384孔板中的探針點到醛基玻片上，形成我們所設(shè)計好的微陣列，點樣后芯片于37t:濕盒中放置12h以上水合，然后芯片用洗滌液(0.2%SDS)洗滌后在封閉液(NaBH4溶液)中封閉5min后用水清洗，離心甩干，即得所述多種亞型流感病毒分型檢測基因芯片。三流感病毒基因組的提取取經(jīng)過預(yù)處理的0.25mL待檢樣品中加入0.75mlTRIZOLLSReagent。用加樣器充分混合均勻，室溫作用5-10min。繼續(xù)加入0.2mL氯仿，震蕩混勻，室溫作用15min。于4°C不超過12000rpm離心10min，收集上清(勿吸到兩液相間的沉淀物)，加入O.5mL異丙醇，顛倒混合均勻，室溫作用10minX4t:不超過12000rpm離心10min，小心倒去上清液，重新加入1.5mL75%冷乙醇。7500-10000rpm離心10min，小心到去乙醇，將離心管倒置于超凈工作臺15min，風(fēng)干豁附于管底的核酸沉淀。最后加30iiLDEPCH20至核酸沉淀中，55°C_60°C水浴8-15min，之后_201:保存?zhèn)溆?。四RT反應(yīng)體系及多重不對稱PCR體系的建立4.1RT反應(yīng)體系為30iiL條件優(yōu)化后，采用TaKaRa公司的M_MLV反轉(zhuǎn)錄酶建立如下反轉(zhuǎn)錄體系提取的RNA6iiL，反轉(zhuǎn)錄引物0.5iiL，無RNA酶水8yL，70。C反應(yīng)5分鐘，放于冰上加入5Xbuffer6iiL，dNTP(10Mm)1.5iiL，M-MLV1.OilL，RnaseInhibitorlul，無RNA酶的水6iiL，42。C孵育20分鐘，95t:5分鐘，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(引物使用5'-AGCAAAAGCAGG-3')。4.2多重不對稱PCR體系為20iiL多重不對稱PCR體系為20iiL，共需要使用6組不對稱PCR體系。所使用試劑為2.5,1/LdNTP、雙蒸水、Ex-Taq酶(5u/iiL)或TaqDNA聚合酶、10XPCRBuffer、引物(HEX修飾)2Q0ng/PL;引物(非HEX修飾)8ng/yL;第一組PCR反應(yīng)配置(擴(kuò)增H1、H2、H3、N1、N2亞型)雙蒸水2.3iiL10XPCRBuffer2.5mmo1/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0481iiL引物SEQIDN0491iiL引物SEQIDN0501iiL引物SEQIDN0511iiL引物SEQIDN0521iiL引物SEQIDN0531iiL引物SEQID簡O1iiL引物SEQID簡l1iiL引物SEQIDN0821iiL引物SEQIDN0831iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板總量第二組PCR反應(yīng)配置(擴(kuò)增H4、H5、H6、H7、H9亞型)雙蒸水2.3iiLlOXPCRBuffer2.5mmo1/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0541iiL引物SEQIDN0551iiL引物SEQIDN0561iiL引物SEQIDN0571iiL引物SEQIDN0581iiL引物SEQIDN0591iiL引物SEQIDN0601iiL引物SEQIDN0611iiL引物SEQIDN0641iiL引物SEQIDN0651iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板總量第三組PCR反應(yīng)配置(擴(kuò)增H8、H10、H11、H12、H13亞型)雙蒸水2.3iiL10XPCRBuffer2.5,1/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0621iiL引物SEQIDN0631iiL引物SEQIDN0661iiL引物SEQIDN0671iiL引物SEQIDN0681iiL引物SEQIDN0691iiL引物SEQIDN0701iiL引物SEQIDN0711iiL引物SEQIDN0721iiL引物SEQIDN0731iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板總量第四組PCR反應(yīng)配置(擴(kuò)增H14、H15、H16、N4、N3亞型)雙蒸水2.3iiL10XPCRBuffer2.5,1/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0741iiL引物SEQIDN0751iiL引物SEQIDN0761iiL引物SEQIDN0771iiL引物SEQIDN0781iiL引物SEQIDN0791iiL引物SEQIDN0841iiL引物SEQIDN0851iiL引物SEQIDN0861iiL引物SEQIDN0871iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板總量第五組PCR反應(yīng)配置(擴(kuò)增N5、N6、N7、N8、N9亞型)雙蒸水2.3iiL0128]10XPCRBuffer2iiL0129]2.5,1/Ld證1.5iiL0130]引物SEQIDN0881iiL0131]引物SEQIDN0891iiL0132]引物SEQIDN0901iiL0133]引物SEQIDN0911iiL0134]引物SEQIDN0921iiL0135]引物SEQIDN0931iiL0136]引物SEQIDN0941iiL0137]引物SEQIDN0951iiL0138]引物SEQIDN0961iiL0139]引物SEQIDN0971iiL0140]Ex-Taq酶0.2iiL0141]cDNA模板0142]總量0143]第六組PCR反應(yīng)配置(擴(kuò)增A型流感病0144]雙蒸水2.3iiL0145]10XPCRBuffer0146]2.5,1/Ld證1.5iiL0147]引物SEQIDN0461iiL0148]引物SEQIDN0471iiL0149]Ex-Taq酶0.2iiL0150]cDNA模板0151]總量0152]4.3建立循環(huán)參數(shù)0153]將PCR管置于PCR擴(kuò)增儀中，按以下程J55。C退火30s，72。C延伸30s，30個循環(huán)，最后72。C延伸反應(yīng)10min，后4。C保存或進(jìn)行下一步實驗。0154]五雜交0155]5.l雜交前準(zhǔn)備0156]CR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束前，將雜交用儀器預(yù)熱至45°C。0157]芯片洗滌液根據(jù)需要及實際情況，按如下比例配制洗滌液I和II。0158]洗滌液I:SSC終濃度為0.3X，SDS終濃度為0.lg/dl。以配制總量200mL為例，取195mL蒸餾水倒入250mL試劑瓶中，加入3mL0159]20XSSC，混勻。再加入2mL10g/dlSDS，混勻。0160]洗滌液II:SSC終濃度為O.06X。以配制總量200mL為例，取199.4mL蒸餾水倒入250mL試劑瓶中，加入0.6mL20XSSC，混勻。若10g/dlSDS產(chǎn)生白色絮狀沉淀，請于50°C水浴中融化混勻后配制洗液。蒸餾水冰水混合物5.2雜交反應(yīng)混合物的配制、變性及冰浴根據(jù)樣品數(shù)目準(zhǔn)備200yL離心管并編號。取出雜交緩沖液，5(TC加熱使其完全融化。充分混勻后，在微量離心機(jī)中瞬時離心，按每份4iiL分裝。將PCR產(chǎn)物加熱至96t:(置于PCR儀中變性即可)變性5分鐘。之后，立即取出，浸入冰水混合物中冰浴3分鐘。從同一個樣品模板的六個不同擴(kuò)增體系管中各取2iiLPCR產(chǎn)物加入到對應(yīng)樣品編號的4iiL雜交緩沖液管中，充分混勻并瞬時離心。5.3芯片雜交反應(yīng)用移液器將雜交反應(yīng)混合物加入到芯片上，16iU/陣列。記錄芯片編號、陣列位置及對應(yīng)的樣品編號。放入預(yù)熱到45t:的雜交用儀器中。計時90分鐘。5.4芯片的洗滌與干燥雜交反應(yīng)結(jié)束后，將芯片取出，立即放在盛有平衡至42t:洗滌液I的容器中(如有玻片架，可將玻片架置于盛有洗滌液的容器中，然后將芯片豎直插在玻片架上；如沒有玻片架，可將芯片正面向上平放在容器底部)，于預(yù)熱至42t:的搖床上80rpm洗滌2min。迅速將芯片從洗滌液i中取出放入預(yù)熱好的平衡至42t:洗滌液n的容器中，42t:搖床80rpm洗滌2min。將芯片放入微陣列芯片離心管，再放入離心機(jī)中1000rpm離心2min，甩干后掃描。六掃描將玻片用GenePix4100A掃描儀掃描，PMT與激光強(qiáng)度設(shè)置分別設(shè)定為650與10，激發(fā)波長為532nm:掃描圖象用掃描儀自帶的圖象分析軟件或Imagene等專用圖像分析軟件對掃描結(jié)果進(jìn)行定量分析。七結(jié)果分析在進(jìn)行結(jié)果判定前首先比較同一條探針4個重復(fù)點的信號值差異，去掉偏離最遠(yuǎn)的一個信號值，用剩下的三個信號值作為有效數(shù)值進(jìn)行結(jié)果判斷，分析結(jié)果，檢測結(jié)果信噪比SNR532大于1.5初步判定為陽性信號。其中M基因探針，位點處出現(xiàn)陽性信號判定為A型流感病毒；根據(jù)H/N相應(yīng)探針位點處信號，判定流感病毒亞型；若有多條HA亞型探針出現(xiàn)陽性信號，則將信燥比均值大的探針判定為確診亞型，其它為弱陽性或假陽性；如果SEQIDN035序列探針出現(xiàn)陽性信號且有M基因探針出現(xiàn)陽性信號則可判定為2009年甲型H1N1流感病毒。實驗例l利用本發(fā)明制備的基因芯片檢測吉林省CDC送檢6例臨床疑似甲型H1N1流感病毒標(biāo)本—芯片點樣將合成好的H1、H2、H3、N1、N2亞型及M探針干粉管首先進(jìn)行溶解。步驟如下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘(注意在離心前不要打開干粉管的蓋子)，加入雙蒸水，溶解至濃度為60iiM，用振蕩器棍勻后快速離心，將管壁上的液體離下。在室溫下放置1小時后，將探針加入到384孔板中相應(yīng)的位置，每孔加入10iiL探針同時加入10iiLDMSO。醛基化玻片購自博奧芯片公司，利用自動點樣儀將384孔板中的探針點到醛基玻片上，形成我們所設(shè)計好的微陣列(參見圖一)，點樣后芯片于37t:濕盒中放置12h以上水合，然后芯片用洗滌液(0.2%SDS)洗滌后在封閉液(NaBH4溶液)中封閉5min后用水清洗，離心甩干，即得所述多種亞型流感病毒分型檢測基因芯片。二流感病毒基因組的提取取經(jīng)過預(yù)處理的O.25mL6例臨床疑似甲型H1N1流感病毒待檢樣品分別加入0.75mlTRIZOLLSReagent。用加樣器充分混合均勻，室溫作用5-10min。繼續(xù)加入0.2mL氯仿，震蕩混勻，室溫作用15min。于4t:不超過12000rpm離心10min，收集上清(勿吸到兩液相間的沉淀物)，加入0.5mL異丙醇，顛倒混合均勻，室溫作用10minX4t:不超過12000rpm離心10min，小心倒去上清液，重新加入1.5mL75%冷乙醇。7500-10000rpm離心10min，小心到去乙醇，將離心管倒置于超凈工作臺15min，風(fēng)干豁附于管底的核酸沉淀。最后加30iiLDEPCH20至核酸沉淀中，55t:-6(TC水浴8-15min，之后-2(TC保存?zhèn)溆?。三RT反應(yīng)體系及多重不對稱PCR體系的建立3.1RT反應(yīng)體系為30iiL條件優(yōu)化后，采用TaKaRa公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶建立如下反轉(zhuǎn)錄體系提取的RNA6iiL，反轉(zhuǎn)錄引物0.5iiL，無RNA酶水8yL，70。C反應(yīng)5分鐘，放于冰上加入5Xbuffer6iiL，dNTP(10Mm)1.5iiL，M-MLV1.OiiL，RnaseInhibitorlul，無RNA酶的水6iiL，42。C孵育20分鐘，95t:5分鐘，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(引物使用5'-AGCAAAAGCAGG-3')。3.2多重不對稱PCR體系為20iiL多重不對稱PCR體系為20iiL，共需要使用兩組不對稱PCR體系。所使用試劑為2.5mmol/LdNTP、雙蒸水、Ex-Taq酶(5u/iiL)或TaqDNA聚合酶、10XPCRBuffer、引物(HEX修飾)200ng/PL;引物(非HEX修飾)8ng/yL;第一組PCR反應(yīng)配置(擴(kuò)增H1、H2、H3、N1、N2亞型)雙蒸水2.3iiLlOXPCRBuffer2iiL2.5mmol/Ld證1.5iiL引物SEQIDN0481iiL引物SEQIDN0491iiL引物SEQIDN0501iiL引物SEQIDN0511iiL引物SEQIDN0521iiL引物SEQIDN0531iiL引物SEQIDN0801iiL引物SEQIDN0811iiL引物SEQIDN0821iiL引物SEQIDN0831iiLEx-Taq酶0.2iiLcDNA模板4iiL總量20iiL第二組PCR反應(yīng)配置(擴(kuò)增A型流感病毒M基因，為通用)雙蒸水2.3iiL10XPCRBuffer10iiL2.5mmol/LdNTP1.5iiL引物SEQIDN0461iiL引物SEQIDN0471iiLEx-T叫酶0.2iiLcDNA模板4iiL總量20iiL3.3建立循環(huán)參數(shù)將PCR管置于PCR擴(kuò)增儀中，按以下程序進(jìn)行94t:預(yù)變性5min，94t:變性30s，55。C退火30s，72。C延伸30s，30個循環(huán)，最后72。C延伸反應(yīng)10min，后4。C保存或進(jìn)行下一步實驗。四雜交4.l雜交前準(zhǔn)備CR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束前，將雜交用儀器預(yù)熱至45°C。芯片洗滌液根據(jù)需要及實際情況，按如下比例配制洗滌液I和II。洗滌液I:SSC終濃度為0.3X，SDS終濃度為0.lg/dl。以配制總量200mL為例，取195mL蒸餾水倒入250mL試劑瓶中，加入3mL20XSSC，混勻。再加入2mL10g/dlSDS，混勻。洗滌液II:SSC終濃度為O.06X。以配制總量200mL為例，取199.4mL蒸餾水倒入250mL試劑瓶中，加入0.6mL20XSSC，混勻。若10g/dlSDS產(chǎn)生白色絮狀沉淀，請于50°C水浴中融化混勻后配制洗液。蒸餾水冰水混合物4.2雜交反應(yīng)混合物的配制、變性及冰浴根據(jù)樣品數(shù)目準(zhǔn)備200L離心管并編號。取出雜交緩沖液，5(TC加熱使其完全融化。充分混勻后，在微量離心機(jī)中瞬時離心，按每份4iiL分裝。將PCR產(chǎn)物加熱至96。C(置于PCR儀中變性即可)變性5分鐘。之后，立即取出，浸入冰水混合物中冰浴3分鐘。從同一個樣品模板的六個不同擴(kuò)增體系管中各取2i！LPCR產(chǎn)物加入到對應(yīng)樣品編號的4iiL雜交緩沖液管中，充分混勻并瞬時離心。4.3芯片雜交反應(yīng)用移液器將雜交反應(yīng)混合物加入到芯片上，16iU/陣列。記錄芯片編號、陣列位置及對應(yīng)的樣品編號。放入預(yù)熱到45t:的雜交用儀器中。計時90分鐘。4.4芯片的洗滌與干燥雜交反應(yīng)結(jié)束后，將芯片取出，立即放在盛有平衡至42t:洗滌液I的容器中(如有玻片架，可將玻片架置于盛有洗滌液的容器中，然后將芯片豎直插在玻片架上；如沒有玻片架，可將芯片正面向上平放在容器底部)，于預(yù)熱至42t:的搖床上80rpm洗滌2min。迅速將芯片從洗滌液I中取出放入預(yù)熱好的平衡至42t:洗滌液n的容器中，42t:搖床80rpm洗滌2min。將芯片放入微陣列芯片離心管，再放入離心機(jī)中1000rpm離心2min，甩干后掃描。五掃描將玻片用GenePix4100A掃描儀掃描，PMT與激光強(qiáng)度設(shè)置分別設(shè)定為650與10，激發(fā)波長為532nm:掃描圖象用掃描儀自帶的圖象分析軟件或Imagene等專用圖像分析軟件對掃描結(jié)果進(jìn)行定量分析(參見圖二)。六結(jié)果分析有四例疑似樣品檢測時SEQIDN06序列探針出現(xiàn)陽性信號且有M基因探針出現(xiàn)陽性信號則可判定為2009年甲型H1N1流感病毒。經(jīng)上述本發(fā)明所建立的基因芯片雜交后，檢測結(jié)果顯示，甲型H1N1流感病毒陽性的有4例，陰性有2例。同時對此6例臨床疑似甲型H1N1流感病毒標(biāo)本進(jìn)行實時熒光定量PCR方法檢測，結(jié)果相同序列表〈110〉中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所〈120〉用于檢測A型流感病毒的基因芯片、其制備方法及應(yīng)用〈130>KHP09113254.6〈160>97〈170>PatentInversion〈210>1〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>1tccgctgcctgttcactc〈210>2〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>2tctgctgcytgttcrctt〈210>3〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3tccgctgcctgctcactt〈210>4〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4tctgctgcctgctcactt〈210〉5〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5tgtccagtaatagttcattctcc〈210>6〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈400>6gtagatggatggtgaatgcc〈210>7〈211>23<212>DNA〈213〉人工序列〈400>7aacttcttgctgtatcttgatg￡i〈210>8〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>83tgat肌tecC3gatccagcatt〈210>9<211>21〈212>腿〈213〉人工序列〈400>9tc朋gc3gagtccagtegteg〈210>10<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉10tgagttgatgattcctgatc〈210>11232023232122〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>11g朋gaatgacggattgccaa〈210〉12〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列<400>12gattgctgcttgagtgctt〈210>13〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>13atctgctgcttgtcctgtg〈210>14〈211>21<212>DNA<213>人工序列〈400〉14tgatggaatttctcgttcgtt〈210>15〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉15gttctgaaagggcttagttgtagt〈210>16〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈400>16gaactcgccactgttgaata〈210>17〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列說明書17/30頁241919212420<400〉17ttccgtttcttacactttccat22〈210〉18<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>18tcctctctgtttagtcttgct21〈210〉19<211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉19ctctagtctcaatctgtggaacatt25〈210〉20〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉203g3gttcagcattet;agg3c22〈210>21<211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>21ttctgttetggaatctctggtc22〈210〉22<211〉23〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉22ctccactatgtatgaccaacctt23〈210〉23〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉23teagttccttcagattccagc21〈210>24〈211>19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>24ccgttccgaattgtctcca〈210〉25〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列<400>25gtcttctctatcagcctgttc朋t〈210>26〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>26ctgttcaacttggactcctcUc〈210>27〈211>25<212>DNA<213>人工序列〈400〉27atgtttattctgctttccacttctg〈210>28〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>28atcttgacaggctgatgatectcc〈210>29〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400>293g3gatag3gcctgacateagage〈210>30〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列說明書19/30頁192423252424〈400>30attacattgcctetctgctgct〈210〉31〈211〉24〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>31朋gacaag朋gcagttectccatc〈210〉32〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉32cctgttagttctggatgctg〈210>33<211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>33ccgctatatcctgaccactc<210>34〈211>23〈212〉DNA〈213>人工序列<400>34gaagcaaggtcttatacaatcca〈210>35〈211〉23〈212>DNA<213>人工序列<400>35tettgagaagttattgtctgtec〈210〉36〈211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉36ttccttctctatggtggtgtt〈210>37242020232321〈211〉19〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>37ttacattgcggctttgacc〈210〉38〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>38ggatcgc;atgacacataagg20〈210>39〈211>28〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>39cagactcttgagttcttagtatatcctt28〈210>40〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>40attgtcgttgtctataatgtcctgt25〈210>41〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400>41gtccaaccgtcttctatcaatagg24〈210>42<211>24〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>42attattgttgttgttgagttggtt24<210>43〈211〉25〈212>DNA〈213〉人工序列<400〉43ccagtgatcggattattacagtctc25〈210〉44<211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉44gcatgatgattcctgagttcttaga25〈210>45〈211〉25〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉45cgtagcatgagcattcttcaatatg25〈210>46〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉46gcactacggcaaaggctatg20〈210>47〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉47gcactcccattcgcttctg19〈210>48〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉48朋朋g朋gtcctygtrctetgg22〈210>49〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉49acattyatccattgrtgcatt21〈210>50〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>50gctacccaggcagtttcaatg〈210〉51〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈400>51tctccgcttgtgttgttgtatg22〈210>52〈211>22〈212>DNA<213>人工序列〈400>52aaatggttgggagggaatgatg22〈210>53〈211>20〈212>DNA<213>人工序列〈400〉53gcgttgtacgaccagagatc20〈210>54〈211>22<212>DNA〈213〉人工序列〈400>54ttccaatagggtcttgcgttag22〈210>55〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>55gccttgccagccattctc18<210>56〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>56acgac朋ggtccgactecag20〈210>57〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>57gattgccagtgctagggaac20〈210>58<211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>58gccacatgccagactattgc20〈210>59〈211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>59tcattccagtccatcctccttc22<210>60〈211〉22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>60gggaagttaaaccggctcatag22〈210>61〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈400>61cagttgtctcctcactcttteg22〈210〉62〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>62caccattggaactgegagae20〈210>63〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>63ggattgaccacctgttgatgc〈210>64<211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>64gcsigtggaag3tggg朋;agg〈210>65<211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>653t朋caagagatgaggcgacag〈210>66〈211>19〈212〉DNA〈213>人工序列〈400>66tggtcaggctgcggattac〈210>67〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>67gttgcttcctcaccctttcg<210>68〈211>22〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>68gacggatgctg朋3g3t朋tgc〈210>69〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列i兌明書25/30頁212022192022〈400>69tgctgccaacacaagactac〈210>70〈211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>70agtggctggctggtatgg〈210>71<211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>71tcc朋cagaac朋gc朋ttc〈210>72〈211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>72朋cgg3gttaatcgcacc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