專利名稱：α－淀粉酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親代Termamyl-樣α-淀粉酶的新變體，相對于親代α-淀粉酶而言，所述變體具有經(jīng)改變的特性。所述特性包括例如在酸性pH，低鈣濃度和/或高溫下增加的穩(wěn)定性。所述變體適于多種用途，特別是工業(yè)淀粉處理(如淀粉液化或糖化)。
背景技術(shù)：
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)構(gòu)成一組能催化淀粉和其它線性和分支1，4-葡糖苷寡-和多糖水解的酶。
大量專利和科學(xué)文獻(xiàn)中涉及這一類在工業(yè)上非常重要的酶。可從例如WO 90/11352，WO 95/10603，WO 95/26397，WO 96/23873和WO 96/23874中了解多種α-淀粉酶(如Termamyl-樣α-淀粉酶)的變體。
WO 96/23874提供了Termamyl-樣α-淀粉酶的三維，X-射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，該α-淀粉酶由解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的300個N-末端氨基酸殘基，和含有氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶C-末端的氨基酸301-483組成(后者有商品TermamylTM(商標(biāo)名))，因此，與工業(yè)上重要的芽孢桿菌α-淀粉酶(在本發(fā)明的上下文中，包含在術(shù)語“Termamyl-樣α-淀粉酶”的定義中，它特別地包括地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶)密切相關(guān)。WO 96/23874進(jìn)一步描述了在分析親代Termamyl-樣α-淀粉酶結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)親代Termamyl-樣α-淀粉酶變體的方法學(xué)，相對于親代而言，所述變體表現(xiàn)出有所改變的特性。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及Termamyl-樣α-淀粉酶的新的α-淀粉分解變體(突變體)，尤其是在高溫和酸性pH下(相對于親代而言)表現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性的變體，如美國專利3,912,590和歐洲專利公開號252,730和63,909所述，所述變體有利于對淀粉進(jìn)行工業(yè)處理(淀粉液化，糖化等)。
淀粉轉(zhuǎn)化“傳統(tǒng)”的淀粉轉(zhuǎn)化方法將淀粉降解為較低分子量的碳水化合物成分，如糖或脂肪替代物，該方法包括脫支步驟。
“淀粉至糖”的轉(zhuǎn)化當(dāng)將淀粉轉(zhuǎn)化為糖時，淀粉被解聚。所述解聚過程由預(yù)處理步驟和兩個或三個連續(xù)處理步驟(即液化處理，糖化處理，根據(jù)所需終產(chǎn)物，還任選包括異構(gòu)化處理)組成。
預(yù)-處理天然淀粉天然淀粉由室溫下不溶于水的微粒組成。加熱水淀粉漿液時，微粒膨脹，最后脹破，將淀粉分子分散至溶液中。在“凝膠化”處理的過程中，粘度顯著增加。由于一般工業(yè)過程中的固體水平為30-40％，因此不得不稀釋或“液化”淀粉以使其便于處理。目前，主要通過酶促降解使粘度降低。
液化在液化步驟中，通過α-淀粉酶(如本文的TermamylTMSEQ ID NO4)將長鏈淀粉分解為分支的和線性的較短單位(麥芽糖糊精)。液化過程在105-110℃進(jìn)行5至10分鐘，接著在95℃進(jìn)行1-2小時。pH為5.5至6.2之間。為了確保這些條件下最佳的酶穩(wěn)定性，需加入1mM鈣(40ppm游離的鈣離子)。如此處理之后，液化淀粉的“葡萄糖當(dāng)量”(DE)為10-15。
糖化液化過程之后，通過加入葡糖淀粉酶(如AMGTM)和脫支酶，如異淀粉酶(美國專利4,335,208)或支鏈淀粉酶(如PromozymeTM)(美國專利4,560,651)，將麥芽糖糊精轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。在此步驟之前，將pH值降低為4.5以下，維持高溫(95℃以上)以滅活液化α-淀粉酶，減少不能被脫支酶正確水解的短寡糖(被稱為“潘糖前體”)的形成。
將溫度降低為60℃，加入葡糖淀粉酶和脫支酶。將糖化過程進(jìn)行24-72小時。
通常，當(dāng)在液化步驟之后變性α-淀粉酶時，約0.2-0.5％的糖化產(chǎn)物是分支的三糖62-α-葡糖基麥芽糖(潘糖)，該糖不能被支鏈淀粉酶降解。如果糖化過程中存在得自液化步驟的活性淀粉酶(即未變性)，該水平可以高至1-2％，這非常不合乎需要，因?yàn)樗@著降低了糖化產(chǎn)量。
異構(gòu)化當(dāng)所需的最終糖產(chǎn)物是例如高果糖漿時，葡萄糖漿可被轉(zhuǎn)變?yōu)楣?。糖化過程之后，將pH值增加為6-8，優(yōu)選為pH7.5，通過離子交換除去鈣。然后使用例如固定化的葡萄糖異構(gòu)酶(如SweetzymeTM)將萄萄糖漿轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖菨{。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“酸性pH”指的是pH低于7.0，尤其是低于上述傳統(tǒng)工業(yè)淀粉液化過程中所用的pH范圍，即為pH5.5-6.2。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“低鈣濃度”指的是濃度低于傳統(tǒng)的工業(yè)淀粉液化過程中所用的正常水平，如濃度為0-40ppm，優(yōu)選為10-30ppm，如15-25ppm鈣。正常濃度根據(jù)谷物中游離Ca2+的濃度而變化。通常加入相當(dāng)于1mM(40ppm)的劑量，該劑量與谷物中的鈣水平一起給出40-60ppm游離的Ca2+。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“高溫”指的是溫度為95至160℃，尤其是正常進(jìn)行工業(yè)淀粉液化處理所用的溫度范圍，所述范圍是95至105℃。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明變體的DNA構(gòu)建體，制備本發(fā)明變體的方法，和本發(fā)明變體單獨(dú)或與其它α-淀粉分解酶聯(lián)合用于多種工業(yè)過程，尤其是淀粉液化的用途。
命名法在本說明書和權(quán)利要求書中，使用了常規(guī)的氨基酸殘基一字母和三字母密碼。
為了易于參照，利用下述命名法描述本發(fā)明的α-淀粉酶變體原來的氨基酸位置取代的氨基酸。
根據(jù)該命名法，用天冬酰胺取代第30位的丙氨酸被表示為Ala30Asn或A30N，在相同位置處缺失丙氨酸被表示為Ala30*或A30*，而插入另一個氨基酸殘基，如賴氨酸被表示為Ala30AlaLys或A30AK。缺失連續(xù)的一段氨基酸殘基，如氨基酸殘基30-33被表示為(30-33)*或Δ(A30-N33)。
當(dāng)特定的α-淀粉酶相對于其它α-淀粉酶而言含有“缺失”，并在該位置插入某個氨基酸，例如在第36位插入天冬氨酸時，被表示為*36Asp或*36D。
多個突變由加號隔開，即Ala30Asp＋Glu34Ser或A30N＋E34S分別表示在第30和34位，丙氨酸和谷氨酸分別用天冬酰胺和絲氨酸取代。多個突變也可以由下列與加號意義相同的符號隔開Ala30Asp/Glu34Ser或A30N/E34S。
當(dāng)在給定的位置插入一個或多個其它氨基酸殘基時，被表示為A30N，E或A30N或A30E。
另外，當(dāng)本文鑒定出適于修飾的位置，而沒有暗示任何具體的修飾時，應(yīng)理解為可用任何氨基酸殘基取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如，當(dāng)提到修飾第30位的丙氨酸，但未具體說明時，應(yīng)理解為丙氨酸可被缺失，或用任何其它氨基酸取代，即下列任何一個氨基酸所取代R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。
附圖簡述

圖1是本發(fā)明上下文中6個親代Termamyl-樣α-淀粉酶的氨基酸序列對比。最左邊的數(shù)字表示以下各個氨基酸序列1SEQ ID NO2，2淀粉酶3SEQ ID NO1，4SEQ ID NO5，5SEQ ID NO4，6SEQID NO3。
圖2表示實(shí)施例1中所用的PCR策略。
發(fā)明詳述Termamyl-樣α-淀粉酶眾所周知，通過芽孢桿菌種產(chǎn)生的多種α-淀粉酶在氨基酸水平上高度同源。例如，已發(fā)現(xiàn)含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(商品為TermamylTM)與含有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶約89％同源，與含有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶約79％同源。其它同源的α-淀粉酶包括得自芽孢桿菌菌種NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513或DSM 9375的α-淀粉酶(皆詳細(xì)描述于WO 95/26397)，和描述于Tsukamoto等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，151(1988)，p25-31中的α-淀粉酶。
其它同源的α-淀粉酶包括由EP 0252666所述的地衣芽孢桿菌菌株(ATCC 27811)所產(chǎn)生的α-淀粉酶，和WO 91/00353和WO 94/18314中鑒定的α-淀粉酶。其它可商購的Termamyl-樣地衣芽孢桿菌α-淀粉酶是OptithermTM和TakathermTM(可得自Solvay)，MaxamylTM(可得自Gist-brocades/Genencor)，Spezym AATM和Spezyme Delta AATM(可得自Genencor)和KeistaseTM(可得自Daiwa)。
由于這些α-淀粉酶基本上同源，因此可以認(rèn)為它們屬于同一類α-淀粉酶，即“Termamyl-樣α-淀粉酶”。
因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“Termamyl-樣α-淀粉酶”欲指在氨基酸水平上與TermamylTM(即具有本文SEQ ID NO4所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶)基本上同源的α-淀粉酶。換句話說，Termamyl-樣α-淀粉酶是具有本文SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7或8所示氨基酸序列，和WO95/26397的SEQ ID NO1(與本文SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同)或WO95/26397的SEQ ID NO2(與本文SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同)或Tsukamoto等，1988(其氨基酸序列示于本文SEQ ID NO6)所示氨基酸序列的α-淀粉酶，或者，Termamyl-樣α-淀粉酶是i)與SEQ ID NO1或2或3或4或5或6或7或8所示的至少一個所述氨基酸序列的同源性(同一性)至少為60％，優(yōu)選至少為70％，更優(yōu)選至少為75％，甚至更優(yōu)選至少為80％，尤其是至少為85％，尤其優(yōu)選至少為90％，尤其是至少為95％，甚至尤其更優(yōu)選至少為97％，尤其是至少為99％的α-淀粉酶，和/或ii)能與針對一種或多種所述α-淀粉酶產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的α-淀粉酶，和/或iii)由能在低至很高嚴(yán)緊條件下(所述條件在下文中描述)與編碼上述-特定α-淀粉酶的DNA序列雜交的DNA序列編碼的α-淀粉酶，所述特定α-淀粉酶的DNA序列分別示于本申請的SEQ ID NO9，10，11，12和32(分別編碼本文SEQ IDNO1，2，3，4和5所示的氨基酸序列)，WO 95/26397的SEQ ID NO4(該DNA序列與終止密碼子TAA一起示于本文SEQ ID NO13，它編碼本文SEQ IDNO8所示的氨基酸序列)和WO 95/26397的SEQ ID NO5(示于本文SEQ IDNO14)。
關(guān)于特性i)，可利用任何常規(guī)的算法測定“同源性”(同一性)，優(yōu)選使用GCG程序包第8版(1994年8月)的缺口程序，該程序使用缺口得分的缺省值，即缺口產(chǎn)生得分為3.0，缺口延伸得分為0.1(Genetic ComputerGroup(1991)GCG程序包程序手冊，第8版，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)。
在一個實(shí)施方案中，親代Termamyl-樣α-淀粉酶骨架具有的氨基酸序列與SEQ ID NO4的同一性程度(按上述方法測定)至少為65％，優(yōu)選至少為70％，優(yōu)選至少為75％，更優(yōu)選至少為80％，更優(yōu)選至少為85％，甚至更優(yōu)選至少約為90％，甚至更優(yōu)選至少為95％，甚至更優(yōu)選至少為97％，甚至更優(yōu)選至少為99％。
可使用Termamyl(SEQ ID NO4)和Termamyl-樣α-淀粉酶之間的結(jié)構(gòu)對比鑒定其它Termamyl-樣α-淀粉酶中等同的/相應(yīng)的位置。得到所述結(jié)構(gòu)對比的一個方法是使用GCG程序包中的Pile Up程序，該程序使用缺省的缺口得分值，即缺口產(chǎn)生得分為3.0，缺口延伸得分為0.1。其它結(jié)構(gòu)對比方法包括疏水簇分析(Gaboriaud等，(1987)，F(xiàn)EBS LETTERS 224，p.149-155)和反向穿梭(threading)法(Huber，T；Torda，AE，蛋白質(zhì)科學(xué)，卷7，1期，142-149(1998))。
例如，在已提及的多種Termamyl-樣α-淀粉酶的氨基酸序列中，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶C-結(jié)構(gòu)域中靶殘基的相應(yīng)位置如下Termamyl-樣α-淀粉酶地衣芽孢桿菌(SEQ ID NO4) S356 Y358 E376 S417 A420解淀粉芽孢桿菌(SEQ ID NO5) S356 Y358 E376 S417 A420嗜熱脂肪芽孢桿菌(SEQ ID NO3) …… Y361 …………………Bac.WO95/26397(SEQ ID NO2) …… Y363 ……S419………Bac.WO95/26397(SEQ ID NO1) …… Y363 …………………這些保守氨基酸殘基的突變對于增加高溫下酸性pH和/或低鈣濃度時的穩(wěn)定性非常重要，這一點(diǎn)將在下文中進(jìn)一步描述。
使用針對相關(guān)Termamyl-樣α-淀粉酶的至少一個表位的抗體或與所述表位反應(yīng)的抗體，可以檢測α-淀粉酶的特性ii)(見上文)，即免疫交叉反應(yīng)性。通過本領(lǐng)域已知的方法，如Hudson等，實(shí)用免疫學(xué)，第3版(1989)，BlackwellScientific Publications可以產(chǎn)生抗體，所述抗體可以是單克隆或多克隆抗體。使用本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)，例如Western印跡或放射狀免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(如Hudson等，1989所述)可以測定免疫交叉-反應(yīng)性。在此方面，已發(fā)現(xiàn)了分別具有氨基酸序列SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7或8的α-淀粉酶之間的免疫交叉-反應(yīng)性。
可以在所述α-淀粉酶的完整或部分核苷酸或氨基酸序列的基礎(chǔ)上適當(dāng)制備寡核苷酸探針，然后使用所述探針，根據(jù)上述特性iii)鑒定Termamyl-樣α-淀粉酶。
檢測雜交的適當(dāng)條件包括在5×SSC中預(yù)浸泡，于～40℃，在20％甲酰胺，5×Denhardt’s溶液，50mM磷酸鈉，pH6.8和50mg變性的經(jīng)超聲處理的小牛胸腺DNA中預(yù)雜交l小時，接著于～40℃，在添加有100mM ATP的相同溶液中雜交18小時，接著于40℃，用2×SSC，0.2％SDS將濾膜洗滌3次，每次30分鐘(低嚴(yán)緊性)，優(yōu)選在50℃(中度嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在65℃(高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選在～75℃(很高的嚴(yán)緊性)進(jìn)行洗滌。有關(guān)雜交方法的更多細(xì)節(jié)描述于Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港，1989。
在本發(fā)明的上下文中，“得自”不僅僅表示由所述生物體產(chǎn)生或可由所述生物體產(chǎn)生的α-淀粉酶，還指由分離自所述菌株的DNA序列編碼的α-淀粉酶，和由所述DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物體產(chǎn)生的α-淀粉酶。最后，該術(shù)語還表示由合成的和/或cDNA來源的DNA序列編碼的，并具有所述α-淀粉酶的鑒定特征的α-淀粉酶。該術(shù)語還表示親代α-淀粉酶可以是天然α-淀粉酶的變體，即修飾(插入，取代，缺失)天然α-淀粉酶的一個或多個氨基酸殘基而得到的變體。
親代雜合α-淀粉酶親代α-淀粉酶(骨架)可以是雜合α-淀粉酶，即含有得自至少兩種α-淀粉酶的部分氨基酸序列組合的α-淀粉酶。
親代雜合α-淀粉酶可以是在氨基酸同源性和/或免疫交叉-反應(yīng)性和/或DNA雜交(如上所述)的基礎(chǔ)上被確定為屬于Termamyl-樣α-淀粉酶家族的雜合α-淀粉酶。此時，雜合α-淀粉酶一般由Termamyl-樣α-淀粉酶的至少一個部分和一種或多種其它α-淀粉酶的部分組成，所述其它α-淀粉酶選自微生物(細(xì)菌或真菌)和/或哺乳動物來源的Termamyl-樣α-淀粉酶或非-Termamyl-樣α-淀粉酶。
因此，親代雜合α-淀粉酶可含有得自至少兩種Termamyl-樣α-淀粉酶，或得自至少一種Termamyl-樣和至少一種非-Termamyl-樣細(xì)菌α-淀粉酶，或得自至少一種Termamyl-樣和至少一種真菌α-淀粉酶的部分氨基酸序列組合。衍生得到部分氨基酸序列的Termamyl-樣α-淀粉酶可以是例如本文所述的任何特定的Termamyl-樣α-淀粉酶。
例如，親代α-淀粉酶可含有得自地衣芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶的C-末端部分，和得自解淀粉芽孢桿菌菌株或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株的α-淀粉酶的N-末端部分。例如，親代α-淀粉酶可含有地衣芽孢桿菌α-淀粉酶C-末端部分的至少430個氨基酸殘基。所述雜合Termamyl-樣α-淀粉酶可以與SEQ ID NO4所示的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶相同，不同之處僅在于(成熟蛋白質(zhì))N-末端的35個氨基酸殘基被SEQ ID NO5所示的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(BAN)成熟蛋白質(zhì)N-末端的33個氨基酸殘基所取代。該雜合體也可由對應(yīng)于嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列)的68個N-末端氨基酸殘基的氨基酸區(qū)段，和對應(yīng)于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(具有SEQ IDNO4所示氨基酸序列)的415個C-末端氨基酸殘基的氨基酸區(qū)段組成。
非-Termamyl-樣α-淀粉酶可以是例如真菌α-淀粉酶，哺乳動物或植物α-淀粉酶或細(xì)菌α-淀粉酶(不同于Termamyl-樣α-淀粉酶)。這種α-淀粉酶的具體例子包括米曲霉TAKA α-淀粉酶，黑曲霉酸性α-淀粉酶，枯草芽孢桿菌α-淀粉酶，豬胰腺α-淀粉酶和大麥α-淀粉酶。所有這些α-淀粉酶都具有已闡明的，與本文所述典型Termamyl-樣α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)顯著不同的結(jié)構(gòu)。
上述真菌α-淀粉酶，即得自黑曲霉和米曲霉的α-淀粉酶在氨基酸水平上高度同源，一般認(rèn)為它們屬于相同的α-淀粉酶家族。得自米曲霉的真菌α-淀粉酶可以商購，其商品名為FungamylTM。
另外，當(dāng)提及Termamyl-樣α-淀粉酶的特定變體(本發(fā)明的變體)時，提到該變體是通過常規(guī)方法，修飾(例如缺失或取代)特定Termamyl-樣α-淀粉酶氨基酸序列中的特定氨基酸殘基而獲得的，應(yīng)理解在另一個Termamyl-樣α-淀粉酶的等同位置(由各個氨基酸序列之間最有可能的氨基酸序列對比測定)修飾得到的變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明變體的優(yōu)選實(shí)施方案是得自地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(作為親代Termamyl-樣α-淀粉酶)的變體，例如，上述α-淀粉酶中的一個，如具有SEQ IDNO4所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的變體。
本發(fā)明變體經(jīng)改變的特性下文將討論本發(fā)明變體中可能存在的改變/突變與由此產(chǎn)生的合乎需要的特性改變(相對于親代Termamyl-樣α-淀粉酶而言)之間的關(guān)系。
在高溫，酸性pH和/或低鈣濃度下穩(wěn)定性的增加本發(fā)明涉及親代Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，與親代α-淀粉酶相比，所述變體α-淀粉酶表面的一個或多個暴露于溶劑的氨基酸殘基發(fā)生變化，從而使α-淀粉酶的總體親水性增加和/或表面上所述暴露于溶劑之氨基酸殘基的側(cè)鏈中的甲基總數(shù)增加。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向內(nèi)彎曲的凹面上的一個或多個暴露于溶劑的氨基酸殘基變?yōu)楦呤杷缘陌被釟埢?br> 在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，凸面上的一個或多個暴露于溶劑的氨基酸殘基經(jīng)改變后增加了側(cè)鏈中的甲基數(shù)目。
本發(fā)明涉及親代Termamyl-樣α-淀粉酶的α-淀粉酶變體，該變體在選自下列的一個或多個位置處具有變化E376，S417，A420，S356，Y358；其中(a)所述變化各為(i)在占用上述位置的氨基酸的下游插入一個氨基酸，(ii)缺失占用上述位置的氨基酸，或(iii)用不同的氨基酸取代占用上述位置的氨基酸，(b)所述變體具有α-淀粉酶活性，和(c)每個位置對應(yīng)于具有SEQ ID NO4氨基酸序列的親代Termamyl-樣α-淀粉酶的氨基酸序列位置。
在一個實(shí)施方案中，變化是下列取代之一E376A，R，D，C，Q，G，H，I，K，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，取代是E376K。
在一個實(shí)施方案中，變化是下列取代之一S417A，R，D，C，E，Q，G，H，I，K，L，M，N，F(xiàn)，P，T，W，Y，V；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，取代是S417T。
在一個實(shí)施方案中，變化是下列取代之一A420R，D，C，E，Q，G，H，I，K，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，取代是A420Q，R。
在一個實(shí)施方案中，變化是下列取代之一S356A，R，D，C，E，Q，G，H，I，K，L，M，N，F(xiàn)，P，T，W，Y，V。
在一個實(shí)施方案中，變化是下列取代之一Y358A，R，D，C，E，Q，G，H，I，K，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，V。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，取代是Y358F。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，變體含有一個或多個下列取代E376K，S417T，A420Q，R，S356A，Y358F。
使用下文闡明本發(fā)明的實(shí)施例2中所述的方法，測定在高溫，酸性pH和/或低鈣濃度下穩(wěn)定性的增加。
用作制備本發(fā)明變體所用骨架的親代Termamyl-樣α-淀粉酶可以是上文所述的任何Termamyl-樣α-淀粉酶。
特別希望它們是選自下列的親代Termamyl-樣α-淀粉酶得自地衣芽孢桿菌，如地衣芽孢桿菌菌株ATCC 27811，解淀粉芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，芽孢桿菌菌種NCIB 12289，NCIBl2512，NCIB 12513或DSM 9375的親代Termamyl-樣α-淀粉酶，和SEQ ID NO1，2，3，4，5，6，7和8所示的親代Termamyl-樣α-淀粉酶。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，親代Termamyl-樣α-淀粉酶是與SEQ IDNO4所示的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(Termamyl)相同的雜合α-淀粉酶，不同之處在于(成熟蛋白質(zhì))N-末端的35個氨基酸殘基被SEQ ID NO5所示解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(BAN)成熟蛋白質(zhì)N-末端的33個氨基酸殘基所取代。親代Termamyl-樣雜合α-淀粉酶可以是上述的雜合Termamyl-樣α-淀粉酶，其進(jìn)一步具有下列突變H156Y+181T+190F+209V+264S(使用SEQ ID NO4中的編號)。所述骨架在下文中被稱為“LE174”。
親代α-淀粉酶進(jìn)一步在下列一個或多個位置具有突變較為有利K176，I201和H205(使用SEQ ID NO4中的編號)，尤其有利的是具有一個或多個下列取代K176R，I201F和H205N(使用SEQ ID NO4中的編號)，例如特別是下列取代K176R+I201F+H205N(使用SEQ ID NO4中的編號)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相對于親代Termamyl-樣α-淀粉酶而言，上述變體在95-160℃的溫度(即高溫)，低于7.0的pH(即酸性pH)和/或低于1mM(40ppm)的鈣濃度(即低鈣濃度)下具有增加的穩(wěn)定性。
改變(如通過取代來改變)一個或多個暴露于溶劑的氨基酸殘基可以1)增加酶的總體親水性，或2)增加暴露于溶劑的氨基酸殘基側(cè)鏈中的甲基數(shù)目，從而改善溫度穩(wěn)定性。優(yōu)選將向內(nèi)彎曲的凹面上的氨基酸殘基改變(如通過取代來改變)為更具疏水性的殘基。優(yōu)選改變(如通過取代來改變)凸面上的氨基酸殘基以增加側(cè)鏈中的甲基數(shù)目。
使用國際互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)http∥sunrise.cbs.umn.edu/cast/版本1.0中的CAST程序(1998年2月發(fā)布)(參考文獻(xiàn)Jie Liang，Herbert Edelsbrunner和ClareWoodward，1998，分析蛋白質(zhì)袋和溝槽測定結(jié)合位點(diǎn)幾何學(xué)并涉及配體設(shè)計(jì)，蛋白質(zhì)科學(xué)，7，pp.1884-1897)，可以鑒定出靠近表面的凹面區(qū)域。由于直徑為1.4埃的探針可進(jìn)可出，因此在該程序中確定了通向表面的路徑。在CAST程序中使用缺省參數(shù)，使用Brookhaven數(shù)據(jù)庫(1BPL)中的地衣芽孢桿菌鈣-耗盡的α-淀粉酶結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)凹面溝槽
三種類型的相互作用可被合理化A.殘基側(cè)鏈和蛋白質(zhì)之間的相互作用，B.殘基側(cè)鏈和周圍環(huán)境中的水之間的相互作用，C.水和蛋白質(zhì)之間的相互作用。
將SEQ ID NO4所示的親代Termamyl-樣α-淀粉酶用作骨架，認(rèn)為下列位置暴露于溶劑，并可對其進(jìn)行適當(dāng)改變E376，S417，A420，S356，Y358。
使用W.kabsch和C.Sander，生物聚合物22(1983)pp.2577-2637的dssp程序，可鑒定其它Termamyl-樣α-淀粉酶表面相應(yīng)的和其它的暴露于溶劑的位置。使用WHATIF程序包中的AACAVI程序部分(G.Vriend，Whatif和藥物設(shè)計(jì)程序，J.Mol.Graph.8，pp.52-56(1990)版本19980317)，可以鑒定凸起的表面。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，變體含有一個或多個下列取代E376K，S417T，A420Q，R，S356A，Y358F。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將上述位置，即E376，S417，A420，S356，Y358(使用SEQ ID NO4的編號)的突變與下列一個或多個位置，即K176，I201和H205的突變聯(lián)合，可以使高溫，酸性pH和/或低鈣濃度下的穩(wěn)定性有更大的提高。
下列其它取代是優(yōu)選的K176A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；I201A，R，D，C，E，Q，G，H，L，K，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；H205A，R，D，C，E，Q，G，I，L，K，M，N，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；如闡明本發(fā)明的實(shí)施例2所示，使用被稱為LE174的雜合α-淀粉酶作為親代Termamyl-樣α-淀粉酶，聯(lián)合下列突變可以使穩(wěn)定性增加K176+I201F+H205N+E376K+A420R或K176+1201F+H205N+S417T+A420Q或K176+I201F+H205N+S356A+Y358F。
本發(fā)明變體中的一般突變優(yōu)選本發(fā)明的變體除了含有上述變化外，還含有一個或多個修飾。因此，經(jīng)修飾的α-淀粉酶變體中一個或多個脯氨酸殘基被非脯氨酸殘基取代較為有利，所述非脯氨酸殘基可以是任何可能的天然非脯氨酸殘基，優(yōu)選為丙氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，纈氨酸或亮氨酸。
類似地，優(yōu)選親代α-淀粉酶被修飾的氨基酸殘基中存在的一個或多個半胱氨酸殘基被非半胱氨酸殘基取代，所述非半胱氨酸殘基可以是例如絲氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，纈氨酸或亮氨酸。
另外，本發(fā)明的變體可以(作為唯一的修飾或與上述任何修飾聯(lián)合)被修飾，以使對應(yīng)于SEQ ID NO4中185-209的氨基酸片段中存在的一個或多個Asp和/或Glu分別被Asn和/或Gln取代。另外，用Arg取代Termamyl-樣α-淀粉酶中對應(yīng)于SEQ ID NO4中185-209的氨基酸片段中存在的一個或多個Lys殘基也很有意義。
應(yīng)理解本發(fā)明包含摻入了兩個或多個上述修飾的變體。
另外，在本文所述的任何變體中導(dǎo)入點(diǎn)突變較為有利。
克隆編碼本發(fā)明α-淀粉酶的DNA序列可使用本領(lǐng)域眾所周知的多種方法，從產(chǎn)生所述α-淀粉酶的任何細(xì)胞或微生物中分離出編碼親代α-淀粉酶的DNA序列。首先，應(yīng)使用源自產(chǎn)生待研究之α-淀粉酶的生物體的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針，使用該探針從制備自所述生物體的基因組文庫中鑒定編碼α-淀粉酶的克隆?；蛘?，將含有與已知α-淀粉酶基因同源之序列的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針用作探針，使用較低嚴(yán)緊度的雜交和洗滌條件鑒定編碼α-淀粉酶的克隆。
另一種鑒定編碼α-淀粉酶的克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達(dá)載體，如質(zhì)粒，用所得基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化α-淀粉酶-陰性細(xì)菌，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪于含有α-淀粉酶底物的瓊脂上，從而鑒定出表達(dá)α-淀粉酶的克隆。
或者，可通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備編碼酶的DNA序列，所述方法例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)所述的膦酰胺法或Matthes等(1984)所述的方法。在膦酰胺法中，可在例如自動化的DNA合成儀中合成寡核苷酸，對其進(jìn)行純化，退火，再連接并克隆至適當(dāng)?shù)妮d體。
最終，DNA序列可以是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過連接合成的，基因組的或cDNA來源的片段(適當(dāng)時是對應(yīng)于完整DNA序列的多個部分的片段)而制備的混合的基因組和合成來源，混合的合成和cDNA來源或混合的基因組和cDNA來源的DNA序列。也可以使用特定的引物，如US 4,683,202或R K.Saiki等(1988)所述的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備DNA序列。
定點(diǎn)誘變一旦分離出編碼α-淀粉酶的DNA序列，并鑒定出合乎需要的突變位點(diǎn)，可使用合成的寡核苷酸導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸含有側(cè)翼于所需突變位點(diǎn)的核苷酸序列；在合成寡核苷酸的過程中插入突變的核苷酸。在特定的方法中，在攜有α-淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生橋連α-淀粉酶-編碼序列的單鏈DNA缺口。然后，使攜有所需突變的合成核苷酸與該單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)補(bǔ)平其余缺口，使用T4連接酶連接構(gòu)建體。該方法的特例描述于Morinaga等(1984)。US 4,760,025公開了通過對盒進(jìn)行微小的改變而導(dǎo)入編碼多個突變的寡核苷酸。然而，由于Morinaga法可以導(dǎo)入多種長度的多個寡核苷酸，因此可在任何一次導(dǎo)入甚至更多個突變。
Nelson和Long(1989)描述了另一種將突變導(dǎo)入編碼α-淀粉酶的DNA序列的方法。所述方法包括以3個步驟產(chǎn)生含有所需突變的PCR片段，所述突變是通過使用化學(xué)合成的DNA鏈作為PCR反應(yīng)的一個引物而導(dǎo)入的。通過用限制性內(nèi)切核酸酶裂解，可從PCR-產(chǎn)生的片段中分離出攜有突變的DNA片段，并將該片段重新插入表達(dá)質(zhì)粒。
隨機(jī)誘變可在翻譯成本文所示氨基酸序列的基因的至少3個部分中，或在整個基因內(nèi)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行隨機(jī)誘變，所述誘變可以是定域的或區(qū)域-特異性的隨機(jī)誘變。
利用本領(lǐng)域已知的任何方法，可以方便地對編碼親代α-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變。
關(guān)于上文，本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生親代α-淀粉酶的變體的方法，例如，其中變體相對于親代而言，表現(xiàn)出經(jīng)改變的或增加的熱穩(wěn)定性，所述方法包括(a)對編碼親代α-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變，(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中得到的突變DNA序列，和(c)篩選表達(dá)α-淀粉酶變體的宿主細(xì)胞，所述變體相對于親代α-淀粉酶而言具有經(jīng)改變的特性(即熱穩(wěn)定性)。
優(yōu)選使用添加引物進(jìn)行本發(fā)明上述方法中的步驟(a)。
例如，可使用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑，使用適當(dāng)?shù)墓押塑账?，或通過對DNA序列進(jìn)行PCR以產(chǎn)生誘變來進(jìn)行隨機(jī)誘變。另外，可使用這些誘變劑的任何組合進(jìn)行隨機(jī)誘變。誘變劑可以是例如誘導(dǎo)堿基轉(zhuǎn)換，顛換，倒位，倒頻，缺失和/或插入的試劑。
適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，鄰甲基羥胺，亞硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亞硫酸氫鈉，甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些誘變劑時，一般通過在適于發(fā)生誘變的條件下，在選定誘變劑的存在下保溫待誘變的編碼親代酶的DNA序列來進(jìn)行誘變，然后篩選具有所需特性的突變DNA。
當(dāng)利用寡核苷酸進(jìn)行誘變時，在合成待改變位置處的寡核苷酸的過程中，可同時添加寡核苷酸和3個非-親代核苷酸。添加的目的是避免不必要氨基酸的密碼子?？赏ㄟ^任何公開的技術(shù)，例如使用PCR，LCR或適當(dāng)時使用任何DNA聚合酶和連接酶，將添加的寡核苷酸摻入編碼α-淀粉酶的DNA。
優(yōu)選使用“恒隨機(jī)的添加”進(jìn)行添加，其中各個位置的野生型和突變的百分比是預(yù)先確定好的。另外，添加可以導(dǎo)致優(yōu)先導(dǎo)入某些核苷酸，從而優(yōu)先導(dǎo)入一個或多個特定的氨基酸殘基。例如，進(jìn)行添加后可在每個位置導(dǎo)入90％野生型和10％突變。選擇添加方案的其它考慮基于遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)的限制?？墒褂肈OPE程序制訂添加方案，所述程序可特別地確保不導(dǎo)入終止密碼子。
當(dāng)使用PCR-產(chǎn)生的誘變時，可在增加核苷酸錯誤摻入的條件下，對經(jīng)化學(xué)處理或未經(jīng)處理的編碼親代α-淀粉酶的基因進(jìn)行PCR(Deshler 1992；Leung等，技術(shù)，Vol.1，1989，pp.11-15)。
可使用大腸桿菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，1974，pp.179-191)，釀酒酵母或任何其它微生物的增變株對編碼α-淀粉酶的DNA進(jìn)行隨機(jī)誘變，誘變方法包括例如將含有親代糖基酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至增變株，培養(yǎng)含有質(zhì)粒的增變株，從增變株中分離突變的質(zhì)粒。隨后，將突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)生物體。
待誘變的DNA序列可以方便地存在于基因組或cDNA文庫中，所述文庫制備自表達(dá)親代α-淀粉酶的生物體?；蛘?，DNA序列可以存在于適當(dāng)?shù)妮d體，如質(zhì)?；蚴删w上，再與誘變劑一起保溫或要不然暴露于誘變劑中。待誘變的DNA也可存在于宿主細(xì)胞中，或者整合于所述細(xì)胞的基因組中，或者存在于細(xì)胞所攜帶的載體上。最后，待誘變的DNA也可以是分離的形式。應(yīng)理解接受隨機(jī)誘變的DNA序列優(yōu)選為cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況下，在進(jìn)行表達(dá)步驟b)或篩選步驟c)前，可以方便地?cái)U(kuò)增突變的DNA序列。可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行擴(kuò)增，本發(fā)明優(yōu)選的方法是使用根據(jù)親代酶的DNA或氨基酸序列制備的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
與誘變劑保溫或暴露于誘變劑之后，通過在允許發(fā)生表達(dá)的條件下培養(yǎng)攜有突變DNA序列的適當(dāng)宿主細(xì)胞來表達(dá)突變的DNA。用于此目的的宿主細(xì)胞可以是被突變的DNA序列(任選其存在于載體上)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或者是在誘變處理的過程中攜有編碼親代酶的DNA序列的宿主細(xì)胞。適當(dāng)宿主細(xì)胞的例子如下革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；和革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。
突變的DNA序列可進(jìn)一步含有能使突變的DNA序列表達(dá)的DNA序列。
定域隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變可有利地定域于所述親代α-淀粉酶的一部分。例如，當(dāng)酶的某些區(qū)域被鑒定為對酶的給定特性特別重要時，以及當(dāng)預(yù)期修飾能導(dǎo)致具有改良特性的變體時，定域隨機(jī)誘變較為有利。當(dāng)親代酶的三級結(jié)構(gòu)已被闡明，且所述結(jié)構(gòu)與酶的功能相關(guān)時，一般可鑒定出所述區(qū)域。
通過使用上述的PCR產(chǎn)生的誘變技術(shù)或本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，可以方便地進(jìn)行定域的或區(qū)域-特異性的隨機(jī)誘變?；蛘?，通過例如插入適當(dāng)?shù)妮d體來分離編碼待修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后可使用上述任何誘變方法對所述部分進(jìn)行誘變。
提供α-淀粉酶變體的其它方法提供α-淀粉酶變體的其它方法包括本領(lǐng)域已知的基因改組方法，所述方法包括例如WO 95/22625(Affymax Technologies N.V.)和WO 96/00343(NovoNordisk A/S)所述的方法。
表達(dá)本發(fā)明的α-淀粉酶變體根據(jù)本發(fā)明，可使用表達(dá)載體，以酶的形式表達(dá)通過上述方法，或通過本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達(dá)載體一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號的控制序列，并任選包括阻抑基因或多種激活基因。
攜有編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是能對其方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自我復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，所述載體的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，所述載體包括例如質(zhì)粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體?；蛘?，載體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時可以整合至宿主細(xì)胞基因組，并與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。
在載體中，DNA序列應(yīng)該與適當(dāng)?shù)膯幼有蛄锌刹僮飨噙B。啟動子可以是在選定宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，啟動子可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。介導(dǎo)編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體之DNA序列轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因dagA啟動子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)啟動子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動子的例子是得自編碼下列酶的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。
本發(fā)明的表達(dá)載體也含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當(dāng)?shù)氐米耘c啟動子相同的來源。
載體可進(jìn)一步含有能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可含有選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。另外，載體可含有曲霉屬選擇標(biāo)記，如amdS，argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或者可通過WO 91/17243中所述的共-轉(zhuǎn)化來完成選擇。
盡管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)在某些方面(例如當(dāng)使用某些細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時)有利，但一般優(yōu)選在細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá)。通常，本文所述的芽孢桿菌α-淀粉酶含有允許表達(dá)的蛋白酶分泌至培養(yǎng)基的前區(qū)。必要時，該前區(qū)可被不同的前區(qū)或信號序列取代，通過取代編碼各個前區(qū)的DNA序列可以方便地實(shí)現(xiàn)此目的。
分別連接編碼α-淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，啟動子，終止子和其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港，1989)。
含有上文所定義的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明細(xì)胞可以有利地用作宿主細(xì)胞，以重組產(chǎn)生本發(fā)明的α-淀粉酶變體。可以方便地通過將編碼變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)檎虾驞NA序列可以在細(xì)胞中更加穩(wěn)定地維持。根據(jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源重組可以將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體?；蛘?，可用與不同類型的宿主細(xì)胞有關(guān)的上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選其為微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
適當(dāng)細(xì)菌的例子是革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，或淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。通過例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，或通過以本身已知的方式使用感受態(tài)細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。
酵母生物體可有利地選自糖酵母屬或裂殖酵母屬的種，例如釀酒酵母。絲狀真菌可有利地屬于曲霉屬的種，例如米曲霉或黑曲霉。通過以下方法可轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞，所述方法包括按本身已知的方式形成原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，接著再生細(xì)胞壁。轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法描述于EP 238 023。
另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明α-淀粉酶變體的方法，所述方法包括在有利于產(chǎn)生變體的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，并從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并表達(dá)本發(fā)明α-淀粉酶變體的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以商購，或者可根據(jù)公開的配方(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中所述的配方)制備。
通過眾所周知的方法，包括通過離心或過濾將培養(yǎng)基與細(xì)胞分開，利用諸如硫酸銨的鹽沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接著利用層析法，如離子交換層析，親和層析等，可以從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞分泌的α-淀粉酶變體。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的α-淀粉酶變體具有有價(jià)值的特性，所述特性有多種工業(yè)用途。本發(fā)明的酶變體可用作洗滌，洗碟和硬-表面清洗去污劑組合物中的組分。多種變體對由淀粉產(chǎn)生增甜劑和乙醇，和/或織物脫漿特別有用。常規(guī)淀粉-轉(zhuǎn)變過程，包括淀粉液化和/或糖化過程的條件描述于例如US 3,912,590和EP專利公開號252,730和63,909。
由淀粉產(chǎn)生增甜劑“傳統(tǒng)的”由淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)楣菨{的方法一般由三個連續(xù)的酶促過程組成，即液化過程，接著是糖化過程和異構(gòu)化過程。在液化過程中，在溫度為95-160℃，pH值為5.5-6.2時，用α-淀粉酶(如TermamylTM)將淀粉降解約2小時，使其成為糊精。為了確保這些條件下的最適酶穩(wěn)定性，需加入1mM鈣(40ppm游離的鈣離子)。
液化過程之后，通過加入葡糖淀粉酶(如AMGTM)和脫支酶，如異淀粉酶或支鏈淀粉酶(如PromozymeTM)，將糊精轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。在此步驟之前，將pH值降低為4.5以下，維持高溫(95℃以上)，使液化α-淀粉酶活性變性。將溫度降低為60℃，加入葡糖淀粉酶和脫支酶。將糖化過程進(jìn)行24-72小時。
糖化過程之后，將pH增加至pH值范圍為6-8，優(yōu)選為pH7.5，通過離子交換除去鈣。然后使用固定化的葡萄糖異構(gòu)酶(如SweetzymeTM)將葡萄糖漿轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖菨{。
此方法的至少1個酶促改良是可以想象到的。即降低了液化α-淀粉酶的鈣依賴性。添加游離的鈣是確保α-淀粉酶足夠高的穩(wěn)定性所必需的，但游離的鈣強(qiáng)烈地抑制了葡萄糖異構(gòu)酶的活性，必需通過操作昂貴裝置以除去游離的鈣，使其水平降至3-5ppm以下。如果這種操作可以避免，液化過程在不加入游離鈣離子時也能進(jìn)行的話，就可以節(jié)省開支。
為了達(dá)到此目的，需要一種對鈣的依賴性較低的Termamyl-樣α-淀粉酶，該α-淀粉酶在游離鈣濃度低(＜40ppm)時是穩(wěn)定的，且具有高活性。這種Termamyl-樣α-淀粉酶應(yīng)該在pH范圍為4.5-6.5時，優(yōu)選在pH范圍為4.5-5.5時具有最適pH。
去污劑組合物如上所述，可將本發(fā)明的變體適當(dāng)摻入去污劑組合物中。關(guān)于去污劑組合物(如洗衣或洗碟去污劑)的相關(guān)成分，將變體配制在所述去污劑組合物中的適當(dāng)方法，和相關(guān)類型的去污劑組合物的例子的其它細(xì)節(jié)可參見例如WO96/23874和WO 97/07202。
含有本發(fā)明變體的去污劑組合物還可含有一種或多種其它的酶，例如脂肪酶，角質(zhì)酶，蛋白酶，纖維素酶，過氧化物酶或漆酶和/或另一種α-淀粉酶。
以常規(guī)使用的濃度將本發(fā)明的α-淀粉酶變體摻入去污劑。本發(fā)明希望使用常規(guī)的去污劑劑量水平，以相當(dāng)于每升洗滌/洗碟液0.00001-1mg(以純的活性酶蛋白質(zhì)計(jì))α-淀粉酶的量摻入本發(fā)明的變體。
材料和方法酶LE174雜合α-淀粉酶變體LE174是與Termamyl序列，即SEQ ID NO4所示的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶相同的雜合Termamyl-樣α-淀粉酶，不同之處在于(成熟蛋白質(zhì))N-末端的35個氨基酸殘基被SEQ ID NO5所示的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(BAN)成熟蛋白質(zhì)N-末端的33個氨基酸殘基所取代，其進(jìn)一步具有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQ IDNO4的編號)。
構(gòu)建pSNK101該大腸桿菌/芽孢桿菌穿梭載體可用于導(dǎo)入突變，而不用在大腸桿菌中表達(dá)α-淀粉酶，然后以α-淀粉酶在芽孢桿菌中具有活性的方式修飾該載體。按下述構(gòu)建載體通過將含有來源于大腸桿菌之片段的1.2kb片段插入α-淀粉酶基因5’編碼區(qū)的PstI位點(diǎn)，來滅活pX載體(在amyL中具有下列改變的pDN1528BAN(1-33)，H156Y，A181T，N190F，A209V，Q264S，實(shí)施例1中將進(jìn)一步描述質(zhì)粒pDN1528)中的α-淀粉酶基因。使用正向引物15’-gacctgcagtcaggc aacta-3’(SEQ ID NO28)和反向引物15’-tagagtcgacctgcaggcat-3’(SEQ ID NO29)，由pUC19(GenBank登記號X02514)擴(kuò)增此片段。于37℃，用PstI消化PCR擴(kuò)增子和含有α-淀粉酶基因的pX質(zhì)粒達(dá)2小時。室溫下連接pX載體片段和來源于大腸桿菌的擴(kuò)增子達(dá)1小時，通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。所得載體被稱為pSnK101。
該大腸桿菌/芽孢桿菌穿梭載體可用于導(dǎo)入突變，而不用在大腸桿菌中表達(dá)α-淀粉酶，然后以α-淀粉酶在芽孢桿菌中具有活性的方式修飾該載體。按下述構(gòu)建載體通過將含有來源于大腸桿菌之片段的1.2kb片段插入α-淀粉酶基因5’編碼區(qū)的PstI位點(diǎn)，來滅活pX載體(在amyL中具有下列改變的pDN1528BAN(1-33)，H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S，實(shí)施例1中將進(jìn)一步描述質(zhì)粒pDN1528)中的α-淀粉酶基因。使用正向引物25’-gacctgcagtcaggcaacta-3’(SEQ ID NO30)和反向引物25’-tagagtcgacctgcaggcat-3’(SEQID NO31)，由pUC19(GenBank登記號X02514)擴(kuò)增此片段。于37℃，用PstI消化PCR擴(kuò)增子和含有α-淀粉酶基因的pX質(zhì)粒達(dá)2小時。室溫下連接pX載體片段和來源于大腸桿菌的擴(kuò)增子達(dá)1小時，通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。所得載體被稱為pSnK101。
低pH濾膜試驗(yàn)于37℃，將芽孢桿菌文庫鋪于含10μg/ml氯霉素的TY瓊脂平板上的醋酸纖維素(OE67，Schleicher & Schuell，Dassel，德國)和硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德國)夾層，至少放置21小時。醋酸纖維素層位于TY瓊脂平板上。
在鋪平板之后，但在保溫之前用針頭特異性地標(biāo)記每個濾膜夾層，以使陽性變體定位于濾膜上，將結(jié)合有變體的硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移至含檸檬酸鹽緩沖液，pH4.5的容器，90℃保溫15分鐘。室溫下，將含菌落的醋酸纖維素濾膜儲存于TY-平板上待用。保溫之后，在含有1％瓊脂糖，0.2％淀粉(皆溶于檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)的試驗(yàn)平板上檢測殘留的活性。按與濾膜夾層相同的方式標(biāo)記含硝酸纖維素濾膜的試驗(yàn)平板，50℃保溫2小時。取出濾膜之后，用10％Lugol溶液染色試驗(yàn)平板。降解淀粉的變體被測定為深藍(lán)色背景上的白點(diǎn)，然后在儲存平板上鑒定該變體。在與第一次篩選相同的條件下再將陽性變體篩選2次。
二級篩選重新篩選之后，從儲存平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子，在二級平板試驗(yàn)中進(jìn)行檢測。于37℃，在5ml LB+氯霉素中將陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)22小時。于90℃，在檸檬酸鹽緩沖液，pH4.5中保溫每個陽性轉(zhuǎn)化子和對照LE174變體的芽孢桿菌培養(yǎng)物，在0，10，20，30，40，60和80分鐘時取樣。將3微升樣品點(diǎn)在試驗(yàn)平板上。用10％Lugol溶液染色試驗(yàn)平板。將試驗(yàn)板上殘留活性高于對照的暈圈定為改良變體。通過核苷酸測序測定這些改良的變體。
發(fā)酵和純化α-淀粉酶變體在含有15μg/ml氯霉素的LB-瓊脂平板上，用-80℃原種劃線攜有相關(guān)表達(dá)質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌菌株，37℃培養(yǎng)過夜。將菌落轉(zhuǎn)移至500ml搖瓶內(nèi)的100ml添加有15μg/ml氯霉素的BPX培養(yǎng)基中。
BPX培養(yǎng)基的組成馬鈴薯淀粉 100g/l大麥粉 50g/lBAN 5000 SKB0.1g/l酪蛋白酸鈉 10g/l大豆粉 20g/lNa2HP4，12H2O9g/lPluronicTM0.1g/l于37℃，以270rpm振蕩培養(yǎng)5天。
通過以4500rpm離心20-25分鐘，從發(fā)酵肉湯中除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后，過濾上清液，得到十分清亮的溶液。在UF-濾器(10000截留膜)上濃縮和沖洗濾液，將緩沖液變?yōu)?0mM醋酸鹽，pH5.5。將UF-濾液上樣于S-Sepharose F.F.，用含0.2M NaCl的相同緩沖液逐步洗脫。洗脫液對10mM Tris，pH9.0透析，然后上樣于Q-sepharoseF.F.，用超過6倍柱體積的0-0.3MNaCl線性梯度進(jìn)行洗脫。集中含有活性(通過Phadebas試驗(yàn)測定)的級分，將pH調(diào)節(jié)至pH7.5，用0.5％W/vol的活性炭處理5分鐘除去殘留的顏色。
穩(wěn)定性的測定使用相同的設(shè)置進(jìn)行所有的穩(wěn)定性試驗(yàn)。方法是在相關(guān)條件(1-4)下保溫酶。在0，5，10，15和30分鐘時取樣，用試驗(yàn)緩沖液(0.1M 50mM Britton緩沖液pH7.3)稀釋25倍(對所有取出的樣品都作相同的稀釋)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(pH7.3，37℃)使用Phadebas試驗(yàn)(Pharmacia)測定活性。
將保溫前(0分鐘)測定的活性用作參照(100％)。百分比的下降被計(jì)算為保溫時間的函數(shù)。表中顯示了保溫30分鐘之后殘留的活性。
活性測定-(KNU)在根據(jù)下列條件測定α-淀粉酶的Novo Nordisk’s標(biāo)準(zhǔn)方法中，1000個α-淀粉酶單位(1KNU)是每小時降解5.26g淀粉(Merck，Amylum Solubile，Erg.B6，批號9947275)所需的酶量底物 可溶性淀粉溶劑中的鈣含量0.0043M反應(yīng)時間 7-20分鐘溫度 37℃pH5.6NovoNordisk’s分析法(AF 9)的詳細(xì)描述即要即得。
比活的測定檢測α-淀粉酶的活性通過利用Phadebas片為底物的方法測定α-淀粉酶的活性。Phadebas片(PhadebasAmylase Test，由Pharmacia Diagnostic提供)含有交聯(lián)的不可溶的藍(lán)色淀粉聚合物，所述聚合物已與牛血清白蛋白和緩沖物質(zhì)混合，并被制成片狀。
對每一個單次測定而言，將1片Phadebas懸浮于含有5ml 50mMBritton-Robinson緩沖液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mMCaCl2，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至所需的值)的試管中。在所需溫度的水浴中進(jìn)行試驗(yàn)。用x ml 50mM Britton-Robinson緩沖液稀釋待檢測的α-淀粉酶。在5ml 50mM Britton-Robinson緩沖液中加入1ml這種α-淀粉酶溶液。通過α-淀粉酶水解淀粉，給出可溶性的藍(lán)色片段。用分光光度計(jì)測定所得藍(lán)色溶液在620nm處的光吸收值，該值是α-淀粉酶活性的函數(shù)。
重要的是，保溫10或15分鐘之后(檢測時間)測定的620nm光吸收值范圍是0.2至2.0個光吸收單位。在此光吸收值范圍內(nèi)，活性和光吸收值之間呈現(xiàn)線性關(guān)系(Lambert-Beer定律)。因此，必須調(diào)節(jié)酶的稀釋度以符合此標(biāo)準(zhǔn)。在特定的一套條件(溫度，pH，反應(yīng)時間，緩沖液濃度)下，1mg給定的α-淀粉酶可水解一定量的底物，并產(chǎn)生藍(lán)色。測定620nm處的顏色強(qiáng)度。在給定的一套條件下，測定的光吸收值與所述α-淀粉酶的比活(活性/mg純α-淀粉酶蛋白質(zhì))直接成比例。
實(shí)施例實(shí)施例1通過隨機(jī)誘變構(gòu)建Termamyl-樣LE174 α-淀粉酶變體，與親代酶相比，所述變體在低pH下具有改善的穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性對鈣離子的依賴性降低隨機(jī)誘變?yōu)榱烁纳朴H代LE174 α-淀粉酶變體在低pH和低鈣濃度下的穩(wěn)定性，在預(yù)先選定的區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)誘變所述區(qū)域是區(qū)域 殘基SERI A425-Y438SERII W411-L424SERIII G397-G410SERV T369-H382SERVII G310-F323SERIX L346-P359對6個區(qū)域中的每一個而言，在上述區(qū)域中的每一個核苷酸位置使用相同的突變率(主要成分97％，三種其余核苷酸中的每一種各1％共給出3％突變)，例如對A425密碼子的第1位而言97％C，1％A，1％T，1％G來合成隨機(jī)寡核苷酸。6個隨機(jī)的寡核苷酸和必要時使用的互補(bǔ)SOE輔助引物示于具有下列4種核苷酸分布的表1-6表1RSERI5′-GC GTT TTG CCG GCC GAC ATA 312 234 322 243 333 133444 233 423 242 212 211 243 343 CAA ACC TGA ATT-3′(SEQ ID NO15)表2RSERII5′-GC GTT TTG CCG GCC GAC ATA CAT TCG CTT TGC CCC ACCGGG TCC GTC TGT TAT TAA TGC CGC 311 133 241 122 243 113 341 432423 433 223 332 242 331 GCC GAC AAT GTC ATG GTG-3′(SEQ ID NO16)
表3RSERIII5′-GTC GCC TTC CCT TGT CCA 433 413 112 423 124 424 423411 121 123 124 324 243 233 GTA CGC ATA CTG TTT TCT-3′(SEQ IDNO17)輔助引物FSERIII5’-TGG ACA AGG GAA GGC GAC AG-3’(SEQ IDNO18)表4RSERV5-TAA GAT CGG TTC AAT TTT 424 222 311 443 144 112 223434 324 441 423 233 222 342 CCC GTA CAT ATC CCC GTA GAA-3(SEQID NO19)輔助引物FSERV5’-AAA ATT GAA CCG ATC TTA-3’(SEQ IDNO20)表5FSERVII5′-TT CCA TGC TGC ATC GAC ACA GGG AGG CGG CTA TGA TATGAG GAA ATT GCT GAA 344 213 442 342 223 311 431 233 422 411 123442 213 122 TGT CGA TAA CCA-3′(SEQ ID NO21)輔助引物RSERVII5’-TGT CGA TGC AGC ATG GAA-3’(SEQ IDNO22)表6FSERIX5′-GT CCA AAC ATG GTT TAA GCC 432 243 221 343 222 212232 313 114 441 123 244 121 333 TCA GGT TTT CTA CGG GGA-3′(SEQID NO23)輔助引物RSERIX5’-GGC TTA AAC CAT GTT TGG AC-3’(SEQ IDNO24)每個突變的核苷酸位置的核苷酸分布197％A，1％T，1％C，1％G297％T，1％A，1％C，1％G397％C，1％A，1％T，1％G
497％G，1％A，1％T，1％C構(gòu)建質(zhì)粒文庫使用引物1B5’-CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG-3’和表1所示的隨機(jī)寡核苷酸，或表2所示的隨機(jī)寡核苷酸，經(jīng)PCR擴(kuò)增兩個約1.4kb的片段。用EcoRV和EagI消化pSnK101和所述PCR片段達(dá)2小時。純化約3.6kb的載體片段和約1.3kb的PCR片段，連接過夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，然后進(jìn)一步按下文所述轉(zhuǎn)化至芽孢桿菌宿主菌株。使用表3-6所示的針對各個區(qū)域的隨機(jī)寡核苷酸(在圖2中通稱為aSER和bSER)，和覆蓋了LE174序列中的EcoRV和EagI位點(diǎn)的特定的地衣芽孢桿菌引物1B(SEQ ID NO26)和#635’-CTA TCT TTG AAC ATA AAT TGA AAC C-3’(SEQ ID NO27)，經(jīng)重疊延伸法(Horton等，基因，77(1989)，pp61-68)產(chǎn)生PCR-文庫-片段。圖2顯示了PCR策略。將PCR片段克隆至大腸桿菌/芽孢桿菌穿梭載體pSNK101(見材料和方法)，從而在大腸桿菌中誘變，并立即在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，以防止α-淀粉酶在大腸桿菌中的致死積累。在大腸桿菌中建立了克隆的PCR片段之后，消化質(zhì)粒，得到經(jīng)修飾的pUC19片段，物理連接啟動子和突變的Termamyl基因，在芽孢桿菌宿主中進(jìn)行表達(dá)。
篩選在上文“材料和方法”一節(jié)中所述的低pH濾膜試驗(yàn)中篩選6個文庫。
按實(shí)施例1所述制備下文實(shí)施例2表中所列的所有變體。
實(shí)施例2測定穩(wěn)定性通常，為了改善95℃-105℃時的穩(wěn)定性，在pH6.0-6.2，加入約40ppm游離鈣時進(jìn)行工業(yè)液化過程。制備本發(fā)明的變體，使之在1.pH低于pH6.2和/或2.游離鈣水平低于40ppm游離鈣時，穩(wěn)定性改善。
使用在酸性pH(pH5.0)，5ppm游離鈣的存在下測定穩(wěn)定性的試驗(yàn)測定穩(wěn)定性的增加。
在下列條件下保溫10μg變體0.1M醋酸鹽溶液，pH調(diào)節(jié)至pH5.0，含有5ppm鈣和5％w/w普通的玉米淀粉(不含鈣)。在95℃水浴中保溫30分鐘。
結(jié)果
在pH5.0，5ppm鈣，95℃保溫時增加的穩(wěn)定性
比活測定使用Phadebas試驗(yàn)(Pharmacia)(上述)將比活測定為活性/mg酶。使用本文材料和方法一節(jié)中所述的α-淀粉酶試驗(yàn)測定活性。
具有下列取代的LE174K176R+I201F+H205N所測比活為13400NU/mg具有下列取代的LE174K176R+I201F+H205N+E376K+A420R所測比活為14770NU/mg具有下列取代的LE174K176R+I201F+H205N+S417T+A420Q所測比活為16670NU/mg具有下列取代的LE174K176R+I201F+H205N+S356A+Y358F所測比活為15300NU/mg參考文獻(xiàn)Klein，C等，生物化學(xué)1992，31，8740-8746，Mizuno，H等，分子生物學(xué)雜志，(1993)，234，1282-1283，Chang，C等，分子生物學(xué)雜志，(1993)，229，235-238，Larson，S.B.，分子生物學(xué)雜志，(1994)，235，1560-1584，Lawson，C.L.，分子生物學(xué)雜志，(1994)，236，590-600，Qian，M等，分子生物學(xué)雜志，(1993)，231，785-799，Brady，R.L等，Acta Crystallogr.sect.B.47，527-535，Swift，H.J等，Acta Crystallogr.sect.B.47，535-544，A.Kadziola博士論文“通過X-射線晶體學(xué)研究的大麥α-淀粉酶及其與底物類似物抑制劑的復(fù)合物”，哥本哈根大學(xué)化學(xué)系，1993，MacGregor，E.A.，食品水膠體，1987，Vol.1，No.5-6，p.B.Diderichsen和L.Christiansen，從嗜熱脂肪芽孢桿菌中克隆產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶，F(xiàn)EMS Microbiol letters56pp.53-60(1988)，Hudson等，實(shí)用免疫學(xué)，第3版(1989)，Blackwell Scientific Publications，Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版，冷泉港，1989，S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，四面體通訊，22，1981，pp.1859-1869，Matthes等，The EMBO J.3，1984，pp.801-805，R.K.Saiki等，科學(xué)，239，1988，pp.487-491，Morinaga等，(1984，生物技術(shù)2646-639)，Nelson和Long，分析生物化學(xué)，180，1989，pp.147-151，Hunkapiller等，1984，自然，310105-111，R.Higuchi，B.Krummel和R.K.Saiki(1988)，體外制備和特異性誘變DNA片段的一般方法研究蛋白質(zhì)和DNA的相互作用，核酸研究，167351-7367，Dubnau等，1971，分子生物學(xué)雜志，56，pp.209-221，Gryczan等，1978，細(xì)菌學(xué)雜志，134，pp.318-329，S.D.Erlich，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.74，pp.1680-1682，Boel等，1990，生物化學(xué)，29，pp.6244-6249。
權(quán)利要求
1.親代Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，與親代α-淀粉酶相比，所述α-淀粉酶變體中，表面有一個或多個暴露于溶劑的氨基酸殘基發(fā)生變化以使該α-淀粉酶的總體親水性增加和/或表面上所述暴露于溶劑的氨基酸殘基的側(cè)鏈中甲基總數(shù)增加。
2.權(quán)利要求1的變體，其中向內(nèi)彎曲的凹面上的一個或多個暴露于溶劑的氨基酸殘基變?yōu)楦呤杷缘陌被釟埢?br> 3.權(quán)利要求1的變體，其中凸面上的一個或多個暴露于溶劑的氨基酸殘基經(jīng)改變后增加了側(cè)鏈中的甲基數(shù)目。
4.親代Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，該變體在選自下列的一個或多個位置處具有變化E376，S417，A420，S356，Y358；其中(a)所述變化各為(i)在占用上述位置的氨基酸的下游插入一個氨基酸，(ii)缺失占用上述位置的氨基酸，或(iii)用不同的氨基酸取代占用上述位置的氨基酸，(b)所述變體具有α-淀粉酶活性，和(c)每個位置對應(yīng)于具有SEQ ID NO4氨基酸序列的親代Termamyl-樣α-淀粉酶的氨基酸序列位置。
5.權(quán)利要求4的變體，所述變體的一個或多個暴露于溶劑的氨基酸殘基具有如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所定義的變化。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的變體，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶得自地衣芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株，芽孢桿菌菌種NCIB 12289，NCIB 12512，NCIB 12513或DSM 9375。
7.權(quán)利要求6的變體，其中親代α-淀粉酶得自地衣芽孢桿菌菌株ATCC27811。
8.權(quán)利要求1-6的變體，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶是選自SEQ IDNO1，2，3，4，5，6，7和8所示的任何α-淀粉酶。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的變體，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶具有的氨基酸序列與SEQ ID NO4的同一性程度至少為65％，優(yōu)選為70％，更優(yōu)選至少為80％，甚至更優(yōu)選至少約為90％，甚至更優(yōu)選至少為95％，甚至更優(yōu)選至少為97％，甚至更優(yōu)選至少為99％。
10.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的變體，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶由能在中度嚴(yán)緊，優(yōu)選為高度嚴(yán)緊的條件下與SEQ ID NO12的核酸序列雜交的核酸序列編碼。
11.權(quán)利要求1-10的變體，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶是SEQ IDNO4所示地衣芽孢桿菌α-淀粉酶和SEQ ID NO5所示解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的雜合體。
12.權(quán)利要求11的變體，其中親代雜合Termamyl-樣α-淀粉酶是LE174。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的變體，其中親代α-淀粉酶還在下列的一個或多個位置處具有突變K176，I201和H205(使用SEQ ID NO4的編號)。
14.權(quán)利要求13的變體，其中親代α-淀粉酶具有一個或多個下列取代K176R，I201F和/或H205N(使用SEQ ID NO4的編號)。
15.權(quán)利要求14的變體，其中親代α-淀粉酶具有下列取代K176R+I201F＋H205N(使用SEQ ID NO4的編號)。
16.權(quán)利要求1至15的變體，其中相對于親代α-淀粉酶而言，所述變體在低于7.0的pH(酸性pH)和/或低鈣濃度和/或95-160℃的溫度范圍(高溫)下具有增加的穩(wěn)定性。
17.權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的變體，所述變體具有一個或多個下列取代E376K，S417T，A420Q，R，S356A，Y358F。
18.DNA構(gòu)建體，其含有編碼權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的α-淀粉酶變體的DNA序列。
19.重組表達(dá)載體，其攜有權(quán)利要求18的DNA構(gòu)建體。
20.被權(quán)利要求18的DNA構(gòu)建體或權(quán)利要求19的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20的細(xì)胞，其為微生物。
22.權(quán)利要求21的細(xì)胞，其為細(xì)菌或真菌。
23.權(quán)利要求22的細(xì)胞，其為革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。
24.去污劑添加劑，其含有權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的α-淀粉酶變體，所述變體任選為不成粉末的顆粒，穩(wěn)定化的液體或被保護(hù)的酶的形式。
25.權(quán)利要求24的去污劑添加劑，其含有0.02-200mg酶蛋白質(zhì)/g添加劑。
26.權(quán)利要求24或25的去污劑添加劑，其中還含有另一種酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過氧化物酶，另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
27.去污劑組合物，其含有權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的α-淀粉酶變體。
28.權(quán)利要求27的去污劑組合物，其中還含有另一種酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過氧化物酶，另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
29.手用或機(jī)用洗碟去污劑組合物，其含有權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的α-淀粉酶變體。
30.權(quán)利要求29的洗碟去污劑組合物，其中還含有另一種酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過氧化物酶，另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
31.手用或機(jī)用洗衣組合物，其含有權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的α-淀粉酶變體。
32.權(quán)利要求31的洗衣組合物，其中還含有另一種酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過氧化物酶，淀粉分解酶和/或纖維素酶。
33.組合物，其含有(i)具有SEQ ID NO4所示序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶與得自具有SEQ ID NO3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(作為親代Termamyl-樣α-淀粉酶)的權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的一種或多種變體的混合物；或(ii)具有SEQ ID NO3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶與得自一種或多種其它親代Termamyl-樣α-淀粉酶的權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的一種或多種變體的混合物；或(iii)得自具有SEQ ID NO3所示序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(作為親代Termamyl-樣α-淀粉酶)的權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的一種或多種變體與得自一種或多種其它親代Termamyl-樣α-淀粉酶的本發(fā)明的一種或多種變體的混合物。
34.含有權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的變體的組合物，其中親代α-淀粉酶是含有SEQ ID NO5所示解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的N-末端部分和SEQ IDNO4所示地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的C-末端部分的雜合α-淀粉酶。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中親代雜合Termamyl-樣α-淀粉酶是LE174。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶是在一個或多個下列位置具有改變的LE174K176，I201和H205。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中親代Termamyl-樣α-淀粉酶是在一個或多個下列取代的LE174K176R，I201F和H205N。
38.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的α-淀粉酶變體或權(quán)利要求33至37的組合物用于洗滌和/或洗碟的用途。
39.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的α-淀粉酶變體或權(quán)利要求33至37的組合物用于織物脫漿的用途。
40.權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)的α-淀粉酶變體或權(quán)利要求33至37的組合物用于淀粉液化的用途。
41.產(chǎn)生親代Termamyl-樣α-淀粉酶的變體的方法，其中變體相對于親代而言，在高溫下表現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性，所述方法包括(a)對編碼親代Termamyl-樣α-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變，(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中得到的突變DNA序列，和(c)篩選表達(dá)突變α-淀粉酶的宿主細(xì)胞，相對于親代Termamyl-樣α-淀粉酶而言，所述變體在高溫下具有增加的穩(wěn)定性。
全文摘要
本發(fā)明涉及親代Termamyl－樣α－淀粉酶的變體,該變體在2,3,4,5,或6個區(qū)域/位置中含有突變。所述變體在高溫下(相對于其親代)具有增加的穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明α－淀粉酶變體之DNA序列的DNA構(gòu)建體,攜帶本發(fā)明DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體,用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,本發(fā)明的α－淀粉酶變體在洗滌和/或洗碟、織物退漿、淀粉液化方面的用途,含有本發(fā)明的α－淀粉酶變體的去污劑添加劑,含有本發(fā)明的α－淀粉酶變體的手洗或機(jī)洗洗碟劑組合物,產(chǎn)生親代Termamyl－樣α－淀粉酶的變體的方法,所述變體顯示增加。
文檔編號C11D3/386GK1333821SQ99815544
公開日2002年1月30日 申請日期1999年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月16日
發(fā)明者阿倫·斯文德森, 索倫·謝魯爾夫, 亨里克·比斯加德弗蘭岑, 卡斯滕·安德森 申請人:諾維信公司