專利名稱：耐熱的α－淀粉酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及耐熱的α-淀粉酶，尤其是在酸性pH下具有提高的熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶。本發(fā)明還涉及此類α-淀粉酶的用途。
背景技術：
α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC.3.2.1.1)構成了一組可以催化淀粉水解以及催化其它線性和支鏈1，4-糖苷寡糖和多糖水解的酶。
已有非常廣泛大量的專利和科學文獻涉及此類工業(yè)上非常重要的酶。例如從WO 90/11352，WO 95/10603，WO 95/26397，WO 96/23873和WO96/23874中可以知道許多被稱為“Termamyl樣α-淀粉酶”的α-淀粉酶和其變體。Termamyl樣α-淀粉酶是非常耐熱的，因此適合在高溫下進行的生產過程，比如葡萄糖生產過程中的淀粉液化。
另外一組α-淀粉酶被稱為“FungamylTM樣α-淀粉酶”，是與從米曲霉(Aspergillus oryzae)中得到的α-淀粉酶相關或同源的α-淀粉酶。FungamylTM樣α-淀粉酶具有相對較低的熱穩(wěn)定性，由丹麥Novozymes A/S以FUNGAMYLTM為商品名出售的商業(yè)產品的最適溫度為55℃，不適合在高溫下進行的加工過程。FungamylTM樣α-淀粉酶目前常被用于例如釀造工業(yè)中制造糖漿。
顯然，提供一種優(yōu)選地在酸性pH下熱穩(wěn)定性提高的α-淀粉酶是非常有利的。盡管沒有新的認識，但實際在本領域有著相當長期的需要。早在1980，Somkuti和Steinberg就描述過一種他們設法從微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(微小毛霉(Mucor pusillus))中分離并鑒定的嗜熱嗜酸胞外α-淀粉酶。他們描述說“由于高溫和酸性的pH環(huán)境是經濟的淀粉水解的最適條件，工業(yè)用途中推薦使用微生物來源的耐熱和耐酸的淀粉酶”，從而得出有關根毛霉(Rhizomucor)α-淀粉酶的結論“這顯然是真菌α-淀粉酶同時顯示出嗜酸和嗜熱的第一個例子。因此，微小根毛霉的α-淀粉酶具有經濟重要性?！?Somkuti GA，Steinberg DH(1980)，微小毛霉的嗜熱嗜酸胞外淀粉酶，Dev Indust Microbiol 21327-337)。
然而，盡管早在1980年Somkuti和Steinberg就已得出非常清楚的結論，但編碼微小根毛霉α-淀粉酶的基因至今仍沒有得到克隆或序列測定，淀粉酶也至今沒能重組化生產達到工業(yè)上相應用量。1987年報導了一種改進的純化方法，但也僅能用于從野生型微小根毛霉中生產酶(Turchi SL和Becker T(1987)Curr Microbiol 15203-205)。
發(fā)明概述本發(fā)明欲解決的問題是，如何提供重組的嗜熱嗜酸α-淀粉酶。本發(fā)明人已經成功地從微小根毛霉中分離出編碼命名為AM782的α-淀粉酶的基因，他們已成功地將此編碼基因導入重組的工業(yè)絲狀真菌表達系統(tǒng)來生產α-淀粉酶。此淀粉酶的特征顯示它是一種高度嗜熱嗜酸的α-淀粉酶，用淀粉酶AM782催化麥芽糖糊精水解所得的糖圖譜證實了它具有很高的目的活性。
淀粉酶AM782能夠在很高的溫度下起作用，至少高達70℃。淀粉酶AM782具有很高的反應速度，與同等劑量的FungamylTM800L相比，淀粉酶AM782能在約3小時內達到FungamylTM所需24至48小時的效果。而且，淀粉酶AM782能夠將DP3降解成DP2和DP1，從而可獲得更高的DP1。
因此，第一方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包含一個開放閱讀框架，能夠編碼具有α-淀粉酶活性的多肽。所述多肽選自a)包含這樣氨基酸序列的多肽，其與SEQ ID NO4的氨基酸22至450位具有至少70％的同一性，優(yōu)選地與SEQ ID NO4的氨基酸22至450位具有75％的同一性，更優(yōu)選地具有80％，甚至更優(yōu)選地具有85％，甚至更優(yōu)選地具有90％，更優(yōu)選地具有95％，且最優(yōu)選地具有至少97％的同一性；b)包含這樣氨基酸序列的多肽，其與下述大腸桿菌(E.coli)宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334，優(yōu)選地與下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的多肽具有75％的同一性，更優(yōu)選地具有80％，甚至更優(yōu)選地具有85％，甚至更優(yōu)選地具有90％，更優(yōu)選地具有95％，且最優(yōu)選地具有至少97％的同一性，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334；c)由這樣的多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ ID NO3所示的68至1417位序列具有至少70％的同一性，優(yōu)選地與SEQ ID NO3所示的68至1417位序列具有75％的同一性，更優(yōu)選地具有80％，甚至更優(yōu)選地具有85％，甚至更優(yōu)選地具有90％，更優(yōu)選地具有95％，且最優(yōu)選地具有至少97％的同一性；以及d)具有α-淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
第二方面，本發(fā)明涉及包含如第一方面所述多核苷酸的核酸構建體，其中所述多核苷酸有效地連接到指導多肽在適宜宿主中產生的一個或多個控制序列上。
第三個方面涉及重組表達載體，其包含如第二方面所述的核酸構建體。
第四方面，本發(fā)明涉及重組宿主細胞，包含如第二方面所述的核酸構建體，或者至少一個如第三方面所述的表達載體的拷貝。
淀粉酶AM782及其同源物和變體的工業(yè)生產自然是非常令人感興趣的。
因此，第五方面，本發(fā)明涉及產生具有α-淀粉酶活性的多肽的方法，此多肽由第一方面所述的多核苷酸編碼，此方法包括(a)在有益于多肽產生的條件下培養(yǎng)如權利要求12-16中任意一項所述的重組宿主細胞；以及(b)回收多肽。
淀粉酶例如淀粉酶AM782有相當多有關的應用，在此給出其中一些主要應用的概述，它包括但不限于淀粉工業(yè)、食品加工業(yè)、紡織品工業(yè)和去垢劑工業(yè)。
因此，本發(fā)明的另外方面涉及酶促改性的淀粉衍生物的產生方法，其中，根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于淀粉液化和/或糖化；涉及高麥芽糖糖漿的生產方法，其中根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于淀粉的液化；涉及織物脫漿方法，其中根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于處理織物；涉及釀造方法，其中根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽在麥芽汁發(fā)酵過程中加入；還涉及醇生產方法，其中根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于酒廠麥芽漿中的淀粉液化；還涉及一種方法，其中將包含根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性多肽的面團產品進行烘焙。
本發(fā)明也考慮了AM782以及其同源物和變體的多種用途。
因此，本發(fā)明的許多非限制的方面涉及根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽在淀粉液化和/或糖化的轉化過程中的用途；涉及根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽在高麥芽糖糖漿生產過程中液化淀粉的用途；涉及根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽在織物脫漿中的用途；涉及根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽在醇生產中的用途；涉及根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽在釀造中的用途；涉及根據(jù)第五方面所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽在烘焙中的用途。
附圖簡述

圖1顯示純化的淀粉酶AM782的pH曲線。
圖2顯示純化的淀粉酶AM782的溫度曲線。
圖3-1至圖3-3顯示AM782分別在pH5及60℃、70℃和80℃下的剩余活度。
圖4-1至圖4-3顯示AM782分別在pH6及60℃、70℃和80℃下的剩余活度。
圖5-1至圖5-3顯示AM782分別在pH7及60℃、70℃和80℃下的剩余活度。
圖6顯示表達質粒pDAu71。
圖7顯示表達質粒pPFJo143。
圖8顯示實施例4的結果。
定義序列同源性和比對根據(jù)本發(fā)明的目的，序列比對和同源性分值的評估可以利用完整的Smith-Waterman比對來完成，對蛋白質和DNA的比對均有用。默認分值的矩陣BLOSUM50和單位矩陣(identity matrix)分別用于蛋白質和DNA的比對。在缺口(gap)的第一殘基處的罰分對于蛋白質是-12，對于DNA是-16，而缺口的其它殘基的罰分對于蛋白質為-2，對于DNA為-4。比對使用FASTA軟件包版本v20u6來完成(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988))，“生物序列分析的改良工具”，PNAS 852444-2448，以及W.R.Pearson(1990)“利用FASTP和FASTA進行快速靈敏的序列比對”Methods in Enzymology，18363-98)。
蛋白質序列的多重比對可以用″ClustalW″(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W通過序列權重、位點特異性缺口罰分和權重矩陣選擇來提高漸進性多重序列比對的靈敏度，NucleicAcids Research，224673-4680)。DNA序列的多重比對可以利用蛋白質比對作模板，將氨基酸用DNA序列的對應密碼子替換而進行。
基本純的多核苷酸在此術語“基本純的多核苷酸”涉及多核苷酸制備物，其中多核苷酸已從天然的遺傳環(huán)境中分離出來，脫離了其它無關或不需要的編碼序列，以適于應用的形式存在于基因工程蛋白生產系統(tǒng)中。因此，基本純的多核苷酸在重量上至多包含10％其它在自然條件下與其相關的多核苷酸(更低百分比的其它多核苷酸是優(yōu)選的，例如，重量上至多8％，重量上至多6％，重量上至多5％，重量上至多4％，重量上至多3％，重量上至多2％，重量上至多1％，以及重量上最多1/2％)。然而，基本純的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選的是，基本純的多核苷酸重量上至少92％是純的，即此種多核苷酸構成了制備物中存在的所有多核苷酸物質重量的至少92％，更高百分比是優(yōu)選的，例如至少94％是純的，至少95％是純的，至少96％是純的，至少97％是純的，至少98％是純的，至少99％是純的，以及最多99.5％是純的。此處所述多核苷酸優(yōu)選地以基本純的形式存在。特別是，此處所述多核苷酸以基本純的形式存在是優(yōu)選的，即多核苷酸制備物中基本無其它在天然上與之相關聯(lián)的多核苷酸物質。此處，術語“基本純的多核苷酸”與術語“分離的多核苷酸”和“分離形式的多核苷酸”是同義的。
cDNA本上下文所用的術語“cDNA”是意指能夠從來自于真核細胞的成熟、剪接的mRNA分子通過反轉錄制備的DNA分子。cDNA缺乏通常存在于基因組DNA中的相應內含子序列。最初，原初RNA轉錄物是mRNA的前體，它經過一系列的加工事件而成為成熟的經剪接mRNA。這些事件包括所謂剪接的內含子去除過程。從而，當cDNA來自于mRNA時即缺乏內含子序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面涉及分離的多核苷酸，它包含一個能編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的開放閱讀框，所述多肽選自a)包含這樣氨基酸序列的多肽，其與SEQ ID NO4的氨基酸22至450位具有至少70％同一性；b)包含這樣氨基酸序列的多肽，其與下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334；c)由這樣的多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ IDNO3所示的68至1417位序列具有至少70％的同一性；以及d)具有α-淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
用于分離或克隆編碼多肽的核苷酸序列的技術在本領域中公知，包括從基因組DNA的分離、從cDNA的制備或其組合。本發(fā)明中來自于此種基因組DNA的核苷酸序列的克隆能夠通過以下得以實現(xiàn)，例如通過利用眾所周知的聚合酶鏈反應(PCR)或表達庫的抗體篩選來檢測具有共有結構特征的克隆DNA片段。參見，例如，Innis等人，1990，PCRA Guide toMethods and Application，Academic Press，New York?？墒褂闷渌鼣U增方法，例如連接酶鏈反應(LCR)、連接激活的轉錄(LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)。核苷酸序列可從根毛霉菌株或其它相關生物體克隆出來，因而，例如，可為此核苷酸序列中多肽編碼區(qū)域的等位基因變體或種變體。
核苷酸序列可通過基因工程中用到的標準克隆方法來獲得，以將核苷酸序列從其天然的位置重新定位到其它位置并在此進行復制?？寺》椒òㄇ谐⒎蛛x包含編碼此多肽的核苷酸序列的目的片段，將此片段插入載體分子，并將此重組載體導入宿主細胞，核苷酸序列的多拷貝或克隆在其中得以復制。核苷酸序列可為基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成來源的或它們的任一組合。
術語“多肽變體”、“蛋白質變體”、“酶變體”、或僅僅“變體”是指本發(fā)明的多肽，所述多肽包含一個或多個改變，例如此多肽的一個或多個特異位點的一個或多個特異氨基酸殘基的替換、插入、缺失或截短。此類改變的總數(shù)一般不超過10個，例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、或九個所述改變。另外，本發(fā)明的變體可包括親本酶的其它修飾，一般不超過10個，例如，不超過5個此類修飾。這些變體通常與親本多肽具有一定程度的至少80％的序列同一性，例如，至少85％，一般至少90％，或至少95％。
術語“親本多肽”、“親本蛋白質”、“親本酶”、“標準酶”、或僅僅“親本”涉及那些作為變體基礎的多肽。此術語也涉及那些將變體與之相比較和比對的多肽。這些親本可為天然存在(野生型)多肽或者甚至是通過任何適宜方法制備的其變體。例如，親本蛋白質可為天然存在多肽的變體，其氨基酸序列已存在修飾或改變。親本也可為等位基因變體，所述等位基因變體是一個基因的占據(jù)著相同染色體基因座的兩個或多個改變形式中的任何一個。等位基因變體天然情況下通過突變引起，可導致如本領域所充分描述的群體多態(tài)性。多肽的等位基因變體是由相應基因的等位基因變體編碼而成的多肽。
術語“隨機文庫”、“變體文庫”、或僅僅“文庫”是指變體多肽的文庫。編碼變體的基因在DNA密碼子水平上的誘變產生了變體文庫的多樣性，由此例如在PCR反應中通過利用部分隨機序列的引物，從而使個體密碼子多樣化。已述幾種技術，利用它們將一個基因的幾個核苷酸位點多樣化并重組它們即可產生多樣的重組文庫，例如，在這些位點相距太遠而單一的(摻入的)寡核苷酸引物不能將其覆蓋的時候。這些技術包括如WO97/07205第3頁8至29行(Novozymes A/S)中所述的個別多樣化基因片段的體內重組。它們也包括用來產生全長基因文庫的DNA改組技術，其中將幾個基因片段組合且其中每個基因片段均可以是多樣化的，例如通過摻入誘變(spiked mutagenesis)形成(Stemmer，Nature 370，pp.389-391，1994和US 5,811,238；US 5,605,793；和US 5,830,721)。人們可以如WO 98/41623和WO 98/41622(Novozymes A/S)中所述的，利用編碼蛋白質“骨架”(野生型親本多肽)的基因作為模板，將其與一個或多個單鏈或雙鏈寡核苷酸結合。在合成中單鏈寡核苷酸可部分隨機化。雙鏈寡核苷酸可以是伴隨特定區(qū)域多樣化的PCR產物。在這兩種情況下，為了限制所引入變化的平均數(shù)目，人們可以用編碼骨架蛋白質序列的相應片段來減少多樣性。
寡聚或多聚核苷酸合成中插入到特異密碼子位點的核苷酸混合物(A；C；T；G)比率的設計方法也已建立，用于導入偏離(bias)以得到針對一個或多個目標氨基酸組的近似目標頻率分布，所述目標氨基酸由特異密碼子編碼。產生變體文庫也是有利的，它包含在多肽一級序列中不同位點處的許多已知氨基酸修飾的排列。這些可通過翻譯后修飾引入或化學修飾位點引入，或通過編碼基因的突變引入。從前已經證實修飾本身由于某種原因(例如，降低抗原性，或提高特異活性、性能、穩(wěn)定性或其它特性)可能是有益的。在這些例子中，產生已知序列的多種重組文庫也許是首先值得做的。例如，如果已知12個單突變，人們能夠組合親本蛋白質編碼基因的(至少)12種片段，其中每個片段以兩種形式存在一個帶有目的突變，另一個沒有。通過改變那些片段的相對量，人們可設計(大小為212)的文庫，可對其預測每個基因的突變平均數(shù)目。組合突變可為一種有用的方法，因為組合突變本身可產生一些但不充足的效果，而不需借助于非常大的文庫，但使用“摻入誘變”時需要非常大的文庫。另一種組合這些已知突變的方法為利用編碼這些已知突變的寡聚DNA的家族步移，所述寡聚DNA帶有全長的野生型序列的片段。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中此多肽是人工變體，包含這樣的氨基酸序列與SEQ ID NO4的22至450位氨基酸相比，有一個或多個截短、和/或氨基酸的至少一個替換、缺失、和/或插入。
對本領域的技術人員來說，顯然能夠在分子的功能關鍵性區(qū)域之外進行這些修飾，從而仍然形成活性多肽。對本發(fā)明的核苷酸序列編碼的多肽，其活性所必需的氨基酸殘基并因此優(yōu)選地不進行修飾例如替換的氨基酸殘基能夠根據(jù)本領域所公知的方法得以確定，例如，定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)。在后一技術中，在分子的每個正電荷殘基處引入突變，并且對所得到的突變分子測試其淀粉酶活性，以確定分子活性的關鍵性氨基酸殘基。用所合成的突變體分子測定底物-酶相互作用的位點也能夠通過三維結構的分析來確定，所述三維結構可通過如核磁共振分析、晶體學或光敏親和標記這些的技術來確定(參見，例如，de Vos等人，1992，Science 255306-312；Smith等人，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaveret等人，1992，F(xiàn)EBS Letters 30959-64)。
而且，編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可以通過引入核苷酸替換來修飾，所述替換不會產生由此核苷酸序列編碼的多肽的其它氨基酸序列，但其符合生產酶所用宿主生物的密碼子使用。
將突變引入核苷酸序列使一個核苷酸換為另一個氨基酸，可利用本領域已知的任何一種方法通過定點誘變來完成。這種方法尤其有用，它利用帶有目的插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和兩個包含目的突變的合成引物。每個各自與載體中相反的鏈互補的寡核苷酸引物，在溫度循環(huán)中通過PfuDNA聚合酶而得以延伸。摻入引物后，生成了包含錯配缺口的質粒。接下來的溫度循環(huán)中，產物經DpnI處理，DpnI特異作用于甲基化和半甲基化DNA，以消化親本DNA模板并用于選擇包含突變的合成DNA。本領域已知的其它方法也可用。核苷酸替換更普遍的描述參見例如，F(xiàn)ord等人，1991，Protein Expression and Purification 295-107。
另一優(yōu)選的實施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽包含與SEQID NO4的22至450位氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列，優(yōu)選地包含與SEQ ID NO4的22至450位氨基酸具有至少75％，更優(yōu)選地具有80％，甚至更優(yōu)選地具有85％，甚至更優(yōu)選地具有90％，更優(yōu)選地具有95％，且最優(yōu)選地具有至少97％同一性的氨基酸序列。
還有另一優(yōu)選的實施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽包含SEQID NO4的22至450位的氨基酸。
在優(yōu)選的實施方案中本發(fā)明涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽由SEQID NO4的22至450位氨基酸組成。
還有另一優(yōu)選的實施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽包含這樣的氨基酸序列，其與下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334；優(yōu)選地與下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的多肽具有75％的同一性，更優(yōu)選地至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少95％同一性，或具有至少97％的同一性，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334；優(yōu)選地，此多肽包含下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的氨基酸序列，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334；更優(yōu)選地，此多肽由下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的氨基酸序列組成，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM15334。
另一優(yōu)選的實施方案涉及第一方面的多核苷酸，其中多肽是包含這樣氨基酸序列的人工變體，其與下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的氨基酸序列相比，具有一個或多個截短、和/或氨基酸的至少一個替換、缺失、和/或插入，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334。
核酸構建體術語“核酸構建體”用于此處是指這樣的單鏈或雙鏈核酸分子，其分離自天然存在的基因，或其已經過修飾，以包含以自然界不存在的方式存在的核酸片段。
當核酸構建體包含本發(fā)明的編碼序列表達所需的控制序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義?？蓮亩喾N途徑操作本發(fā)明中編碼多肽的多核苷酸來提供多肽的表達。插入載體之前對核苷酸序列的操作是值得的或是依賴于表達載體所必要的。利用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術是本領域公知的。
此處所述術語“控制序列”包括對本發(fā)明的多肽表達所必要或有利的所有組分。每個控制序列對編碼多肽的核苷酸序列來說可是天然的或是外來的。這些控制序列包括但不限于前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽(propeptide)序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。至少，控制序列包括啟動子、轉錄和翻譯停止信號?？刂菩蛄锌蓳碛羞B接子，用于引入特異的限制性位點，該位點促進控制序列與編碼多肽的核苷酸編碼序列編碼區(qū)的連接。
此處術語“有效地連接”定義為下述構型，在此構型中控制序列合適地置于與DNA序列的編碼序列相關的位置，從而控制序列指導多肽的表達。
此處所用術語“編碼序列”意指直接指定其蛋白質產物的氨基酸序列的核苷酸序列。通常由ATG起始密碼子開始的開放閱讀框架一般決定了編碼序列的邊界。編碼序列一般包括DNA、cDNA和重組核苷酸序列。
本發(fā)明的一個方面涉及核酸構建體，該核酸構建體包含如第一方面所述的多核苷酸有效地連接到一個或多個指導多肽在適宜宿主中產生的控制序列上。
表達載體在本上下文中，術語“表達”包括多肽合成中有關的任何步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
在本上下文中，術語“表達載體”包含線性或環(huán)形的DNA分子，該DNA分子包含編碼本發(fā)明多肽的片段，且其有效連接到另外提供轉錄的片段上。
本發(fā)明的一方面涉及重組表達載體，該載體包含如前一方面所述的核酸構建體。
根據(jù)本發(fā)明，編碼本發(fā)明淀粉酶的多核苷酸能夠利用表達載體來表達，所述表達載體一般包括控制序列，例如啟動子、操縱子、核酸結合位點、翻譯起始信號和任選地抑制子基因或多種激活子基因。攜帶編碼本發(fā)明α-淀粉酶的多核苷酸的重組表達載體可為任何一個可進行重組DNA操作的載體，載體的選擇常常取決于其所導入的宿主細胞。導入的載體可為這樣一個載體，當其導入宿主細胞時，整合到宿主細胞基因組并與其整合的染色體一同復制。合適的表達載體的例子包括pMT838。
在載體中，DNA序列應當有效地連接到合適的啟動子序列上。啟動子可為任何DNA序列，該序列在選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性，且可來源于與宿主細胞同源或異源的蛋白質的編碼基因。
本發(fā)明的表達載體還可包含一個合適的轉錄終止子，且在真核生物中，多聚腺苷酸化序列有效地連接到編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列上。終止序列和多聚腺苷酸化序列可適宜地與啟動子來自于相同的來源。
載體進一步可包含能使載體在所述宿主細胞中復制的DNA序列。質粒pUC19、pACYC177、pUB110，、pE194，、pAMB1和pIJ702復制起點就是這種序列的例子。
載體也可包含可選擇標記，例如，其產物可彌補宿主細胞缺陷的基因，例如，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)中的dal基因，或賦予其抗生物素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。此外，載體可包含曲霉屬的選擇標記，例如amdS、argB、niaD和sC(可產生潮霉素抗性的標記)，或可通過共轉化來完成的選擇，例如，如WO 91/17243所述。
用于分別連接本發(fā)明的編碼葡糖淀粉酶變體、啟動子、終止子和其它元件的DNA構建體以及將它們插入到含有復制必需信息的適當載體的方法，對本領域技術人員是眾所周知的(參見，例如，Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。
指導編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列轉錄尤其是在細菌宿主中轉錄的合適啟動子的例子，有大腸桿菌lac操縱子的啟動子、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因dagA啟動子、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的啟動子、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥芽糖淀粉酶基因(amyM)的啟動子、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的啟動子、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的啟動子等等。對于真菌宿主的轉錄，有用啟動子的非限制性的例子是那些來源于下述編碼基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶基因的啟動子、來自于釀酒酵母的TPI(磷酸丙糖異構酶)啟動子(Alber等人(1982)，J.Mol.Appl.Genet 1，p.419-434)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶或構巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的啟動子、以及其突變的、截短的、和/或雜化啟動子(hybrid promoter)。
絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選終止子的例子是從下述基因得到的米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶和尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
控制序列也可為合適的前導序列、mRNA中對宿主細胞的翻譯過程重要的非翻譯區(qū)域。前導序列有效地連接到編碼多肽的核苷酸序列的5’端。任何在所選的宿主細胞中有功能的前導序列均可用于本發(fā)明。
絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導序列從米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉磷酸丙糖異構酶基因中獲得。
控制序列也可為有效地連接于核苷酸序列3’末端的多聚腺苷酸化序列，并在轉錄時作為添加多腺苷酸殘基到轉錄的mRNA的信號而被宿主細胞識別。任何在所選地宿主細胞中有功能的多聚腺苷酸化序列均可用于本發(fā)明。
絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的多聚腺苷酸化序列從下述基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡萄糖苷酶。
控制序列也可為信號肽編碼區(qū)域，該區(qū)域編碼連接到多肽氨基末端上的氨基酸序列，指導所編碼的肽進入細胞的分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列的5’端可固有一個天然地與編碼區(qū)域片段一起連接到翻譯閱讀框架中的信號肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)編碼分泌的多肽。備選地，編碼序列的5’端可包含對于編碼序列是外來的信號肽編碼區(qū)域。在編碼序列天然不包含信號肽編碼區(qū)域時，可能需要外來的信號肽編碼區(qū)域。備選地，外來的信號肽編碼區(qū)域可能僅僅是代替了天然信號肽編碼區(qū)域以增強多肽的分泌。然而，任何指導表達蛋白進入所選宿主細胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)域均可用于本發(fā)明。
對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼區(qū)域可以是從下述基因獲得的信號肽編碼區(qū)域芽孢桿菌NCBI 11837生麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因。Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57109-137描述了更多信號肽。
絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽是從下述基因中獲得的信號肽米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因。
控制序列也可為編碼定位于多肽氨基末端的氨基酸序列的多肽編碼區(qū)域。所得的多肽已知為酶原或前多肽(或在一些情況下為酶原)。前多肽通常是非活性的，且能夠通過催化或自身催化分解而從前多肽轉變成成熟有活性的多肽。前肽編碼區(qū)域可以從下述基因獲得枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)的基因。在信號肽和前肽區(qū)域都存在于多肽的氨基端時，前肽區(qū)域定位于緊鄰多肽的氨基端，信號肽區(qū)域定位于緊鄰前肽區(qū)域的氨基端。
添加與宿主細胞生長相關的允許調節(jié)多肽表達的調節(jié)序列是值得做的。那些響應化學或物理刺激引起基因表達的開或關的調節(jié)系統(tǒng)是調節(jié)系統(tǒng)的例子，其包括調節(jié)化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱子系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可用作調節(jié)序列。
調節(jié)序列的其它例子是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些包括在氨甲蝶呤存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，以及用重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將有效地與調節(jié)序列連接在一起。
載體可為自主復制載體，即以染色體外實體存在的載體，它的復制獨立于染色體的復制，例如，質粒(一種染色體外的元件)、微型染色體或人工染色體。
載體可包括確保自我復制的任一工具。備選地，載體可為一個這樣的載體，當其導入宿主細胞時整合進基因組并與其所整合的染色體一同復制。而且，可使用單個載體或質粒、或者兩個或多個載體或質粒、或者轉座子，其中所述兩個或多個載體或質粒合起來含有導入宿主細胞基因組的總DNA。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地包含一個或多個可選擇標記，使轉化細胞容易選擇?？蛇x擇標記是一個基因，其產物提供了殺蟲劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營養(yǎng)缺陷型等。
細菌可選擇標記的例子有枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生物素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。用于絲狀真菌宿主細胞的可選擇標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷?；D移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)以及其等同物。
優(yōu)選地用于曲霉屬細胞的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地包含這樣的元件，它允許載體穩(wěn)定整合入宿主細胞的基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復制。
對于進入宿主細胞基因組的整合，載體可依賴于編碼多肽的核苷酸序列或載體的其它元件，用于通過同源或非同源重組穩(wěn)定整合進基因組。備選地，載體可包含另外的核苷酸序列指導通過同源重組進入宿主細胞基因組的整合。另外的核苷酸序列使載體在染色體精確的位置處整合進入細胞基因組。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應當優(yōu)選地包含充分數(shù)量的核苷酸，比如100至1500堿基對，優(yōu)選地400至1500堿基對，且最優(yōu)選地800至1500堿基對，其與相應靶序列高度同源，以增加同源重組的可能性。整合元件可為任何與宿主細胞基因組的靶序列同源的序列。而且，整合元件可為非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合進入宿主細胞基因組。
對于自主復制，載體進一步可包含能夠使載體在所述宿主細胞中自主復制的復制起點。細菌復制起點的例子有允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復制起點，以及允許在芽孢桿菌中復制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復制起點。AMA1序列就是在絲狀真菌宿主細胞中確保自主維持序列的例子。復制起點可為一個具有突變的序列，該突變使其在宿主細胞中具有功能性溫度敏感(參見，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 751433)。
本發(fā)明的多于一個拷貝的核苷酸序列可以插入到宿主細胞以增加基因產物的產生。核苷酸序列拷貝數(shù)量的增加能夠通過整合至少一個額外拷貝的此序列進入宿主細胞基因組，或通過隨核苷酸序列包含一個可擴增的選擇標記基因來獲得，其中此細胞包含可選擇標記基因的擴增拷貝，因此核苷酸序列的額外拷貝能夠通過在合適的選擇性試劑中培養(yǎng)細胞來篩選。
宿主細胞包含如上所述的本發(fā)明DNA構建體或表達載體的本發(fā)明細胞，有利地用作本發(fā)明α-淀粉酶變體的重組產生的宿主細胞。該細胞可用編碼本發(fā)明變體的DNA構建體便利地通過將DNA構建體(一個或多個拷貝)整合到宿主染色體來獲得轉化。整合通常被認為是有利條件，因為DNA序列更可能在細胞中穩(wěn)定地維持。DNA構建體整合到宿主染色體可以根據(jù)常規(guī)的方法來實施，例如，通過同源或異源重組。備選地，細胞可以用上述與不同類型宿主細胞相關的表達載體來轉化。
本發(fā)明的細胞可以是高等生物體例如哺乳動物或昆蟲的細胞，但是優(yōu)選地是微生物細胞，例如，細菌或真菌(包括酵母)細胞。
適合的細菌的例子有革蘭氏陽性細菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、短芽孢桿菌(bacillus brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)或變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)，或者革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌。細菌的轉化可通過例如原生質體轉染或利用感受態(tài)細胞以本來已知的方式來實現(xiàn)。
宿主細胞也可為絲狀真菌，例如，屬于曲霉屬最優(yōu)選地米曲霉或黑曲霉的菌株，或鐮孢屬的菌株，例如尖孢鐮孢、禾谷鐮孢(Fusariumgraminearum)(在理想狀態(tài)稱為Gribberella zeae，先前稱為Sphaeriazeae，與Gibberella roseum和Gibberella roseum f.sp.cereals同義)、或硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)(在理想狀態(tài)稱為Gibberella puricaris，與Fusarium trichothecioides、桿孢狀鐮孢、接骨木鐮孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium sambucium、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)和Fusarium roseum var.graminearum同義)、Fusarium cereals(與Fusariumcrokkwellnse同義)、或Fusarium venenatum的菌株。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是蛋白酶缺陷的或蛋白酶欠缺的菌株。例如可以是曲霉屬的蛋白酶缺陷株，尤其是具有刪除了名為“alp”的堿性蛋白酶基因的米曲霉菌株例如米曲霉JaL125。此菌株在WO97/35956(Novo Nordisk)中有描述。
絲狀真菌細胞可以通過包括原生質體形成和轉化及隨后的細胞壁重建的過程以本來已知的方式來進行轉化。將曲霉屬作為宿主微生物在EP 238023(Novo Nordisk)中有所描述，引用其內容作為參考。
本發(fā)明的一方面涉及包含上述核酸構建體或至少一個上述表達載體的拷貝的重組宿主細胞。優(yōu)選的實施方案涉及前一方面的細胞，所述細胞是微生物；優(yōu)選地是細菌或真菌的細胞；更優(yōu)選地是革蘭氏陽性細菌細胞例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌，或最優(yōu)選地是真菌曲霉屬尤其是米曲霉的蛋白酶缺陷菌株的細胞。
產生本發(fā)明α-淀粉酶變體的方法在進一步的方面，本發(fā)明涉及產生本發(fā)明α-淀粉酶變體的方法，該方法包括在有益于變體產生的條件下培養(yǎng)宿主細胞，和從細胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。
用于培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基可為任何適于所述宿主細胞生長和α-淀粉酶變體獲得表達的常規(guī)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應商得到或根據(jù)公開的配方配備(例如，the American Type Culture Col-lection的目錄所述)。
宿主細胞分泌的α-淀粉酶變體可通過熟知的方法方便地從培養(yǎng)基中回收，所述方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞，和通過鹽例如硫酸胺的方式沉淀蛋白質級分，接著利用層析方法例如離子交換層析、親和層析等。
使用如此產生的淀粉酶的多種方法以及更多具體用途在本發(fā)明的其它方面已列出，如已經在本發(fā)明概述中提到。
本發(fā)明提供了利用本發(fā)明多核苷酸編碼的α-淀粉酶從淀粉產生葡萄糖或麥芽糖等的方法。
通常，方法包括，在α-淀粉酶存在下部分水解前體淀粉和然后在葡糖淀粉酶存在下通過剪切α-(1 4)和α-(1 6)糖苷鍵進一步水解從淀粉或相關寡糖和多糖分子的非還原性末端釋放D-葡萄糖的步驟。
利用α-淀粉酶的前體淀粉的部分水解通過水解內部的α-(1 4)-鍵提供了淀粉分子的初步分解。商業(yè)應用中，利用α-淀粉酶的初步水解在大約105℃的溫度下進行。對高的淀粉濃度通常是30％到40％的干燥固體進行處理。初步水解通常在此提高的溫度下進行約5分鐘。然后將部分水解的淀粉轉移至第二個罐中，在85℃到90℃下孵育大約一小時以獲得10到15的葡萄糖等同物(D.E.)。
在葡糖淀粉酶存在下進一步水解，從淀粉或相關寡糖和多糖分子的非還原性末端釋放D-葡萄糖的步驟，通常在30℃與60℃之間的降低的溫度下在單獨的罐中進行。優(yōu)選地底物液體的溫度降至55℃和60℃之間。溶液的pH從6-6.5降至3-5.5。優(yōu)選地，溶液的pH是4-4.5。葡糖淀粉酶加入溶液中且反應進行24-72小時，優(yōu)選地36-48小時。
由本發(fā)明的多核苷酸編碼的α-淀粉酶也可用于釀造過程。此外，本發(fā)明的多核苷酸編碼的α-淀粉酶可用于麥芽糖生產。高麥芽糖糖漿一般如下生產。為生產“高麥芽糖糖漿”(包含50％-55％的麥芽糖)，淀粉要液化至DE10-20。將液化淀粉的pH和溫度分別調至65℃和pH約5.0，且置于生麥芽糖淀粉酶活性(例如，嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶，例如MaltogenaseTM4000L，0.4I/t DS(Novozymes))，支鏈淀粉酶活性(例如，支鏈淀粉酶芽孢桿菌(Bacillus pullulanase)，例如PromozymeTM600L，0.3I/t DS(Novozymes))和α-淀粉酶活性(例如，BAN 240L或TermamylTM120L，type LS，0.4kg/t DS(Novozymes))中24-41小時。具體的處理時間取決于所要達到的目的糖圖譜。通過增加生麥芽糖α-淀粉酶和支鏈淀粉酶的量，麥芽糖含量能夠得以增加。
備選地，“高麥芽糖糖漿”可以通過下述步驟生產首先液化淀粉至DE10-20，然后調整pH和溫度至55℃或更高且pH約5.5或更低，然后將液化淀粉置于真菌α-淀粉酶的活性(例如，嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶，例如FungamylTM800L(Novozymes))中22-44小時。真菌FungamylTM800L的量取決于預見的糖化作用的時間，例如，200g/tDS 44小時和400g/t DS 22小時。在以上過程中本發(fā)明的多核苷酸編碼的α-淀粉酶可以取代FungamylTM800L，然后溫度可更高且pH更低，可達到更高的轉化率從而產生更好更全面的節(jié)約。
為生產麥芽糖含量為55-65％的“高麥芽糖糖漿”淀粉，淀粉要液化至DE10-20。液化淀粉的溫度和pH調整至60℃或更高，pH至約6或更低，置于生麥芽糖α-淀粉酶活性(例如，MaltogenaseTM4000L，0.25-1.0I/t DS(Novozymes))和真菌α-淀粉酶活性(例如，曲霉屬淀粉酶，例如Fungamyl)TM800L，0.4-1.0kg/t DS(Novo Nordisk))中24-48小時；或者置于本發(fā)明的多核苷酸編碼的α-淀粉酶更短的時間。
本發(fā)明的α-淀粉酶變體也可用于烘焙工藝。本發(fā)明的一方面涉及本發(fā)明的變體對于淀粉轉化、醇生產、釀造和烘焙的用途。
本發(fā)明也涉及生產麥芽糖糖漿的方法，該方法包括下述步驟1)在α-淀粉酶存在下液化淀粉；2)在本發(fā)明的真菌α-淀粉酶變體存在下糊精化；和3)回收糖漿并任選地純化糖漿。
在步驟1)中用于液化的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。優(yōu)選的α-淀粉酶是芽孢桿菌α-淀粉酶，例如Termamyl-樣α-淀粉酶，包括地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(商業(yè)上可獲得的如TermamylTM(NovoNordisk))、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(出售的如BAN(Novo Nordisk)、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶(出售的如TermamylTM120L typeS)、來自芽孢桿菌菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375的α-淀粉酶(在WO 95/26397中均有詳述)、和由Tsukamoto等人，Biochemical and Biophysical Research Communications，151(1988)，25-31頁所述的α-淀粉酶。在“Termamyl-樣α-淀粉酶”定義中的α-淀粉酶在例如WO 96/23874(Novo Nordisk)中有描述。
另一方面本發(fā)明涉及生產麥芽糖的方法，包括下述步驟1)在溫度140-160℃，pH4-6下液化淀粉；2)本發(fā)明的真菌α-淀粉酶變體存在時pH4-6，60-95℃尤其是在65-85℃，例如70-80℃的溫度下糊精化；和3)回收糖漿和任選地純化糖漿。
在本發(fā)明的實施方案中，在步驟2)中加入有效量的葡糖淀粉酶。本實施方案(包括用葡糖淀粉酶的處理)中的糖漿將不是麥芽糖糖漿，而是有著不同糖圖譜的糖漿。葡糖淀粉酶可以是曲霉屬葡糖淀粉酶，尤其是黑曲霉葡糖淀粉酶。
備選地，該方法包括如下步驟1)在芽孢桿菌α-淀粉酶存在時，在溫度95-110℃，pH4-6下液化淀粉；2)在如本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸編碼的α-淀粉酶存在時，在溫度70-95℃，pH4-6下液化淀粉，隨后回收和/或任選純化所得產物。
最后，本發(fā)明的一些方面涉及多種去垢劑的用途。一方面涉及包含如第一方面所述多核苷酸編碼的α-淀粉酶的去垢添加劑，優(yōu)選地以無粉塵顆粒、穩(wěn)定的液體或受保護酶的形式存在。此方面的優(yōu)選實施方案涉及每克添加劑中包含0.02-200mg酶蛋白質的去垢添加劑。另一優(yōu)選實施方案涉及根據(jù)前一方面的去垢添加劑，其另外包含其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、其它淀粉分解酶和/或纖維素酶。另一方面涉及包含如第一方面所述多核苷酸編碼的α-淀粉酶的去垢劑組合物，該方面的優(yōu)選實施方案涉及另外包含其它酶例如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、其它淀粉分解酶和/或纖維素酶的去垢劑組合物。還有另一方面涉及手工或自動的洗碗盤的去垢劑組合物，該組合物包含如第一方面所述多核苷酸編碼的α-淀粉酶變體。優(yōu)選的洗碗盤去垢劑組合物另外包含其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、其它淀粉分解酶和/或纖維素酶。去垢劑最后所涉及的方面是手工的或自動的洗衣洗滌組合物，其包含如第一方面所述的多核苷酸編碼的α-淀粉酶；且優(yōu)選的洗衣洗滌組合物相應地另外包含其它酶，例如蛋白酶、脂肪酶、過氧化物酶、淀粉分解酶和/或纖維素酶。
實施例實施例1從微小根毛霉NN046782中純化并表征α-淀粉酶。
命名為AM782的α-淀粉酶純化于嗜熱真菌菌株NN046782的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)其在60、70和80℃，pH＝5.0、6.0和7.0時比BAN(解淀粉芽孢桿菌)淀粉酶更加穩(wěn)定。特性概述如下分子量(SDS)＝50kDa(SDS-PAGE)pI pH3.5活性pH范圍 pH3-9最適pH pH4-5活性溫度范圍30-80℃
最適溫度70℃pH穩(wěn)定性在pH＝5、6、7下穩(wěn)定真菌生長培養(yǎng)基YG酵母-葡萄糖瓊脂5.0g Difco粉狀酵母提取物；10.0g葡萄糖20.0g瓊脂； 1000ml自來水121℃高壓滅菌15-20分鐘。
FG-4培養(yǎng)基50ml/瓶30g大豆粉， 15g麥芽糖5g蛋白胨 1000ml水1g橄欖油(2滴/瓶)50ml放入帶有2擋板的500ml錐形瓶。121℃高壓滅菌30分鐘。
在YG瓊脂平板(4.5cm直徑)上45℃黑暗中培養(yǎng)真菌3天，用于接種搖瓶。用前將長滿真菌培養(yǎng)物的平板置于4℃存放。
對于酶的產生，將上述平板中長滿真菌培養(yǎng)物的4-6個瓊脂塞(plugs)用于接種一個含有FG-4的搖瓶，45℃下160轉/分鐘72小時培養(yǎng)，然后在8000轉/分鐘和4℃下離心培養(yǎng)基30分鐘來收獲。收集上清用于酶純化。
化學藥品和試劑BAN標準和FungamylTM800L(NovozymesA/S，Denmark)用作基準。
AZCL-直鏈淀粉(Megazyme)用于酶試驗。
其它化學試劑和緩沖液包括25mM Tris-HCI，pH7.0；25mM Tris-HCI；1M NaCI，pH7.0；0.1MNa3PO4/檸檬酸，pH5.5；硫酸胺；0.1M NaAc，pH5.0；0.1M MES，pH6.0；0.1M Tris-HCI，pH7.0緩沖液用于pH譜100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCI，0.01％TritonX-100，用HCI或NaOH調整至pH值2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0和11.0。
酶活性測試微量滴定板試驗用上清通過微量滴定板測定法來測試α-淀粉酶活性。將0.2％的藍色底物AZCL-直鏈淀粉(Megazyme)溶液在攪拌下懸于0.1M的磷酸檸檬酸鹽緩沖液(pH5.5)或Tris-HCl緩沖液(pH7)中。攪拌下將溶液分裝入微量滴定板(200μl每孔)。加入20μl酶樣品，在Eppendorf熱攪拌器中50℃和650轉/分鐘孵育平板15-30分鐘。100℃煮沸20分鐘制備變性的酶樣品，然后用作空白對照。孵育后通過4℃下3000轉/分鐘離心5分鐘將有色液體與固體分離開。然后將150μl上清轉至微量滴定板，用BioRadMicroplate Reader在595nm下測定吸光度。
Eppendorf管測定將0.2％的藍色底物AZCL-直鏈淀粉(Megazyme)溶液在攪拌下懸于不同pH值的緩沖液。攪拌下將溶液分裝入1.5ml的Eppendorf管(每管900μl)，每管加入100μM酶樣品，然后將它們在50℃水浴中孵育10-60分鐘。變性的酶樣品(100℃煮沸20分鐘來制備)用作空白對照。孵育后通過在4℃下5000轉/分鐘離心10分鐘將有色溶液與固體分離開。然后將200μl的上清轉至微量滴定板并用BioRad Microplate Reader在595nm測定吸光度。
等電聚焦等電聚焦根據(jù)廠商的使用說明書在預制的pH3.5-9.5的Apholine PAG板(Pharmacia，Sweden)中進行。樣品一式三份進行，電泳后將膠分為三份。將在pH5-7的緩沖液中含1％瓊脂糖和0.4％AZCL-直鏈淀粉的覆蓋層注入每部分凝膠，所述凝膠在45℃孵育12-16小時。酶活性和酶蛋白質的pI通過藍帶進行鑒定。
SDS-PAGE為檢測所純化酶的純度和確定其分子量，用30μl的酶樣品進行12％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。100V跑膠1.5小時并用考馬斯亮蘭染色。
酶純化用硫酸胺(80％飽和)沉淀菌株NN046782的300ml上清并再溶解在20ml 25mM pH7.0的Tris-HCl緩沖液中，然后用同樣的緩沖液透析并通過0.45mm的濾器過濾，終體積為200ml。將溶液加入用pH7.0、25mMTris-HCl緩沖液平衡過的35ml Source 15Q柱，并用線性NaCl梯度(0-0.3M)洗脫蛋白質。在pH5.5時分析從柱中所得的級分對于AZCL-直鏈淀粉的淀粉酶活性。將有淀粉酶活性的級分混合。然后將混合的溶液超濾，濃縮的溶液加入到用pH7.0的25mMTris-HCl平衡過的180mlSuperdex75柱中，用相同的緩沖液洗脫蛋白質。包含淀粉酶的級分通過SDS-PAGE進行分析并將純級分混合。
酶特性描述pH譜20μl酶樣品和在下述有著不同pH的緩沖系統(tǒng)(100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCI2，150mM KCI，0.01％Triton X-100，用HCI或NaOH調整至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0)中的200μl 0.2％AZCL-直鏈淀粉在微量滴定板中混合并在反應前置于冰上。通過將微量滴定板轉至Eppendorf熱攪拌器中開始測定，測定溫度設置為50℃。將此板在Eppendorf熱攪拌器上以650轉/分鐘的震動速度孵育20分鐘。通過將板移回冰浴終止孵育。然后在冰冷離心機中將此板離心幾分鐘并將150μl上清移至新的微量滴定板。讀取吸光度-OD595作為淀粉酶活性的測量尺度。所有反應重復進行三次，緩沖液空白包括在測試中(代替酶)。BAN和FungamylTM商業(yè)化的酶用作陽性對照。結果如圖1所示。
溫度譜裝有200μl溶在0.1M pH5.5Na3PO4/檸檬酸緩沖液中的0.2％AZCL-直鏈淀粉的Eppendorf管在20、30、40、50、55、60、70、80℃下預孵育。通過將20μl酶樣品與緩沖液混合而開始測定。管子在Eppendorf熱攪拌器上以其最高震動速度(1400轉/分鐘)孵育10分鐘。通過將管移至冰浴終止孵育。然后將管子在冰冷離心機上離心幾分鐘并將150μl上清移至微量滴定板中。讀取OD595作為淀粉酶活性的測量尺度。所有反應均重復三次且緩沖液空白包括在測定中(代替酶)。BAN和FungamylTM用作對照。結果如圖2所示。
pH和溫度穩(wěn)定性Eppendorf管中的80μl酶樣品(用0.1M NaAc pH5.0，0.1M MESpH6.0，0.1M Tris-HCI pH7.0分別稀釋)在Eppendorf熱攪拌器上，于60、70、80℃和300轉/分鐘的震動孵育5、10、15和20分鐘。通過將管子移回冰浴終止孵育。未孵育的樣品用作對照。將20μl上述孵育的樣品移入新的微量滴定板中并加入200μl溶于0.1M Na3PO4/檸檬酸緩沖液pH5.5中的0.2％AZCL-直鏈淀粉。通過將微量滴定板轉至Eppendorf熱攪拌器中開始測定，測定溫度設置為50℃。將此板在Eppendorf熱攪拌器上以650轉/分鐘的震動速度孵育30分鐘。通過將板移回冰浴終止孵育。然后將板在冰冷離心機上離心幾分鐘并將150μl上清移至新的微量滴定板中。讀取OD595作為淀粉酶活性的測量尺度。所有反應均重復三次且緩沖液空白包括在測定中(代替酶)。BAN和FungamylTM用作對照。結果如圖3-5所示。
副活性(side activity)測試純化的淀粉酶在pH7.0的下述底物中測試AZCL-半乳甘露聚糖、AZCL-β-葡聚糖、AZCL-右旋糖酐、AZCL-木糖葡聚糖、AZCL-馬鈴薯半乳聚糖、AZCL-阿拉伯聚糖(arabinan)、AZCL-支鏈淀粉、AZCL-木聚糖、AZCL-半纖維素(he-cellulose)、AZCL-酪蛋白。在任何底物中均未檢測出副活性。
純化的淀粉酶的純度在12％SDS-PAGE中檢查，在SDS-PAGE中顯示此酶的分子量大約50KDa，通過IEF所確定的AM782的pI大約是3.5。
實施例2克隆編碼微小根毛霉NN046782的AM782α-淀粉酶基因。
真菌菌株及其培養(yǎng)微小根毛霉NN046782在45℃、165轉/分鐘在含有2％淀粉的FG4培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。通過7000轉/分鐘離心30分鐘收獲菌絲體。收獲的菌絲體在用于RNA提取前儲存在-80℃。
總RNA的提取利用RNeasy Mini Kit(Qiagen)從100mg菌絲體中提取總RNA。
特異引物來自于微小根毛霉NN046782的淀粉酶AM782被發(fā)現(xiàn)有著與我們在前一項目中鑒定和測序的微小根毛霉NN101459菌株的淀粉酶編碼基因相同的N-末端序列。因此從先前確定的DNA序列設計出兩條特異引物，并將這些用于從NN046782克隆淀粉酶。
引物AM298-CDSF(SEQ ID NO1)5′tat cat gaa att cag cat引物AM298-CDSR(SEQ ID NO2)5′agt tca aaa tgg aca aag t用下列的PCR反應系統(tǒng)和條件Pfu DNA聚合酶含MgSO4的10×PCR緩沖液 5μl10mM dNTP混合物1μl引物AM298-CDSF(10μM) 1μl引物AM298-CDSR(10μM) 1μl
pfu DNA聚合酶(3u/μl)0.5μlcDNA合成反應(模板) 2μl加高壓滅菌的蒸餾水至 50μl條件95℃ 3分鐘95℃ 30秒鐘45或50或53℃ 30秒鐘40個循環(huán)72℃ 3分鐘72℃ 7分鐘PCR產物用瓊脂糖凝膠顯示并將特異條帶進行鑒定和純化。從而0.3μl的該PCR產物用作模板在下列條件下進行第二輪PCR。
Pfu DNA聚合酶含MgSO4的10×PCR緩沖液 5μl10mM dNTP混合物 1μl引物AM298-CDSF(10μM)1μl引物AM298-CDSR(10μM)1μlpfu DNA聚合酶(3u/μl)0.5ulcDNA合成反應 0.3μl加高壓滅菌的蒸餾水至 50μl條件95℃ 3分鐘95℃ 30秒鐘55℃ 30秒鐘40個循環(huán)72℃ 3分鐘72℃ 7分鐘擴增結果是一條大約1.5kb大小的特異條帶。用Taq DNA聚合酶(PCR產物20μl，10×緩沖液2μl，Mg2+1μl，dATP(10mM)0.5μl，Taq聚合酶(5單位/μl)0.3μl)將PolyA尾加上并在72℃下孵育30分鐘。用GFX Kit從凝膠中將加了dA-尾的片段回收并再溶解在30μl水中。然后將純化的片段連接到pGEM-T載體中(通過混合2×緩沖液10μl、T載體(50ng/l)1μl、T4連接酶(3單位/l)1μl和純化的PCR產物8μl；然后置之于4℃過夜)，并將它轉化入感受態(tài)細胞(轉化條件1μl連接溶液和40μlDH10B感受態(tài)細胞在0.1cm的電穿孔杯(curvette)中，1.8KV)。通過菌落PCR篩選出8個陽性克隆。
菌落PCR系統(tǒng)10×PCR緩沖液 5μl25mM MgCl23μl10mM dNTP混合物 1μlAM298-CDSF1μlAM298-CDSR1μlpfu聚合酶 1μl加高壓滅菌的蒸餾水至 50μl將一個白色菌落直接移至PCR混合物中作為模板。PCR條件如下94℃ 3分鐘94℃ 30秒鐘55℃ 30秒鐘30個循環(huán)72℃ 1分鐘72℃ 10分鐘PCR反應后，10μl PCR產物加到在0.5×TBE緩沖液中的1％瓊脂糖中，在90V下跑膠1小時，然后在紫外線下觀察，所有菌落顯示陽性結果。
然后用Wizards Plus Minipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega)從8個克隆中的3個克隆提取質粒。用兩個引物AM298-CDSF和AM298-CDFR及ET terminater kit(Amersham)測定質粒序列且3個克隆結果一致，其全長序列顯示于SEQ ID NO3中。
包含編碼α-淀粉酶AM782DNA序列的質粒已轉化入大腸桿菌DH10B菌株中，該菌株由發(fā)明人根據(jù)布達佩斯條約于2002年11月29日以保藏號DSM15334保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德意志共和國，上述布達佩斯條約是有關用于專利程序目的的微生物保藏的國際認可。保藏物由Novozymes A/S制作。認為此質粒的DNA序列包含SEQID NO3的DNA序列。
cDNA克隆的進一步序列分析顯示此序列包含1413個核苷酸的編碼區(qū)域。編碼區(qū)域的翻譯產物是471個氨基酸的多肽。推導出的由此基因編碼的氨基酸序列帶有一個信號肽(氨基酸1-21)和一個成熟肽(氨基酸22-471)，顯示于SEQ ID NO4中。
實施例3AM782淀粉酶的亞克隆和異源表達。
菌株和質粒用作表達宿主的米曲霉菌株BECh2具有下列基因型amy-、alp-、Npl-、CPA-、KA-。大腸桿菌DH5α(InvitrogenTM)在表達載體的構建中用作克隆宿主。表達質粒pDAu71(圖6)包含構巢曲霉amdS基因，作為在曲霉屬中的篩選基因，還包含氨芐抗性基因用于大腸桿菌的篩選，使用了兩拷貝的具有3個額外amyR位點的黑曲霉NA2啟動子(中性淀粉酶)+構巢曲霉TPI啟動子5’非翻譯部分用于異源表達，并使用了黑曲霉AMG終止子。
PCR擴增10×PCR緩沖液(包含MgCl2) 5μl2.5mM dNTP混合物5μl168/R.p.amy3-正向引物(10μM)5μl169/R.p.amy4-反向引物(10μM)5μlExpand高保真聚合酶(Roche) 0.5μl模板DNA 1μl
加高壓滅菌的蒸餾水至 50μl條件95℃ 1分鐘 1個循環(huán)94℃ 30秒60℃ 30秒 20個循環(huán)72℃ 1.30分鐘72℃ 2分鐘 1個循環(huán)質粒pPFJo143(圖7)的構建從包含全長cDNA的質粒中PCR擴增出包含AM782基因的DNA片段，用從全序列設計的引物引物168/R.p.amy3-正向(SEQ ID NO5)gaagatctaccatgaaattcagcatctctctc引物169/R.p.amy4-反向(SEQ ID NO6)ccgctcgagttaagcagaggtgaagatagc引物末端分別具有克隆限制性位點BglII-Xhol。來自于PCR反應的PCR產物合并物用于克隆。用BglII和Xhol消化PCR產物并克隆入用BamHI和Xhol消化過的pDAu71。對PCR產物測序并證實與原始序列一致。
BECh2的轉化是通過涉及原生質體形成和轉化的方法來完成的。用于曲霉屬轉化的合適方法在EP 0238023和Yelton等人，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 811470-1474中有述。將轉化子分離并在小Nunc-容器的10ml YPM中(1％酵母提取物，2％細菌培養(yǎng)用蛋白胨和2％麥芽糖)30℃培養(yǎng)3天(旋轉)。
SDS-PAGE凝膠電泳將來自上述10ml培養(yǎng)物的10μl上清樣品進行SDS-凝膠電泳。用SYPRO Orange Protein Gel Stain(Molecular Probes)對凝膠進行染色。
α-淀粉酶通過PNP如下進行鑒定。配制工作液5mlα-葡萄糖苷酶溶液+1ml底物溶液(PNP-底物)。TermamylTM作為標準(濃度0-100NU/ml)。稀釋用緩沖液50mM乙酸、硼酸和磷酸及0.1mM CaCl2+0.25％BRIJ35。20μl上清在微量滴定板中孵育2分鐘。加入200μl工作液。在3分鐘期間測定405nm處的動力學。
將PCR擴增的ORF克隆進表達載體pDAu71，結果形成如材料和方法中所述的pPFJo143(圖7)。將質粒轉化進BECh2(米曲霉)。分離出10個轉化子，在YPM中培養(yǎng)3天并將上清跑SDS-PAGE。這顯示了表達從非常少至相當好的不同表達水平。分子量約為50kDa，與野生型酶的情況一致。選擇轉化子BECh2/pPFJo143-9發(fā)酵，以小規(guī)模純化淀粉酶。α-淀粉酶測定根據(jù)材料和方法實施(表1)。用TermamylTM作為標準，且單位是NU/ml--意味著這僅僅給我們相對的數(shù)值，但我們可以看到活性和蛋白量間存在好的相關性。
表1利用PNP-底物將從143-1至143-10的10個轉化子發(fā)酵所得上清用于α-淀粉酶測定。數(shù)值是相對的。
實施例4通過α-淀粉酶AM782進行麥芽糖糊精水解的糖譜研究。
裝置恒溫水浴Heto lab equipment DT1；pH計(Mettler MP220)；HPLCWaters系統(tǒng)(A/P TSCN-QI-2411)；電子吸液器；分光光度計UV-1601；天平(Mettler AG 204)；折光計。
玻璃器具250ml的有蓋瓶；用于瓶的承重環(huán)(heavy rings)；500ml容量瓶；500ml燒杯；10ml玻璃試管。
酶0.225FAU/ml的AM782α-淀粉酶，0.135FAU/g.ds的市售真菌淀粉酶FungamylTM800L(Novozymes A/S，Denmark；AFN-000515)作為對照。
淀粉分解活性α-淀粉酶活性可以以“真菌α-淀粉酶單位”(FAU)來表達。一個(1)FAU是在標準條件(即在37℃和pH4.7)下每小時分解5260mg固體淀粉(Amylum solubile，Merck)所需酶量。更詳細地描述了此FAU測定的文件夾(folder)AF9.1/3，從Novozymes A/S，Denmark一經請求即可獲得，引用此文件夾作為參考。
底物DE11麥芽糖糊精FFS-99039方案分別設置兩個溫度為55℃和70℃的水浴。將53g麥芽糖糊精緩慢加入玻璃燒杯中的397g沸騰的Milli-Q水，同時用電子攪拌器攪拌，直到麥芽糖糊精溶解在水中。記錄麥芽糖糊精溶液的重量并加入更多沸騰的水至450g。將麥芽糖糊精溶液移至水浴并冷卻至水解溫度。然后將麥芽糖糊精溶液分為兩等份一部分用1N HCl調整至pH5.0；剩余的保持它自然的pH(5.5)。底物濃度通過折光計來檢測(DS大約10％)。
將麥芽糖溶液移至四個250ml的有蓋瓶瓶#1有90g pH5.5的溶液；瓶#2和#3有90g pH5.0的溶液；瓶#4有95g pH5.5的溶液。將瓶保持在水解溫度的水浴中，瓶#1-3在70℃，瓶#4在55℃。
將10ml稀釋的AM782酶(6mlAM782樣品和4ml Milli-Q水)加入到每個包含90g溶液的瓶#1-3中，并將5ml稀釋的FungamylTM(0.04gFungamyl溶在100ml Milli-Q水中)加入到包含95g溶液的瓶#4中。這樣，AM782和FungamylTM劑量在相同的活性水平，即0.135FAU/g.ds。
測試每瓶的pH且每瓶的DS通過在T＝0小時采樣來測量。其后，在水浴中孵育T＝3、6、9、21、24、28、45和48小時后從每個搖瓶取出4ml樣品。
水解樣品中的酶采樣后通過煮沸樣品15分鐘立即失活，然后將它們冷卻至室溫用于HPLC分析。冷卻后，測定每個樣品的pH和DS，以確定樣品的稀釋度，然后用Milli-Q水稀釋樣品至DS＝5％的濃度。將樣品與混合床的離子交換樹脂(Bio-Rad AG501/X8(D))混合并將其靜置20分鐘，這樣從樣品中除去灰塵和可溶性N。然后將樣品濾過0.2μm的濾器(Sartorius MINISARTTMNML 0.2微米)并將濾過的樣品收集進HPLC瓶中通過HPLC分析。結果在下面的表2-4和圖8中給出。
表2.在70℃和初始pH5.5的含有AM782(0.135FAU/g.ds.)的瓶#1。
表3.在70℃和初始pH5.0的含有AM782(0.135FAU/g.ds.)的瓶#2和#3
表4.在55℃和初始pH5.5的含有FungamylTM(0.135FAU/g.ds.)的瓶#4。
該實驗顯示淀粉酶AM782能夠在很高的溫度下起作用，至少高達70℃。淀粉酶AM782具有很高的反應速度；與同等劑量的FungamylTM800L相比，淀粉酶AM782能在約3小時內達到FungamylTM所需24至48小時的效果。而且，淀粉酶AM782能夠將DP3降解成DP2和DP1，從而可以提供更高的DP1結果。
序列表<110>諾和酶股份有限公司<120>耐熱的α-淀粉酶<130>10348.000-DK<160>6<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物AM298-CDSF<400>1tatcatgaaa ttcagcat18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物AM298-CDSR<400>2agttcaaaat ggacaaagt 19<210>3<211>1438<212>DNA<213>微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)<220>
<221>CDS
<222>(5)..(1417)<223>
<220>
<221>sig_peptide<222>(5)..(68)<223>
<220>
<221>mat_peptide<222>(68)..()<223>
<400>3tatc atg aaa ttc agc atc tct ctc tcg gca gca att gta ctc ttc gcg 49Met Lys Phe Ser Ile Ser Leu Ser Ala Ala Ile Val Leu Phe Ala-20 -15 -10gcc gca aca agc ctt gca agc cct ttg ccc caa cag cag cga tat ggc97Ala Ala Thr Ser Leu Ala Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly-5 -1 1 5 10aaa aga gca act tcg gat gac tgg aaa agc aag gcc att tat cag ctg145Lys Arg Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu15 20 25ctt aca gat cga ttt ggc cgc gcc gat gac tca aca agc aac tgc tct193Leu Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser30 35 40aat tta tcc aac tac tgt ggt ggt acc tac gaa ggc att acg aag cat241Asn Leu Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His45 50 55ctt gac tac att tcc ggt atg ggc ttt gat gct atc tgg ata tcg cca289Leu Asp Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro60 65 70att ccc aag aac tcg gat gga ggc tac cac ggc tac tgg gct aca gat337Ile Pro Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp75 80 85 90ttc tac caa cta aac agc aac ttt ggt gat gaa tcc cag ctc aaa gcg385Phe Tyr Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala
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445 450<210>4<21l>471<212>PRT<213>微小根毛霉<400>4Met Lys Phe Ser Ile Ser Leu Ser Ala Ala Ile Val Leu Phe Ala Ala-20 -15 -10Ala Thr Ser Leu Ala Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly Lys-5 -1 1 5 10Arg Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu15 20 25Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn30 35 40Leu Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu45 50 55Asp Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile60 65 70 75Pro Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe80 85 90Tyr Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu95 100 105Ile Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val110 115 120
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物168/R.p.amy3-正向<400>5gaagatctac catgaaattc agcatctctc tc32<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物169/R.p.amy4-反向<400>6ccgctcgagt taagcagagg tgaagatagc 30
權利要求
1.分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的開放閱讀框，所述多肽選自a)包含與SEQ ID NO4的氨基酸22至450位具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含氨基酸序列的多肽，其與下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334；c)由這樣的多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ ID NO3所示的68至1417位序列具有至少70％的同一性；以及d)具有α-淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
2.根據(jù)權利要求1所述的多核苷酸，其中多肽為包含這樣氨基酸序列的人工變體，所述氨基酸序列與SEQ ID NO4的22至450位氨基酸相比，具有一個或多個截短、和/或氨基酸的至少一個替換、缺失和/或插入。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的多核苷酸，其中多肽包含與SEQ ID NO4的22至450位氨基酸具有至少70％同一性的氨基酸序列。
4.根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的多核苷酸，其中多肽包含SEQID NO4的22至450位氨基酸。
5.根據(jù)權利要求1-4中任意一項所述的多核苷酸，其中多肽由SEQ IDNO4的22至450位氨基酸組成。
6.根據(jù)權利要求1所述的多核苷酸，其中多肽包含這樣的氨基酸序列，其與下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入核苷酸序列的淀粉酶編碼部分所編碼的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334。
7.根據(jù)權利要求6所述的多核苷酸，其中多肽包含由下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入核苷酸序列的淀粉酶編碼部分編碼的氨基酸序列，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DS M15334。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的多核苷酸，其中多肽由這樣的氨基酸序列組成，所述氨基酸序列由下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入核苷酸序列的淀粉酶編碼部分編碼，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334。
9.根據(jù)權利要求6或7所述的多核苷酸，其中多肽是包含這樣的氨基酸序列的人工變體，所述氨基酸序列與由下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入核苷酸序列的淀粉酶編碼部分編碼的氨基酸序列相比，具有一個或多個截短、和/或氨基酸的至少一個替換、缺失、和/或插入。
10.核酸構建體，其包含有效地連接至一個或多個控制序列的如權利要求1-9中任意一項所述的多核苷酸，其中所述一個或多個控制序列指導多肽在合適的宿主細胞中產生。
11.重組表達載體，其包含如權利要求10所述的核酸構建體。
12.重組宿主細胞，其包含如權利要求10所述的核酸構建體，或其包含至少一個拷貝的如權利要求11所述的表達載體。
13.根據(jù)權利要求12所述的細胞，該細胞是微生物。
14.根據(jù)權利要求13所述的細胞，該細胞是細菌或真菌。
15.根據(jù)權利要求14所述的細胞，該細胞是革蘭氏陽性細菌，例如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。
16.根據(jù)權利要求14所述的細胞，該細胞是真菌曲霉屬的蛋白酶缺陷株，尤其是米曲霉的蛋白酶缺陷株。
17.產生由權利要求1-9中任意一項所述多核苷酸編碼的具有α-淀粉酶活性的多肽的方法，該方法包括a)在益于多肽產生的條件下培養(yǎng)如權利要求12-16中任意一項所述的重組宿主細胞，并b)回收多肽。
18.產生酶促改性的淀粉衍生物的方法，其中將根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于液化和/或糖化淀粉。
19.產生高麥芽糖糖漿的方法，其中將根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于液化淀粉。
20.織物脫漿的方法，其中將根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于處理織物。
21.釀造方法，其中將根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽在麥芽汁發(fā)酵過程中加入。
22.醇生產方法，其中將根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽用于酒廠麥芽漿中的淀粉液化。
23.一種方法，其中將包含根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽的面團產品進行烘焙。
24.根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于淀粉轉化過程中的液化和/或糖化。
25.根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于高麥芽糖糖漿生產過程中液化淀粉。
26.根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于織物脫漿。
27.根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于醇生產。
28.根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于釀造。
29.根據(jù)權利要求17所述方法產生的具有α-淀粉酶活性的多肽的用途，用于烘焙。
全文摘要
分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼具有α－淀粉酶活性的多肽的開放閱讀框，所述多肽選自a)包含這樣氨基酸序列的多肽，其與SEQ IDNO4的氨基酸22至450位具有至少70％的同一性；b)包含這樣氨基酸序列的多肽，其與下述大腸桿菌宿主的質粒中所插入多核苷酸的淀粉酶編碼部分所編碼的多肽具有至少70％的同一性，其中所述大腸桿菌宿主根據(jù)布達佩斯條約保藏在DSMZ，保藏號為DSM 15334；c)由這樣的多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ ID NO3所示的68至1417位序列具有至少70％的同一性；以及d)具有α－淀粉酶活性的(a)、(b)或(c)的片段。
文檔編號C12R1/645GK1726280SQ200380106514
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權日2002年12月17日
發(fā)明者湯嵐, 吳文平, 段俊欣, P·F·約翰內森 申請人:諾和酶股份有限公司