專利名稱：一種誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)細(xì)胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基，特別是涉及一種誘導(dǎo)肝卵圓細(xì) 胞向膽管細(xì)胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
WB-F344細(xì)胞是一類從Fischer雄鼠肝臟分離出來的細(xì)胞，具有許多肝干/祖細(xì)胞 的特性1)它具有肝細(xì)胞和肝膽管細(xì)胞的表型特征；2)當(dāng)它移植到大鼠的肝臟中后，它能 夠獲得肝細(xì)胞的型態(tài)和功能特征；:3)WB-F344細(xì)胞經(jīng)過化學(xué)誘變后移植入大鼠肝臟后能夠 發(fā)展成為膽管癌，表明它具有向膽管細(xì)胞分化的潛能，這些特征都說明WB-F344細(xì)胞是肝 干/祖細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉處理后的WB-F344細(xì)胞具有了膽管細(xì)胞的一系列標(biāo)志，說 明WB-F344可在丁酸鈉的誘導(dǎo)下向膽管細(xì)胞分化。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，把WB-F344細(xì)胞培 養(yǎng)在Matrigel上時(shí)，細(xì)胞的生長開始停滯，細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞開始收縮并沿管腔 結(jié)構(gòu)方向拉伸，細(xì)胞的核質(zhì)比變大。對誘導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行mRNA和蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，膽管細(xì) 胞的標(biāo)志如CK19、Yp、aquaporin以及BDS7等的表達(dá)量都不同程度的上調(diào)。EPM是哺乳動物中高度保守的一個(gè)間質(zhì)細(xì)胞表面膜蛋白，在多種表皮組織(包括 肺、腸、肝、乳腺、胰腺、毛囊、膽囊和血管內(nèi)皮等)的表皮形態(tài)發(fā)生尤其是腺管結(jié)構(gòu)的形態(tài) 發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中，EPM的表 達(dá)量以及EPM陽性細(xì)胞的數(shù)量隨組織修復(fù)的時(shí)間而發(fā)生變化。Watanabe等(Watanabe S， Hirose M, Wang X E, et al.A novel hepatic stellate (Ito) cell-derived protein, epimorphin,plays a key role in the late stages ofliver regeneration[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 250 (2) :486-490)發(fā)現(xiàn)，重組的EPM蛋白對于原代培養(yǎng)的大鼠 肝細(xì)胞功能的維持也具有重要作用，在普通的培養(yǎng)皿上，原代的大鼠肝細(xì)胞只能形成單層 的細(xì)胞，而在覆蓋有EPM蛋白的平皿上可以形成球狀聚集體，說明EPM對于肝細(xì)胞的三維 結(jié)構(gòu)形成以及極性的維持至關(guān)重要。隨著肝干/祖細(xì)胞研究的發(fā)展，Nagai等(Nagai H， Terada K, Watanabe G, etal. Differentiation of liver epithelial (stem-like)cells into hepatocytesinduced by coculture with hepatic stellate cells[J]. Biochem Biophys ResCommun，2002，293(5) :1420-1425)研究表明，肝星狀細(xì)胞不僅對于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞 功能的維持，而且對肝干/祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化起到重要的支持作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便易行的用于體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化
的專用培養(yǎng)基。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案用于體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化 為膽管細(xì)胞的專用培養(yǎng)基，是在RPMI1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 3% (V/V)胎牛血清，2% (V/V)B27,0. 2mol/L L-谷氨酰胺，(V/V)青-鏈霉素。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞定向分化為膽管細(xì)胞的方法。本發(fā)明所提供的體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)將表皮形態(tài)發(fā)生蛋白(印imorphin，EPM)基因?qū)脒M(jìn)PT67細(xì)胞，得到高表達(dá)活 性表皮形態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞；2)將高表達(dá)活性表皮形態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞作為飼養(yǎng)層并進(jìn)行生長阻滯處理 后接種WB-F344細(xì)胞，用上述體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞的專用培養(yǎng)基在37°C、 5%C02下共培養(yǎng)，促使WB-F344細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化并形成管腔樣結(jié)構(gòu)，得到膽管細(xì)胞。在上述誘導(dǎo)方法中，步驟1)中的表皮形態(tài)發(fā)生蛋白具有序列表中序列1的氨基酸 殘基序列，其編碼基因具有序列表中序列2的核苷酸序列?？砂凑粘Ｒ?guī)方法將表皮形態(tài)發(fā)生蛋白基因轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞，如通過含有表皮形態(tài) 發(fā)生蛋白基因的重組真核表達(dá)載體或利用慢病毒載體系統(tǒng)或利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等將表皮 形態(tài)發(fā)生蛋白基因?qū)隤T67細(xì)胞。步驟2、中對高表達(dá)活性表皮形態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞進(jìn)行生長阻滯處理的方法 為將貼壁后的高表達(dá)活性表皮形態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞用濃度為15-20μ g/ml的絲裂霉 素在37°C、5% C02下處理細(xì)胞Ih。用上述方法誘導(dǎo)得到的膽管細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。該方 法是通過共培養(yǎng)的方式使得WB-F344細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞，采用的技術(shù)方案如下通過脂 質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將EPM基因?qū)隤T67細(xì)胞中，再通過極限稀釋法和流式單細(xì)胞接種法篩選穩(wěn)定 表達(dá)EPM的PT67細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，然后將T7-EPM-PT67細(xì)胞作為飼養(yǎng)層并進(jìn)行生長阻滯處 理后接種WB-F344細(xì)胞，使WB-F344在體外培養(yǎng)的條件下自主分化為膽管細(xì)胞并形成管腔 樣結(jié)構(gòu)。形態(tài)學(xué)觀察、基因水平的驗(yàn)證結(jié)果表明用本發(fā)明的方法及培養(yǎng)基可獲得表達(dá)有膽 管系相關(guān)標(biāo)志Yp、CX43、AqUap0rin-l等的膽管細(xì)胞。本發(fā)明提供了一條獲得膽管細(xì)胞的 新途徑，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖IA為穩(wěn)定表達(dá)T7-EPM的PT67細(xì)胞株的RT-PCR鑒定結(jié)果圖IB為穩(wěn)定表達(dá)T7-EPM的PT67細(xì)胞株的^festern Blotting鑒定結(jié)果圖2為WB-F344細(xì)胞與T7-EPM-PT67細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞形態(tài)3為WB-F344細(xì)胞與T7-EPM-PT67細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)膽管標(biāo)志物基因表達(dá)水平的檢 測
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別均為常規(guī)方法，所用引物均由上海英駿公司合 成，所述百分比濃度均為質(zhì)量/體積(W/ν)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。實(shí)施例1、體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞用本發(fā)明的方法體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞，包括以下步驟
一、穩(wěn)定表達(dá)EPM的PT67細(xì)胞單克隆的篩選將攜帶EPM 基因的質(zhì)粒 T7-EPM-pQXCIN(構(gòu)建方法見=Hongbin Z, Elaine FR, Claude S, et al. The Epimorphin Gene Is Highly Conserved among Humans, Mice, and Rats and Maps to Human Chromosome 7, Mouse Chromosome 5, and Rat Chromosomel2. Genomics, 1996, 37 :386-389.)經(jīng)擴(kuò)增、測序結(jié)果正確后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒導(dǎo)入 PT67細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫保存細(xì)胞系)中，具體步驟如下1)在37°C、5%C02條件下，培養(yǎng)PT67細(xì)胞至長滿90-95% (細(xì)胞密度高時(shí)，可獲得 最佳結(jié)果)。轉(zhuǎn)染前5小時(shí)更換完全培養(yǎng)基[HD-DMEM(GIBC0公司)+10%胎牛血清(Hyclone 公司)+0. 2mol/L L-谷氨酰胺(sigma公司)]。2)用最優(yōu)培養(yǎng)基OPTI-MEM (GIBC0公司)稀釋T7_EPM_pQXCIN質(zhì)粒DNA至濃度為 200 μ g/ml。3)用 OPTI-MEM 稀釋脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 公司)至濃度為 400 μ g/ml，室溫孵育5分鐘(脂質(zhì)體Lipofectamine 2000必須在30分鐘內(nèi)與DNA結(jié)合， 否則活性降低)。4)將稀釋的T7-EPM-pQXCIN質(zhì)粒DNA與稀釋的Lipofectamine 2000混合，室溫孵 育20分鐘以形成DNA-脂質(zhì)體Lipof ectamine 2000復(fù)合物(復(fù)合物室溫穩(wěn)定6小時(shí)；混合 物可呈云霧狀，但不妨礙轉(zhuǎn)染)。5)吸出培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液(GIBC0公司)洗細(xì)胞2次，每皿中加入無血清無 抗生素培養(yǎng)液，再加入DNA-脂質(zhì)體Lipofectamine 2000復(fù)合物，在37°C、5% (X)2條件下 培養(yǎng)5小時(shí)，更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，適時(shí)傳代。6)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按10 1傳代后，培養(yǎng)M小時(shí)，換成含G418 (終濃度400-600 μ g/ mL)的HD-DMEM培養(yǎng)液(GIBC0公司)進(jìn)行篩選，每三天更換培養(yǎng)基一次，待對照組細(xì)胞全部 死亡，其它孔板出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)，開始挑取細(xì)胞克隆(備選方案將轉(zhuǎn)染細(xì)胞利 用流式細(xì)胞儀接種單細(xì)胞)。然后，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞(以未轉(zhuǎn)染的PT67為對照)的mRNA和蛋白，分別進(jìn)行 RT-PCR(引物 1 為 5，-CAAACGACGATGGAGACA-3，，引物 2 為 5，-TTGGAGCAGACAGGATGA-3，) 禾口 Western Blotting[ 一 抗為 mouse monoclonal antibodies against the T7 peptide (Novagen 公司)，二抗為 goat antibodies against mouse (中杉公司)]檢測，以 β-actin為內(nèi)參，檢測結(jié)果如圖IA和圖IB (SEP1、SEP2、SEP3為三個(gè)細(xì)胞克隆)所示，經(jīng)驗(yàn) 證EPM基因在基因和蛋白水平上均高度表達(dá)，說明EPM基因已成功地轉(zhuǎn)進(jìn)PT67細(xì)胞中，得 到高表達(dá)活性EPM基因的PT67細(xì)胞，命名為T7-EPM-PT67。二、將WB-F344細(xì)胞誘導(dǎo)分化為膽管細(xì)胞并形成管腔樣結(jié)構(gòu)分化培養(yǎng)基在RPMI1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 3% (V/V，3_5%均可)胎牛血清 (fetal calf serum,FCS), 2% (V/V，1-3% 均可)B27 和 (V/V，0· 5_1· 5% 均可)青-鏈 霄素。1)常規(guī)培養(yǎng)ΕΡΜ-ΡΤ67細(xì)胞，0. 25%胰酶消化，計(jì)數(shù)，以3Χ IO4個(gè)/孔接種于6孔 板內(nèi)培養(yǎng)；2)待接種的ΕΡΜ-ΡΤ67細(xì)胞貼壁后，用濃度為15-20yg/ml的絲裂霉素(購 自……)處理細(xì)胞lh(37°C，5% C02，期間每隔15min搖勻細(xì)胞)以生長阻滯，1 XPBS洗滌4-5次以除去殘留絲裂霉素即可接種；3)取正常培養(yǎng)的WB-F344細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶消化，1，200rpm離心5分鐘，計(jì) 數(shù)，以1. 5-3X105個(gè)/孔接種于步驟2中的6孔板，每板4孔，其中2孔為陰性對照(未共 培養(yǎng)的WB-F344細(xì)胞)，在37°C、5% CO2、飽和濕度條件下共培養(yǎng)。接種后12小時(shí)開始觀察，之后每M小時(shí)觀察一次。結(jié)果如圖2所示(比例尺 IOOum)，與陰性對照相比，WB-F344細(xì)胞與T7-EPM-PT67 (s印)細(xì)胞經(jīng)過共培養(yǎng)后形成管腔 樣結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞收縮且沿著管腔樣結(jié)構(gòu)方向拉伸。三、共培養(yǎng)體系中WB-F344細(xì)胞膽管分化的驗(yàn)證取步驟二經(jīng)共培養(yǎng)的WB-F344細(xì)胞，提取mRNA進(jìn)行RT_PCR(檢測Cx43基因的引 物為 5，-GGAAAGTACCAAACAGCAGC-3，和 5，-AGGACTTGTCATAGCAGACG-3，，檢測 Yp 基因的引物 為 5，-TGGAAGGAGGAGGTGGTTAC-3，和 5，-TGTCCCTTCGTCCACTACTG-3，，檢測 Aquaporin-Ι 基 因的引物為 5，-CAGCAGCGACTTTACAGACC-3’ 和 5’ -GGGGACTTTCTAGCACACTC-3，)檢測。結(jié) 果如圖3所示，與陰性對照細(xì)胞相比，膽管標(biāo)志Yp、Cx43、Aquaporin-I等的表達(dá)量均上調(diào)， 表明WB-F344細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化成為膽管細(xì)胞。序列表<160>2<210>1<211>......<212>PRT<213> 小鼠屬小鼠(Mus musculus)<400>1請?zhí)峁┮粋€(gè)大寫字母表示的EPM的氨基酸殘基序列MRDRLPDLTACRTNDDGDTAVVIVEKDHFMDGFFHQVEEIRSSIARIAQHVEDVKKNHSIILSAPNPEGKIKEELEDLDKEIKKTANRIRGKLKSIEQSCDQDENGNRTSVDLRIRRTQHSVLSRKFVDVMTEYNEAQILFRERSKGRIQRQLEITGRTTTDDELEEMLESGKPSIFISDIISDSQITRQALNEIESRHKDIMKLETSIRELHEMFMDMAMFVETQGEMVNNIERNVVNSVDYVEHAKEETKKAIKYQSKARRKKffIIAAVAVAVIAVLALIIGLSVGK<210>2<211>......<212>DNA<213> 小鼠屬小鼠(Mus musculus)<400>2atgcgggacc ggctgcccga cctcacggcg tgtaggacaa acgacgatgg agacactgctgtcgtcattg tggagaagga tcatttcatg gacggtttct tccatcaggt agaggagattcgaagcagca tagccaggat tgctcagcat gtagaagacg tgaagaagaa ccacagcatcatcctgtctg ctccaaaccc agaaggaaaa ataaaagaag agctggagga cctggacaaagagatcaaga aaactgctaa caggatccgg ggcaagctga agtctattga gcagagctgtgatcaggacg agaatgggaa ccgaacttca gtggatctgc ggatacgaag gacccagcactcggtgctgt cacggaagtt tgtggacgtc atgacagaat acaatgaagc gcagatcctg
60 120 180 240 300 360 420
ttccgggagcgaagcaaaggccgcatccagcgccagctgg agatcactgggaggaccacc480
actgacgacgagctggaagagatgctggagagcgggaagc cgtccatcttcatctcggat540
attatatcagattcacaaatcactaggcaagctctcaatg agatcgagtcccgccacaaa600
gacatcatgaagctggagaccagcatccgagagctgcacg agatgttcatggatatggcc660
atgtttgtcgagactcagggtgaaatggtcaacaacatcg agagaaatgtggtgaactct720
gtagattacgtggaacatgccaaggaagagacgaagaaag ccatcaaataccagagcaag780
gccaggcggaaaaagtggataattgctgctgtggcggtgg ctgtcattgccgtcctggct840
ctaatcattggcttgtcggttggcaaatga870
權(quán)利要求
1.用于體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞的培養(yǎng)基，是在RPMI1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ) 上添加了 3% (V/V)胎牛血清，2% (V/V)B27,0. 2mol/L L-谷氨酰胺，(V/V)青-鏈霉素。
2.—種體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)將表皮形態(tài)發(fā)生蛋白基因?qū)脒M(jìn)PT67細(xì)胞，得到高表達(dá)活性表皮形態(tài)發(fā)生蛋白的 PT67細(xì)胞；2)將高表達(dá)活性表皮形態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞作為飼養(yǎng)層并進(jìn)行生長阻滯處理后接 種WB-F344細(xì)胞，用權(quán)利要求1所述的體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞的專用培養(yǎng)基 在37°C、5% CO2下共培養(yǎng)，得到膽管細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟1)中的表皮形態(tài)發(fā)生蛋白 具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟1)中通過含有表皮形 態(tài)發(fā)生蛋白基因的重組真核表達(dá)載體或利用慢病毒載體系統(tǒng)或利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將表皮 形態(tài)發(fā)生蛋白基因?qū)隤T67細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于所述步驟2、中對高表達(dá)活性表 皮形態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞進(jìn)行生長阻滯處理的方法為將貼壁后的高表達(dá)活性表皮形 態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞用濃度為15-20 μ g/ml的絲裂霉素在37°C、5% CO2下處理細(xì)胞lh。
6.用權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)所述方法誘導(dǎo)得到的膽管細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化的方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基是在RPMI1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了3％(V/V)胎牛血清，2％(V/V)B27，0.2mol/L L-谷氨酰胺，1％(V/V)青-鏈霉素。該誘導(dǎo)分化方法包括以下步驟1)將表皮形態(tài)發(fā)生蛋白基因?qū)脒M(jìn)PT67細(xì)胞，得到高表達(dá)活性表皮形態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞；2)將高表達(dá)活性表皮形態(tài)發(fā)生蛋白的PT67細(xì)胞作為飼養(yǎng)層并進(jìn)行生長阻滯處理后接種WB-F344細(xì)胞，用上述體外誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞分化為膽管細(xì)胞的專用培養(yǎng)基在37℃、5％C02下共培養(yǎng)，得到膽管細(xì)胞。本發(fā)明提供了一條獲得膽管細(xì)胞的新途徑，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N5/071GK102120982SQ200910250330
公開日2011年7月13日 申請日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日
發(fā)明者姚海雷, 岳 文, 師偉, 李艷華, 王韞芳, 裴雪濤, 賈雅麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所