本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，涉及一種用于臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液。

背景技術(shù)：

臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有較高的分化潛能，可向多個(gè)方向進(jìn)行分化。它在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、內(nèi)皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。有報(bào)道從人臍帶中分離出MSCs，且細(xì)胞含量、增殖能力優(yōu)于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，因此越來(lái)越受到研究工作者們的關(guān)注。

臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系主要應(yīng)用含動(dòng)物血清(如胎牛血清)的培養(yǎng)基，在此種環(huán)境下生長(zhǎng)的干細(xì)胞，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生何種變化尚未可知，含動(dòng)物血清培養(yǎng)液會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)過(guò)程中病毒等病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，異種血清亦會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)，因此，不含有動(dòng)物血清的培養(yǎng)液成為了培養(yǎng)液的主流選擇。通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)體系和相應(yīng)的添加物，能夠模擬出血清的效用，能促使細(xì)胞生長(zhǎng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一在于：含有動(dòng)物血清的培養(yǎng)液，容易引發(fā)過(guò)敏免疫反應(yīng)，病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)高。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二在于：現(xiàn)有的無(wú)血清培養(yǎng)體系細(xì)胞在體外的增值慢、連續(xù)傳代次數(shù)少。

本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，使用如下技術(shù)方案：提供一種臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基α-DMEM和添加物，所述添加物包括血清替代成分、其他營(yíng)養(yǎng)成分、細(xì)胞因子，其中，所述血清替代成分包括：

牛血清白蛋白 50～200mg/L

胰島素 5～20mg/ml

轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.05～0.25μg/ml；

所述其他營(yíng)養(yǎng)成分包括：

所述細(xì)胞因子包括：

bFGF 5～50ng/ml。

在本發(fā)明提供的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述血清替代成分還包括：

B-27 10～20ml/L。

在本發(fā)明提供的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述其他營(yíng)養(yǎng)成分還包括：

丙酮酸鈉 50～80mg/L

谷氨酰胺 200～500mg/L。

在本發(fā)明提供的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述其他營(yíng)養(yǎng)成分還包括：

肌醇 10～25mg/L

青霉素 100U/ml

鏈霉素 100μg/ml。

在本發(fā)明提供的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，所述細(xì)胞因子還包括：

黃體酮 5～100ng/ml

白介素3 2～10ng/ml

hEGF 5～10ng/ml。

實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案，具有如下有益效果：本發(fā)明的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，避免臨床中可能產(chǎn)生的過(guò)敏免疫反應(yīng)，并降低病毒等病原體污染的幾率，可有效提高臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在體外的增值分化。

附圖說(shuō)明

圖1使用α-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)15d后的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞；

圖2使用本發(fā)明實(shí)施例6中培養(yǎng)液培養(yǎng)15d后的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，提供一種新型的用于臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液。包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基α-DMEM和添加物，所述添加物包括血清替代成分、其他營(yíng)養(yǎng)成分、細(xì)胞因子，其中，所述血清替代成分包括：

牛血清白蛋白 50～200mg/L

胰島素 5～20mg/ml

轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.05～0.25μg/ml；

所述其他營(yíng)養(yǎng)成分包括：

所述細(xì)胞因子包括：

bFGF 5～50ng/ml。

本發(fā)明所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是α-DMEM，含有細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可供大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)。將α-DMEM的基本營(yíng)養(yǎng)成分溶解于無(wú)熱源超純水中(電阻率為18.2Ω)，并將酸堿度調(diào)至6.8～7.4，經(jīng)過(guò)濾滅菌處理后，即為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

一種臍帶血間充值干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的使用方法，培養(yǎng)臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)程如下：a)在制備好α-DMEM培養(yǎng)液中按濃度加入上述添加物制混勻得無(wú)血清培養(yǎng)液。

本發(fā)明中所述牛血清白蛋白，是牛血清中的一種球蛋白，常見(jiàn)于代替血清。牛血清白蛋白為負(fù)極，可與水分，鹽分，脂肪酸，維他命，荷爾蒙結(jié)合并把這些成分帶入細(xì)胞。

本發(fā)明中所述胰島素可作用與細(xì)胞表面的胰島素受體，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入，運(yùn)輸和利用，又可促進(jìn)氨基酸的吸收，可維持細(xì)胞分化，從而增強(qiáng)細(xì)胞的活力與功能，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本發(fā)明中所述轉(zhuǎn)鐵蛋白可作用與細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，將鐵元素運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞體內(nèi)從而調(diào)節(jié)鐵元素的代謝。轉(zhuǎn)鐵蛋白還可與其他微量元素一起調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)及功能表達(dá)。

本發(fā)明中所述β-巰基乙醇是一種還原劑，可防治二硫鍵被氧化，從而保護(hù)蛋白不被破環(huán)。其在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用是降低氧氣其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷。

本發(fā)明中所述葉酸(維生素B9)，維生素B12,維生素C，鹽酸吡多醇(維生素B6)及核黃素(維生素B2)為維持細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞活性物質(zhì)。在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)和控制作用。維生素C具有穩(wěn)定的抗氧化作用，它在培養(yǎng)液中可以長(zhǎng)時(shí)間保持活性，大大延緩干細(xì)胞衰老的速度，且有助于為細(xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定的微環(huán)境。

本發(fā)明所述bFGF為人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是一種肝素結(jié)合的生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖。在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中，使細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中保持未分化形態(tài)。

優(yōu)選的，所述血清替代成分還包括：

B-27 10～20ml/L。

本發(fā)明中所述B-27是一種無(wú)血清添加劑，購(gòu)于Invitrogen公司，用于維持細(xì)胞的生長(zhǎng)及長(zhǎng)期活性。

優(yōu)選的，所述其他營(yíng)養(yǎng)成分還包括：

丙酮酸鈉 50～80mg/L

谷氨酰胺 200～500mg/L。

本發(fā)明中所述丙酮酸鈉是一種細(xì)胞代謝碳源。在葡萄糖缺少的情況下，可以部分替代葡萄糖作為碳源，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本發(fā)明中所述谷氨酰胺，可為干細(xì)胞提供持續(xù)能量，干細(xì)胞在分化過(guò)程中對(duì)能量的需求較高，谷氨酰胺不僅可以持續(xù)為干細(xì)胞提供能量，而且可以避免因自然代謝而造成的有毒代謝物的積累。

優(yōu)選的，所述其他營(yíng)養(yǎng)成分還包括：

肌醇 10～25mg/L

青霉素 100U/ml

鏈霉素 100μg/ml。

本發(fā)明中所述肌醇參與碳水化合物，磷脂代謝，及離子平衡等生理活動(dòng)且可促進(jìn)其他活性物質(zhì)發(fā)回效應(yīng)，可促進(jìn)細(xì)胞壁的構(gòu)建。

本發(fā)明中無(wú)血清培養(yǎng)基中還含有抗生素。所述抗生素優(yōu)選為青霉素和鏈霉素?？股氐淖饔檬欠乐渭?xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中受到污染。

優(yōu)選的，所述細(xì)胞因子還包括：

黃體酮 5～100ng/ml

白介素3 2～10ng/ml

hEGF 5～10ng/ml

本發(fā)明中無(wú)血清培養(yǎng)液中添加的黃體酮可刺激間充值干細(xì)胞分泌纖連蛋白，促進(jìn)干細(xì)胞的黏附。加入黃體酮可代替加入纖連蛋白，降低培養(yǎng)液成本。

本發(fā)明中所示白介素3(Interleukin3)有利于干細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性維持，同時(shí)可抑制臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的早期增值分化。

本發(fā)明中所描述的hEGF為人表皮生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞增殖。

實(shí)施例1

實(shí)施例2

實(shí)施例3

實(shí)施例4

實(shí)施例5

實(shí)施例6

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

將上述實(shí)施例1-6中的細(xì)胞培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)基α-DMEM(對(duì)比例)用于臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，具體如下：

無(wú)菌收集人體臍帶(約10cm)，并浸泡于還有雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液中密封運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。在生物安全柜中將人臍帶用PBS反復(fù)洗滌，并用解剖刀除去羊膜及靜脈動(dòng)脈。將剩余組織剪碎未肉糜，并用PBS反復(fù)沖洗組織至離心后未見(jiàn)紅細(xì)胞。將組織塊，接種于0.2％明膠包被過(guò)的75cm²培養(yǎng)瓶中(10cm臍帶培養(yǎng)在兩個(gè)培養(yǎng)瓶中)，并加入培養(yǎng)液約10ml，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7天后，用培養(yǎng)液沖洗掉組織塊，并換液添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子。接種15天后，取細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得細(xì)胞純度為99.9％，細(xì)胞存活率為99.7％。原代細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到80～90％后進(jìn)行第一次傳代，培養(yǎng)2～3天后進(jìn)行傳代，每次傳代時(shí)補(bǔ)半量的新鮮細(xì)胞因子。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在不同的培養(yǎng)液中擴(kuò)增倍數(shù)有顯著區(qū)別。實(shí)施例1與實(shí)施例4略優(yōu)于對(duì)比例；實(shí)施例2與實(shí)施例3略優(yōu)于實(shí)施例1與實(shí)施例4。實(shí)施例6明顯優(yōu)于對(duì)照組及其他實(shí)施例。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞在不同實(shí)施例的培養(yǎng)液中細(xì)胞凋亡的情況與對(duì)照組無(wú)明顯差異。實(shí)施例1-5中的細(xì)胞培養(yǎng)液可使臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞連續(xù)傳代10次以上。實(shí)施例6中的細(xì)胞培養(yǎng)液可使臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞連續(xù)傳代20次以上。

將使用α-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)15d后的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞和使用本發(fā)明實(shí)施例6中培養(yǎng)液培養(yǎng)15d后的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞使用顯微鏡檢測(cè)，結(jié)果如圖1和圖2所示。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。