專利名稱：：α-淀粉酶變體的制作方法a-淀粉酶變體發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及，特別是親本Termamyl-樣a-淀粉酶的新變體，尤其是顯示改變的特性的變體，特別是改變了淀粉親和力(相對(duì)于親本)，對(duì)于所述變體的應(yīng)用，特別是工業(yè)淀粉處理(processing)(如淀粉液化或糖化)，這是有利的。發(fā)明背景oc-淀粉酶(a-l,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2丄1)組成催化淀粉和其它直鏈及支鏈1,4-葡糖苷寡糖和多糖水解的一組酶。有大量的專利和科學(xué)文獻(xiàn)涉及此類(lèi)在工業(yè)上十分重要的酵。許多a-淀粉酶，例如Te腿myl-樣a-淀粉酶可了解自，如WO90/11352、WO95/10603、WO95/26397、WO96/23873、WO96/23874和WO97/41213。在最近涉及a-淀粉酶的公開(kāi)內(nèi)容中，WO96/23874提供了稱為BA2的Termamyl-樣a-淀粉酶的三維X-射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，BA2由包含本文SEQIDNO:6中所示氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌CS.w^/o/z'，e/ac/era)a-淀粉酶的300個(gè)N-末端氨基酸殘基，以及包含本文SEQIDNO:4中所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌(B.//c/7em/0rm&)a-淀粉酶的C-末端的氨基酸301-483(后者可以商品名TermamyFM購(gòu)得)組成，因此與工業(yè)上重要的芽孢桿菌a-淀粉酶(其在本文中包括在術(shù)語(yǔ)"Termamyl-樣a-淀粉酶"的含義中，尤其包括地衣芽孑包桿菌，解淀粉芽孢桿菌，和嗜熱脂肪芽孢桿菌(及5^^0^2￡/7^^/2//1)01-淀粉酶)密切相關(guān)。WO96/23874進(jìn)一步描述了在對(duì)親本Termamyl-樣a-淀4分酶的結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)相對(duì)于親本顯示改變的特性的親本Termamyl-樣a-淀粉酶變體的方法學(xué)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及Termamyl-樣a-淀粉酶的新的a-淀粉分解變體(突變體)，特別是顯示出改變的淀粉親和力(相對(duì)于親本)的變體，所述改變?cè)诘矸鄣墓I(yè)處理方面(淀粉液化，糖化等等)是有利的。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與親本Termamyl-樣a-淀粉酶相比，具有改變的特性、特別是改變的淀粉親和力(a伍nity)的變體改善了淀粉的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼本發(fā)明變體的DNA構(gòu)建體，包含本發(fā)明變體的組合物，制備本發(fā)明變體的方法，以及本發(fā)明變體和組合物單獨(dú)或與其它a-淀粉分解酶(alpha-amylolyticenzymes)聯(lián)合在各種工業(yè)處理中的應(yīng)用，如淀粉液化，在洗滌劑組合物中，例如洗衣、清洗碗碟(dishwashing)和硬表面清洗組合物；乙醇生產(chǎn)，例如燃料，酒類(lèi)和工業(yè)乙醇生產(chǎn)；紡織品(textile)、織物(fabric)或衣物的退漿等。命名法在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，使用了常規(guī)的單字母和三字母編碼表示氨基酸殘基。為便于引用，本發(fā)明的a-淀粉酶變體采用下列命名法描述原氨基酸位置取代的氨基酸依照該命名法，例如用天冬酰胺取代第30位的丙氨酸表示為Ala30Asn或A3ON在相同位置處丙氨酸的缺失表示為Ala30*或A30*以及額外的氨基酸殘基例如賴氨酸的插入表示為Ala30AlaLys或A3OAK缺失連續(xù)的一段氨基酸殘基，例如氨基酸殘基30-33,表示為(30-33)*或A(A30-N33)。在特定的a-淀粉酶相對(duì)于其它a-淀粉酶而言含有"缺失"，并在該位置具有插入，如在第36位插入天冬氨酸的情況下，表示為*36Asp或*36D多個(gè)突變由加號(hào)隔開(kāi)，即Ala30Asn+Glu34Ser或A30N+E34S分別表示在第30和34位，天冬酰胺和絲氨酸取代了丙氨酸和谷氨酸。當(dāng)在給定位置插入一個(gè)或多個(gè)可選擇的氨基酸殘基時(shí)，其表示為A30N,E或A3ON或A30E此外，當(dāng)本文鑒定出適于修飾的位置，而沒(méi)有暗示任何具體的修飾時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為可用任一氨基酸殘基取代該位置存在的氨基酸殘基。因此，例如，當(dāng)提及修飾第30位的丙氨酸，但未具體說(shuō)明時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解為丙氨酸可缺失，或可用任何其他氨基酸，即下列任一氨基酸來(lái)取代R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。此外，"A30X"表示任何一種下列取代A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y或A30V;或簡(jiǎn)言之A30R,N,D,C,Q，E，G，H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y，V。如果使用這種編號(hào)方式的親本酶已具有建議在該位置被取代的所述氨基酸殘基，在例如N或V之一存在于野生型中的情況下，使用下列命名法"X30N"或"X30N,V"。因此，其表示其他相應(yīng)的親本酶在第30位被"Asn"或"Val"取代。氨基酸殘基特性帶電氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His帶負(fù)電荷氨基酸(帶有最多負(fù)電荷的殘基列于最前)Asp、Glu帶正電荷氨基酸(帶有最多正電荷的殘基列于最前)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Aa、Val、Leu、IJe、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro疏水氨基酸殘基(具有最大疏水性的殘基列于最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp親水氨基酸(具有最大親水性的殘基列于最后)Thr、Ser、Cys、Gln、Asn發(fā)明詳述Termamyl-樣a-淀粉酶眾所周知，通過(guò)芽孢桿菌CBac///^w.)產(chǎn)生的多種a-淀粉酶在氨基酸水平上是高度同源的。例如，已發(fā)現(xiàn)包含SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶(商品名為T(mén)ermamylTM)與包含SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌ot-淀粉酶約89%同源，與包含SEQIDNO:8中所示的氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶約79。/。同源。其他同源的a-淀粉酶包括來(lái)源于芽孢桿菌菌抹NCIB12289、NCIB12512、NCIB12513或DSM9375的a-淀粉酶，皆詳述于WO95/26397，以及Tsul(amoto等,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,151(1988),pp.25-31所描述的#707a-淀4分酶。更多同源的a-淀粉酶包括由EP0252666中所述的地衣芽孢桿菌菌抹(ATCC27811)所產(chǎn)生的a-淀粉酶，以及WO91/00353和WO94/18314中鑒定的a-淀粉酶。其他商用Termamyl-樣a-淀粉酶包括在以下列商品名出售的產(chǎn)品'中OptithermTM和TakathermTM(可購(gòu)自Solvay);MaxamyFM(可購(gòu)自Gist-brocades/Genencor)、SpezymAA丁m和SpezymeDeltaAA頂(可購(gòu)自Ge-nencor)和Keistase丁m(可購(gòu)自Daiwa)、PurastarST5000E、PURASTRATMHPAML(來(lái)自Ge腦corlnt.)。由于發(fā)現(xiàn)這些a-淀粉酶之間基本上同源，因此它們被認(rèn)為屬于相同一類(lèi)的a-淀粉酶，即"Termamyl-樣a-淀粉酶"。因此，在本發(fā)明上下文中，術(shù)語(yǔ)"Termamyl-樣a-淀粉酶"意在指示在氨基酸水平上具有與Termamyl,即具有本文SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶，基本上(substantial)同源的a-淀粉酶。換言之，Termamyl-樣a-淀粉酶是具有本文SEQIDNO:2、4或6中所示的氨基酸序列,和WO95/26397或Tsukamoto等，1988中的SEQIDNO:1或2所示的氨基酸序列的a-淀粉酶，或者是i)顯示與至少一種上述氨基酸序列至少60%,優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,甚至更優(yōu)選至少80%，尤其是至少85%,尤其優(yōu)選至少90%，甚至尤其更優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少為97%,更優(yōu)選至少99%同源性的a-淀粉酶，和/或ii)顯示與針對(duì)至少一種上述a-淀粉酶產(chǎn)生的抗體免疫交叉反應(yīng)性的a-淀粉酶，和/或iii)由與編碼上述特定a-淀粉酶的DNA序列雜交的DNA序列編碼的a-淀粉酶，所述編碼特定a-淀粉酶的DNA序列分別示于本申請(qǐng)的SEQIDNO:1、3和5，以及WO95/26397的SEQIDNOS:4和5。同源性(同一性)同源性可測(cè)定為兩條序列之間的同一性水平，指示第一序列與第二序列的偏差(derivation)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序例如GCG程序包中提供的GAP(上述的)適當(dāng)?shù)販y(cè)定同源性。因此，可使用具有用于同一性的默認(rèn)得分矩陣(defaultscoringmatrix)和下列默認(rèn)參數(shù)的GapGCGv8:用于核酸序列比較，分別為缺口(GAP)產(chǎn)生罰分5.0和缺口延伸罰分0.3,以及用于蛋白序列比較，分別為缺口(GAP)產(chǎn)生罰分3.0和缺口延伸罰分0.1。GAP使用了Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.48,p.443-453的方法進(jìn)4亍比對(duì)和計(jì)算同一性?？墒褂肨ermamyl和Termamyl-樣a-淀粉酶之間的結(jié)構(gòu)對(duì)比來(lái)鑒定其它Termamyl-樣a-淀粉酶中等同的/相應(yīng)的位置。一種獲得所述結(jié)構(gòu)對(duì)比的方法是使用GCG程序包中的PileUp程序，該程序使用默認(rèn)的缺口罰分值，即缺口產(chǎn)生罰分3.0和缺口延伸罰分0.1。其它結(jié)構(gòu)對(duì)比方法包括疏水性聚類(lèi)分析(Gaboriaud等，(1987),FEBSLETTERS224，pp.149-155)和反向穿梭法(reversethreading)(Huber,T;Torda,AE,PROTEINSCIENCEVol.7,No,1pp.142-149(1998))。a-淀粉酶的特性ii)，即可使用針對(duì)相關(guān)的Termamyl-樣a-淀粉酶的至少一個(gè)表位產(chǎn)生的、或與之反應(yīng)的抗體測(cè)定免疫交叉反應(yīng)性?？梢允菃慰寺』蚨嗫寺〉乃隹贵w可用本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，如Hudson等,PracticalImmunology,第3版(1989),BlackwellScientificPublications中所述的。免疫交叉反應(yīng)性可使用本領(lǐng)域已知測(cè)定法來(lái)測(cè)定，如蛋白質(zhì)印跡法或放射免疫擴(kuò)散，如Hudson等，1989所述。在這方面，在分別具有氨基酸序列SEQIDNOS:2、4、6或8的a-淀粉酶之間發(fā)現(xiàn)了免疫交叉反應(yīng)性。雜交可以在所述a-淀粉酶的完整或部分核苷酸或氨基酸序列的基礎(chǔ)上適當(dāng)?shù)刂苽涔押塑账崽结?，用于鑒定符合上述特性iii)的Termamyl-樣a-淀粉酶。用于檢測(cè)雜交的合適條件包括在5xSSC中預(yù)浸泡，并在20%曱酰胺、5xDenhardt's溶液、50mM磷酸鈉，pH6.8和50mg變性的經(jīng)超聲處理的小牛胸腺DNA溶液中于40。C預(yù)雜交1小時(shí)，接著于40。C，在補(bǔ)充有100mMATP的相同溶液中雜交18小時(shí)，然后于40。C在2xSSC,0.2%SDS中洗滌濾月莫三次，每次30分鐘(低嚴(yán)謹(jǐn)性)，優(yōu)選于50。C(中等嚴(yán)謹(jǐn)性)，更優(yōu)選于65。C(高嚴(yán)謹(jǐn)性)，甚至更優(yōu)選于75。C(非常高嚴(yán)謹(jǐn)性)。有關(guān)雜交方法的更多細(xì)節(jié)可見(jiàn)于Sambrook等，Molecular—Cloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989中。在本發(fā)明上下文中，"來(lái)源于(derivedfrom)，，并不意在只表示由所述生物菌抹產(chǎn)生的或可由所述生物菌抹產(chǎn)生的a-淀粉酶，還表示由分離自這樣的菌抹的DNA序列編碼的a-淀粉酶以及由所述DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物產(chǎn)生的a-淀粉酶。最后，該術(shù)語(yǔ)還意在表示由合成的和/或cDNA來(lái)源的DNA序列編碼的，并具有所述a-淀粉酶的鑒定特征的a-淀粉酶。該術(shù)語(yǔ)還意在表示親本a-淀粉酶可以是天然存在的a-淀粉酶的變體，即天然存在的a-淀粉酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的修飾(插入、取代、缺失)所得到的變體。親本雜合a-淀粉酶親本a-淀粉酶可以是雜合a-淀粉酶，即包含來(lái)源于至少兩種a-淀粉酶的部分氨基酸序列組合的a-淀粉酶。親本雜合a-淀粉酶可以是在氨基酸同源性和/或免疫交叉反應(yīng)性和/或DNA雜交(如上所定義的)的基礎(chǔ)上可被確定為屬于Termamyl-樣a-淀粉酶家族的一種雜合a-淀粉酶。在該情況下，雜合a-淀粉酶一般由Termamyl-樣a-淀粉酶的至少一個(gè)部分和一種或多種其它a-淀粉酶的部分組成，所述其它a-淀粉酶選自微生物(細(xì)菌或真菌)和/或哺乳動(dòng)物來(lái)源的Termamyl-樣a-淀粉酶或非-Termamyl-樣a-淀粉酶。因此，親本雜合a-淀粉酶可包含來(lái)源于至少兩種Termamyl-樣a-淀粉酶，或來(lái)源于至少一種Termamyl-樣和至少一種非-Termamyl-樣細(xì)菌a-淀粉酶，或來(lái)源于至少一種Termamyl-樣和至少一種真菌a-淀粉酶的部分氨基酸序列的組合。部分氨基酸序列所來(lái)源的Termamyl-樣a-淀粉酶可以是例如本文所提及的任何那些特定的Termamyl-樣a-淀粉酶。例如，親本a-淀粉酶可包含來(lái)源于地衣芽孢桿菌菌4朱的a-淀粉酶的C-末端部分，和來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌菌林或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌抹的a-淀粉酶的N-末端部分。例如，親本a-淀粉酶可包含地衣芽3包桿菌a-淀粉酶的C-末端部分的至少430個(gè)氨基酸殘基，也可包含如a)相應(yīng)于具有SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的37個(gè)N端氨基酸殘基的氨基酸區(qū)段(segment)，和相應(yīng)于具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的445個(gè)C末端氨基酸殘基的氨基酸區(qū)段，或b)相應(yīng)于具有SEQIDNO:8中所示的氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶的68個(gè)N-末端氨基酸殘基的氨基酸區(qū)段，和相應(yīng)于具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的415個(gè)C-末端氨基酸殘基的氨基酸區(qū)段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親本Termamyl-樣a-淀粉酶是與SEQIDNO:4中所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶相同的雜合Termamyl-樣a-淀4分酶，不同之處在于(成熟蛋白的)N-末端的35個(gè)氨基酸殘基為SEQIDNO:6中所示的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶(BAN)的成熟蛋白的N-末端的33個(gè)氨基酸殘基所取代。上述雜合Termamyl-樣a-淀粉酶可進(jìn)一步具有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的編號(hào))，稱為L(zhǎng)EI74。另一個(gè)優(yōu)選的親本雜合a-淀粉酶是SEQIDNO:2中所示的LE429。非-Termamyl-樣a-淀粉酶可以是例如真菌a-淀粉酶、哺乳動(dòng)物或植物a-淀粉酶或細(xì)菌a-淀粉酶(不同于Termamyl-樣a-淀粉酶)。這樣的a-淀粉酶的具體例子包括米曲霉(A^ergW^oo;zae)TAKAa-淀粉酶、黑曲霉(Am'ger)酸性a-淀粉酶、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶、豬胰腺a-淀粉酶和大麥a-淀粉酶。所有的這些a-淀粉酶都具有已闡明的，與本文所述典型的Termamyl-樣a-淀粉酶的結(jié)構(gòu)明顯不同的結(jié)構(gòu)。上述真菌a-淀粉酶，即來(lái)源于黑曲霉和米曲霉的a-淀粉酶在氨基酸水平上高度同源，一般認(rèn)為屬于相同的a-淀粉酶家族。來(lái)源于米曲霉的真菌a-淀粉酶可以商品名FungamylTM從市場(chǎng)上買(mǎi)到。此外，當(dāng)提及Termamyl-樣a-淀粉酶的特定變體(本發(fā)明的變體)時(shí)，所提及的變體是通過(guò)常規(guī)的方法，修飾(如缺失或取代)特定Termamyl-樣a-淀粉酶的氨基酸序列中的特定氨基酸殘基而獲得的，應(yīng)理解在等同位置(由各個(gè)氨基酸序列之間可能達(dá)到最好的氨基酸序列對(duì)比所測(cè)定的)修飾得到的另一個(gè)Termamyl-樣a-淀粉酶的變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明變體的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是來(lái)源于地衣芽孢桿菌a-淀粉酶(作為親本Termamyl-樣a-淀粉酶)的變體，如上述a-淀粉酶中的一個(gè)的變體，例如具有SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的變體。本發(fā)明變體的構(gòu)建可通過(guò)在有助于生產(chǎn)變體的條件下，培養(yǎng)包含編碼所述變體的DNA序列的微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)變體的構(gòu)建。所述變體可隨后從所得到的培養(yǎng)物中回收。這進(jìn)一步詳述于下。改變的特性改變(相對(duì)于親本Termamyl-樣a-淀粉酶的特性)之間的關(guān)系。本發(fā)明的第一方面涉及具有a-淀粉酶活性并包含R437W取代的親本Termamyl-樣a-淀粉酶的變體，其中所述位置相應(yīng)于具有SEQIDNO:4氨基酸序列的親本Termamyl-樣a-淀粉酶的氨基酸序列的位置。在淀粉液化過(guò)程以及其中涉及a-淀粉酶的其他過(guò)程中，增加a-淀粉酶的淀粉親和力并由此增加如生(mw)淀粉水解(RSH)是有利的。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過(guò)在僅具有兩個(gè)色氨酸之一的ot-淀粉酶的C-末端區(qū)域?qū)肷彼釟埢?，由此產(chǎn)生一對(duì)色氨酸，形成推定的淀粉結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其在吸附至淀粉中起主要作用，因而對(duì)于高的淀粉轉(zhuǎn)化率是關(guān)鍵性的。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是不僅以下特別提及的Termamyl-樣a-淀粉酶可被使用。而且其他商用Termamyl-樣a-淀粉酶也可使用。這樣的a-淀粉酶的不太詳細(xì)的列表如下EP0252666(ATCC27811)中所述的地衣芽孢桿菌菌抹產(chǎn)生的a-淀粉酶，和WO91/00353和WO94/18314中鑒定的a-淀粉酶。其他商用Termamyl-樣地衣芽孢桿菌a-淀粉酶是OptithermTM和TakathermTM(可購(gòu)自Solvay)、MaxamylTM(可購(gòu)自Gist-brocades/Genencor)、SpezymAATMSpezymeDeltaAATM(可購(gòu)自Genencor)和Keistase((可購(gòu)自Daiwa)。但是，只有在C-末端不具有兩個(gè)色氨酸殘基的Termamyl-樣oc-淀粉酶能合適地用作為骨架用于制備本發(fā)明變體。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親本Termamyl-樣a-淀粉酶是SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或它們的變體的a-淀粉酶。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述變體包含一個(gè)或多個(gè)下列額外的突變R176*、G177*、N190F、E469N，更特別是R176*+G177*+N190F，還特別是R176承+G177氺+N190F+E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，親本Termamyl-樣a-淀粉酶是SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的雜合a-淀粉酶。特別是，所述親本雜合Termamyl-樣a-淀粉酶可以是包含SEQIDNO:4中所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的445個(gè)C-末端氨基酸殘基和SEQIDNO:6中所示的來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的成熟的a-淀粉酶的37個(gè)N-末端氨基酸殘基的雜合a-淀粉酶，其可合適地進(jìn)一步具有下列突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的編號(hào))。該雜合體稱為L(zhǎng)E174。LE174雜合體可以與更進(jìn)一步的突變I201F結(jié)合以形成具有以下突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(使用SEQIDNO:4的編號(hào))的親本雜合Termamyl-樣a-淀粉酶。該雜合變體如SEQIDNO:2所示，并被用于以下實(shí)施例中，稱為L(zhǎng)E429。當(dāng)通過(guò)結(jié)合LE174與突變I201F(SEQIDNO:4編號(hào))，使用LE429(示于SEQIDNO:2)作為主鏈時(shí)(即作為親本Termamyl-樣a-淀粉酶)，突變/改變，特別是取代、缺失和插入，根據(jù)本發(fā)明可在一個(gè)或多個(gè)以下位置上進(jìn)行R176*、G177*、E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，變體包含額外的突變E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。在一個(gè)更特別的實(shí)施方案中，變體包含額外的突變R1764+G177f+E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。在本發(fā)明變體中的常規(guī)突變除以上概述的那些修飾之外，最好讓本發(fā)明的變體包含一個(gè)或多個(gè)修飾。制備a-淀粉酶變體的方法本領(lǐng)域已知幾種將突變導(dǎo)入基因中的方法。在對(duì)編碼a-淀粉酶的DNA序列克隆的簡(jiǎn)短討論之后，將要討論在編碼a-淀粉酶的序列中的特定位點(diǎn)處產(chǎn)生突變的方法。克隆編碼a-淀粉酶的DNA序列可使用本領(lǐng)域眾所周知的多種方法，從產(chǎn)生所述a-淀粉酶的任何細(xì)胞或微生物中分離出編碼親本a-淀粉酶的DNA序列。首先，應(yīng)使用源自產(chǎn)生待研究之a(chǎn)-淀粉酶的生物的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。然后，如果a-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的經(jīng)標(biāo)記的寡核芬酸探針，并使用該探針從制備自所述生物的基因組文庫(kù)中鑒定編碼a-淀粉酶的克隆?；蛘撸蓪⒑信c已知a-淀粉酶基因同源之序列的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針用作探針，使用較低嚴(yán)謹(jǐn)性的雜交和洗滌條件鑒定編碼a-淀粉酶的克隆。另一種筌定編碼a-淀粉酶的克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達(dá)載體，例如質(zhì)粒，用所得到的基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化a-淀粉酶-陰性細(xì)菌，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪于含有a-淀粉酶底物的瓊脂上，由此使得表達(dá)a-淀粉酶的克隆得以鑒定?；蛘撸赏ㄟ^(guò)已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備編碼酶的DNA序列，所述方法例如S丄.Beaucage和M.H.Camthers(1981)所述的膦酰胺(phosphoroamidite)法或Matthes等(1984)所述的方法。在膦酰胺法中，可在例如自動(dòng)化的DNA合成儀中合成寡核香酸，對(duì)其進(jìn)行純化、退火、連接并克隆至適當(dāng)?shù)妮d體中。最終，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，DNA序列可以是通過(guò)連接合成的，基因組的或cDNA來(lái)源的片段(適當(dāng)時(shí)是對(duì)應(yīng)于完整DNA序列的多個(gè)部分的片段)而制備的混合的基因組和合成來(lái)源，混合的合成和cDNA來(lái)源或混合的基因組和cDNA來(lái)源的DNA序列。也可以使用特定的引物，例如US4，683，202或位點(diǎn)定向誘變一旦分離出編碼a-淀粉酶的DNA序列，并鑒定出期望的突變位點(diǎn)，可使用合成的寡核苷酸導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸含有側(cè)接于期望的突變位點(diǎn)的核苷酸序列；在寡核苷酸合成期間插入突變的核苷酸。在一種特定的方法中，在攜有a-淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生橋連a-淀粉酶-編碼序列的DNA單鏈缺口。然后，使含有期望的突變的合成核香酸與該單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)補(bǔ)平其余缺口，并使用T4連接酶連接構(gòu)建體。該方法的一個(gè)特定的例子描述于Morinaga等(1984)。US4,760,025公開(kāi)了通過(guò)對(duì)盒進(jìn)行微小的改變而導(dǎo)入編碼多個(gè)突變的寡核普酸。但是，由于可導(dǎo)入不同長(zhǎng)度的多個(gè)寡核苷酸，因此通過(guò)Morinaga法可在任何一次導(dǎo)入甚至更多個(gè)的突變。Nelson和Long(1989)描述了另一種將突變導(dǎo)入編碼a-淀粉酶的DNA序列的方法。所述方法包括以3個(gè)步驟產(chǎn)生含有期望的突變的PCR片段，所通過(guò)用限制性內(nèi)切核酸酶裂解，可從PCR-產(chǎn)生的片段中分離出攜有突變的DNA片段，并將該片段重新插入表達(dá)質(zhì)粒中。隨機(jī)請(qǐng)變可在翻譯為本文所示氨基酸序列的基因的至少3個(gè)部分中，或在整個(gè)基因內(nèi)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行隨機(jī)誘變，所述誘變可以是定域的(localised)或區(qū)域-特異性的隨機(jī)誘變。利用本領(lǐng)域已知的任何方法，可以方便地對(duì)編碼親本a-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變。相對(duì)于上文，本發(fā)明的另一方面涉及一種產(chǎn)生親本a-淀粉酶的變體的方法，例如，其中相對(duì)于親本，變體顯示改變的淀粉親和力，所述方法包括(a)對(duì)編碼親本a-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)i秀變，(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中獲得的突變的DNA序列，和(c)篩選表達(dá)相對(duì)于親本a-淀粉酶具有改變的淀粉親和力的a-淀粉酶變體的宿主細(xì)月包。適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑，通過(guò)使用適當(dāng)?shù)墓押塑账?，或通過(guò)對(duì)DNA序列進(jìn)行PCR以產(chǎn)生誘變來(lái)進(jìn)行隨機(jī)誘變。此外，可使用這些謙變劑的任何組合來(lái)進(jìn)行隨機(jī)誘變。謙變劑可以是例如誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換、顛換(transversion)、倒位、顛倒(scrambling)、缺失和/或插入的試劑。適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-曱基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉(sodiumbisulphite)、曱酸和核苷酸類(lèi)似物。當(dāng)使用這樣的誘變劑時(shí)，一般通過(guò)在適于發(fā)生誘變的條件下，在選定誘變劑的存在下溫育要被誘變的編碼親本酶的DNA序列來(lái)進(jìn)行誘變，然后篩選具有期望的特性的突變DNA。當(dāng)利用寡核苷酸進(jìn)行誘變時(shí)，在合成要被改變位置處的寡核苷酸的過(guò)程中，寡核苷酸可以摻雜或摻入有3種非親本核苷酸。摻雜或摻入的目的是避免不需要的氨基酸的密碼子?？赏ㄟ^(guò)任何公開(kāi)的技術(shù)如使用PCR、LCR或在適當(dāng)時(shí)使用任何DNA聚合酶和連接酶，將摻雜(doped)或摻入(spiked)的寡核苷酸摻入編碼a-淀粉酶的DNA。優(yōu)選地，使用"不變的隨機(jī)摻雜"進(jìn)行摻雜，其中在每個(gè)位置中的野生型和突變的百分比是預(yù)先確定的。此外，摻雜可以導(dǎo)致優(yōu)先導(dǎo)入某些核苷酸，從而優(yōu)先導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)特定的氨基酸殘基。例如，進(jìn)行摻雜可使得在每個(gè)位置中導(dǎo)入90%野生型和10%突變。選擇摻雜方案的其它考慮是基于遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)的限制?？墒褂肈OPE程序制訂摻雜方案，所述程序可特別地確保避免導(dǎo)入終止密碼子。當(dāng)使用PCR-產(chǎn)生的誘變時(shí)，可在增加核苷酸錯(cuò)誤摻入的條件下，對(duì)經(jīng)化學(xué)處理或未經(jīng)處理的編碼親本a-淀粉酶的基因進(jìn)行PCR(Deshler1992;Leung等，Technique,VoU,1989,pp.11-15)。可使用大腸桿菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133,1974，pp.179-191),釀酒酵母或任何其它微生物的增變抹對(duì)編碼a-淀粉酶的DNA進(jìn)行隨機(jī)誘變，誘變方法包括例如將含有親本糖基化酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到增變抹中，培養(yǎng)含有質(zhì)粒的增變林，從增變抹中分離突變的質(zhì)粒。隨后，將突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)生物中。要被誘變的DNA序列可方便地存在于基因組或cDNA文庫(kù)中，所述文庫(kù)制備自表達(dá)親本a-淀粉酶的生物。或者，DNA序列可以存在于適當(dāng)?shù)妮d體例如質(zhì)?；蚴删w上，可與誘變劑一起溫育或要不然暴露于誘變劑中。要被誘變的DNA也可存在于宿主細(xì)胞中，或者整合于所述細(xì)胞的基因組中，或者存在于細(xì)胞所攜帶的載體上。最后，要被誘變的DNA也可以是分離的形式。很清楚要接受隨機(jī)誘變的DNA序列優(yōu)選是cDNA或基因組DNA序列。在某些情況下可在實(shí)施表達(dá)步驟b)或篩選步驟c)之前方便地?cái)U(kuò)增突變的DNA序列?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行這樣的擴(kuò)增，本發(fā)明優(yōu)選的方法是使用根據(jù)親本酶的DNA或氨基酸序列制備的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。與誘變劑溫育或暴露于誘變劑之后，通過(guò)在允許發(fā)生表達(dá)的條件下培養(yǎng)攜有突變DNA序列的適當(dāng)宿主細(xì)胞來(lái)表達(dá)突變的DNA。用于此目的的宿主細(xì)胞可以是已用突變的DNA序列(任選地存在于載體上)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或者是在誘變處理過(guò)程中攜有編碼親本酶的DNA序列的宿主細(xì)胞。適當(dāng)宿主細(xì)胞的例子如下革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(^^7/w/eWw力、短芽孢桿菌CBac///^Z)rev^)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌(5flc/〃wfl/A:<3/o//2//z^)、解淀4分芽孑包才于菌、)疑結(jié)芽孑包沖干菌CSac/〃MScoagw/am1)、環(huán)狀芽孢桿菌(5ac〃/wC7>cw/a"s)、火山爛芽孑包桿菌(i^zc/〃M/aw/M)、巨大芽孑包才干菌(5flc〃/"i1附eg"/en'M柳)、蘇云金芽孑包牙干菌(5"c〃/z^//2"n'"g/e"j/力、淺青紫鏈霉菌(jSW/,omyces//vz'd(my)或鼠灰鏈霉菌(5Vre/7/函ycesww/m);禾口革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌(Eco//)。突變的DNA序列可進(jìn)一步包含能使突變的DNA序列表達(dá)的DNA序列。定域隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變可有利地定域于所述親本a-淀粉酶的一部分。例如，當(dāng)酶的某些區(qū)域已被鑒定為對(duì)酶的給定特性特別重要時(shí)，以及當(dāng)預(yù)期修飾能導(dǎo)致具有改善特性的變體時(shí)，定域隨機(jī)誘變可能是有利的。當(dāng)親本酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)已被闡明，且所述結(jié)構(gòu)與酶的功能相關(guān)時(shí)，一般可鑒定出這樣的區(qū)域。通過(guò)使用上述的PCR產(chǎn)生的誘變技術(shù)或本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)?shù)牟迦脒m當(dāng)?shù)妮d體來(lái)分離編碼要被修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后可使用上述任何誘變方法對(duì)所述部分進(jìn)行誘變。提供a-淀粉酶變體的備選方法提供a-淀粉酶變體的備選方法包括本領(lǐng)域已知的基因改組方法，所述方法包括例如WO95/22625(來(lái)自AffymaxTechnologiesN.V.)和WO96/00343(來(lái)自NovoNordiskA/S)中所述的方法。表達(dá)a-淀粉酶變體根據(jù)本發(fā)明，可使用表達(dá)載體，以酶的形式表達(dá)通過(guò)上述方法，或通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達(dá)載體通常包括編碼啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)的控制序列，并任選包括阻遏基因或多種激活基因。攜有編碼本發(fā)明a-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是能對(duì)其方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇常取決于其要被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，所述載體的復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒、噬菌體或染色體外元件、微型染色體或人工染色體?；蛘撸d體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，被整合入宿主細(xì)胞基因組，并與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。在載體中，DNA序列應(yīng)與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列可操作地連接。啟動(dòng)子可與宿主細(xì)胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。指導(dǎo)編碼本發(fā)明a-淀粉酶變體之DNA序列轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的例子是大腸桿菌/ac操縱子的啟動(dòng)子、天藍(lán)色鏈霉菌05^印"附>^^￡&0/^)瓊脂酶基因dagj啟動(dòng)子、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(am;AL)啟動(dòng)子、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶Om;;0啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌x少M(fèi)和矽/B基因的啟動(dòng)子等。對(duì)于在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動(dòng)子的例子是來(lái)源于編碼下列酶的基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(7^'zo"wcor柳'e/^)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性a-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉(Am'^/ara)乙酰胺酵。本發(fā)明的表達(dá)載體還可含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，以及在真核生物中，還可含有與編碼本發(fā)明ot-淀粉酶變體的DNA序列可操作地連接的聚腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當(dāng)?shù)貋?lái)源于與啟動(dòng)子相同的來(lái)源。載體可進(jìn)一步包含能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這樣的序列的例子是質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和piJ702的復(fù)制起點(diǎn)。載體還可含有選4奪標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以彌補(bǔ)宿主細(xì)胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的^/基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性例如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。此外，載體可含有曲霉屬選擇標(biāo)記，例如amdS、argB、niaD和sC,產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或者可通過(guò)如WO91/17243中所述的共轉(zhuǎn)化來(lái)完成的選擇。盡管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)在某些方面(如當(dāng)使用某些細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時(shí))有利，但一般優(yōu)選在細(xì)胞外表達(dá)。一般而言，本文所述的芽孢桿菌屬a-淀粉酶包含允許表達(dá)的蛋白酶分泌至培養(yǎng)基的前區(qū)。必要時(shí)，該前區(qū)可為不同的前區(qū)或信號(hào)序列所取代，通過(guò)取代編碼各個(gè)前區(qū)的DNA序列可以方便地實(shí)現(xiàn)此目的。用于分別連接編碼a-淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體、啟動(dòng)子、終止子和其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域兮支術(shù)人員眾所周知的(參見(jiàn)例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989)。在重組生產(chǎn)本發(fā)明的a-淀粉酶變體中，包含上文所定義的本發(fā)明DNA通過(guò)將編碼變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體(以一個(gè)或多個(gè)拷貝)整合至宿主染色體中，用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)檎虾驞NA序列可以在細(xì)胞中更加穩(wěn)定地維持。根據(jù)常規(guī)方法，例如通過(guò)同源或異源重組可以將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體中。或者，可用與不同類(lèi)型的宿主細(xì)胞有關(guān)的上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物的細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)的細(xì)胞，但優(yōu)選其為微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)的細(xì)胞。適合的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可受例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或以感受態(tài)細(xì)胞自身已知的方式使用該細(xì)胞而影響。酵母生物可優(yōu)選糖酵母屬或裂殖酵母屬OSc/n'zcwacc/zaramycay)，例如釀酒酵母(Sacc/2ara"^yc^cereWw'ae)。絲狀真菌優(yōu)選屬于曲霉屬，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌細(xì)胞可通過(guò)一種方法轉(zhuǎn)化，該方法涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、然后細(xì)胞壁以其自身已知的方式再生。適合用于曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法如EP238023所述。在另一方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明a-淀粉酶變體的方法，該方法包含在有利于變體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞以及從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以及獲得本發(fā)明a-淀粉酶變體表達(dá)的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可從供應(yīng)商處購(gòu)得，或者可根據(jù)公開(kāi)的配方(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中所述的)制備。通過(guò)眾所周知的方法，包括通過(guò)離心或過(guò)濾分離培養(yǎng)基與細(xì)胞，利用諸如硫酸銨等鹽沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接著通過(guò)利用層析法(chromatography),例如離子交換層析，親和層析等，可以從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞分泌的a-淀粉酶變體。工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的a-淀粉酶變體具有能進(jìn)行多種工業(yè)應(yīng)用的有價(jià)值的特點(diǎn)。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明酶變體適于作為洗衣、碗碟清洗、硬表面清洗的洗滌劑組合物的成分來(lái)應(yīng)用。尤其是淀粉液化(參見(jiàn)例如US3,912,590,EP專利申請(qǐng)?zhí)?52730和63909，WO99/19467,以及WO96/28567，所有文獻(xiàn)在此并入作為參考)。還涉及的是用于淀粉轉(zhuǎn)化目的的組合物，其除本發(fā)明變體之外，還可包含葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶和其他a-淀粉酶。此外，本發(fā)明的變體還特別用于由淀粉或整谷物/谷粒(wholegrain)生產(chǎn)增甜劑和乙醇(參見(jiàn)例如US專利號(hào)5,231,017,在此并入作為參考)，例如燃料、酒類(lèi)和工業(yè)乙醇。本發(fā)明的變體還可用于紡織品(textile)、織物(fabric)或衣物的退漿(參見(jiàn)例如WO95/21247,US專利4,643,736,EP119,920，在此并入作為參考)、啤酒生產(chǎn)或釀造、紙漿和紙生產(chǎn)以及飼料和食品生產(chǎn)。淀粉轉(zhuǎn)化常規(guī)的淀粉轉(zhuǎn)化處理例如液化核糖化處理描述于如US專利號(hào)3,912,590和EP專利申請(qǐng)?zhí)?52,730和63,909中,在此并入作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，將淀粉降解為低分子量的碳水化合物成分例如糖或脂肪代用品的淀粉轉(zhuǎn)化處理包括脫支步驟。淀粉至糖的轉(zhuǎn)化在將淀粉轉(zhuǎn)化為糖的情況下，淀粉被解聚。這樣的解聚處理由預(yù)處理步驟和兩或三步的連續(xù)處理步驟(即液化處理、糖化處理和取決于所需最終產(chǎn)物任選的異構(gòu)化處理)組成。天然淀粉的預(yù)處理天然淀粉由顯微鏡下可見(jiàn)的顆粒組成，所述顆粒在室溫下不溶于水。當(dāng)加熱淀粉漿水溶液時(shí)，顆粒膨脹并最終爆裂，將淀粉分子分散在溶液中。在該"凝膠化，，處理過(guò)程中，粘度急劇增加了。由于在工業(yè)過(guò)程中一般固體含量為30-40%，因此淀粉必須變稀或"液化"，以使得其能易于處理?，F(xiàn)今，降低粘度主要通過(guò)酶促降解進(jìn)行。液化在液化步驟過(guò)程中，使用a-淀粉酶長(zhǎng)鏈淀粉降解為支鏈和線性的短單元(麥芽糖糊精)。液化處理在105-110°C下進(jìn)行5-10分鐘，然后在95。C下進(jìn)行l(wèi)-2小時(shí)。pH在5.5-6.2之間。為了在這些條件下確保最佳的酶穩(wěn)定性，添加1mM4丐(40ppm游離4丐離子)。在該處理后，液化的淀粉應(yīng)具有10-15的"糖化率，，(DE)。糖化在液化處理后，通過(guò)添加葡糖淀粉酶(如AMG)和諸如異淀粉酶(US專利號(hào)4,335,208)或支鏈淀粉酶(如Promozyme)(US專利號(hào)4,560,65l)的脫支酶將麥芽糖糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。在該步驟之前，將pH降低到低于4.5,保持高溫(高于95。C)以失活液化的oi-淀粉酶，以減少稱為"潘糖前體，，的短寡糖形成，所述"潘糖前體"無(wú)法為脫支酶所完全水解。將溫度降低到60°C，并添加葡糖淀粉酶和脫支酶。糖化處理持續(xù)進(jìn)行24-72小時(shí)。正常地，當(dāng)在液化步驟后變性a-淀粉酶時(shí)，約0.2-0.5%的糖化產(chǎn)物是無(wú)法為支鏈淀粉酶所降解的支鏈三糖6、a-葡糖基麥芽糖(潘糖)。如果在糖化過(guò)程中，來(lái)自液化步驟的活性淀粉酶存在(即不變性)，則該水平可高達(dá)1-2%，其是極其不期望的，因?yàn)槠涿黠@降低了糖化率。異構(gòu)化當(dāng)期望的最終糖產(chǎn)物是例如高果糖糖漿時(shí)，可將葡萄糖糖漿轉(zhuǎn)化為果糖。在糖化處理后，將pH增加到6-8，優(yōu)選pH7.5,并通過(guò)離子交換除去鈣。然后使用例如固定化的葡糖異構(gòu)酶(例如SweetzymeTMlT)將葡萄糖糖漿轉(zhuǎn)化為高果糖糖漿。乙醇生產(chǎn)一般而言，由整谷物/谷粒生產(chǎn)乙醇(酒精)可分成4個(gè)主要的步驟-研磨-液化-糖化-發(fā)酵研磨研磨谷粒以便打開(kāi)其結(jié)構(gòu)并供進(jìn)一步處理。所用到的兩種處理是濕磨或干磨。在干磨中，完整的谷粒(kernel)被研磨并用于處理的剩余步驟中。濕磨提供了十分良好的胚和粗粉(meai)(淀粉粒和蛋白質(zhì))的分離，有些例外的是可用于糖漿的并行生產(chǎn)。液化在液化處理中，通過(guò)水解為麥芽糖糊精使淀粉粒溶解，大部分的DP高于4。可通過(guò)酸處理或a-淀粉酶酶催化進(jìn)行水解。酸水解在受限的基礎(chǔ)上使用。原料可以是磨碎的整谷物/谷粒后來(lái)自淀粉處理的側(cè)線餾分(sidestream)。酶促液化通常以三步熱淤漿(hotslmry)法來(lái)進(jìn)行。將淤漿加熱至60-95。C，優(yōu)選80-85。C,并添加酶。然后在95-140。C噴射(jet-cooked)加熱淤漿，優(yōu)選105-125。C,冷卻至60-95。C，并添加更多的酶以獲得最終的水解。液化處理在pH4.5-6.5下進(jìn)行，通常在pH5-6下進(jìn)行。磨碎的和液化的谷粒也稱為醪液(mash)。糖化為產(chǎn)生酵母能代謝的低分子量糖類(lèi)DPw,來(lái)自液化的麥芽糖糊精應(yīng)進(jìn)一步水解。一般通過(guò)葡糖淀粉酶酶催化進(jìn)行水解，或者可以使用a-葡糖苷酶或酸性a-淀粉酶。完全的糖化步驟可延續(xù)72小時(shí)，但是，所共有的預(yù)糖化通常只進(jìn)行40-90分鐘，然后在發(fā)酵過(guò)程(SSF)中完成糖化。糖化一般在30-65。C的溫度和pH4.5下進(jìn)行，通常在60。C左右進(jìn)行。發(fā)酵將通常來(lái)自糖酵母屬菌種的酵母添加到醪液中，并發(fā)酵24-96小時(shí)，例如通常發(fā)酵35-60小時(shí)，溫度在26-34。C，通常在約32。C，以及pH為pH3-6，優(yōu)選pH4-5左右。注意到廣泛使用的處理是同時(shí)進(jìn)行糖化和發(fā)酵(SSF)處理，其中對(duì)于糖化來(lái)說(shuō)沒(méi)有保溫(holding)階段，意味著酵母和酶要同時(shí)添加。當(dāng)在高于50。C的溫度下引入預(yù)糖化步驟是進(jìn)行SSF所共有的之時(shí)，只要在發(fā)酵之前同時(shí)添加酵母和酶即可。蒸餾發(fā)酵后蒸餾醪液以提取乙醇。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可用作為例如燃料乙醇；飲料乙醇即飲料酒精；或工業(yè)乙醇。副產(chǎn)品發(fā)酵中留下的是谷物/谷粒，其通常以液體形式或干燥形式用作為動(dòng)物飼料。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知關(guān)于如何進(jìn)行液化、糖化、發(fā)酵、蒸餾和乙醇回收的更多細(xì)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明的方法，糖化和發(fā)酵可同時(shí)或獨(dú)立進(jìn)行。紙漿和紙生產(chǎn)本發(fā)明的堿性a-淀粉酶還可用于由淀粉加固(starchreinforced)的廢紙和紙板生產(chǎn)木質(zhì)纖維(lignocellulosic)材料，例如紙漿、紙和紙板，特別是其中在高于7的pH下進(jìn)行再制漿，并且淀粉酶通過(guò)降解加固淀粉而促進(jìn)廢料的分解。本發(fā)明的a-淀粉酶能特別用于由涂有漿糊的印刷紙生產(chǎn)造紙紙漿的處理。該處理可如WO95/14807中所述的進(jìn)行，包括以下步驟a)分解(disintegrating)紙以產(chǎn)生紙漿，b)在步驟a)之前、過(guò)程中或之后，用淀粉降解酶處理，和c)在步驟a)和b)之后，將油墨(ink)顆粒與紙漿分離。本發(fā)明的-a-淀粉酶還可特別用于改性淀粉，其中酶促改性的淀粉與諸如碳酸釣、高嶺土(kaolin)和粘土的堿性填料一起用于造紙。使用本發(fā)明的堿性ct-淀粉酶，有可能在填料存在下改性淀粉，從而可供更簡(jiǎn)單的綜合工藝使用。紡織品、織物或衣物的退漿在紡織品、織物或衣物退漿中，本發(fā)明的a-淀粉酶還可以是十分有用的。在紡織加工工業(yè)中，在退漿處理中oc-淀粉酶通常用作為助劑以促進(jìn)在確保要在隨后織物被洗煉(scoured)、漂白和染色的處理中獲得最好的結(jié)果，重要的是在織布后要完全除去膠料涂層。優(yōu)選的是酶促淀粉分解，因?yàn)槠鋵?duì)纖維材料不產(chǎn)生任何有害影響。為了降低加工成本并增加工廠生產(chǎn)量，退漿處理往往與洗煉和漂白步驟結(jié)合進(jìn)行。在這樣的情況下，非酶助劑例如堿化劑或氧化劑通常用于分解淀粉，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的a-淀粉酶與高pH水平及漂白劑并不非常相容。由于使用了具有相當(dāng)侵蝕性的化學(xué)品，淀粉膠料的非酶分解導(dǎo)致了一些纖維損傷。因此，期望使用本發(fā)明的a-淀粉酶，因?yàn)樗鼈冊(cè)趬A性溶液中具有改善的特性。當(dāng)退漿含有纖維素的織物或紡織品時(shí)，a-淀粉酶可單獨(dú)或與纖維素酶結(jié)合使用。退漿和漂白處理是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，這樣的處理描述于WO95/21247、US專利4,643,736、EP119,920中，在此并入作為參考。用于退漿的市售產(chǎn)品包括來(lái)自NovozymesA/S的AQUAZYME⑧和AQUAZYMEULTRA。啤酒生產(chǎn)在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，本發(fā)明的a-淀粉酶還是十分有用的；a-淀粉酶一般在淀粉糖化過(guò)程中添加。洗滌劑組合物可添加本發(fā)明的a-淀粉酶，并因此成為洗滌劑組合物的成分。本發(fā)明的洗滌劑組合物可例如配制為手洗或機(jī)洗衣服的洗滌劑組合物，包括適于染色織物預(yù)處理的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物柔順劑組合物，或可配制為用于一般家庭硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或可配制用于手洗或機(jī)洗碗碟操作。在一個(gè)特定的方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的酶的洗滌添加劑。所述洗滌添加劑以及洗滌劑組合物可包含一種或多種其他的酶，例如蛋白酶，脂肪酶，過(guò)氧化物酶，不同的(another)淀粉分解酶，如不同的(another)a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、CGT酶(CGTase)和/或纖維素酶、甘露聚糖酶(例如來(lái)自Novozymes，Denmark的MANNAWAYTM)、果膠酶、果膠裂解酶、角質(zhì)酶(cutinase)和/或漆酶。一般而言，所選擇的酶的特性應(yīng)與所選擇的洗滌劑相容(即在最適pH下與其他酶或非酶成分相容等)，并且所述酶應(yīng)以有效量存在。蛋白酶適合的蛋白酶包括那些動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的蛋白酶。微生物來(lái)源的蛋白酶是優(yōu)選的。包括化學(xué)改性或蛋白質(zhì)工程化的突變體。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，特別是那些來(lái)源于芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(如豬或牛來(lái)源的)以及WO89/06270和WO94/25583中描述的鐮孢屬(Fwan'wm)蛋白酶。有用的蛋白酶的例子是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的變體，特別是在一個(gè)或多個(gè)以下位置具有取代的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的市售蛋白酶包括ALCALASE、SAVINASE、PRIMASE、DURALASE、ESPERASE和KANNASE(來(lái)自NovozymesA/S)，MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、PROPERASE、PURAFECT、PURAFECTOXP、FN2、FN3、FN4(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶適合的脂肪酶包括那些細(xì)菌或真菌來(lái)源的脂肪酶。包括化學(xué)改性或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的脂肪酶的例子包括來(lái)自腐質(zhì)霉(//mw/co/g)(同義詞77ze;^ow少cey)的脂肪酶，如來(lái)自EP258068和EP305216中所述的//,/畫(huà)g/卿a(7:/fl聽(tīng)g/"osM)的脂肪酶，或來(lái)自WO96/13580中所述的//./rao/era的脂肪酶，假單胞菌屬(尸"^fomo，力脂肪酶，如來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌CP/^//^"&)或類(lèi)產(chǎn)石成假單胞菌(戶/wewcfoa/ca/Zge"")(EP218272)、洋蔥假單胞菌CPce;ac/a)(EP331376)、施氏假單胞菌(PWwteen;j(GB1,372,034)、熒光假單胞菌CRyZMore"ms)、假單胞菌菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、Pw^cora/werak(WO96/12012)的月旨肪酶，芽孢桿菌屬脂肪酶，如來(lái)自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131,253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pw脂7w》(WO91/16422)的脂肪酶。其他的例子是脂肪酶變體，例如那些描述于WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中的。優(yōu)選的市售脂肪酶包括LIPOLASE和LIPOLASEULTRATM(NovozymesA/S)。淀粉酶適合的淀粉酶(a和/或p)包括那些細(xì)菌或真菌來(lái)源的淀粉酶。包括化學(xué)改性或蛋白質(zhì)工程化的突變體。淀粉酶包括，例如獲得自芽孢桿菌，如詳述于GB1,296,839中的地衣芽孢桿菌的特定菌抹的a-淀粉酶。有用的a-淀粉酶的例子是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的變體，特別是在一個(gè)或多個(gè)以下位置具有取代的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。市售a-淀粉酶是DURAMYLTM、LIQUEZYMETM、TERMAMYLTM、NATALASE'm、SUPRAMYL'M、STAINZYME、FUNGAMYLiM和BANTM(NovozymesA/S),RAPIDASE、PURASTAR和PURASTAROXAMTm(來(lái)自Ge腿corInternationalInc.)。纖維素酶適合的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來(lái)源的那些纖維素酶。包括化學(xué)改性或蛋白質(zhì)工程化的突變體。適合的纖維素酶包括來(lái)自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬(Z/wmZco/a)、鐮孢屬(Fi^an^m)、梭孢殼屬(77z/e/aWa)、枝頂孢屬04cremom'ww)的纖維素酶，例如US4,435,307、US5,648，263、US5,691,178、US5，776，757和WO89/09259中所披露的//m,'co/"/rao/ews、p者熱皇殳絲霉(_/V^ce//op/^/2or<a^zermop/z〃a)禾口尖孑包鐮孑包(Fwan,Mmox，/orz/w)產(chǎn)生的真菌纖維素酶。特別適合的纖維素酶是具有顏色護(hù)理效果的堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是描述于EP0495257、EP0531372、W096/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纖維素酶。其他例子是諸如WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些的纖維素酶變體。市售纖維素酶包4舌CELLUZYME⑧和CAREZYME(NovozymesA/S)，CLAZINASE和PURADAXHA(GenencorInternationalInc.)以及KAC-500(B)(KaoCorporation)。過(guò)氧化物酶/氧化酶適合的過(guò)氧化物酶/氧化酶包括那些植物、細(xì)菌或真菌來(lái)源的過(guò)氧化物酶/氧化酶。包括化學(xué)改性或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的過(guò)氧化物酶的例子包括如WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所迷的來(lái)自鬼傘(Coprinus),如來(lái)自灰蓋鬼傘(C.c/"erew力的過(guò)氧化物酶及其變體。市售過(guò)氧化物酶包括GUARDZYME(NovozymesA/S)。通過(guò)添加含有一種或多種酶的分離的添加劑或通過(guò)添加包含所有這些酶的組合的添加劑，可將洗滌劑酶包括在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌添加劑即分離的添加劑或組合的添加劑可配制成例如顆粒、液體、淤漿等。優(yōu)選的洗滌添加劑配方是顆粒狀的，特別是無(wú)粉塵(non-dusting)顆粒，液體的，特別是穩(wěn)定液體或淤漿的。可例如US4,106,991和4,661,452中所披露的生產(chǎn)無(wú)粉塵顆粒，并可任選地通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包被。蠟涂層材料的例子是具有1000-20000平均分子量的聚(環(huán)氧乙烷)(ethyleneoxide)制品(聚乙二醇，PEG);既有16-50個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬酚；其中醇含有12-20個(gè)碳原子以及存在15-80個(gè)環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化脂肪族醇；脂肪族醇；脂肪酸和脂肪酸甘油單酯、二酯和三酯。在GB1483591中給出了適用于流化床技術(shù)的成膜涂層材料的例子。#4居所確定的方法，液體酶制劑可以例如通過(guò)添加諸如丙二醇的多元醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸來(lái)穩(wěn)定?？筛鶕?jù)EP238,216中所4皮露的方法制備保護(hù)的酶。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以任何方便的形式存在，如條、片、粉末、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般包含高達(dá)70%水和0-30%有機(jī)溶劑，或是不含水的。洗滌劑組合物包含可以是非離子型表面活性劑的一種或多種表面活性劑，包括半極性和/或陰離子和/或陽(yáng)離子和/或兩性離子型表面活性劑。按重量計(jì)算表面活性劑通常以0.1%-60%的水平存在。當(dāng)包括在其中時(shí)，洗滌劑應(yīng)通常含有約1%至約40%的陰離子型表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鹽/酯(alkylbenzenesulfonate)、a-烯屬磺酸鹽/酯、烷基硫酸鹽/S旨(alkylsulfate)(脂肪醇硫酸鹽/酯(fattyalcoholsulfate))、脂肪醇乙氧基石克酸鹽/酯(alcoholethoxysulfate)、仲烷基石黃酸鹽/酯(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸曱酯(sulfofattyacidmethylester)、烷基或烯基琥珀酸或脂肪酸鹽(soap)。當(dāng)包括在其中時(shí)，洗滌劑(detergent)應(yīng)通常約0.2%至約40%的非離子型表面活性劑，例如脂肪醇乙氧基化物、壬酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二曱胺化氧化物(alkyldimethylamine-oxide)、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanol-amide)、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酸酰胺或葡萄糖胺("葡糖胺")的N-?；鵑-烷基衍生物。洗滌劑可含有0-65。/。的洗滌增效助劑(builder)或絡(luò)合劑，例如沸石、二磷酸鹽/酯、三磷酸鹽/S旨、膦酸鹽/酯(phosphonate)、碳酸鹽/酯、檸檬酸鹽/酯、次氮基三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五醋酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽/西旨或分層(layered)硅酸鹽/S旨(如來(lái)自Hoechst的SKS-6)。洗滌劑可包含一種或多種聚合物。例子是羧曱基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、諸如的聚丙烯酸酯的聚羧化物(polycarboxylates)、馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物以及甲基丙烯酸月桂酯/丙晞酸共聚物。洗滌劑可含有漂白體系，所述漂白體系可包含諸如過(guò)硼酸鹽/酯或過(guò)碳酸鹽/酯的&02源，所述氏02源可與諸如四乙?；叶坊蛉甚；u笨磺酸鹽/酯(nonanoyloxyben-zenesul-fonate)的過(guò)酸形成的漂白活化劑結(jié)合?；蛘?，漂白體系可包含例如酰胺、二酰亞胺或石風(fēng)型過(guò)氧酸?？墒褂贸Ｒ?guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定本發(fā)明洗滌劑組合物的酶，所述常規(guī)穩(wěn)定劑例如諸如丙二醇或甘油的多元醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物如芳香族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物例如4-曱酰苯基硼酸以及可配制的組合物，如WO92/19709和WO92/19708中所述的。洗滌劑還可含有其他常見(jiàn)的洗滌劑成分，例如包括粘土的織物調(diào)節(jié)劑、發(fā)泡劑(foamboosters)、抑泡劑、防腐劑、污垢懸浮劑、防污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑、水溶助長(zhǎng)劑、晦暗抑制劑或香料。預(yù)計(jì)任何酶都能存在于洗滌劑組合物中，特別是本發(fā)明的酶，可以相應(yīng)于每升洗滌液0.001-100mg酶類(lèi)蛋白質(zhì)的量添加，優(yōu)選以每升洗滌液0.005-5mg酶類(lèi)蛋白質(zhì)，更優(yōu)選以每升洗滌液0.01-1mg酶類(lèi)蛋白質(zhì)，以及特別是以每升洗滌液0.1-1mg酶類(lèi)蛋白質(zhì)的量添加。本發(fā)明的酶可額外地?fù)饺氲絎O97/07202中披露的洗滌劑配方中，其在此并入作為參考。碗碟清洗洗滌劑組合物本發(fā)明的酶還可用于碗碟清洗洗滌劑組合物中，包括以下1)粉末自動(dòng)碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>2)粉末自動(dòng)碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>3)粉末自動(dòng)碗》萊清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>4)粉末自動(dòng)碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>6)帶有清潔表面活性劑體系的粉末和液體碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>8)非水液體碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>)9)觸變性液體自動(dòng)碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>11)含有保護(hù)的漂白粒子的液體自動(dòng)碗碟清洗組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>12)如1)、2)、3)、4)、6)和IO)中所述的自動(dòng)碗碟清洗組合物，其中過(guò)硼酸鹽/酯為過(guò)碳酸鹽/酯所取代。13)如l)-6)中所述的自動(dòng)碗碟清洗組合物，其還含有錳催化劑。錳催4匕劑可例^口是"Efficientmanganesecatalystsforlow-temperaturebleaching",Nature369，1994，pp.637-639.中描述的化合物的一種。原料和方法酶LE174:雜合a-淀粉酶LE174是一種雜合Termamyl-樣a-淀粉酶，除N-末端35個(gè)氨基酸殘基(成熟蛋白的)已為BAN(成熟蛋白)(即SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶)的N-末端33個(gè)殘基所取代之外，其與Termamyl序列(即SEQIDNO:4所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶)一致，其進(jìn)一步具有以下突變H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S(SEQIDNO:4).LE429雜合a-淀4分酶變體LE429是一種雜合Termamyl-樣a-淀粉酶，除N-末端35個(gè)氨基酸殘基(成熟蛋白的)已為BAN(成熟蛋白)(即SEQIDNO:6所示的解淀粉芽孢桿菌oc-淀粉酶)的N-末端33個(gè)殘基所取代之外，其與Termamyl序列(即SEQIDNO:4所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶)一致，其進(jìn)一步具有以下突變H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQIDNO:4)。LE429示于SEQIDNO:2,并通過(guò)SOE-PCR(Higuchi等1988,NucleicAcidsResearch16:7351)構(gòu)建。來(lái)源于黑曲霉的葡糖淀粉酶具有示于WOOO/04136中的氨基酸序列，如SEQIDNo:2或所披露的變體之一。來(lái)源于黑曲霉的酸性真菌a-淀粉酶。底物獲得自Sigma-Aldrich的小麥淀粉(S-5127)。發(fā)酵和a-淀粉酶變體的純化在來(lái)自-80°C儲(chǔ)存的具有10嗎/ml卡那霉素的LB-瓊脂平板上劃線接種攜有相關(guān)的表達(dá)質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌菌抹，并在37°C下培養(yǎng)過(guò)夜。將克隆轉(zhuǎn)移入在500ml搖瓶中的補(bǔ)充有10fig/ml卡那霉素的100mlBPX培養(yǎng)基中。BPX培養(yǎng)基成分馬鈴薯淀粉100g/1大麥粉50g/1BAN5000SKB0.1g/1酪蛋白酸鈉10g/1大豆粉20g/1Na2HP04，12H209g/1Pluronic0.1g/1培養(yǎng)物在37。C下以270rpm振蕩培養(yǎng)5天。通過(guò)以4500rpm離心20-25分鐘，從發(fā)酵培養(yǎng)液中除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。之后過(guò)濾上清液以獲得完全清澈的溶液。在UF-過(guò)濾器(10000截留分子量膜)上濃縮并洗滌濾液，并將緩沖液改變?yōu)?0mM醋酸，pH5.5。將UF-濾液加在S-sepharoseF.F.上，通過(guò)使用在相同緩沖液中的0.2MNaCl—步洗脫來(lái)進(jìn)行洗脫。對(duì)10mMTris,pH9.0透析洗脫物并加在Q-sepharoseRF.上,用超過(guò)6倍柱體積的0-0.3MNaCl的線性梯度進(jìn)行洗脫。匯集含有活性(通過(guò)Phadebas測(cè)定法測(cè)定的)的級(jí)分，調(diào)節(jié)pH至pH7.5并在5分鐘內(nèi)通過(guò)用0.5%W/V活性炭處理除去殘留的顏色?；钚詼y(cè)定(KNU)可使用馬鈴薯淀粉作為底物測(cè)定淀粉分解活性。該方法是基于用酶分解改性馬鈴薯淀粉，并接著通過(guò)將淀粉/酶溶液的樣品與碘溶液混合進(jìn)行反應(yīng)。最初，與有色玻璃標(biāo)準(zhǔn)相比，出現(xiàn)稍黑的藍(lán)色，但在淀粉分解過(guò)程中，藍(lán)色變淺并逐漸地變?yōu)榧t棕色。1000個(gè)Novoa淀粉酶單位(KNU)規(guī)定為在標(biāo)準(zhǔn)條件(即在37。C+/-0.05;0.0003MCa2+;和pH5.6)下，糊精化5.26g淀粉干物質(zhì)——Merck可溶性淀4分(Amylumsolubile)的S^的"f:。文件夾AF9/6更詳細(xì)地描述了該分析方法，函索NovozymesA/S，Denmark即可獲得，該文件夾在此并入作為參考。葡糖淀粉酶活性(AGU)l個(gè)Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)規(guī)定為在37。C和pH4.3下，每分鐘水解l微摩爾麥芽糖的酶的量。通過(guò)在使用來(lái)自BoehringerMannheim,124036的葡萄糖GOD-Perid試劑盒之后改良的方法(AEL-SM-0131,函索Novozymes即可獲得)將該活性確定為AGU/ml。標(biāo)準(zhǔn)AMG-標(biāo)準(zhǔn)，批號(hào)7-1195,，195AGU/ml。375pL底物(在50mM醋酸鈉，pH4.3中的l。/。麥芽糖)在37。C下溫育5分鐘。添加在醋酸鈉中稀釋的25j^L酶。在10分鐘后通過(guò)添加100(iL0.25MNaOH停止反應(yīng)。將20^L轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板中，并添加200(iLGOD-Perid溶液(124036，BoehringerMannheim)。在室溫下30分鐘后，在650nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)AMG-標(biāo)準(zhǔn)以AGU/ml計(jì)算活性。更詳細(xì)地描述該分析方法的文件夾(AEL-SM-0131)函索NovozymesA/S,Denmark即可獲得，該文件夾在此并入作為參考。酸性a-淀粉酶活性(AFAU)酸性a-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌a-淀粉酶單位)測(cè)定，其中是相對(duì)于酶標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定的。所使用的標(biāo)準(zhǔn)是AMG300L(來(lái)自NovozymesA/S，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉Gl,也披露于Boel等(1984),EMBOJ.3(5)，p.1097-1102和WO92/00381中)。在該AMG中的中性a-淀粉酶在室溫下貯藏3周后從大約1FAU/mL降低到低于0.05FAU/mL。才艮據(jù)以下描述測(cè)定該AMG標(biāo)準(zhǔn)中的酸性a-淀粉酶活性。在該方法中，1AFAU規(guī)定為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每小時(shí)降解5.26mg淀粉干物質(zhì)固形物(drysolids)的酶的量。碘與淀粉形成藍(lán)色絡(luò)合物，但不與其降解產(chǎn)物形成藍(lán)色絡(luò)合物。因此，顏色強(qiáng)度與淀粉濃度成正比。使用在指定分析條件下作為淀粉濃度減少的逆比色法測(cè)定淀粉酶活性。a-淀粉酶淀粉+碘糊精+寡糖40。C,pH2.5藍(lán)色/紫色t-23秒.脫色標(biāo)準(zhǔn)條件/反應(yīng)條件(每分鐘)底物淀粉，大約0.17g/L緩沖液檸檬酸鹽，大約0.03M碘(12):0.03g/LCaC12:1.85mM2.50-0.05X=590nm酶濃度:0.025AFAU/mL酶工作范圍0.01-0.04AFAU/mL更多細(xì)節(jié)優(yōu)選這些能見(jiàn)于函索NovozymesA/S即可獲得的EB-SM-0259.02/01中的，在此并入作為參考。糖分布和溶解的干固形物的測(cè)定通過(guò)HPLC測(cè)定淀粉水解產(chǎn)物的糖成分，隨后計(jì)算葡萄糖產(chǎn)率為DX.。BRIX，并通過(guò)折光率(refractiveindex)測(cè)定法測(cè)定淀粉水解產(chǎn)物的溶解(可溶)干固形物。a-淀粉酶活性的測(cè)定通過(guò)使用Phadebas⑧藥片作為底物的方法測(cè)定a-淀粉酶活性。Phadebas藥片(Phadebas⑧淀粉酶檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，提供自PharmaciaDiagnostic)含有交聯(lián)的不溶性藍(lán)色淀粉聚合物，其已與牛血清白蛋白和緩沖物質(zhì)混合并壓片。對(duì)于每一次測(cè)定，將一片懸浮于含有5ml50mMBritton-Robinson緩沖液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mMCaCl2,用NaOH調(diào)節(jié)pH至所需值)的試管中。于所需溫度下在水浴中進(jìn)行該測(cè)試。在xml的50mMBritton-Robinson緩沖液中稀釋要被測(cè)試的a-淀粉酶。將1ml該a-淀粉酶溶液添力卩到5ml50mMBritton-Robinson緩沖液中。通過(guò)a-淀粉酶釋放出可溶的藍(lán)色片段水解淀粉。在620nm處用分光光度計(jì)測(cè)定所得到的藍(lán)色溶液的吸光度，其是a-淀粉酶活性的函數(shù)。重要的是在10-15分鐘的溫育(測(cè)試時(shí)間)后測(cè)定的620nm吸光度要在0.2-2.0的620nm處吸光度單位范圍內(nèi)。在該吸光度范圍內(nèi)，在活性和吸光度之間存在線性(朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律)。因此應(yīng)調(diào)節(jié)酶的稀釋以適合該標(biāo)準(zhǔn)。在給定的一組條件(溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、緩沖液條件)下，lmg給定的a-淀粉酶應(yīng)水解一定量的底物并會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色。在620nm處測(cè)定顏色強(qiáng)度。在給定組的條件下，所測(cè)定的吸光度與所述a-淀粉酶的比活性(純的a-淀粉酶蛋白的每毫克活性)成正比。測(cè)定比活性使用Phadebas測(cè)定法(Pharmacia)測(cè)定比活性為活性/毫克酶。測(cè)定。H活性分布(pH穩(wěn)定性)將變體貝i藏在20mMTRISpH7.5，0.1mM,CaCl2中,并在30°C下，50mMBritton-Robinson,0.1mMCaCl2中測(cè)試。使用上述Phadebas測(cè)定法，在pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0(9.5)、9.5、10和10.5下測(cè)定pH活性。實(shí)施例實(shí)施例1構(gòu)建Termamyl變體LE429在枯草芽孢桿菌中由稱為pDN1528的質(zhì)粒表達(dá)Termamyl(地衣芽孢桿菌a-淀粉酶SEQIDN0:4)。該質(zhì)粒含有編碼Termamyl的完整基因，其表達(dá)受其自己的啟動(dòng)子所指導(dǎo)。此外，該質(zhì)粒含有來(lái)自于質(zhì)粒pUB110的復(fù)制起點(diǎn)on',和賦予對(duì)氯霉素抗性的來(lái)自于質(zhì)粒pC194的caf基因。pDN1528示于WO96/23874的圖9中。制備一種含有SEQIDNO:3編碼區(qū)主要部分的特定的誘變載體。稱為pJeENl的該載體的主要特征包括來(lái)自于pUC質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，賦予對(duì)氯霉素抗性的基因以及Wfl基因的含有移碼的變型，其野生型通常賦予對(duì)氨千青霉素的抗性(ampR表型)。該突變型產(chǎn)生ampS表型。質(zhì)粒pJeENl示于WO96/23874的圖10中，大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)。".、亂ca、Termamyl淀粉酶基因的5'-截短變型以及所選擇的限制酶切位點(diǎn)指示在質(zhì)粒上。除具有摻入的"選擇引物"(引物#6616，參見(jiàn)以下)的質(zhì)粒是基于含有具有修復(fù)的Wa基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞ampK表型進(jìn)行選擇，而不使用Deng和Nickoloff所一既述的限制性內(nèi)切酶消化選4奪之外，通過(guò)Deng和Nickoloff(1992,Anal.Biochem.200,pp.81-88)所述的方法將突變導(dǎo)入amy丄。用于該誘變的化學(xué)品和酶獲得自Stratagene的Chameleon(!)誘變?cè)噭┖?目錄號(hào)200509)。在檢驗(yàn)變體質(zhì)粒中的DNA序列之后，將含有期望的改變的截短的基因作為尸Wl-五coRI片段亞克隆入pDN1528，并轉(zhuǎn)化入蛋白酶-和淀粉酶-缺失的枯草芽孢桿菌菌抹SHA273(描述于W092/11357和WO95/10603)中，以便表達(dá)變體酶。通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體V54W:通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體A52W+V54W:NO:10)引物#6616(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě)；P表示5'磷酸)通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體V54E:PGGTCGTAGGCACCGTAGCCCTCATCCGCTTG(SEQIDNO:12)通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體V54M:通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體V54I:通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體Y290E和Y290K:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>Y表示C和T的等量混合。通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證編碼第290位的谷氨酸或賴氨酸的密碼子的存在。通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體N190F:通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體N188P+N190F:PCATAGTTGCCGAATTCAGGGGAAACTTCCCAATC(SEQIDNO:17)通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體H1概+H142D:(SEQIDNO:18)通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體I-I156Y:PCAAAATGGTACCAA丁ACCACTTAAAATCGCTG(SEQIDNO:19)通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體A181T:通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體A209V:PCTTAATTTCTGCTACGACGTCAGGATGGTCATAATC(SEQIDNO:21)通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體Q264S:PCGCCCAAGTCATTCGACCAGTACTCAGCTACCGTAAAC(SEQIDNO:22)通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體S187D:通過(guò)使用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體DELTA(K370-G371-D372)(即缺失氨基酸殘基370、371和372):PGGAATTTCGCGCTGACTAGTCCCGTACATATCCCC(SEQIDNO:24)通過(guò)4吏用以下誘變引物(5'到3'從左到右書(shū)寫(xiě))構(gòu)建Termamyl變體DELTA(D372-S373陽(yáng)Q374):PGGCAGGAATTTCGCGACCTTTCGTCCCGTACATATC(SEQIDNO:25)通過(guò)用切割pDN1528-樣質(zhì)粒兩次產(chǎn)生1116bp片段和3850bp載體部分(即含有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn))的限制性內(nèi)切酶C/gI消化含有A1WT的pDNl528-樣質(zhì)粒(即在flmy丄中含有引起A181T改變的突變的pDN1528)和含有A209V的pDN1528-樣質(zhì)粒(即在awy丄中含有引起A209V改變的突變的pDN1528),將Termamyl變體A181T和A209V結(jié)合為A181T+A209V。在瓊脂糖凝膠上分離后，通過(guò)QIAquick凝膠抽提試劑盒(購(gòu)自QIAGEN)純化含有A209V突變的片段和含有A181T突變的載體部分。連接片段和載體并轉(zhuǎn)化入上述提及的蛋白酶和淀粉酶缺失的枯草芽孢桿菌菌抹。對(duì)來(lái)自aw少+(在含有淀粉的瓊脂平板上亮區(qū))和氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒分析質(zhì)粒上兩種突變的存在。以類(lèi)似于上述的方法，使用限制性內(nèi)切酶Acc651和EcoRI結(jié)合HI56Y和A209V，給出H156Y+A209V。通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶Acc651和HindIII將H156Y+A209V和A181T+A209V結(jié)合為H156Y+A181T+A209V。利用SOE-PCR方法(Higuchi等1988，NucleicAcidsResearch16:7351),Termamyl變體H156Y+A181T+A209V成熟部分的35個(gè)N-末端殘基被解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶(SEQIDNO:4)(在本發(fā)明上下文中稱為BAN)的33個(gè)N-末端殘基所取代，如下引物19364(序歹'〗5,-3,):CCTCATTCTGCAGCAGCAGCCGTAAATGGCACGCTG(SEQIDNO:26)引物19362:CCAGACGGCAGTAATACCGATATCCGATAAATGTTCCG(SEQIDNO:27)引物19363:CGGATATCGGTATTACTGCCGTCTGGATTC(SEQIDNO:28)引物1C:CTCGTCCCAATCGGTTCCGTC(SEQIDNO:29)根據(jù)廠商的說(shuō)明書(shū)，使用來(lái)自BoehringerMannheim的Pwo耐熱聚合酶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，溫度循環(huán)94。C5分鐘，25個(gè)循環(huán)(94。C30秒、50。C45秒、72。C1分鐘)，72。C10分鐘。在稱為PCR1的第一次PCR中，使用引物19364和19362，對(duì)含有編碼解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的基因的DNA片段擴(kuò)增出大約130bp片段。在稱為PCR2的另一次PCR中，使用引物19363和1C，對(duì)模板pDN1528擴(kuò)增出大約400bp片段。PCR1和PCR2純化自瓊脂糖凝膠并在使用引物19364和1C的PCR3中被用作為模板，得到大約520bp的片段。因此，該片段含有融合至編碼從第35個(gè)氨基酸起的Termamy的DNA的一部分的編碼來(lái)自BAN的N-末端的DNA的一部分。通過(guò)用限制性內(nèi)切酶Pstl和SacII消化、連接并如先前所述的轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌菌抹，將520bp片段亞克隆入pDN1528-樣質(zhì)粒(含有編碼Termamyl變體H156Y十A181T+A209V的基因)中。通過(guò)在提取的來(lái)自a77^+和氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒中進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證在限制酶切位點(diǎn)尸WI和SacII之間的DNA序列。最終的構(gòu)建體含有來(lái)自BAN的正確N-末端和H156Y+A181T+A209V，稱為BAN(1-35)+H156Y+A181T+A209V。除pJeENl中的am;;丄序列為編碼Termamyl變體BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V的DNA序列所取代之外，通過(guò)如上所述進(jìn)行誘變，將N190F與BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V結(jié)合，給出BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V。除pJeEN中的amyL序列為編碼Termamyl變體BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V的DNA序列所取代之外，通過(guò)如上所述進(jìn)行誘變，將Q264S與BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V結(jié)合，給出BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V+G264S。利用限制性內(nèi)切酶i^aHI(在A209V突變附近導(dǎo)入份aHI位點(diǎn))和PWl，將BAN(l-35)+H156Y+A181T+A209V+Q264S和BAN(l-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V結(jié)合入BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S。通過(guò)如上所述進(jìn)行誘變，將I201F與BAN(l-35)+H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S結(jié)合，給出BAN(l-35)+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+I201F(SEQIDNO:2)。使用誘變引物AM100,導(dǎo)入I201F取代并同時(shí)除去Clal限制酶切位點(diǎn)，其利于容易鑒別突變。引物AM100:5,GATGTATGCCGACTTCGATTATGACC3，(SEQIDNO:30)實(shí)施例2構(gòu)建具有改變的淀粉親和力的Termamyl-樣a-淀粉酶變體構(gòu)建LEI153(LE429+R437W):通過(guò)PCR，使用結(jié)合淀粉酶基因下游的載體引物CAAX37和誘變引物CAAX447擴(kuò)增來(lái)自pDN1528-樣質(zhì)粒(在編碼來(lái)自SEQIDNO:4的淀粉酶的的大約450bpDNA片l爻。450bp片段純化自瓊脂糖凝膠并用作為大(mega)引物與引物IB—起對(duì)相同的模板進(jìn)行在第二PCR。用限制性內(nèi)切酶PstI和AvrII消化所得到的大約1800bp片段，純化所得到的大約1600bpDNA片段并與用相同的酶消化的pDN1528-樣質(zhì)粒連接。用連接和氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草芽孢桿菌SHA273(低淀粉酶和蛋白酶)細(xì)胞，并通過(guò)DNA測(cè)序檢查以驗(yàn)證質(zhì)粒上正確突變的存在。引物CAAX37:5，CTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGC3,(SEQIDNO:31)引物IB:5，CCGATTGCTGACGCTGTTATTTGC3，(SEQIDNO:32)引物CAAX447:5，CCCGGTGGGGCAAAGTGGATGTATGTCGGCCGG3，(SEQIDNO:33)構(gòu)建LEI154:除使用兩種誘變引物CAAX447和CAAX448之外，以類(lèi)似的方法構(gòu)建BAN/Termamyl雜合+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+[R437W+E469N]。引物CAAX448:5'CGGAAGGCTGGGGAAATTTTCACGTAAACGGC3'(SEQIDNO:34)實(shí)施例3構(gòu)建具有改變的淀粉親和力的BAN-樣a-淀粉酶變體(R176*+G177*)BAN(解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶SEQIDNO:6)由類(lèi)似于描述于實(shí)施例1中的pDN1528的質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。該稱為pCA330-BAN的BAN質(zhì)粒含有取代限定為SEQIDNO:4中的氨基酸1-483的編碼地衣芽孢桿菌a-淀粉酶成熟部分的基因的限定為SEQIDNO:6中的氨基酸1-483的編碼BAN成熟部分的基因。解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的變體示于SEQIDNO:2,包含兩個(gè)氨基酸缺失R176和G177以及N190F取代(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))，與野生型解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶相比，具有改善的穩(wěn)定性。該變體在下文中稱為BAN-var003。為改善所述a-淀粉酶變體的淀粉親和力和水解能力，使用Sarkar和Sommer,19卯(BioTechniques8:404-407)所述的大引物方法進(jìn)行位點(diǎn)定向誘變.構(gòu)建BE1001:BAN-var003+R437W:通過(guò)PCR,使用結(jié)合淀粉酶基因下游的載體引物CAAX37和誘變引物CABX437擴(kuò)增來(lái)自pCA330-BAN質(zhì)粒(在編碼來(lái)自SEQIDNO:6的淀粉酶的基因中含有BAN-var003突變)的大約450bpDNA片段。450bp片段純化自瓊脂糖凝膠并用作為大引物與引物IB—起對(duì)相同的模板進(jìn)行第二PCR。用限制性內(nèi)切酶PstI和AvrII消化所得到的大約1800bp片段，純化所得到的大約1600bpDNA片段并與用相同的酶消化的pCA330-樣質(zhì)粒連接。用連接和氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草芽孢桿菌SHA273(低淀粉酶和蛋白酶)細(xì)胞，并通過(guò)DNA測(cè)序^r查以^r證質(zhì)粒上正確突變的存在。引物CABX437:5，GGTGGGGCAAAGTGGATGTATGTCGGC3，(SEQIDNO:35)構(gòu)建BE1004:除使用兩種誘變引物CABX437和CABX438之外，以類(lèi)似方法構(gòu)建BAN-var003淀粉酶+[R437W+E469N]。CABX438:5'GGAAGGCTGGGGAAACTTTCACGTAAACG3，(SEQIDNO:36)實(shí)施例4TermamylLC對(duì)LE1153和LE1154該實(shí)施例說(shuō)明了與TermamylLC相比，使用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌a-淀粉酶(LE1153和LE1154)將粒狀小麥淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。通過(guò)在攪拌下將247.5g小麥淀粉添加到502.5ml水中，制備具有33%干固形物(DS)粒狀淀粉的淤漿。用HCl將pH調(diào)節(jié)到4.5。將粒狀淀粉漿分配在100ml錐形燒瓶中，每瓶75g。在60。C水浴中溫育燒瓶，帶有磁力攪拌。在0小時(shí)處，將表1中所給出的酶活性劑量給予燒瓶。在24、48和73以及94小時(shí)后提取樣品。表1.使用的酶活性水平<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>使用以下方法測(cè)定總的干固形物淀粉。通過(guò)添加過(guò)量的a-淀粉酶(300KNU/kg干固形物)并將樣品置于95。C油浴中45分鐘完全水解淀粉。隨后將樣品冷卻至60。C，并添加過(guò)量的葡糖淀粉酶(600AGU/kgDS),接著在60°C下溫育2小時(shí)。在通過(guò)0.22微米過(guò)濾器過(guò)濾后，通過(guò)折光率測(cè)定法對(duì)樣品測(cè)定淀粉水解產(chǎn)物中的可溶性千固形物。通過(guò)HPLC測(cè)定糖分布。葡萄糖的量計(jì)算為DX。結(jié)果示于表2和3中。表2.在100KNU/kgDSa-淀粉酶用量下，可溶性千固形物占總的<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>該實(shí)施例說(shuō)明了與BANWT相比，使用根據(jù)本發(fā)明的BANR437W變體的細(xì)菌(X-淀粉酶將粒狀小麥淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。通過(guò)在攪拌下將247.5g小麥淀粉添加到502.5ml水中，制備具有33%干固形物(DS)粒狀淀粉的淤漿。用HCl將pH調(diào)節(jié)到4.5。將粒狀淀粉漿分配在100ml錐形燒瓶中，每瓶75g。在60。C水浴中溫育燒瓶，帶有磁力攪拌。在0小時(shí)處，將表1中所給出的酶活性給予燒瓶。在24、48和73以及94小時(shí)后提取樣品。表1.使用的酶活性水平a<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>使用以下方法測(cè)定總的干固形物淀粉。通過(guò)添加過(guò)量的a-淀粉酶(300KNU/kg干固形物)并將樣品置于95。C油浴中45分鐘完全水解淀粉。隨后將樣品冷卻至60°C,并添加過(guò)量的葡糖淀4分酶(600AGU/kgDS)，接著在60。C下溫育2小時(shí)。在通過(guò)0.22微米過(guò)濾器過(guò)濾后，通過(guò)折光率測(cè)定法對(duì)樣品測(cè)定淀粉水解產(chǎn)物中的可溶性干固形物。通過(guò)HPLC測(cè)定糖分布。葡萄糖的量計(jì)算為DX。結(jié)果示于表4和5中。表4.在100KNU/kgDSa-淀粉酶用量下，可溶性干固形物占總的干物質(zhì)的百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>參考文獻(xiàn)Klein,C.，等，所oc/zem/Wo;31,8740-8746，Miz腳，H.，等，JMo/.扁.(1993)234,1282-1283，Chang,C.,etal,/Mo/.扁.(1993)229,235-238,Larson,S.B.,J^fo/.歷o/.(1994)235，1560-1584，Lawson，C丄.，/7kfo/.J5/o/.(1994)236，590-600，Qian,M"等，/M/.腸/.(1993)231,785-799,Brady，R丄.，等，D^to〃o^:5，47，527-535,Swift,H丄，等，爿ctoCV^to〃ogr.B,47，535-544A.Kadziola,博士論文"Analpha-amylasefromBarleyanditsComplexwithaSubstrateAnalogueInhibitorStudiedbyX-rayCrystallography",DepartmentofChemistryUniversityofCopenhagen1993MacGregor，E.A.，F(xiàn)oodHydrocolloids,1987,Vol.1,No.5-6,p.B.Diderichsen和L.Christiansen,CloningofamaltogenicamylasefromBac/〃w5Weoro^2enMo//n'/ws,FEMSMicrobiol,letters:56:pp.53-60(1988)Hudson等,PracticalImmunology,Thirdedition(1989》BlackwellScientificPublications,Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,1989S丄.Beaucage和M.H.Caruthers,TetrahedronLetters22,1981,pp.1859-1869Matthes等，TheEMBOJ.3,1984,pp,801-805.R.K.Saiki等，Science239,1988,pp.487-491.Morinaga等，(984,Biotechnology2:646-639)Nelson和Long,AnalyticalBiochemistry180，1989,pp.147-151Hunkapiller等，1984,Nature310:105-111R.Higuchi,B.Krummel和R,K.Saiki(1988).Ageneralmethodofz'"v"rapreparationandspecificmutagenesisofDNAfragments:studyofproteinandDNAinteractions.jVmc/.爿"Ai饑16:7351-7367.Dubnau等，1971,J.Mol.Biol.56,pp.209-221.Gryczan等,1978,J,Bacteriol.134，pp.318-329.S.D.Erlich，1977,Proc.Natl.Acad.Sd.74,pp.1680-1682.Boel等，1990,Biochemistry22，pp.6244-6249.Sarkar和Sommer,1990,BioTechniques8，pp.404-407.權(quán)利要求1.具有α-淀粉酶活性并包含取代R437W的親本Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，其中所述位置相應(yīng)于具有SEQIDNO4之氨基酸序列的親本Termamyl-樣α-淀粉酶的氨基酸序列的位置。2.權(quán)利要求1的變體，其中親本a-淀粉酶是SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的雜合a-淀粉酶。3.權(quán)利要求l-2任一項(xiàng)的變體，其中親本雜合a-淀粉酶是包含如SEQIDNO:4所示的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的445個(gè)C-末端氨基酸殘基和如SEQIDNO:6所示的來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌的a-淀粉酶的37個(gè)N-末端氨基酸殘基的雜合a-淀粉酶。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的變體，其中親本雜合Termamyl-樣a-淀粉酶進(jìn)一步具有以下突變H156Y+A181T+N1卯F+A209V+Q264S(使用SEQIDNO:4中的編號(hào))或LE174。5.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的變體，其中親本雜合Termamyl-樣a-淀4分酶進(jìn)IDNO:4的編號(hào))或LE429。6.權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)的變體，其中變體包含一個(gè)或多個(gè)以下額外的突變R176*、G177*、E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。7.權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)的變體，其中變體包含額外的突變E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的變體，其中變體包含額外的突變R176*+G177*+E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。9.權(quán)利要求1的變體，其中親本a-淀粉酶是SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的a-淀4分酶。10.權(quán)利要求9的變體，其中變體包含一個(gè)或多個(gè)以下額外的突變R176*、G177*、N190F、E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。11.權(quán)利要求10的變體，其中變體包含額外的突變R176承+G177氺+N190F(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。12.權(quán)利要求11的變體，其中變體包含額外的突變E469N(使用SEQIDNO:6中的編號(hào))。13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的變體，其中親本Termamyl-樣a-淀粉酶具有與SEQIDNO:4具有至少60%、優(yōu)選70°/。、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少約90%、甚至更優(yōu)選至少95%、甚至更優(yōu)選至少97%以及甚至更優(yōu)選至少約99%同一性水平的氨基酸序列。14.一種包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的a-淀粉酶變體的DNA序列的DNA構(gòu)建體。15.—種攜有根據(jù)權(quán)利要求14的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。16.—種用根據(jù)權(quán)利要求14的DNA構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求15的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。17.權(quán)利要求16的細(xì)胞，其是微生物，特別是細(xì)菌或真菌，例如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、杣爛芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。18.—種包含權(quán)利要求1-13的a-淀粉酶變體的組合物。19.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求l-13任一項(xiàng)的變體的方法，其中在有利于產(chǎn)生變體的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求16-17任一項(xiàng)的細(xì)胞，并隨后從培養(yǎng)物中回收變體。20.權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)的a-淀粉酶變體或權(quán)利要求18的組合物在淀粉液化；在洗滌劑組合物，例如洗衣、碗碟清洗和硬表面清潔組合物；乙醇生產(chǎn)，例如燃料、^L用和工業(yè)乙醇生產(chǎn)；紡織品、織物或衣物的退漿中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及親本Termamyl-樣α-淀粉酶的變體，該變體具有改變的特性，具體來(lái)說(shuō)是相對(duì)于親本α-淀粉酶增加的淀粉親和力。文檔編號(hào)C12P19/14GK101128579SQ200580048604公開(kāi)日2008年2月20日申請(qǐng)日期2005年12月22日優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日發(fā)明者卡斯滕·安德森,安德斯·維克索-尼爾森申請(qǐng)人:諾維信公司