專利名稱：：用于抗hiv免疫的方法和組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于治療和預防人免疫缺陷病毒(HIV)感染的核酸和減毒痘苗病毒載體，以及在對HIV感染易感的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的方法。本發(fā)明的治療性和預防性疫苗方案包括用包含兩種新型核酸載體的接種物進行初次免疫，然后用表達相應HIV蛋白的修飾痘苗病毒Ankara(MVA)重組病毒載體進行加強免疫。本發(fā)明的其它方面在以下
發(fā)明內(nèi)容中有描述或者是顯而易見的，并且都包括本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
背景技術：
：盡管經(jīng)過20多年的努力抗爭，但是全球HIV流行仍然持續(xù)不斷地危害人類。面對這一前所未有的醫(yī)學挑戰(zhàn)，科學界在病毒學、免疫學和藥學領域上已經(jīng)取得了重大進展。盡管如此，已經(jīng)異常艱難地證明了感染在全世界的擴散，以及在大多數(shù)感染者中預防疾病的發(fā)展。自流行開始，已有6500萬人被感染。全球至今有超過4200萬活著的HIV感染者，僅在2002年就有500萬新增感染病例(AIDSepidemicupdate，December2002.JointUNAIDS/WHO)。自大流行開始，已有超過2500萬人死于該病；僅在2002年就有300萬人死于愛滋病(AIDS)。超過95％的新增HIV感染病例是發(fā)生在發(fā)展中國家，絕大多數(shù)感染是發(fā)生在撒哈拉非洲次大陸和東南亞。在接受抗逆轉錄病毒藥物的感染者中，有5％的人因副作用而明顯不耐受可用的藥物，而另一部分人則攜帶抗藥性病毒變異株。雖然公共衛(wèi)生工作在某些地區(qū)有助于減緩HIV傳播速率，但是對全球性難題來說，顯而易見，保護性疫苗才是最令人滿意的解決方案。已鑒定出兩種主要的HIV病毒，即HIV-1和HIV-2。HIV-1的3個亞型組已在全球擴散M(主要亞型組，major)、O(外亞型組，outlying)和N(新亞型組，new)。其中M組占已報告HIV/AIDS病例的90％以上；在M組中，病毒包膜變化多樣，使得該組被進一步劃分成9個主要的基因亞型(包括A-D、F-H、J和K)以及多個循環(huán)重組型。病毒多樣性看來是從撒哈拉非洲次大陸發(fā)散開來，在這里生活著的總共4000萬人中超過2800萬人被感染。另一類逆轉錄病毒即HIV-2，以前多在西非流行，但目前也已廣泛流行。在非洲以外的地區(qū)已觀察到散在病例，但該病毒看來致病性明顯小于HIV-1。HIV-1的一個特殊亞型看來已獲得系統(tǒng)發(fā)生優(yōu)勢(phylogeneticdominance)。目前全球亞型C病毒占新增HIV-1感染的50％強。具體地講，該基因亞型已在大部分撒哈拉非洲次大陸肆虐，并且目前已蔓延到印度支那(Beyrer，C.等，(2000)AIDS，14(1)75-83；Yu，X.F.，(2001)AIDS15(4)523-5；Piyasirisilp，S.等，(2000)AIDS74(23)11286-95)。通過印度和緬甸，亞型C在中華人民共和國找到立足點，據(jù)推測是在中國西南地區(qū)的靜脈吸毒者(IVDU)之間進行傳播。云南省的負擔特別重，占全中國將近半數(shù)的HIV-1病例。根據(jù)云南省衛(wèi)生廳，在該省的IVDU中HIV-1感染的感染率在2000年為29％，到2005年預期可達40.7％。云南5個縣(文山、紅河、德宏、臨滄和大理)感染率最高，估計在50％至75％之間。HIV-1亞型C也波及鄰省，例如四川和廣西，并且也是遙遠的新疆發(fā)生大量感染的原因。DNA疫苗或基因免疫在疫苗學上是有希望的新策略。已知細胞介導免疫(CMI)是控制HIV-1復制的關鍵(Ogg等，(1998)Science2792103-6；Schmitz等，(1999)Science283857-60；Jin等，(1999)J.Exp.Med.189991-8；McMichael等，(2001)Nature410980-7)。設計抗HIV-1疫苗的早期工作顯示，蛋白/亞單位或滅活病毒等常規(guī)方法對逆轉錄病毒感染無效。也許作為從頭表達的結果，DNA疫苗看來容許對產(chǎn)生CMI的更好的抗原呈遞。在一項研究中，DNA疫苗對用病原性SHIV進行實驗性攻擊的恒河猴(rhesusmacaque)產(chǎn)生至少部分保護性(Barouch等，(2000)Science290486-92)。然而，當在初次-加強方案中與重組載體聯(lián)用時，證明DNA疫苗在刺激CMI和含有SHIV感染中甚至能更有效(Robinson等，(1999)Nat.Med.5526-34；Hanke等，(1999)Vaccine17589-96；Hanke等，(1999)J.Virol.737524-32；Allen等，(2000)J.Immunol.1644968-78；Amara等，(2001)Science29269-74；Barouch等，(2001)J.Virol.755151-8)。普遍認為，按照HIV自身而設計的減毒活疫苗用于抗病毒，具有不可接受的風險。因此，在其它疫苗策略迄今未獲成功的情況下，單用核酸或與減毒的非慢病毒加強聯(lián)用的有效疫苗方案將提供顯著的進步。發(fā)明概述迄今為止，安全而有效的治療性和預防性抗HIV疫苗一直是一個重大挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)疫苗方法已證明對HIV是無效或不安全的，然而，已經(jīng)意想不到地顯示，單獨給予或者與減毒痘病毒聯(lián)合用于加強給予抗HIV的核酸疫苗，在抗選定HIV抗原決定簇的免疫應答的刺激中是有效的。因此，本發(fā)明涉及用于治療和預防HIV感染的核酸和減毒痘苗病毒載體，以及在對HIV感染易感的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的組合物和方法。本發(fā)明的治療性和預防性疫苗方案包括用含兩種新型核酸載體的接種物進行初次免疫，然后用表達相應HIV蛋白的重組MVA進行加強免疫。本發(fā)明的其它方面在以下
發(fā)明內(nèi)容中有描述或者是顯而易見的，并且包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的第一方面提供核酸載體，所述載體包含至少一個有效連接啟動子的HIV序列，并且該序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。另一方面，所述核酸載體包含至少兩個HIV序列，其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接，并且其中所述HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。本文所述的HIV序列選自env、gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx、其突變體、融合體及其部分。啟動子包含選自以下的異源啟動子原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子。在一個實施方案中，所述真核啟動子是人類真核起始因子-1α啟動子，而所述核酸載體的病毒啟動子是巨細胞病毒立即/早期啟動子。本發(fā)明也描述了位于HIV序列下游的轉錄終止序列在所述核酸載體中的用途。所述轉錄終止子可以是選自以下的聚腺苷酸化信號牛生長激素聚腺苷酸化信號、SV40聚腺苷酸化信號和痘苗病毒聚腺苷酸化信號。本發(fā)明還描述了至少一個與異源前導序列有效連接的HIV序列。所述前導序列可以是組織纖溶酶原激活物(tPA)前導序列，但也可以包含酵母α-因子交配信息素前導序列、前胰島素原前導序列和轉化酶前導序列、免疫球蛋白A前導序列和卵白蛋白前導序列。本發(fā)明的核酸載體包含與tPA前導序列有效連接的HIVGag，使得病毒顆粒不能裝配。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述HIV序列選自SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13；SEQIDNO17；和SEQIDNO19。本發(fā)明的核酸載體也包括在單細胞生物中指導核酸載體復制和擴增的復制起點。這些起點可以是但不限于colE1(pMB1)起點、2μ酵母起點、真核著絲粒區(qū)、真核自主復制序列、SV40起點和巨細胞病毒(CMV)起點。本發(fā)明的核酸載體還包含選擇性標記基因，所述基因可以是抗生素抗性基因。所述抗性基因可以是抗以下抗生素的基因氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、強力霉素、新霉素、潮霉素、博來霉素、零霉素(zeocin)、嘌呤霉素和氯霉素。在本發(fā)明的另一方面，提供包含至少兩個HIV序列的核酸載體，其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接，并且編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。此外，至少一個HIV序列與異源前導序列有效連接。所述載體還任選包含下游轉錄終止子、復制起點和選擇性標記基因。本發(fā)明的核酸載體可以是病毒載體，例如修飾痘苗病毒Ankara(MVA)載體、ALVAC載體、NYVAC.1載體或NYVAC.2載體。所述病毒載體最好是MVA載體，所述MVA載體包含至少兩個插入到MVA基因組缺失位點III的HIV序列，其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接，并且其中所述HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。用于表達所述HIV序列的痘病毒啟動子選自痘病毒7.5K啟動子、疸病毒40K啟動子、痘病毒H5啟動子、痘病毒11K啟動子、痘病毒I3啟動子、痘病毒合成(SYN)啟動子和痘病毒合成早期/晚期啟動子。在另一個實施方案中，所述啟動子是不同的啟動子。另一方面使用核酸載體，所述載體是MVA載體，所述MVA載體包含至少兩個插入到MVA基因組缺失位點III的HIV序列、至少一個插入到MVA基因組缺失位點II的HIV序列；并且其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接。此外，這些HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。本
發(fā)明內(nèi)容中描述的HIV序列選自env、gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx、其突變體、融合體及其部分。本發(fā)明病毒載體中描述的啟動子選自痘病毒7.5K啟動子、痘病毒40K啟動子、痘病毒H5啟動子、痘病毒11K啟動子、疸病毒I3啟動子、痘病毒合成(SYN)啟動子和痘病毒合成早期/晚期啟動子。在另一個實施方案中，所述啟動子是不同的啟動子。本發(fā)明的HIV序列還包含選自以下的異源前導序列tPA前導序列、酵母α-因子交配信息素前導序列、前胰島素原前導序列、轉化酶前導序列、免疫球蛋白A前導序列、β-珠蛋白前導序列和卵白蛋白前導序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，HIV序列SEQIDNO17和SEQIDNO19插入到MVA的缺失位點III，而SEQIDNO21插入到MVA的缺失位點II。本發(fā)明也描述了一種核酸載體，所述載體包含選自以下的病毒載體ALVAC、MVA、NYVAC.1和NYVAC.2。本發(fā)明的一個實施方案提供MVA載體，所述載體包含插入到MVA缺失位點III的tPA-δV2env和tPA-gag-pol，以及插入到MVA缺失位點II的tPA-nef-tat。包含本文描述的核酸載體的組合物也包括在本
發(fā)明內(nèi)容中。在一個實施方案中，每個核酸載體包含不同的HIV序列。優(yōu)選tPA-env和tPA-gag在第一核酸載體上，而tPA-nef-tat在第二核酸載體上。甚至更優(yōu)選SEQIDNO7和SEQIDNO9在第一核酸載體上，而SEQIDNO11和SEQIDNO13在第二核酸載體上。本發(fā)明的另一方面描述了一種組合物，其中tPA-env和tPA-gag在第一核酸載體上，而tPA-pol和tPA-nef-tat在第二核酸載體上。所述組合物還包含插入到MVA缺失位點III的tPA-δV2env和tPA-gag-pol以及插入到MVA缺失位點II的tPA-nef-tat。SEQIDNO7和SEQIDNO9最好是在第一核酸載體上，而SEQIDNO11和SEQIDNO13在第二核酸載體上。所述組合物還包含插入到MVA缺失位點II的SEQIDNO17和SEQIDNO19。本發(fā)明還涉及藥用組合物，所述組合物包含上述核酸載體，以及藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑。此外，本發(fā)明涉及在對HIV相關疾病或病癥易感的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的方法。所述方法包括將本
發(fā)明內(nèi)容中描述的核酸載體、組合物和藥用組合物給予所述受試者，從而引發(fā)抗HIV的免疫應答。附圖簡述以下詳述僅作為實例，并不是將本發(fā)明限制在具體描述的實施方案中，可以結合附圖來理解這些詳述，所述詳述通過引用結合到本文中。以非限制性實例的方式并參考以下附圖來描述本發(fā)明的各種優(yōu)選特征和實施方案，其中圖1是pVAX1的示意圖。圖2是pADVAX的示意圖，所述載體是包括人延伸因子1α(hEF1α)作為第二啟動子的修飾pVAX1載體。圖3柱狀圖，顯示出當用市售的ELISA試劑盒定量測定HIVGag(p24)時，在瞬時轉染天然pVAX1、密碼子最優(yōu)化pADVAX和密碼子最優(yōu)化tPApADVAX的293T細胞中gag基因表達。圖4是env在用以下DNA構建體轉染的293T細胞中表達的蛋白質(zhì)印跡帶有rev的天然gp160(A)、帶有天然信號肽的最優(yōu)化gp160(B)和帶有tPA信號肽的最優(yōu)化gp160。圖5是蛋白質(zhì)印跡，顯示由pADVAX雙啟動子-載體驅(qū)動的env和gag的表達。垂直箭頭指示從ADVAXI的蛋白表達。圖6為ADVAXII制備的pol基因的修飾示意圖，其中PR＝蛋白酶，RT＝逆轉錄酶，IN＝整合酶。蛋白酶的缺失(DTGA)包含野生型基因的氨基酸25-28。逆轉錄酶的點突變(M→G)位于野生型基因的184位。對用pVAX1-tPA-突變型pol(A)和單獨的pVAX1(B)轉染的293T細胞的細胞裂解液進行蛋白質(zhì)印跡。未切割的tPA-Pol為110kD。圖7是蛋白質(zhì)印跡，顯示用nef-tat轉染的細胞培養(yǎng)上清液中表達的蛋白。圖8是蛋白質(zhì)印跡，顯示用tPA-nef-tat轉染的細胞培養(yǎng)上清液中表達的蛋白。圖9顯示用以下nef構建體轉染的293T細胞表達I類MHC的流式細胞儀分析結果單獨的載體、nef、tPA-nef和tPA-nef-tat。圖10是ADVAXI和ADVAXII的示意圖。圖11顯示對來自Env和Gag的肽庫的IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。肽是重疊10次的20-mers。每庫含有12個肽，只是GagA-I除外，后者代表先前在BALB/c小鼠中被鑒定為抗原特異性CD8+表位的特異性9-mer(AMGMLKDTI)(SEQIDNO2)。EnvPI包含氨基酸24-144，EnvP4包含氨基酸403-573，GagP3包含氨基酸251-380，而GagA-I包含氨基酸217-225。圖12顯示用不同劑量的ADVAXI免疫的小鼠中Env-和Gag特異性IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。圖13顯示，小鼠肌內(nèi)接種不同的DNA疫苗后，在第0、3和6周，用血清抗Gag抗體進行ELISA分析。圖14顯示針對來自Pol、Tat和Nef的肽庫的IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。圖15顯示用不同劑量的ADVAXII免疫的小鼠中Pol-和Nef-Tat特異性IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。圖16是蛋白質(zhì)印跡，顯示將nef基因引入MVA基因組的不同插入位點后HIV-1nef的表達。圖17顯示由293T細胞表達的DV2Env介導與攜帶第一受體CD4和第二受體CCR5的HOS細胞的細胞融合。圖18是ADMVA的基因組圖。圖19是示意圖，顯示從pLW7構建pZC1和pZC3。圖20顯示，通過用抗Env抗體的免疫染色(左圖)和蛋白質(zhì)印跡分析(右圖)，重組env-gag-polMVA的表達。圖21是示意圖，顯示從pLW22構建pZC22。圖22和圖23顯示，通過用抗Env抗體和抗Nef抗體的雙重免疫染色，重組ADMVA表達Env和Nef。圖24是蛋白質(zhì)印跡，顯示所有5種插入在ADMVA中的基因。圖25顯示用103-108ADMVA，HIV-1Env的免疫染色。圖26顯示用ADMVA感染人類細胞。圖27是柱狀圖，表示針對肽庫中來自HIV-1Env、Gag、Pol、Nef和Tat的肽的IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。圖28表示BALB/c小鼠中針對來自同源亞型CEnv、Gag、Pol、Nef和Tat的肽或肽庫的IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。圖29表示B6×B10小鼠中針對來自同源亞型CEnv、Gag、Pol、Nef和Tat的肽或肽庫的IFNγ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。圖30顯示用不同劑量ADMVA接種的BALB/c小鼠中Env特異性IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。圖31是柱狀圖，顯示BALB/c小鼠中針對Gag和gp120蛋白的HIV-1特異性抗體反應。圖32顯示BALB/c小鼠中針對gp120的HIV-1特異性抗體反應。圖33是柱狀圖，顯示通過不同免疫途徑接種ADMVA的BALB/c小鼠中Env特異性IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。圖34顯示用不同劑量MVA接種的BALB/c小鼠中MVA特異性IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答。發(fā)明詳述本文所用的以下術語的含義如下。術語“HIV感染相關疾病”或“HIV-1相關疾病”等，在本文中是指以HIV感染為特征的疾病狀態(tài)。所述HIV感染相關疾病包括但不限于愛滋病、卡波西肉瘤(Kaposi′ssarcoma)、由卡氏肺囊蟲(Pneumocystiscarinii)和結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)等引起的機會性感染；包括鵝口瘡、毛狀白斑和口瘡性潰瘍在內(nèi)的口腔潰瘍；全身淋巴結病；帶狀皰疹；血小板減少癥；無菌性腦膜炎；神經(jīng)病例如弓形蟲病、隱球菌病、CMV感染、原發(fā)性CNS淋巴瘤和HIV相關性癡呆；周圍神經(jīng)?。话d癇；以及肌病。“受試者”是脊椎動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類。哺乳動物包括但不限于人類、農(nóng)場動物、運動動物和寵物。對HIV感染或HIV相關病癥或疾病“易感”的受試者是指在全部群體中對HIV感染風險更高的群體所屬的受試者。術語“免疫原性組合物”、“免疫組合物”和“疫苗”是指這樣的免疫組合物所述組合物含有引發(fā)局部或全身免疫應答的載體(或其表達產(chǎn)物)。所述應答可以具有、但并不一定具有保護性。同樣，含有本發(fā)明重組體或載體(或其表達產(chǎn)物)的免疫原性組合物引發(fā)可以具有、但并不一定具有保護性的局部或全身免疫應答。疫苗組合物引發(fā)局部或全身保護性應答。因此，術語“免疫組合物”和“免疫原性組合物”包括“疫苗組合物”(因為前兩個術語可以是保護性組合物)。本發(fā)明包括免疫組合物、免疫原性組合物或疫苗組合物。術語“治療有效劑量”是指能產(chǎn)生給藥所需效果的劑量。準確劑量取決于治療目的，可由本領域技術人員采用已知技術來確定(參見例如Lieberman(1992)PharmaceuticalDosageForms第1-3卷；Lloyd(1999)TheArt，ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding；和Pickar(1999)DosageCalculations)。就治療有效量的本發(fā)明DNA疫苗而論，所述治療有效量是在治療個體HIV感染或AIDS中達到任何成功指標所需的劑量，包括任何客觀或主觀標準，例如HIV病毒抑制，HIV感染和AIDS相關癥狀的減少，或患者身體或精神上良好狀態(tài)的改善?！拜d體”是允許或促進一個實體從一個環(huán)境轉移到另一個環(huán)境的工具(參見″TheDevelopmentofHumanGeneTherapy″T.Friedmann主編，1999，ColdSpringHarborPress)。例如，一些用于重組DNA技術的載體允許實體(例如一段DNA(例如一個異源轉基因))轉移到靶細胞中。一旦在靶細胞中，所述載體任選起到將其轉基因保留在胞內(nèi)的作用，或者可作為DNA復制單位起作用。用于重組DNA技術的載體的實例包括質(zhì)粒、染色體、人工染色體或病毒。本發(fā)明的載體可以通過非病毒載體(質(zhì)粒)或病毒載體轉移到靶位點。當抗原和抗體特異性結合/反應時，本文所用的抗原或抗原決定簇(例如HIV的基因產(chǎn)物)，對抗該抗原而產(chǎn)生的抗體來說是“有活性”的。術語“宿主細胞”是指其中引入了重組DNA分子的一種或多種細胞。本發(fā)明的宿主細胞包括但不限于細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞。宿主細胞可以是單細胞，或者可以在液體培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)物中生長的單層細胞等。宿主細胞也可以直接或間接來源于組織。當核酸從胞外環(huán)境轉移到細胞中時，該宿主細胞被所述核酸“轉化”。任何將核酸轉移到細胞中的方法均可采用；除非另有說明，該術語并不特指任何將核酸轉移到細胞中的具體方法，也不特指任何待轉移的具體細胞類型。本領域使用的另一術語是“轉染”。非病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于DNA轉染方法。在此，轉染包括采用非病毒載體將基因傳遞給真核靶細胞(例如哺乳動物細胞)的方法。典型轉染方法包括DNA直接注射、電穿孔、DNA生物射彈(biolistics)、脂質(zhì)介導轉染、緊密DNA介導轉染、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、脂轉染、陽離子試劑介導轉染、陽離子兩親性表面活性劑(CFA)(NatureBiotechnology199614；556)和它們的組合?！氨磉_控制序列”是調(diào)節(jié)基因表達(即轉錄、RNA形成和/或翻譯)的核酸序列。表達控制序列可以是不同的，取決于例如所選宿主細胞或生物體(例如原核細胞宿主和和真核宿主)、轉錄單位的類型(例如其中RNA聚合酶必須識別該序列)、該基因在其中能正常表達的細胞類型(換句話說，生物因子在該細胞類型中正常出現(xiàn))?！皢幼印本褪且粋€這樣的表達控制序列，在本文中是指一組控制、調(diào)節(jié)和/或指導下游(3′)核酸序列轉錄的核酸序列。本文所用的啟動子包括靠近轉錄起始位點的必需核酸序列，例如在聚合酶II類啟動子的情況下，是TATA元件。術語“有效連接”是指核酸表達控制序列(諸如啟動子或一組轉錄因子結合位點)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達控制序列指導對應于第二序列的核酸轉錄。術語“重組體”當在本文中用于核酸或蛋白部分時，是指核酸包含2個或多個亞序列，而在自然界沒有發(fā)現(xiàn)同樣的相互關系。例如，重組產(chǎn)生的核酸通常具有來自不同基因或相同基因非鄰近區(qū)的2個或多個序列，經(jīng)人工排列而產(chǎn)生編碼新蛋白的新核酸序列。本文所用的術語“重組”是指通過本領域技術人員已知的標準技術產(chǎn)生重組蛋白或重組核酸的方法，所述方法描述于例如Sambrook等，MolecularCloning；ALaboratoryManual，第2版(1989)。在本申請中的術語“異源”是指與其有效連接的核酸分子正常情況下兩者并不相連的元件，例如質(zhì)粒載體的組分(例如啟動子、前導序列)。在本發(fā)明公開內(nèi)容中，“包含”、“含有”和“具有”等全都具備美國專利法中規(guī)定的含義，并且可以表示“包括”等；“基本上由......組成”或“基本組成為”同樣具備美國專利法中規(guī)定的含義；該術語是開放式的，即允許存在未指出的含義，只要基本特性或者新的特性并不因所指出的含義而改變即可，但并不包括現(xiàn)有技術實施方案。本發(fā)明的第一方面提供核酸載體，所述載體包含至少一個有效連接啟動子的HIV序列，該序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。另一方面，所述核酸載體包含至少兩個HIV序列，這些HIV序列分別與各自的啟動子有效連接，并且這些序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。本文描述的HIV序列選自env、gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx、其突變體、融合體及其部分。所述啟動子包括選自以下的異源啟動子原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子。在一個實施方案中，所述真核啟動子是人類真核起始因子-1α啟動子，而核酸載體的病毒啟動子是巨細胞病毒立即/早期啟動子。本發(fā)明也描述了位于HIV序列下游的轉錄終止序列在所述核酸載體中的應用。所述轉錄終止子可以是選自以下的聚腺苷酸化信號牛生長激素聚腺苷酸化信號、SV40聚腺苷酸化信號和痘苗病毒聚腺苷酸化信號。本發(fā)明還描述了至少一個有效連接異源前導序列的HIV序列。所述前導序列可以是組織纖溶酶原激活物(tPA)前導序列，此外也可包含酵母α-因子交配信息素前導序列、前胰島素原前導序列和轉化酶前導序列、免疫球蛋白A前導序列和卵白蛋白前導序列。本發(fā)明的核酸載體包含有效連接tPA前導序列的HIVGag，以使病毒顆粒不能裝配。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述HIV序列選自本文提供的以下序列SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13；SEQIDNO17；和SEQIDNO19。本發(fā)明的核酸載體也包括在單細胞生物中指導核酸載體復制和擴增的復制起點。這些起點可以是但不限于colE1(pMB1)起點、2μ酵母起點、真核著絲粒起點、真核自主復制序列、SV40起點和巨細胞病毒(CMV)起點。本發(fā)明的核酸載體還包含選擇性標記基因，所述基因可以是抗生素抗性基因。所述抗性基因可以是抗以下抗生素的基因氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、強力霉素、新霉素、潮霉素、博來霉素、零霉素、嘌呤霉素、氯霉素。本發(fā)明的另一方面提供核酸載體，所述載體包含至少兩個HIV序列，其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接，并且編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。此外，至少一個HIV序列與異源前導序列有效連接。所述載體任選還包含下游轉錄終止子、復制起點和選擇性標記基因。本發(fā)明的核酸載體可以是病毒載體，例如修飾痘苗病毒Ankara(MVA)載體、ALVAC載體、NYVAC.1載體或NYVAC.2載體。所述病毒載體最好是包含至少兩個插入到MVA基因組缺失位點III的HIV序列的MVA載體，其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接，并且其中所述HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。用于表達所述HIV序列的疸病毒啟動子選自痘病毒7.5K啟動子、痘病毒40K啟動子、痘病毒H5啟動子、痘病毒11K啟動子、痘病毒I3啟動子、痘病毒合成(SYN)啟動子和痘病毒合成早期/晚期啟動子。在另一個實施方案中，所述啟動子是不同的啟動子。另一方面利用核酸載體，所述載體是MVA載體，所述載體包含至少兩個插入到MVA基因組缺失位點III的HIV序列，至少一個插入到MVA基因組缺失位點II的HIV序列，且其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接。此外，這些HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。本
發(fā)明內(nèi)容中描述的HIV序列選自env、gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx、其突變體、融合體及其部分。本發(fā)明病毒載體中描述的啟動子選自痘病毒7.5K啟動子、痘病毒40K啟動子、痘病毒H5啟動子、痘病毒11K啟動子、痘病毒I3啟動子、痘病毒合成(SYN)啟動子和痘病毒合成早期/晚期啟動子。在另一個實施方案中，所述啟動子是不同的啟動子。本發(fā)明的HIV序列還包含選自以下的異源前導序列tPA前導序列、酵母α-因子交配信息素前導序列、前胰島素原前導序列、轉化酶前導序列、免疫球蛋白A前導序列、β-珠蛋白前導序列和卵白蛋白前導序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，HIV序列SEQIDNO17和SEQIDNO19插入到MVA的缺失位點III，而HIV序列SEQIDNO21插入到MVA的缺失位點II。本發(fā)明還描述了一種核酸載體，所述載體包含選自以下的病毒載體ALVAC、MVA、NYVAC.1和NYVAC.2。本發(fā)明的一個實施方案提供MVA載體，所述載體包含插入到MVA缺失位點III的tPA-δV2env和tPA-gag-pol，以及插入到MVA缺失位點II的tPA-nef-tat。本
發(fā)明內(nèi)容中也包括組合物，所述組合物包含本文描述的任何核酸載體。在一個實施方案中，每個核酸載體包含不同的HIV序列。優(yōu)選tPA-env和tPA-gag在第一核酸載體上，而tPA-nef-tat在第二核酸載體上。甚至更優(yōu)選SEQIDNO7和SEQIDNO9在第一核酸載體上，而SEQIDNO11和SEQIDNO13在第二核酸載體上。本發(fā)明的另一方面描述了一種組合物，其中tPA-env和tPA-gag在第一核酸載體上，而tPA-pol和tPA-nef-tat在第二核酸載體上。所述組合物還包含插入到MVA缺失位點III的tPA-δV2env和tPA-gag-pol，以及插入到MVA缺失位點II的tPA-nef-tat。優(yōu)選SEQIDNO7和SEQIDNO9在第一核酸載體上，而SEQIDNO11和SEQIDNO13在第二核酸載體上。所述組合物還包含插入到MVA缺失位點II的SEQIDNO17和SEQIDNO19。本發(fā)明還涉及藥用組合物，所述組合物包含上述核酸載體，以及藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑。此外，本發(fā)明涉及在對HIV相關疾病或病癥易感的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的方法。所述方法包括將本
發(fā)明內(nèi)容中描述的核酸載體、組合物和藥用組合物給予所述受試者，從而引發(fā)抗HIV的免疫應答?？梢岳酶鞣N各樣的核酸載體，以攜帶用于本發(fā)明組合物和疫苗的HIV核酸序列。對于本領域技術人員來說，顯然，本發(fā)明的核酸載體必須具有高容量產(chǎn)生的能力，并且同時還必須在目標宿主中能夠表達。因此，核酸載體可含有允許在單細胞宿主(例如細菌或酵母)中表達和擴增的序列。有用的表達載體包括但不限于pVAX1、pGEM、pSP72、pcDNA和其它市售的克隆載體。設計作為疫苗組合物并可在細菌中擴增的核酸必須進行進一步純化，以便去除可引起感染、炎癥和疾病的細菌細胞壁組分。這些“內(nèi)毒素”也稱為“脂多糖”或“LPS”?？赏ㄟ^本領域已知的過濾方法去除內(nèi)毒素。質(zhì)粒載體擴增的替代方法是使用酵母，例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。另外，在下文中也可與同義詞“啟動子”交替使用的各種表達控制序列，可用于核酸載體，以表達用于本發(fā)明組合物和方法的HIV序列。在選擇表達控制序列時，也會考慮各種因素。這些因素包括例如啟動子序列的相對強度、其控制能力及其與本發(fā)明所述肽的DNA序列的相容性，特別是與潛在二級結構的相容性。所述有用的表達控制序列包括異源表達控制序列，例如原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子。有用的病毒啟動子的實例包括例如SV40早期和晚期啟動子、巨細胞病毒啟動子、牛乳頭瘤病毒啟動子、巨細胞病毒啟動子、包括慢病毒在內(nèi)的逆轉錄病毒啟動子、腺伴隨病毒啟動子和腺病毒啟動子、T3啟動子和T7啟動子、λ噬菌體主要操縱子(majoroperator)和啟動子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)。也可使用原核啟動子，例如但不限于lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)或TRC系統(tǒng)?？捎欣赜糜诒磉_本發(fā)明核酸載體中的HIV序列的真核啟動子包括但不限于人類真核起始因子1啟動子、3-磷酸甘油酸激酶啟動子、乙醇脫氫酶啟動子、丙酮酸激酶啟動子或其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶啟動子例如Pho5、α-肌動蛋白啟動子和β-肌動蛋白啟動子、以及已知控制原核細胞或真核細胞或它們的病毒的基因表達的其它組成型和誘導型啟動子序列，以及它們的各種組合。人們知道，并不是所有載體和啟動子在本文提到的核酸和組合物中都能同樣好的起到表達所述HIV序列的作用。然而，本領域技術人員可以不需要進行過多實驗、也不偏離本發(fā)明范圍，在這些載體、啟動子和宿主中進行選擇。例如，在選擇載體時，必須考慮其宿主，因為所述載體必須在其中進行復制。也應考慮該載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力、控制整合的能力、增強子序列的存在和使用(如果有的話)，以及該載體所編碼的其它蛋白(例如抗生素標記或其它選擇標記)的表達。HIV序列的最佳表達也得益于插入序列3’端所添加的轉錄終止序列。轉錄終止子在生物體中各不相同，可包含核酸序列，所述序列可在體內(nèi)有利地形成二級結構，例如莖-環(huán)結構。在這種情況下，終止取決于RNA產(chǎn)物，而不單由轉錄過程中DNA序列來確定。眾所周知的原核終止機制包括內(nèi)部終止，其中在缺乏任何其它因子時，所述RNA聚合酶核心酶可在某位點終止。另一個已表征的終止機制取決于原核生物的Rho因子，即一種46kD的蛋白，該蛋白與RNA聚合酶從相關RNA鏈的脫離密切相關。其它轉錄終止子都是本領域眾所周知的，包括聚腺苷酸化信號，例如牛生長激素聚腺苷酸化信號和病毒聚腺苷酸化信號，例如來自痘苗病毒和猿猴病毒40的病毒聚腺苷酸化信號。聚腺苷酸化后，在下游的相對位點上常發(fā)生轉錄終止，所述位點在大多數(shù)真核mRNA的3’端。聚腺苷酸化是無需模板的50-200nt的聚腺苷酸鏈(polyA)的插入。切割必須先于聚腺苷酸化。這些聚腺苷酸化信號常包含序列AAUAAA，所述序列當缺失或突變時，阻止聚腺苷酸化mRNA的產(chǎn)生。前導序列定義為在核酸(DNA和RNA)或蛋白一端的序列，所述序列必須被切掉，以容許成熟分子的專一性功能。前導序列在特定細胞區(qū)室中指導蛋白的定位。前導序列的一個類似的術語是“信號序列”。對于ER中駐留的蛋白和欲進入溶酶體或過氧化物酶體的蛋白來說，信號序列指導它們返回它們各自的細胞區(qū)室中。膜蛋白和欲分泌的蛋白也需要信號序列，其中指導所述蛋白進入通向質(zhì)膜、胞外空間或通過內(nèi)體分選的特定的分泌途徑。信號序列沒有顯示出序列保守性。信號序列通常在N-端的10個氨基酸內(nèi)開始。它們的長度在20個和30個殘基之間，特征是中心為約10-15(但不小于6)個殘基的疏水核心，以亮氨酸或丙氨酸為優(yōu)先選擇。它們通過極性殘基帶正電荷序列段鄰接N-端一側，并通過中性的極性殘基鄰接C-端區(qū)。它們明顯能耐受氨基酸取代，只要它們的中心疏水特征能保留。在本發(fā)明的一個實施方案中，組織纖溶酶原激活物有利地用于指導翻譯的HIV序列進入分泌途徑，這不同于天然HIV蛋白，使得病毒顆粒不能產(chǎn)生。前導序列的其它實例包括酵母α-因子交配信息素前導序列、前胰島素原前導序列、轉化酶前導序列、免疫球蛋白A前導序列、β-珠蛋白前導序列和卵白蛋白前導序列。選擇性標記可用于分析目標宿主或宿主細胞中核酸載體的存在與否。常用的選擇性標記包括當表達時導致宿主抗生素抗性的基因。所述基因賦予各種抗生素抗性，例如但不限于氨芐青霉素、四環(huán)素、強力霉素、卡那霉素、新霉素、博來霉素、嘌呤霉素、零霉素、潮霉素、氯霉素。也可使用報道基因，來監(jiān)測載體的表達(例如lacZ基因產(chǎn)物)，但是這并不推薦采用，因為本領域常用的報道基因編碼外源蛋白，當給予受試者時，所述蛋白能刺激不需要的或無法預料的免疫應答。同樣，在其中不需要抗生素抗性的某些環(huán)境下(例如當目的是高收率地產(chǎn)生用于臨床給藥的純的生物制品時)，抗生素的使用會產(chǎn)生三大問題。首先，在高密度培養(yǎng)條件(例如高生物量或連續(xù)培養(yǎng))下選擇壓力的喪失會導致抗生素降解或失活，結果導致產(chǎn)品收率下降。其次，產(chǎn)物不可避免地污染殘留的抗生素，在某些情況下，這會增加免疫致敏的危險性，甚至在受試者體內(nèi)產(chǎn)生過敏反應。最后，還存在著基因轉移后抗藥性傳播到環(huán)境生物(具體來說是病原體)的風險。一個阻抑蛋白滴定系統(tǒng)，可有利地用于在原核宿主中擴增核酸產(chǎn)物，而無需存在抗生素抗性基因；所述系統(tǒng)的方法通過引用結合到本文中(Williams，S.G.等，(1998)NucleicAcidsRes.26(9)2120-2124；美國專利第5,972,708號)。通過采用比染色體基因組過量的質(zhì)粒分子，來競爭性結合來自宿主選擇性基因的阻抑蛋白，可以選擇含有所述質(zhì)粒的細胞。換句話說，所述系統(tǒng)使用質(zhì)粒分子本身來激活選擇。這需要1)宿主菌株含有編碼細胞存活或生長必需產(chǎn)物的染色體基因，2)基因被阻抑蛋白例如λ阻抑蛋白負調(diào)節(jié)，3)胞內(nèi)阻抑蛋白濃度剛好足以達到阻抑所述基因，4)質(zhì)粒合有該阻抑蛋白的結合位點，和5)每個細胞中質(zhì)粒拷貝數(shù)足以達到阻抑蛋白滴定。復制起點定義為在其中發(fā)現(xiàn)復制起始位點的DNA上的位置。在質(zhì)粒產(chǎn)生的起始序列的情況下，起點是DNA序列，所述序列當加入到非復制的DNA中時能使之復制。起點也可以描述為DNA序列，所述序列在體外是酶復合物的結合靶位，已知所述酶復合物的功能是啟動DNA復制。通常使用的起點是colE1(pMB1)起點、酵母2μ起點、真核自主復制序列(ARS)、真核著絲粒序列、SV40起點、CMV起點。病毒傳遞系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、逆轉錄病毒載體或慢病毒載體。載體的其它實例包括離體傳遞系統(tǒng)，其中包括但不限于DNA轉染方法，例如電穿孔、DNA生物射彈、脂質(zhì)介導的轉染、緊密DNA介導的轉染。在一個優(yōu)選的實施方案中，痘病毒載體用于傳遞核酸。更優(yōu)選所用的疸病毒載體是修飾痘苗病毒Ankara病毒載體，所述載體以下還將進一步討論。目前，痘苗病毒作為用于在哺乳動物細胞的細胞質(zhì)內(nèi)表達基因的唯一的活載體(Hu，S.L.等，(1986)Nature320537-40；Moss，B.等，(1996)Adv.Exp.Med.Biol.3977-13；Sutter，G.和B.Moss.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910847-51)。痘苗病毒在本領域已有充分的描述，可參見美國專利號6,340,462；5,972,597；5,942,235；5,225,336；5,204,243；5,155,020；5,110,587；4,769,330；4,722,848；和4,603,112。作為科學工具，重組痘苗病毒已用于研究抗具體的感染性疾病(包括愛滋病)的保護所需的免疫應答類型(Girard，M.(1990)CancerDetect.Prev.14411-3；Haynes，B.F.(1996)Lancet348933-7；Moss，B.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9311341-8)。因為痘苗病毒感染人類，所以使用活痘苗病毒載體的主要擔心的是其安全性。常規(guī)痘苗病毒不能用于無免疫應答的患者，例如患有HIV、血液惡性腫瘤的患者，或者是經(jīng)歷化療的患者(Mayr，A.和K.Danner，(1978)DevBiolStand41225-34)。因此，已經(jīng)開發(fā)出幾株高度減毒的痘苗病毒株，用作天花疫苗(Paoletti(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9311349-53)(Moss，B.等，(1996)Adv.Exp.Med.Biol.3977-13；Sutter，G.和B.Moss.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910847-51；Blanchard，T.J.等，(1998)JGenVirol791159-67；Paoletti，E.(1996)ProcNatlAcadSciUSA9311349-53)。盡管這些減毒病毒不再需要用于抗天花的免疫，但是它們早就用于人類，提供了嚴格的安全信息，以指導對用于愛滋病疫苗開發(fā)的合適毒株的選擇。三種高度減毒而有效的基于痘病毒的載體，包括NYVAC(美國專利號6,596,279；5,762,938；5,494,807；5,453,364；5,378,457；364,773，金絲雀痘病毒(Canarypox)(ALVAC；美國專利號5,863,542；5,766,598；5,756,103)和修飾痘苗病毒Ankara(MVA)，可用于人用和獸用重組疫苗的定向應用中(Moss等，(1996)Adv.Exp.Med.Biol.3977-13)。MVA的應用描述于美國專利第5,185,146號。最好是使用宿主范圍有局限性的、并且只能在幼倉鼠腎細胞(BHK)和雞胚成纖維細胞(CEF)中復制的正痘病毒或禽痘病毒。美國專利第5,494,807號公開了ALVAC和NYVAC兩者在特定宿主中復制能力的差異。具體地講，MVA已用于超過12萬人初次接種的大規(guī)模疫苗試驗和臨床實踐。沒有與其應用相關的副作用，甚至當高?；颊呓邮艹醮谓臃N時也是如此(Mayr等，(1978)ZBLBaktHyg.IAbt.Orig.B167375-90)。MVA是宿主范圍局限性痘苗病毒株(Sutter，G.和B.Moss，(1995)DevBiolStand84195-200；Wyatt，L.S.等，(1998)Virology251334-42)。所述MVA株在雞胚成纖維細胞(CEF)中已經(jīng)傳代超過570次，并且已經(jīng)失去其在大多數(shù)哺乳動物細胞系中的復制能力，因為與WR痘苗病毒株相比，其基因組合有6個大缺失(Altenburger等，(1989)Arch.Virol.10515-27；Meyer等，(1991)J.Gen.Virol，71-1031-8；Mayr，A.，(1978)ZentralblBakteriol[B]167375-90；Meyer，H.等，(1991)JGenVirol721031-8；Stickl，H.等，(1974)DtschMedWochenschr992386-92)。這些缺失位于病毒基因組兩端附近。值得注意的是，一個缺失影響55K以及32K人類宿主范圍基因。進一步分析表明，約三分之二的宿主范圍基因的缺失部分造成病毒的減毒。MVA株在禽類細胞中生長良好，但是在人類和大多數(shù)所試驗的其它哺乳動物細胞中不能繁殖。盡管如此，MVADNA的復制看來是正常的，而且在人類細胞中合成了早期和晚期病毒蛋白(Sutter等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910847-51；Sutter，G.和B.Moss.(1992)ProcNatlAcadSciUSA8910847-51；Sutter，G.等，(1994).Vaccine121032-40)。因為重組基因表達在非容許人類細胞中未受破壞，所以MVA仍可作為高效且特別安全的載體(Moss，B.等，(1996)AdvExpMedBiol3977-13)。重要的是，在對付天花的戰(zhàn)役中，MVA株已用于對超過12萬人進行初次接種的大規(guī)模疫苗試驗和臨床實踐。沒有與其應用相關的副作用，甚至當免疫抑制恒河猴(macaque)或患者接受初次接種時也是如此(Mayr，A.等，(1978)ZentralblBakteriol[B]167375-90；Hochstein-Mintzel，V.等，(1972)ZImmunitatsforschExpKlinImmunol144104-56；Stittelaar，K.J.等，(2001)Vaccine193700-9)。已經(jīng)證明，高度減毒和復制缺陷型重組MVA的免疫原性和保護功效比許多常規(guī)痘苗病毒(VV)強。采用感染復數(shù)(MOI)≥1，高度減毒株MVA是誘導顯著量的IFNα/β的VV的唯一代表，IFNα/β起到抗病毒效應。來自5種眾所周知的常規(guī)VV株以及中國VV天壇株(VVTT)用作重組疫苗的復制型病毒不能誘導白細胞的IFN(IFNα；Buttner，M.等，(1995)Vet.Immunol.46237-50)。在小動物中，表達HA-NP基因的重組MVA株不僅誘導血清IgG抗體、粘膜IgA抗體和強烈的CTL應答，而且保護免疫小鼠免受流感病毒攻擊而造成的肺部感染，甚至當口服免疫后(Bender，B.S.等，(1996)J.Virol.706418-24)。最重要的是，用SIV/SHIV重組MVA免疫的恒河猴比用SIV重組NYCBH-VV免疫的恒河猴來說更會成為長期無進展者(non-progressors)(Hirsch，V.M.等，(1996)703741-52；Amara，R.R.等，(2001)Science29269-74)。這些恒河猴，就象感染HIV的人類長期無進展者一樣，最初具有低水平的血漿病毒血癥，然后是病毒復制的持續(xù)性限制，這與正常淋巴細胞亞組和完整的淋巴樣結構的維持有關。這些結果，與先前的MVA在人類的安全性數(shù)據(jù)一起，表明重組MVA用于人類愛滋病預防性接種的潛在用途。目前，尚沒有構建HIV重組MVA或者用于人類HIV-1免疫接種。多基因重組ADMVA是設計作為同源加強劑，對應于用于HIV-1亞型C初次免疫的質(zhì)粒DNA。該構建體編碼HIV-1結構基因(env、gag、pol)和調(diào)節(jié)基因(nef、tat)。在我們的疫苗中使用的基因來自基因亞型C株(循環(huán)重組型007或HIVCHN·AD，其也含有基因亞型B的片段)，該株在云南省是優(yōu)勢亞型。其它HIV基因亞型也可在本發(fā)明的核酸和病毒載體中被有利地取代，無需進行過多實驗。當采用痘苗病毒作為基因轉移或基因表達的載體時，痘苗病毒啟動子是必要的，因為所述病毒在感染細胞的細胞質(zhì)中復制。因為這一特征，所述病毒編碼其自身的復制和轉錄機，所述機器特異性識別痘苗病毒啟動子。與之相反，其它病毒利用宿主自身的機制來進行復制、轉錄和用于病毒繁殖的其它過程。在MVA載體中可有利地使用的啟動子包括但不限于7.5K啟動子、11K啟動子、40K啟動子、H5啟動子、I3啟動子、SYN(合成)啟動子和合成早期/晚期啟動子(sE/L)(Moss等，Biotechniques)。MVA通過在雞胚成纖維細胞中超過570次連續(xù)傳代而實現(xiàn)減毒。對MVA基因組的分析表明，減毒可以歸功于大片段的缺失，所述缺失大多是在被認為是非必需基因的區(qū)域。在MVA中，有6個大的自然發(fā)生的缺失，稱之為缺失I-VI。推測這些缺失位點含有非必需基因，因此提供異源基因的插入位點。使用缺失位點I-VI的任何一個，可產(chǎn)生效果并增強目的基因表達。另外，非必需胸苷激酶基因也提供另一個位點，在該位點可以插入外源基因。優(yōu)選的實施方案使用缺失位點III。缺失位點II也可單獨使用，或者與缺失位點III一起使用。同樣，其它減毒痘病毒具有含工程化缺失的基因組區(qū)，所述缺失可以是或不是必需的。美國專利第5,766,882號描述了一種缺陷型痘病毒，使之缺乏其親本痘病毒的必需區(qū)所賦予的功能。減毒NYVAC載體描述了基因組的類似區(qū)域，其中胸苷激酶基因、出血區(qū)、A型包涵體區(qū)、血凝素基因、宿主范圍基因區(qū)和大亞基、核糖核苷酸還原酶已從中缺失(美國專利第5,364,773號)。此外，NYVAC載體可額外包含產(chǎn)生干擾素的基因的缺失，因此增加了在目標宿主中的安全性。有2種用于制備重組MVA的基本方法，即同源重組和體外連接。同源重組是最早用于制備重組MVA的方法，并且仍然是最廣泛使用的方法(參見美國專利第4,769,330號)。用轉移質(zhì)粒來轉染細胞以及用病毒來感染細胞，所述質(zhì)粒含有處于痘苗病毒啟動子控制之下的重組基因，該啟動子鄰接來自痘苗病毒的幾百個堿基對的DNA。重組發(fā)生在轉移質(zhì)粒和病毒基因組的同源序列之間。各種方法均可用于分離重組MVA，這些方法包括根據(jù)溴脫氧尿苷或抗生素抗性進行選擇、對表達顯色標記的報道基因進行檢測、宿主范圍的補充或小噬斑表型(參見例如美國專利第5,155,020號)，以及噬斑的直接抗體染色或DNA雜交。選擇性標記的穩(wěn)定整合阻礙其在第二基因選擇上的應用；另外，在用于受試者的重組MVA中不希望存在額外的遺傳物質(zhì)。已經(jīng)開發(fā)了如下方案其中整合了抗生素抗性基因或顏色標記基因，并且其后通過重組而自發(fā)缺失；所述方案包括多輪噬斑純化(Chakrabarti，S.等，(1985)Mol.Cell.Biol.5(12)3403-9)。外源基因與MVA基因組的體外連接也為同源重組提供了替代方法(參見美國專利第6,265,183；5,866,383；5,445,953號)。因為MVADNA不具有感染性，所以用MVADNA來轉染細胞，以及用宿主限制性輔助病毒、條件致死病毒或其它缺陷病毒來感染細胞(美國專利第5,204,243號)。這些技術有效地容許相當大的DNA片段或者甚至將DNA片段文庫直接插入到痘苗病毒基因組中。已經(jīng)使用啟動子和唯一限制位點來構建重組VV基因組，以便進行克隆和表達(Pfleiderer，M.等，(1995)J.Gen.Virol.76(Pt.12)2957-62；Merchlinsky，M.和B.Moss(1992)Virology190(1)522-6)。人免疫缺陷病毒是一種逆轉錄病毒，逆轉錄病毒有許多種類。逆轉錄病毒的一些實例包括但不限于鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉納米肉瘤病毒(Fujinamisarcomavirus，F(xiàn)uSV)、莫洛尼鼠類白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠類骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾貝爾遜鼠類白血病病毒(Abelsonmurineleukemiavirus，A-MLV)、禽類成髓細胞瘤病毒-29(MC29)和禽類成紅細胞增生病毒(AEV)以及包括慢病毒屬在內(nèi)的所有其它逆轉錄病毒科。逆轉錄病毒的詳細一覽表可在Coffin等(″Retrovirus″1997ColdSpringHarbourLaboratoryPressJMCoffin，SMHughes，HEVarmus主編，第758-763頁)中找到。逆轉錄病毒一般分為2大類，即“單純型”和“復合型”。逆轉錄病毒還可再細分為7組。其中5組代表致癌的逆轉錄病毒。余下2組是慢病毒和泡沫病毒。有關這些逆轉錄病毒的綜述可參見Coffin等，1997(同上)。慢病毒家族與其它類型逆轉錄病毒之間的區(qū)別在于慢病毒具有既感染分裂細胞又感染非分裂細胞的能力(Lewis，P.等，(1992)EMBOJ.113053-3058；Lewis，P、F、和M.Emerman(1994)J.Virol.68510-516)。與之相反，其它逆轉錄病毒，例如MLV，不能感染已分化細胞等非分裂細胞，例如肌肉、腦、肺和肝組織。HIV屬于“慢病毒”類。在本申請中，可有利地使用其它慢病毒序列，例如FIV、SIV、EIAV等。本領域可以找到某些慢病毒的基因組結構詳述。有關HIV基因組的詳述在NCBIGenbank數(shù)據(jù)庫(即Genome檢索號AF033819；SEQDNO23-41)中可以找到。HIV逆轉錄病毒基因組包含gag基因、pol基因和env基因，這些基因編碼病毒體的蛋白和酶。這些基因的兩端鄰接被稱為長末端重復序列(LTR)的區(qū)域。LTR負責原病毒的整合和轉錄。它們也起到增強子-啟動子序列的作用。換句話說，LTR可以控制病毒基因的表達。逆轉錄病毒RNA的脫衣殼是通過位于病毒基因組5’端的ψ序列來進行。LTR本身是相同的序列，可分為三個元件，稱之為U3、R和U5。U3來自只有該RNA的3’端才有的獨特序列。R來自該RNA兩端的重復序列，而U5來自只有該RNA的5’端才有的獨特序列。這三個元件的大小在不同的逆轉錄病毒中變化很大。對于病毒基因組，轉錄起始位點在左側LTR的U3和R間的邊界上，而聚腺苷酸附加序列位點(終止位點)在右側LTRR和U5間的邊界上。U3含有絕大多數(shù)原病毒轉錄控制元件，其中包括對細胞轉錄活化蛋白起反應的啟動子和多個增強子序列，在某些情況下包括對病毒轉錄活化蛋白起反應的啟動子和多個增強子序列。對于結構基因gag、pol和env本身來說，gag編碼病毒內(nèi)部結構蛋白。Gag蛋白被蛋白酶水解而加工成成熟蛋白MA(基質(zhì))、CA(衣殼)和NC(核衣殼)。pol基因編碼逆轉錄酶(RT)，所述酶含有與RNA酶H和整合酶(IN)相關的DNA聚合酶，該酶介導基因組的復制。env基因編碼病毒體的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，所述蛋白形成與細胞受體蛋白特異性相互作用的復合體。所述相互作用通過病毒膜與細胞膜的融合而最終導致感染。gag、pol和env的共表達，結果形成感染性的病毒顆粒。對于制備免疫原性組合物和疫苗的目的來說，感染性病毒顆粒的形成將導致危險和不可接受的風險局面。盡管所述基因各自的突變(例如在pol特異區(qū)的突變)引起病毒感染性的失活，然而，仍然會發(fā)生病毒顆粒的形成。本發(fā)明提供HIV序列的表達，其中所述序列編碼不能裝配成感染性或非感染性病毒顆粒的蛋白。用于本文目的的蛋白表達，其作用是誘導免疫應答。對于在有需要的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答來說，所述蛋白的活性、或者甚至是全長蛋白的存在，通常并不是必需的。先前已經(jīng)描述了包含HIV序列的質(zhì)粒。美國專利第5,665,577號描述了HIV序列，所述序列可以在質(zhì)粒載體中表達，但是該序列編碼的蛋白形成的病毒體卻沒有足夠的HIVRNA，以產(chǎn)生有復制能力的HIV病毒體。美國專利第6,451,304號描述了用于制備不能復制的逆轉錄病毒載體的方法，所述方法包括用第一原病毒質(zhì)粒、第二原病毒質(zhì)粒和第三構建體來轉染細胞；所述第一原病毒質(zhì)粒編碼gag，但不編碼pol或包膜蛋白；第二原病毒質(zhì)粒編碼pol，但不編碼gag或包膜蛋白；而第三構建體編碼單獨的包膜蛋白。HIV也含有除編碼gag、pol和env蛋白之外的額外基因。HIV中的額外基因是vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef。額外基因編碼的蛋白具有各種功能，其中的一些可以通過細胞蛋白提供復制功能。在HIV中，tat起到病毒LTR的轉錄活化物的作用。它與穩(wěn)定的莖-環(huán)RNA二級結構結合，被稱為TAR。Rev通過rev效應元件(RRE)來調(diào)節(jié)和輔助病毒基因的表達。在發(fā)達西方國家中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢亞型即基因亞型B，與非洲和亞洲(這里居住著絕大多數(shù)的HIV感染者)存在的其它亞型和重組株很不相同。因此，醫(yī)生們在北美和歐洲遇到的亞型B逆轉錄病毒與那些在全球范圍危害人類的病毒亞型之間存在著很大的差異(Spira，S.等，(2003)J.Antimicrob.Chemother.51(2)229-40)。在不同地理區(qū)域的病毒亞型的大的基因組多樣性，是HIV逆轉錄酶(RT)驚人的高錯配誤差率、再加上缺乏核酸外切酶校正活性的結果。引起遺傳多樣性高度變化的其它因子包括每種病毒亞型的復制率、每次復制周期產(chǎn)生的突變數(shù)、基因組重組和病毒適合度的病毒傾向性。另外，基因組進化的高速率也可由宿主、環(huán)境和/或治療性選擇壓力而引起。3類HIV-1已經(jīng)在全球擴散M(主要亞型組)、O(外亞型組)和N(新亞型組)。其中M組占已報告HIV/AIDS病例的90％以上；在M組中，病毒包膜變化多樣，使得該組被進一步劃分成9個主要的基因亞型(包括A-D、F-H、J和K)以及多個循環(huán)重組型。病毒多樣性看來是從撒哈拉非洲次大陸發(fā)散開來，在這里生活著的總共4000萬人中超過2800萬人被感染。A和A/G重組變異株在西非和中非占優(yōu)勢。B在歐洲和美洲成為優(yōu)勢種。然而，隨著移民和全球化的增加，在歐洲，＞40％的新增感染呈現(xiàn)非B非洲變異株和亞洲變異株。C在南非和東非、印度和尼泊爾占優(yōu)勢。的確，基因亞型C因為在以下國家未受控制地擴散，而已成為近年來HIV大流行的中心博茨瓦納、津巴布韋、馬拉維、贊比亞、納米比亞、萊索托、南非、印度、尼泊爾和中國。D一般局限于東非和中非，并在南非和西非觀察到散在病例。E從未單獨出現(xiàn)，但泰國、菲律賓、中國和中非卻檢測到A/E嵌合狀態(tài)。F已在中非、南美和東歐有報道。G和A/G重組病毒已在西非和東非以及中歐發(fā)現(xiàn)。H僅在中非被檢測到。J僅在中美洲報道過。K目前已在剛果民主共和國和喀麥隆被鑒定。該表并不詳盡，因為還在不斷發(fā)現(xiàn)更多亞型，而且移民群體正帶來新的感染模式。需要特別關注的是HIV-1基因亞型C和A，以及A/G和A/E重組型，這些代表了非洲和亞洲的優(yōu)勢亞型，而非洲和亞洲又是HIV病最危險的失控地區(qū)。與此形成鮮明對比的是，其它種類的逆轉錄病毒如HIV-2，除了在西非正在流行外，并未更多地擴散到西非以外的地區(qū)。僅在非洲觀察到一些散在的病例，但是該病毒的致病性看來明顯低于HIV-1。根據(jù)包膜(env)核苷酸序列中20-50％的差異，可將HIV-1基因亞型按系統(tǒng)發(fā)生進行分類。M組和O組的Env蛋白可有多達30-50％的差異。但是，N亞型看來與M和O在系統(tǒng)發(fā)生上是等距的。在M組內(nèi)，觀察到基因亞型間env變異的不同達20-30％，而基因亞型內(nèi)的變異為10-15％。HIV-1的pol區(qū)的變異性比env小2-3倍，因為該區(qū)編碼2種極其重要的酶，即RT和蛋白酶，所以該區(qū)如果過分突變則會導致該病毒不起作用。Gag序列甚至更不耐受突變，因為它們編碼更嚴格的核心蛋白序列。基因亞型間和基因亞型內(nèi)pol序列的變異特別有關，因為該區(qū)編碼許多抗病毒藥物所針對的RT和蛋白酶蛋白。因此，在這些區(qū)域的變異可影響藥物敏感性，并且發(fā)展抗藥性。埃塞俄比亞基因亞型C分離株與基因亞型B有6.8-10％的差異(就RT而言)，并且已經(jīng)報道來自非洲、印度和南美毒株的基因亞型內(nèi)差異達3.5-5.8％。值得注意的是這一事實核苷酸序列中一定的百分率變異翻譯成較低的氨基酸序列變異，因為許多遺傳突變是沉默型的。例如在基因亞型E和B中RT序列間有10％的核苷酸變異，僅產(chǎn)生7％的氨基酸殘基的變異。不僅基因亞型與基因亞型間的env基因基本上不同，而且長末端重復(LTR)序列也不同，所述序列含有HIV復制的轉錄啟動子。每個基因亞型具有其自身的LTR拷貝數(shù)以及精確的增強子和啟動子結構核苷酸序列，雖然在其它LTR均一性的特征在于，即Spl位點、TATA盒和TAT效應元件。此外，在各種轉錄啟動子中都觀察到多樣性。這些包括NF-κB結合位點(C中有3-4個，B中有2個，而E中僅1個)，以及在NF-κB位點上游序列(例如nef重疊USF基因，該基因僅存在于基因亞型B中)，和AP-1轉錄因子結合位點(所述位點在亞型C、E和G中存在1個，在A和F中存在2個，而在B或D中不存在)。不僅在基因亞型A、C、D或O中具有含NF-IL6轉錄因子(C/EBP-B)特異性基序的U3的-170區(qū)，而且在B中也具有。該因子反式激活來自單核細胞的細胞中的HIV-1LTR。此外，與基因亞型B的檢測相比，在基因亞型C、D和E中觀察到負調(diào)節(jié)元件(NRE)之間的亞型差異。最近實驗表明，在HIV-1基因亞型間，病毒調(diào)節(jié)蛋白序列Nef也不同，變異范圍從14.4％到23.8％，其中B和D的Nef構型最接近。目前，Nef序列多樣性的臨床意義尚不明確，但是可能是意義重大，因為近期觀察到，在基因亞型B的感染者中，Nef序列可隨疾病進程而變化。最后，有證據(jù)表明，其它的調(diào)節(jié)和輔助HIV-1基因在亞型多樣性中發(fā)揮重要作用。這部分地涉及這一事實基因亞型C含有獨特的截短Rev蛋白和增加的Vpu產(chǎn)物，以及發(fā)現(xiàn)基因亞型D表達C端缺失的Tat蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供含有HIV-1基因亞型C以及循環(huán)重組型007(也稱為HIVCHN.AD)的核酸和MVA載體，所述載體也含有基因亞型B的區(qū)段)，所述亞型在云南省是優(yōu)勢亞型。此外，其它基因亞型也可任選用于替代實施方案。先前在WO99/41397中已經(jīng)描述了密碼子最優(yōu)化。不同細胞對具體密碼子的使用不同。這種“密碼子偏倚”符合在該細胞類型中特定tRNA相對豐度的偏倚。通過改變序列中的密碼子，使它們更加匹配相應的tRNA的相對豐度，可以增加表達。同樣，可以通過為已知在特定細胞類型中稀有的相應tRNA來刻意選擇密碼子，以降低表達。因此，可以進行額外程度的翻譯控制。許多病毒，包括HIV和其它慢病毒在內(nèi)，均大量使用稀有密碼子；通過將其改變成相應的哺乳動物通用密碼子，可以在哺乳動物生產(chǎn)細胞中達到增加所包裝組分的表達。哺乳動物細胞和其它各種生物的密碼子使用表是本領域已知的。密碼子最優(yōu)化具有許多其它優(yōu)點。由于改變其序列，在生產(chǎn)細胞/包裝細胞中編碼裝配病毒顆粒所需的病毒顆粒包裝組分的核苷酸序列具有從中消除的RNA不穩(wěn)定序列(INS)。同時，保留了包裝組分氨基酸序列的編碼序列，使得所述序列所編碼的病毒組分保持相同，或者至少十分相似，使得所述包裝組分功能沒有降低。密碼子最優(yōu)化也克服了輸出、獨立賦予最佳序列Rev所需的Rev/RRE。密碼子最優(yōu)化也可在載體系統(tǒng)中降低不同構建體之間的同源重組(例如在gag-pol和env可讀框重疊區(qū)之間)。因此，密碼子最優(yōu)化的總體效果是顯著增加病毒滴度并提高了安全性。本發(fā)明涉及將編碼病毒抗原的DNA直接注射到皮膚或肌肉的策略。然后局部細胞可吸收所述質(zhì)粒并自己表達所述外源蛋白，原位產(chǎn)生疫苗免疫原。任選使用MVA初次免疫和加強免疫，以在具有HIV感染或HIV相關疾病危險的受試者中增強免疫應答。該方法既經(jīng)濟又靈活多變。然而，更重要的是體內(nèi)潛在的功效。本發(fā)明還包括使用所述核酸載體，在已經(jīng)感染所述病毒的感染者體內(nèi)刺激免疫應答。此外，本發(fā)明的載體可用于在感染者體內(nèi)產(chǎn)生針對該載體提供的抗HIV序列的抗體，或者是抗預先存在的循環(huán)HIV序列的抗體。因此，本發(fā)明還預期在HIV或HIV相關疾病的診斷試劑盒中使用本文公開的載體而產(chǎn)生的抗體的用途。藥學上可接受的載體部分取決于在給予所述化合物時所使用的具體組合物以及具體方法。本發(fā)明包括給予包含核酸的藥用組合物，并任選與MVA病毒加強劑聯(lián)用。在一個替代實施方案中，可以單獨給予MVA，而不給予核酸。因此，這些核酸的藥用組合物有許多合適的制劑(參見例如Remington′sPharmaceuticalSciences，第17版.1989)?？梢圆捎萌魏纬Ｒ?guī)方式給藥，例如注射、口服給藥、吸入、經(jīng)皮給藥，或者直腸給藥。當采用粘膜給藥時，可以采用口服、眼用或鼻腔途徑。適于胃腸外給藥的制劑，例如通過肌內(nèi)、皮內(nèi)和皮下途徑，包括含水和不含水的、等滲無菌注射液，其中可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及賦予該制劑與預期給予的受體血液等滲的溶質(zhì)；以及含水和不含水的、等滲無菌混懸液，其中可含有懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。在本發(fā)明的實踐中，可以給予組合物，例如通過靜脈內(nèi)輸注、口服、局部、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)或鞘內(nèi)方式。胃腸外給藥是優(yōu)選給藥方式。所述制劑可呈單位劑型或多劑量密封容器形式，例如安瓿和小瓶。可以通過本領域已知方法制備純化疫苗溶液，供給藥用，所述方法可包括將溶液過濾除菌、稀釋溶液、加入佐劑并穩(wěn)定該溶液。疫苗可以是凍干疫苗，以生產(chǎn)易于運輸和貯藏的干形式抗HIV疫苗。此外，可以制備供初次接種用的單獨的ADVAXI和ADVAXII疫苗或聯(lián)合疫苗，以及供加強免疫用的單獨的ADMVA疫苗，或可含有至少一種其它抗原，只要所加抗原不干擾初次或加強免疫疫苗的有效性，并且不額外增加或協(xié)同增加副作用和不良反應。重組痘病毒或免疫原可以與合適的載體、稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理鹽水等)混合。組合物也可以凍干或冷凍。所述組合物可含有輔料，例如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、佐劑、防腐劑等，這取決于給藥途徑和所需制劑。藥學上可接受的佐劑，例如完全或不完全弗氏佐劑、RIBI(胞壁酰二肽)、ISCOM(免疫刺激復合物)、霍亂毒素B、氫氧化鋁等礦物凝膠劑，以及溶血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子等表面活性劑，肽類、含油乳劑、匙孔血藍蛋白和二硝基苯酚。BCG(卡介苗)和小棒狀桿菌(Corynebacteriumparvum)是潛在有用的人用佐劑，它們可以通過將核酸和/或病毒載體螯合在局部貯庫中以防止其快速分散，或者它們可含有某些物質(zhì)，所述物質(zhì)刺激宿主分泌巨噬細胞趨化因子和其它免疫系統(tǒng)組分。免疫程序可以涉及或不涉及兩種或多種多肽的給藥，時間可以跨越數(shù)周。本發(fā)明包括在動物中誘導抗HIV的免疫性或保護性免疫應答的方法，所述方法包括將所述免疫原性組合物或疫苗組合物給予所述動物。本發(fā)明還包括抗HIV的初次-加強免疫或接種，其中所述初次免疫是采用DNA疫苗或免疫組合物或免疫原性組合物，它們含有在體內(nèi)編碼和表達HIV免疫原、抗原或表位的核酸分子；而所述加強免疫是采用疫苗或免疫組合物或免疫原性組合物，它們是HIV失活制劑或減毒制劑或亞單位(抗原、免疫原和/或表位)制劑，和/或重組或修飾病毒疫苗或免疫組合物或免疫原性組合物，所述疫苗和組合物含有在體內(nèi)編碼和表達HIV免疫原、抗原或表位的核酸分子。因此，本發(fā)明提供抗HIV的初次-加強免疫或接種方法，例如包括以下的抗HIV的初次-加強免疫或接種將含有在體內(nèi)編碼和表達HIV抗原、免疫原或表位的核酸分子的本發(fā)明DNA疫苗或免疫組合物或免疫原性組合物給予目標動物(作為初次接種)，然后給予含有在體內(nèi)編碼和表達HIV免疫原、抗原或表位的核酸分子的重組或修飾病毒疫苗或免疫組合物或免疫原性組合物，最好給予體內(nèi)表達HIV免疫原、抗原或表位的重組疫苗或免疫組合物或免疫原性組合物(作為加強免疫)。加強免疫最好與初次免疫相匹配，例如加強免疫含有或表達至少一種被初次免疫表達的抗原、表位或免疫原。給藥方法可包括給予有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗?？梢圆捎靡淮位蚨啻谓o藥，例如兩次給藥。本發(fā)明包括用于不同給藥途徑的組合物形式。按已知因素確定有效劑量和給藥途徑，例如年齡、性別、體重以及已知的其它篩選程序，而無需進行過多的實驗。對于亞單位的免疫原性組合物、免疫組合物或疫苗組合物，每種活性劑的劑量可以是按照本文引用文件(或本文引用文件所參考或引用的文件)和/或其范圍可以從一微克或幾微克到幾百微克或幾千微克，例如1μg-1mg。初次免疫和加強免疫的給藥量和給藥途徑可以是如本文所討論的，例如按照本發(fā)明和本領域的知識，可以實施初次-加強方案，而無需進行過多的實驗。此外，按照本文公開內(nèi)容和本領域的知識，技術人員可以對上面提到的目標物種使用所述方法、試劑盒等?？梢杂脽o針的液體噴射注射器或粉末噴射注射器注射所述疫苗或免疫原性組合物。對于質(zhì)粒，也可使用包埋質(zhì)粒的金顆粒并采用所述方法噴射而穿透待免疫受試者的皮膚細胞(Tang等，Nature1992，356，152-154)。本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物的給藥方法和儀器可以參考引用并結合到本文的其它文件。無針注射器也可以是例如Biojector2000(BiojectInc.，PortlandOR，USA)。本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗最好包含有效量的引發(fā)免疫應答和/或保護性免疫應答的本文討論的一種或多種表達載體和/或多肽；并且，有效量可以按照本
發(fā)明內(nèi)容(包括結合到本文中的文件)和本領域的知識來確定，而無需進行過多的實驗。在基于質(zhì)粒載體的免疫原性組合物或疫苗的情況下，劑量通?？砂s10μg至約2000μg，最好約50μg至約1000μg。給藥體積可以在約0.1ml和約2ml之間，最好在約0.2ml和約1ml之間?？梢园春线m劑量給予重組載體，以達到本文和/或本文所引用文件所描述劑量的相應的體內(nèi)表達。例如，可以憑經(jīng)驗來確定病毒懸液的合適范圍。本發(fā)明的病毒載體或重組株可以按每劑至少103pfu的量給予受試者或感染或轉染到細胞中；更優(yōu)選約104pfu至約1010pfu，例如約105pfu至約109pfu，例如約106pfu至約108pfu，例如每劑2ml。如果不止一種重組株表達不止一種基因產(chǎn)物，每個重組株可以按這些量給予；或者，每個重組株可以與包含這些劑量的重組株聯(lián)合、共同給予。在本發(fā)明使用的重組載體組合物中，劑量可以按照本文引用文件描述或按照本文描述或按照本文引用文件中的參考或引用文件來確定。例如，重組載體組合物中每種DNA的合適量可以是1μg至2mg，最好是50μg至1mg。技術人員可以參考本文引用文件(或本文引用文件中的引用或參考文件)中關于DNA載體的內(nèi)容，來確定本發(fā)明重組DNA載體組合物的其它合適劑量，而無需進行過多的實驗。然而，引發(fā)合適的免疫應答的組合物劑量、其中的組分濃度和給予所述組合物的時間可以通過血清抗體滴定等方法來確定，例如通過受試者體內(nèi)的ELISA和/或血清中和測定分析和/或通過接種攻擊評估。所述確定方法可按照技術人員的知識、本
發(fā)明內(nèi)容和本文引用文件，而無需進行過多的實驗。而且，序貫給藥時間同樣可以按照本
發(fā)明內(nèi)容和本領域的知識來確定，而無需進行過多的實驗。以下給出實施例，是為了給本領域普通技術人員提供完整
發(fā)明內(nèi)容和怎樣進行和采用本發(fā)明的測定、篩選和治療性方法的詳述，并且不是用來限制本發(fā)明人所考慮的本發(fā)明的范圍的。實施例實施例1DNA疫苗ADVAXI和II的構建本發(fā)明預防性疫苗方案包括兩種新型DNA載體，以及用重組表達相應的HIV-1蛋白的修飾痘苗病毒Ankara(MVA)的加強免疫。本疫苗所采用的基因來自HIV-1基因亞型C株、循環(huán)重組型007或HIVCHN.AD，所述基因也含有在云南作為優(yōu)勢亞型的基因亞型B的小區(qū)段。nef基因產(chǎn)物和tat基因產(chǎn)物在病毒生命周期早期表達，并且代表HIV-1感染的免疫控制的關鍵靶。另外，也選擇Gag、pol和env結構基因。因此，在本發(fā)明的DNA疫苗策略中包括結構基因和調(diào)控基因，是為最大量包括免疫原性表位而設計的。本發(fā)明的DNA疫苗基于pVAX1，這是一種Invitrogen市售質(zhì)粒(圖1)。該載體是專為用于開發(fā)DNA疫苗而設計的，而且按照美國食品及藥品管理局(FDA)規(guī)程的要求來構建(CenterforBiologicsEvaluation和Research，F(xiàn)DA，1996年12月22日，卷號96N-0400)。但是，原來的載體通過插入額外的啟動子而被修飾。采用PCR，從市售載體pBudCE4.1(Invitrogen)擴增人延伸因子1α(hEF1a)啟動子。所述啟動子克隆到pVAX1的EcoRI/NotI位點，該新構建體經(jīng)測序證實。hEF1a啟動子已經(jīng)由他人表征(Najjar，S.M.等，(1999)Gene23041-5；Nishimura，Y.等，(1999)Vaccine18675-80；Wallich，R.等，(2001)Infect.Immun.692130-6)。pVAX1的這一變化，產(chǎn)生pADVAX(圖2)，已發(fā)現(xiàn)后者容許獨立的高水平表達第二基因插入序列。pADVAX的雙順反子容量比用內(nèi)部核糖體進入位點或IRES更加有效(10-20倍)(Martinez-Salas，E.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10458-64)。蛋白質(zhì)印跡顯示，處于pADVAX雙啟動子控制之下的每個基因的蛋白表達水平與pVAX1中單由CMV啟動子驅(qū)動的表達水平相當。構建pADVAX載體后，制備用于插入的HIV病毒基因。合成HIV-1env基因和gag基因，使之包含對于哺乳動物表達最優(yōu)化的密碼子。密碼子最優(yōu)化代表Rev/RRE獨立型核輸出的促進作用(Schneider，R.等，(1997)J.Virol.714892-903；Kotsopoulou，E.等，(2000)J.Virol.744839-52)，這與病毒基因表達增加是一致的。用重疊PCR，將寡核苷酸(80-mers至90-mers，重疊16-18次)與序列結合，反映理想的密碼子選擇。經(jīng)ELISA或蛋白質(zhì)印跡測定，這增加了基因表達100倍至1000倍。通過摻入組織纖溶酶原激活物(tPA)前導序列(MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSAR)(SEQIDNO1)來替代天然env序列和補充gag基因，進一步修飾所述基因。認為該序列通過促進蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)轉運到高爾基體而部分增強表達(Haddad，D.等(1997)FEMSImmunol.Med.Microbiol.18193-202；Li，Z.等，(1999)Infect.Immun.674780-6；Weiss，R.等，(1999)Vaccine1881524；Qiu，J.T.等，(2000)J.Virol745997-6005)。有了這樣的修飾，基因表達可進一步增加3-5倍。圖3顯示經(jīng)定量測定HIV-1Gag(p24)的ELISA(AbbottLaboratories)法檢測，天然gag(NAT)、密碼子最優(yōu)化gag(OPT)和密碼子最優(yōu)化gag/tPA(tPAOPT)的表達。采用抗env基因產(chǎn)物的多克隆抗體，進行蛋白質(zhì)印跡測定，得到因密碼子最優(yōu)化和添加tPA前導序列而得到的增加的env表達的類似結果(圖4)。結果表明，Env功能保留了遺傳修飾。在涉及攜帶CD4/CCR5(HIV-1受體/共同受體)的HeLa細胞的融合測定中，用tPA-最優(yōu)化env載體轉染的293T細胞能夠融合而形成合胞體(結果未顯示)。有了合適位置的所需遺傳修飾，兩個HIV-1基因克隆到pADVAX中，產(chǎn)生第一疫苗即ADVAXI。經(jīng)蛋白質(zhì)印跡證實雙順反子表達(圖5)。如上所述再構建第二疫苗即ADVAXII，用重疊PCR結合密碼子最優(yōu)化寡核苷酸，來合成pol、nef和tat。然而，采取額外措施，以保證體內(nèi)應用的安全性。首先，pol基因包括蛋白酶(PR)活性位點的缺失，以阻止多肽加工(Loeb，D.D.等，(1989)Nature340307-400)，結果用蛋白質(zhì)印跡證實(圖6)。采取額外的謹慎步驟，以在逆轉錄酶(RT)活性位點以及pol基因中摻入點突變(Wakefield，J.K.等，(1992)J.Virol666806-12；Chao，S.F.等，(1995)NucleicAcidsRes.23803-10)。為了將這三個基因全部摻入到一個基于pADVAX的載體中，重疊PCR產(chǎn)生nef-tat融合基因。這兩個遺傳序列都保持完整，因而在所得融合蛋白中保留所有的免疫原性表位。如上所述，將tPA前導序列加入到pol和nef-tat中。用蛋白質(zhì)印跡分析用相關載體轉染的293T細胞的兩種裂解物和上清液，證實得到增加的表達和分泌效率(圖7-8)。所用抗體是多克隆兔抗Nef抗體(由CeciliaCheng-Mayer博士提供)。因為有了Pol，所以考慮了用于體內(nèi)的nef-tat融合蛋白的安全性，并進行了如下分析。已知Nef負調(diào)節(jié)CD4和I類MHC的表面表達(Collins，K.L.等，(1998)Nature391397-401；Aiken，C.等，(1994)Cell76853-64；Collins，K.L.等，(1999)Immunol.Rev.16865-74)，而tat具有免疫抑制效應，推測起到通用反式激活物的作用(Goldstein，G.(1996)Nat.Med.2960-4；Garber，M.E.等，(1999)Curr.Opin.Immunol.11460-5)。然而，采用流式細胞儀分析，我們證明Nef對I類MHC表達的影響被tPA前導序列抵消(圖9)。同樣，在nef-tat融合蛋白的情況下，tat喪失其反式激活能力。在“MAGI”測定中，可明確觀察到該現(xiàn)象，所述測定包括使用HeLa細胞，該細胞經(jīng)工程化以便在功能性HIV-1Tat存在下表達β-半乳糖苷酶基因(Kimpton，J.等，(1992)J.Virol.662232-9)。隨著X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷)底物的加入，該細胞變藍，如果tat有活性的話(結果未顯示)。因此，可以推導出，由該疫苗產(chǎn)生的Nef-Tat融合蛋白將不再具有體內(nèi)免疫抑制效應。確實，甚至不顧通用反式激活的風險，已經(jīng)知道，編碼野生型HIV-1tat的DNA在無免疫應答個體中用作疫苗是安全的(Calarota，S.A.等，(1999)J.Immunol.1632330-8)。圖10圖示這些載體。實施例2ADVAXI和II-細胞介導應答的體內(nèi)免疫原性評價如上所述，用酶聯(lián)免疫斑點測定來評價針對ADVAXI和II的細胞介導的免疫應答(另參見Hanke，T.等，(1998)J.Gen.Virol7983-90；Carvalho，L.H.等，(2001)J.Immunol.Methods252207-18；Tobery，T.W.等，(2001)J.Immunol.Methods25459-66；Novitsky，V.等，(2001)J.Virol.759210-28)。用ADVAX1的GLP級貯液(Aldeveon，F(xiàn)argo，ND)來免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。分別在第0、3和6周肌內(nèi)給予200μg所述疫苗。用以下構建體接種總共5組小鼠，每組6只pVAX1-env、pVAX1gag、pVAX1-env+pVAX1-gag、pVAX1(對照)和ADVAX1。呈現(xiàn)特定表位的肽如下Env34(VPVWKEAKTTLFCASDAKAY)(SEQIDNO3)已知能引發(fā)CD4+細胞介導的應答，Env43(RNVSSDGTYNETYNEIKNCS)(SEQIDNO4)引發(fā)CD8+細胞介導的應答，Gag26(TSNPPIPVGDIYKRWIILGL)(SEQIDNO5)引發(fā)CD4+細胞介導的應答，以及GagA-I(AMQMLKDTI)(SEQIDNO6或2)引發(fā)CD8+細胞介導的應答。第3次注射后2周，處死小鼠。然后從每組收集脾細胞，并且在用Env和Gag抗原特異性肽庫(NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram)進行體外再次刺激期間，用酶聯(lián)免疫斑點測定來檢測它們分泌干擾素-γ(IFNγ)的能力。就在本文寫成之時，僅來自異源株(HIV96zM65.8，產(chǎn)品目錄號3993)的Gag肽可用。同樣，在我們進行酶聯(lián)免疫斑點測定時，我們尚不具備全套同源Env肽(HIVCHN.AD，產(chǎn)品目錄號4974，80％完整性)。盡管如此，結果顯示出對每種單啟動子驅(qū)動的載體(pVAX1-env和pVAX1-gag)的強烈免疫應答，每種都產(chǎn)生約700斑點形成細胞(SFC)/106脾細胞。ADVAXI誘導的免疫應答比較顯著，約600SFC/106脾細胞對所檢測的Env和Gag肽庫具有特異性。預期針對pVAX1控制的應答是nil，而且在脾細胞合并液缺乏CD8+細胞時，沒有檢測到針對GagA-I的酶聯(lián)免疫斑點測定的應答(圖11)?？偟膩碇v，檢測了抗至少9個不同表位的細胞介導免疫應答，所述表位包括對CD8+或CD4+T細胞具有特異性的表位(數(shù)據(jù)未顯示)。沒有檢測到ADVAXI的兩種基因產(chǎn)物間的免疫原性協(xié)同或干擾的證據(jù)。劑量提高實驗揭示出清楚的劑量-反應效應(圖12)。對于至少一個表位(Env34)，發(fā)現(xiàn)150μg的定量酶聯(lián)免疫斑點測定的應答約為5μg的7倍。盡管如此，劑量-反應趨勢對于所有檢測的表位都適用，不管對CD4+或CD8+細胞介導的應答是否有特異性。實施例3體內(nèi)臨床前免疫原性評價以下數(shù)據(jù)支持ADVAXI的體內(nèi)體液免疫原性。在小鼠實驗的最后一次(第3次)免疫后兩周，收集血清樣品，用ELISA檢測抗Gag抗體。盡管在接種pVAXI-gag的小鼠中觀察到最高滴度，但是，與接受pVAXI-env+pVAXI-gag的動物延遲的應答相比，在用ADVAXI免疫的一組動物中也有基礎滴度(圖13)。通過蛋白質(zhì)印跡，證明從ADVAXI組收集的血清樣品也有抗EnV抗體應答。用ADVAXII進行了相似的體內(nèi)研究。具體地講，用ADVAXII的GLP級貯液(Aldevron，F(xiàn)argo，ND)來免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。分別在第0、3和6周肌內(nèi)注射給予200μg所述疫苗。用以下構建體共接種5組小鼠，每組5只pVAX1-pol、pVAX1-nef-tat、pVAX1-pol+pVAX1-nef-tat、pVAX1(對照)和ADVAXII(唯一的雙啟動子載體)。第3次注射后2周，處死小鼠。然后從每組收集脾細胞，并且在用來自肽庫的pol、tat和nef進行體外再次刺激期間，用酶聯(lián)免疫斑點測定來檢測它們分泌干擾素-γ的能力。要注意的是，檢測時，沒有可用的基因亞型C肽。所述抗原特異性肽由基于基因亞型B共有序列的15-mers(NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgramTat的產(chǎn)品目錄號5138，Nef的產(chǎn)品目錄號5189和Pol的產(chǎn)品目錄號6208)組成。盡管如此，正如在ADVAXI實驗中一樣，我們比較性地觀察了單基因載體和雙啟動子疫苗的良好應答。抗Pol庫的應答，例如，對于pVAX1pol單用是最好的(300-800SFC/106脾細胞，取決于庫)。對于pVAX1pol+pVAX1nef-tat，結果范圍是180-500SFC/106脾細胞，而對于ADVAXII，應答在180-600SFC/106脾細胞之間。由于有了Tat庫，對于pVAXI-neftat來說應答為-180SFC，而對于pVAX1pol+pVAX1nef-tat和ADVAXII來說為-100SFC。使用Nef庫，對于pVAX1nef-tat來說應答為30-200SFC，而對于pVAX1pol+pVAX1nef-tat和ADVAXII為20-150SFC(圖14)。我們用ADVAXII還進行了劑量增加研究，證明了明確的劑量-反應效應(圖15)。分別在第0、3和6周，經(jīng)肌內(nèi)注射給予小鼠5μg、10μg、50μg、100μg或150μg的DNA。在第8周處死小鼠后，收集脾細胞，用來自基因亞型B共有序列的肽進行體外再次刺激。Pol應答隨劑量的增加而增加，從10μg時的250-500SFC增加到100μg時的500-700SFC。150μg時的應答與100μg時的相當。Nef應答范圍從-20SFC到-200SFC，而Tat應答從-25SFC到-100SFC。進行了ADVAXI+II聯(lián)合接種的體內(nèi)試驗。分別在第0、3和6周，經(jīng)肌內(nèi)注射給予各組小鼠5μg、10μg、50μg、100μg或150μg的ADVAXI+II。對照組接受pVAX1gag、pVAX1env、pVAX1pol和pVAX1-nef-tat各50μg的混合物。最后一次免疫后2周，處死小鼠，收集各組的脾細胞，用酶聯(lián)免疫斑點法測定干擾素-γ的釋放。用含有CD4+和CD8+T細胞表位的Env特異性肽、Gag特異性肽和Pol特異性肽進行體外再次刺激，如同自體亞型CTat和Nef序列一樣。正如在單用ADVAXI和ADVAXII的試驗中所觀察的，該聯(lián)合接種試驗的結果表明對這兩種疫苗載體的比較好的應答。用ADVAXI+II接種的小鼠具有抗所有受試肽(肽庫)的抗原特異性應答，而且所述應答是以劑量依賴性方式誘導的(表1)。表1.針對聯(lián)合接種和對照的抗原特異性干擾素-γ酶聯(lián)免疫斑點測定的應答注意根據(jù)兩種細胞輸入水平的雙份重復孔，斑點數(shù)都標準化每106脾細胞，并且計算每種樣品和抗原的平均數(shù)。Gag26、Env34和Pol223含有CD4表位，而GagA-I、EnvT-I、PolYLI和PolVGI含有CD8表位。用于Tat和Nef的肽庫來自自體亞型-C序列。注意，在該試驗中，在用來自亞型C的Nef和Tat肽庫對脾細胞進行體外再次刺激時，觀察到特別強烈的應答；相比之下，先前在ADVAXI試驗中觀察到較溫和的應答。這一差異可能歸結于異源蛋白和自體蛋白間的差異。因此，我們認為，事實上，在ADVAXII中的nef-tat融合基因能誘導非常有效的免疫應答。此外，聯(lián)合接種試驗證明，通過干擾素-γ酶聯(lián)免疫斑點測定，在不同的抗原特異性應答中沒有可檢測的干擾。實施例4構建重組MVA病毒載體作為抗HIV-1疫苗我們采用的MVA穿梭載體最先得自美國國立衛(wèi)生研究院的BernardMoss博士。該載體經(jīng)進一步修飾，使之符合美國食品及藥品管理局(FDA)的規(guī)范。我們先通過除去我們不希望引入人體的報道基因或抗藥性基因，來修飾原載體。然后我們評價了用于表達HIV-1蛋白的3個MVA插入位點(delII、delIII和HA)。通過蛋白質(zhì)印跡，我們發(fā)現(xiàn)，對于基因表達來說，delII和delIII優(yōu)于HA位點(圖16)。此外，我們注意到，痘苗病毒特異性啟動子按以下順序驅(qū)動外源基因表達pSYN＞pH5＞p7.5。因此，我們選用delII和delIII位點，以及痘苗病毒啟動子pSYN和pH5，用于構建我們的疫苗。采用該策略，以保證HIV-1蛋白的高水平表達。評價了MVA系統(tǒng)中的HIV-1的基因表達。盡管序列“人源化”有助于提高DNA疫苗中的蛋白表達，但是，通過蛋白質(zhì)印跡檢測，與插入到delII位點的人源化和野生型nef基因相比，MVA的HIV-1的蛋白表達沒有任何優(yōu)勢。因此，選用野生型HIV-1序列，來構建我們的疫苗。此外，MVA不能耐受全長HIV包膜蛋白，可能是因為它對痘苗病毒的毒性(Amara，R.R.等，(2001)Science29269-74；Barouch，D.H.等，(2001)JVirol755151-8；Men，R.等，(2000)Vaccine183113-22；Ourmanov，I.等，(2000)JVirol742740-51；Takahashi，H.等，(1988)ProcNatlAcadSciUSA853105-9)。因此，通常將HIV-1gp41區(qū)的羧基端截短，以產(chǎn)生活的重組HIV-1-MVA?？紤]到這些發(fā)現(xiàn)，通過在其可變(V)區(qū)引入缺失，來修飾病毒包膜序列。與野生型相比，gp120V2區(qū)(DV2)的缺失，可使重組MVA達到更高滴度，即＞108TCID50/ml。該修飾保留了gp41內(nèi)的所有免疫原性表位。DV2包膜可以作為更好的免疫原，誘導抗HIV-1的廣泛的中和抗體，因為增加了對某些關鍵抗體表位的暴露(Barnett，S.W.等，(2001)JVirol755526-40；Cherpelis，S.等，(2001)ImmunolLett7947-55；Cherpelis，S.等，(2001)JVirol751547-50；Donnelly，J.J.等，(2002)Science2971277-8；discussion1277-8；Ly，A.和L.Stamatatos.(2000)JVirol746769-76；Stamatatos，L.等，(2000)AIDSResHumRetroviruses16981-94)。注意，DV2也消除了痘苗病毒轉錄終止信號，所述信號能影響全長包膜的表達(Moss，B.等，(1996)AdvExpMedBiol.3977-13；Moss，B.(1996)ProcNatlAcadSciUSA9311341-8)。重要的是，盡管進行了修飾，但保留了DV2包膜的功能性特征。在采用攜帶CD4/CCR5(HIV-1受體/共同受體)的HOS細胞的融合測定中，用修飾的DV2env載體轉染的293T細胞能夠融合，形成合胞體(圖17)。既然理想的插入位點僅限于MVA，所以重疊PCR產(chǎn)生gag-pol和nef-tat融合基因。這樣，就完整地保留了兩個遺傳序列，因而在所得融合蛋白中保留了所有的免疫原性表位。為了與在我們的質(zhì)粒DNA疫苗中增加表達的方法相一致，通過摻入組織纖溶酶原激活物(tPA)前導序列(氨基酸MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSAR)，再加上gag-pol和nef-tat融合基因，對所述基因進行進一步修飾。正如DNA疫苗所述，還進行了其它工作，以保證體內(nèi)應用的安全性。在pol基因中，引入蛋白酶(PR)活性位點的缺失，使多肽加工受阻(LoebDD等，(1989)NatureAug3；340(6232)397-400)。蛋白酶的缺失(DTGA)包括野生型基因的氨基酸25-28。在逆轉錄酶(RT)活性位點也引入了點突變，使得逆轉錄病毒反轉錄失活(Wakefield，J.K.等，(1992)JVirol.66(11)6806-12；ChaoS.F.等，(1995)NucleicacidsRes23(5)803-10)。逆轉錄酶中的點突變(YMDD→YGDD)對應于野生型基因的184位。引入nef和tat基因，作為包含tPA前導序列的nef-tat融合基因。當在MAGI測定中進行評價時，該tPAnef-tat融合基因，在質(zhì)粒DNA疫苗候選者的情況下，顯示出不具有通常與天然tat表達相關的反式激活功能。將用表達tPAnef-tat的質(zhì)粒轉染的細胞與用僅表達天然nef的構建體轉染的細胞相比較，通過對293T細胞進行流式細胞儀分析，證明nef對I類MHC表面表達的負調(diào)節(jié)效應，被tPA前導序列的引入所抵消。為了將所有的5個基因摻入到一個重組MVA病毒中，構建了雙啟動子穿梭載體pZC1。采用這一新型載體，將env和gag-pol基因都通過同源重組插入到MVA缺失III中。Moss和Wyatt博士(NIAID，theNationalInstitutesofHealth)提供的MVA穿梭質(zhì)粒pLW7，含有SYN啟動子并能指導重組到MVA缺失III中。從獲得的數(shù)據(jù)來劃分痘苗病毒特異性啟動子的效率，pLW7質(zhì)粒通過添加處于H5啟動子控制之下的克隆位點的修飾，產(chǎn)生新型雙啟動子插入質(zhì)粒。因為pZC1含有兩個不同的啟動子，所以不存在啟動子競爭的潛在問題。采用插入雙啟動子的質(zhì)粒ZC1，來構建穿梭質(zhì)粒pZC4，所述質(zhì)粒含有處于SYN啟動子控制之下的DV2Env，以及處于H5啟動子控制之下的tPAgag-pol。所構建的這一新型插入載體pZC1并不只將一個外源基因、而是將兩個外源基因傳遞給MVA基因組的DelIII區(qū)。因此，pZC1可以將位于同一插入盒中、但分別處于各自不同的痘苗病毒啟動子控制之下的env和gag-pol，傳遞給MVA的DelIII區(qū)(圖19)。因為包膜免疫染色已經(jīng)證明是靈敏和可靠的方法，所以采用env作為替代標記，以篩選gag-pol的存在，因為gag-pol本身是難以檢測的。因此，包膜染色陽性細胞的基因組上也整合了gag-pol基因。經(jīng)過多輪濃縮后，可以用蛋白質(zhì)印跡法證實gag-pol表達，該方法比原位免疫染色法靈敏得多。正如先前描述的，插入的HIV-1env和gag-pol都分別處于各自的啟動子控制之下，稱為pZC4。env-gag-polpZC4通過同源重組插入到野生型MVA的DelIII區(qū)中。通過免疫染色并使用抗Env抗體，鑒定了該重組env-gag-polMVA，然后通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測gag-pol表達，進行進一步證實。因此，在雙啟動子構建體中表達了這兩個基因(圖20)。通過采用抗Env抗體的富集/選擇，進一步繁殖重組env-gag-polMVA株(“ADMVA”)。感染親株MVAP585的CEF細胞，用質(zhì)粒pZC4(env/gag-pol)轉染，通過同源重組，產(chǎn)生表達DV2env和tPAgag-pol的重組MVA。從轉染培養(yǎng)物中收獲的細胞的裂解物，經(jīng)超聲處理，稀釋，然后接種在CEF細胞上。對所得單層進行免疫染色，挑出單個色點。通過滅活人抗Env血清(Km94)染色，對陽性色點進行鑒定。將色點轉移到裝有含2％FCS的DMEM的試管中。進行數(shù)次凍融循環(huán)，裂解細胞并釋放結合的病毒。內(nèi)容物經(jīng)離心澄清。將上清液吸出，通過感染盛于150mlTC瓶的CEF細胞來進行病毒擴增。48小時后收獲感染細胞，通過裂解細胞，釋放結合的病毒。將病毒在36％蔗糖層中經(jīng)超速離心而純化，然后測定滴度。根據(jù)滴定結果，通過有限稀釋來稀釋病毒，然后再進行下一輪色點純化。色點純化步驟連續(xù)進行11次。所選分離株稱為ZC4PCRE11/12。通過免疫染色證實插入DV2env基因的表達，同時通過蛋白質(zhì)印跡分析證實gag-pol表達。通過上述重組MVA克隆感染的CEF細胞以及穿梭質(zhì)粒pZC22之間的同源重組，產(chǎn)生多基因重組，又稱為ADMVA；其中穿梭質(zhì)粒pZC22指導tPA修飾的nef-tat融合基因插入到MVA缺失II中，該MVA缺失II位于delIII區(qū)上游的120kbp(圖18)。從轉染培養(yǎng)物中收獲的細胞的裂解物，經(jīng)超聲處理，稀釋，然后接種在CEF細胞上。對所得單層進行免疫染色，挑出單個色點。通過雙重染色選擇技術、采用兔抗nef血清和滅活人抗env血清，對陽性色點進行鑒定。如上所述，進行9輪連續(xù)色點純化循環(huán)。在特征鑒定之前，最終分離株通過5次傳代進一步隨機擴增，得到ADMVA研究種子貯液，其滴度等于2.15×106TCID50/ml。MVA穿梭質(zhì)粒pLW22含有SYN啟動子，并指導重組到MVA缺失II中(圖21)。delII區(qū)在delIII區(qū)上游120kbp處。修飾pLW22質(zhì)粒，得到含有處于SYN啟動子控制之下的tPAnef-tat融合基因的穿梭質(zhì)粒pZC22。通過限制酶分析證實穿梭質(zhì)粒pZC4和pZC22的身份。進行PCR分析，證實所插入的轉基因的身份。所述修飾消除了報道基因的存在。理論上講，通過使用pZCI載體和pZC22載體，可將多個HIV-1基因重組到一個MVA基因組中。為了將5個HIV-1基因用于DNA疫苗，構建了第二個ADMVA變異體。通過同源重組，將HIV-1nef-tat基因插入到pZC22中，再將這個nef-tatpZC22引入到空斑純化的ADMVA的delII區(qū)。通過雙重免疫染色、采用抗Env和抗Nef抗體，鑒定所述重組ADMVA(圖22-23)。通過用抗Env抗體和抗Nef抗體的選擇，對重組ADMVA株進行空斑純化。用富集ADMVA，評價了5個HIV-1基因產(chǎn)物在感染后的細胞中的表達。通過蛋白質(zhì)印跡分析證實了所有5個基因的有效表達(圖24)。此外，所有5個基因可以從ADMVA基因組DNA擴增。序列分析已經(jīng)證實所插入的基因的身份。ADMVA的感染性可達到108-109TCID50/mL(圖25)，所述病毒可以按1∶10的比例容易地擴增。ADMVA在體外經(jīng)6次傳代后仍保持穩(wěn)定。除了雞胚成纖維細胞外，ADMVA還可感染人類細胞(圖26)。實施例5ADMVA的臨床前體內(nèi)免疫原性評價在完成ADMVA構建和體外表征后，我們試圖確定該重組病毒的體內(nèi)免疫原性。為了測定細胞介導的免疫(CMI)應答，具體地講，我們首先選用了酶聯(lián)免疫斑點測定法，該方法對于CD8+和CD4+T細胞活性的檢測來說，快速、可重現(xiàn)而且靈敏。采用組合肽庫矩陣和缺乏CD4+T細胞或CD8+T細胞的脾細胞，鑒定了存在于BALB/c小鼠上Env、Gag和Pol中的CD4和CD8表位。通過使用SYFPEITHI預測對于CD8(Env和Gag)的最小9mer表位，隨后在IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點測定中得到證實；其中SYFPEITHI是用于MHC配體和肽基序的數(shù)據(jù)庫(www.uni-tuebingen.de/uni.kxi)，購自SigmaGenosys(Woodlands，TX)。肽序列如下Env特異性CD4+T細胞表位(Env34VPVWKEAKTTLFCASDAKAY-20mer)和CD8+T細胞表位(EnvT-ITYNETYNEI-9mer)。Gag特異性CD4+T細胞表位(Gag26TSNPPIPVGDIYKRWIILGL-20mer)和CD8+T細胞表位(GagA-IAMQMLKDTI-9mer)。Pol特異性CD4+T細胞表位(Pol223TAVQMAVFIHNFKRK-15mer)和CD8+T細胞表位(Pol118VHGVYYDPSKDLIAE-15mer)。Tat特異性CD4+T細胞表位(Tat12ISYGRKKRRQRRRAP-15mer)。除了用于初步酶聯(lián)免疫斑點測定中的亞型B共有肽庫以外，用于Nef和Tat的肽庫來自自體序列。肽是重疊11次的15mer，得自IAVICoreLaboratory，ImperialCollege，London，UK。有包含完整Nef區(qū)的51肽。這些51肽分為兩個肽庫。Nef肽庫1(C.NefP1)含有肽1至肽24，而庫2(C.NefP2)含有肽25至肽51。用于Tat的肽庫(C.Tatp1)含有包含全長Tat的23肽。采用ADMVA的研究種子貯液來免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。具體地講，分別在第0周和第3周肌內(nèi)(IM)給予ADMVA疫苗。用以下疫苗接種總共3組小鼠，每組各6只106TCID50的ADMVA、106TCID50的野生型MVA和鹽水對照。第2次注射后2周，處死小鼠。然后從每組收集脾細胞，并且在用HIV-1抗原特異性肽進行體外再次刺激期間，用酶聯(lián)免疫斑點測定來檢測它們分泌干擾素-γ(IFNγ)的能力(NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram)。結果表明，疫苗誘導出對該5種免疫原(gag、pol、env、nef和tat)明顯的免疫應答，對于最強烈的表位即EnvTI，產(chǎn)生約750斑點形成細胞(SFC)/106脾細胞(圖27)。野生型MVA所引起的非特異性基礎免疫應答約為50SFC/106脾細胞。預測對鹽水對照的應答小于10。注意，對nef和tat的CMI應答并不是最佳的，因為該測定使用來自亞型B的肽。當采用亞型C特異性同源肽進行刺激，來重復所述實驗時，抗nef和tat的SFC數(shù)顯著增加(圖28)?？偟膩碇v，這些CMI應答是針對至少9個不同的表位，包括對CD8+(EnvTI、GagAI、Pol118)或CD4+(Env34、Gag26、Pol223、TatT12)T細胞具有特異性的表位。還應注意的是，盡管在ADMVA感染的細胞中，調(diào)節(jié)蛋白nef和tat是與結構蛋白env、gag和pol共表達的，但是對后者的CMI應答并未消除或受限制。為了進一步確定在BALB/c小鼠中引發(fā)的CMI應答是否具有株特異性現(xiàn)象，用ADMVA來免疫6-8周齡雌性B6×B10小鼠。同樣，在第0周和第3周肌內(nèi)給予該疫苗。用106TCID50的ADMVA接種總共6只小鼠。第2次注射后2周，處死小鼠。用同源亞型-C肽再次刺激，對脾細胞進行酶聯(lián)免疫斑點測定(圖29)。根據(jù)所得SFC計數(shù)，在該品系小鼠中也得到類似CMI應答。因此，ADMVA誘導廣泛CMI應答的能力并不限于單一小鼠品系。在小鼠中進行劑量增加實驗時，我們發(fā)現(xiàn)了明確的劑量-反應效應(圖30)。例如，針對EnvTICD8表位，對于106TCID50的劑量，觀察到定量酶聯(lián)免疫斑點測定的應答比103TCID50高約20倍。此外，對所有受試表位，劑量-反應趨勢都適用，無論特異性是針對CD4+細胞介導的應答還是CD8+細胞介導的應答。另外，對于所有受試表位，在第二免疫后，都具有明顯的MVA加強效應。對于每個劑量，所有免疫小鼠都能很好地耐受疫苗。在免疫小鼠中，ADMVA不引起任何疾病癥狀或致病效應。除了CMI應答之外，我們也測定了ADMVA在小鼠中引發(fā)體液免疫應答的能力。通過直接(對于Gag)或間接(對于gp120)ELISA來監(jiān)測抗體應答。為了定量測定抗體應答，用不同稀釋度的免疫小鼠血清進行了ELISA。來自用106TCID50ADMVA免疫小鼠的數(shù)據(jù)顯示，在第二次免疫后2周，容易測定抗gp120和Gag的抗體(圖31)。在第二次免疫后，抗gp120抗體滴度超過1∶20,000。我們測定了Th1和Th2在誘導抗gp120抗體中的作用。在小鼠中，Th1往往促成IgG2a的產(chǎn)生，而Th2往往促成IgG1的產(chǎn)生。通過測定IgG1和IgG2a的稀釋滴度，我們發(fā)現(xiàn)每個亞類的相似抗gp120抗體水平(圖32)。因此，ADMVA引發(fā)相當平衡的抗gp120的Th1和Th2應答。目前，我們正在測定這些動物中中和抗體水平。采用ADVAXenv/gag質(zhì)粒DNA+ADVAXpol/hef-tat質(zhì)粒DNA(ADVAX)和ADMVA的1∶1的混合物，在用不同方案免疫的BALB/c小鼠中，進行了初步的初次-加強實驗。如下顯示每組4只小鼠接受不同的免疫方案。在加強免疫后2周處死小鼠，用于免疫應答評價。免疫時間表如表2所示。初次-加強實驗結果概括于表3.表2.初次-加強接種時間表ADVAXDNA劑量每次注射(IM)20μg總DNAADMVA劑量每次注射(IM)106TCID50表3.4種不同免疫方案誘導的CMI應答根據(jù)兩種細胞輸入水平的雙份重復孔，斑點數(shù)都標準化每106脾細胞，并且計算每種樣品和抗原的平均數(shù)。Gag26、Env34、Pol223和Tat64含有CD4表位，而GagA-I、EnvT-1、PolVGI和Tat60含有CD8表位。用于測定抗Nef應答的肽庫基于自體亞型-C序列。盡管通過所有4種方案、針對所有5種MVA-編碼的HIV-1免疫原的表位，來誘導CD4+細胞介導應答和CD8+T細胞介導應答，但是ADVAX(DNA)初次+ADMVA加強免疫誘導最強的總體應答。在用多價重組ADMVA株免疫的BALB/c小鼠中，誘導抗所有5種HIV免疫原的同源HIV-1亞型C肽特異性CTL應答。此外，ADMVA誘導CMI應答與用于小鼠的給藥途徑無關，這與臨床運用中肌內(nèi)途徑所觀察到的強烈應答是一致的(圖33)。盡管在ADMVA單次免疫后產(chǎn)生強烈的MVA特異性T細胞應答，但是在初次應答后3周，第2次用ADMVA免疫后，小鼠證明產(chǎn)生加強的HIV特異性CMI應答。重組MVA疫苗在兩個不同品系的小鼠中引發(fā)類似的CTL應答。當檢測抗gp120抗體和抗gag抗體滴度時，也觀察到了體液免疫應答。當比較所得抗gp120抗體應答的IgG亞類時，ADMVA在BALB/c小鼠中引發(fā)平衡的Th1和Th2應答，正如類似的IgG1和IgG2aenv特異性抗體滴度所示。在中國，因為1980年前出生的人都接種了天花疫苗，所以他們可能已經(jīng)具有抗我們的重組MVA載體的免疫性。因此，我們試圖在接種病毒后，采用改良的酶聯(lián)免疫斑點測定法，測定小鼠中針對ADMVA的CMI應答的數(shù)量級。在該測定中，在用野生型MVA進行感染(MOI為1)后，采用H-2d限制性A20細胞作為抗原呈遞細胞。在用ADMVA以106TCID50和107TCID50的劑量進行初次免疫后2周，針對MVA本身的SFC數(shù)達到700～800(圖34)。盡管如此，當?shù)诙谓o予時，相同劑量的病毒能引發(fā)免疫應答約1.5倍(圖29)。因為將使用ADMVA作為加強組分用于我們的人體試驗，所以，我們的發(fā)現(xiàn)支持這一前提ADMVA將用作有效的疫苗加強劑，甚至在預先已具有一定水平的針對該病毒載體的免疫性的情況下也是如此。在采用ADVAX質(zhì)粒DNA和ADMVA候選疫苗的幾個初次-加強方案的評價中，所述DNA初次+MVA加強方案誘導抗由5個HIV-1轉基因所表達的肽(代表表位)的最強烈的CMI應答。實施例6測定免疫動物中的抗HIV-1Gag抗體在4℃下，在0.1MNaHCO3，pH9.6中，將一個板用100μlGag蛋白(0.5μg/孔)包被過夜(Inanulon-2，DynexTechnologies，Chantilly，VA或CostarEIA/RIA強結合96孔板9018，CorningInc.，Corning，NY)。該板用200μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次，然后在室溫下，用5％脫脂奶和0.5％BSA的PBS封閉1-2小時。加入用封閉緩沖液連續(xù)稀釋的動物血清或?qū)φ?，然后將該板在室溫下孵?小時。該板用含0.05％Tween-20的PBS洗滌4次。加入堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG(PharmingenBD)；在10ml封閉緩沖液中制備每1μl綴合物的1∶10,000的稀釋液，然后該板在室溫下孵育30分鐘。將該板用AmpliQ洗滌緩沖液洗滌4次。在AmpliQ說明書中包括下述步驟在室溫下，每孔加入100μl新制底物(50μl溶液A與50μl溶液B混合)，為時15分鐘。反應用AmpliQ終止液終止，然后在15分鐘內(nèi)用分光光度計在490nm對該板讀數(shù)(AmpliQ；DAKODiagnosticsLtd.)。實施例7針對HIV-1gp120的體液免疫應答用間接ELISA測定抗HIV-1gp120的抗體。在4℃，將CostarEIA/RIA強結合96孔板(CorningInc.，Corning，NY)用100μl的5μg/ml抗gp120C端的綿羊抗gp120抗體(InternationalEnzymes，Inc.，F(xiàn)allbrook，CA)的0.1MNaHCO3(pH9.6)包被過夜。然后用PBS洗滌，在室溫下，通過加入5％脫脂奶、0.5％BSA的PBS而使其封閉2小時。在室溫下，加入預滴定亞型Cgp120上清液達1小時。然后，該板用PBST洗滌4次。加入免疫小鼠的連續(xù)稀釋血清或合適的對照，并在室溫下孵育1小時。該板如上所述進行洗滌，在室溫下加入1∶10,000稀釋的堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG(PharmingenBD)達30分鐘。將該板用AmpliQ洗滌緩沖液(DAKODiagnosticsLtd.)洗滌3次，用AmpliQ底物溶液顯影，顏色反應用AmpliQ終止液終止，在15分鐘內(nèi)在490nm進行讀數(shù)。實施例8小鼠IFNγ酶聯(lián)免疫斑點測定在第1天，加入1∶50稀釋的捕獲Ab(例如小鼠IFNγ)以及包被緩沖液(例如125μl的5ml包被緩沖液)，預包被酶聯(lián)免疫斑點測定濾板。用100μl捕獲Ab/包被緩沖液包被各孔，然后覆蓋并在4℃孵育過夜。在第2天，收獲細胞，該板用PBS-Tween洗滌4次。在37℃，各孔用R10(200μl/孔)封閉2小時。根據(jù)具體接種計劃加入細胞(例如0.5-1.0×106細胞/孔)。然后加入肽并在CO2培養(yǎng)箱中在37℃孵育過夜。在第3天，各板用PBS-T洗滌5次，然后加入100μl/孔的1∶60稀釋于1％BSA中的檢測Ab。各板在4℃孵育過夜。在第4天，各板用PBS-T洗滌4次，然后加入以1∶60稀釋于1％BSA中的100μl/孔SAP。各板在室溫下孵育2小時，用PBS-T洗滌4次，隨后用雙蒸水洗滌1次。每孔含有100μl底物，然后在室溫下避光孵育約15分鐘或直到完全顯色。這些板用自來水洗滌，充分干燥，目測免疫反應斑點。已經(jīng)在本發(fā)明的詳細優(yōu)選實施方案進行了描述，可以理解，所附權利要求書定義的本發(fā)明并不限于以上描述中給出的具體細節(jié)，因為可以在不違背本發(fā)明的精神或范圍下對其進行的許多明顯改變。本文所述方法和設備的修改和改變，對于本領域技術人員來說是顯而易見的，并且將包括在所附權利要求書中。參考文獻AIDSEpidemicUpdate，December2002，JointUNAIDS/WHO。Aiken，C.，Konner，J.，Landau，N.R.，Lenburg，M.E.，Trono，D.″NefinducesCD4endocytosisrequirementforacriticaldileucinemotifinthemembrane-proximalCD4cytoplasmicdomain(Nef誘導CD4胞吞作用對膜近側CD4胞質(zhì)結構域中關鍵性二亮氨酸基序的要求)″.(1994)Cell76(5)853-64。Allen，T.M.，Vogel，T.U.，F(xiàn)uller，D.H.，Mothe，B.R.，Steffen，S.，Boyson，J.E.，Shipley，T.，F(xiàn)uller，J.，Hanke，T.，Sette，A.，Altman，J.D.，Moss，B.，McMichael，A.J.和WatkinsD.I.″InductionofAIDSvirus-specificCTLactivityinfresh，unstimulatedperipheralbloodlymphocytesfromrhesusmacaquesvaccinatedwithaDNAprime/modifiedvacciniavirusAnkaraboostregimen(對來自用DNA初次/修飾痘苗病毒Ankara加強免疫方案免疫的恒河猴的新鮮、未受刺激的外周血淋巴細胞中愛滋病病毒特異性CTL活性的誘導)″.(2000)J.Immunol.164(9)4968-78。Altenburger，W.，美國專利第5,185,146號。Altenburger，W.，Suter，C.P.和Altenburger，J.″PartialdeletionofthehumanhostrangegeneintheattenuatedvacciniavirusMVA(在減毒痘苗病毒MVA中人類宿主范圍基因的部分缺失)″.(1989)ArchVirol.105(1-2)15-27。Amara，R.R.，Villinger，F(xiàn).，Altman，J.D.，Lydy，S.L.，O′Neil，S.P.，Staprans，S.I.，Montefiori，D.C.，Xu，Y.，Hemdon，J.G.，Wyatt，L.S.，Candido，M.A.，Kozyr，N.L.，Earl，P.L.，Smith，J.M.，Ma，H.L.，Grimm，B.D.，Hulsey，M.L.，Miller，J.，McClure，H.M.，McNicholl，J.M.，Moss，B.，Robinson，H.L.″ControlofamucosalchallengeandpreventionofAIDSbyamultiproteinDNA/MVAvaccine(用多蛋白DNA/MVA疫苗對粘膜攻擊的控制和愛滋病的預防)″.(2001)Science292(5514)69-74。Barnett，S.W.，Lu，S.Srivastava，I.Cherpelis，S.Gettie，A.Blanchard，J.Wang，S.Mboudjeka，I.Leung，L.Lian，Y.Fong，A.Buckner，C.Lv，A.Hilt，S.Ulmer，J.Wild，C.T.Mascola，J.R.和Stamatatos，L.″Theabilityofanoligomerichumanimmunodeficiencyvirustype1(HIV-1)envelopeantigentoelicitneutralizingantibodiesagainstprimaryHIV-1isolatesisimprovedfollowingpartialdeletionofthesecondhypervariableregion(第2超變區(qū)部分缺失后，提高寡聚人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜抗原引發(fā)抗原代HIV-1分離株的中和抗體的能力)″.(2001)J.Virol.755526-40。Barouch，D.H.，Santra，S.，Schmitz，J.E.，Kuroda，M.J.，F(xiàn)u，T.M.，Wagner，W.，Bilska，M.，Craiu，A.，Zheng，X.X.，Krivulka，G.R.，Beaudry，K.，Lifton，M.A.，Nickerson，C.E.，Trigona，W.L.，Punt，K.，F(xiàn)reed，D.C.，Guan，L.，Dubey，S.，Casimiro，D.，Simon，A.，Davies，M.E.，Chastain，M.，Strom，T.B.，Gelman，R.S.，Montefiori，D.C.，Lewis，M.G.，Emini，E.A.，Shiver，J.W.和Letvin，N.L.″ControlofviremiaandpreventionofclinicalAIDSinrhesusmonkeysbycytokine-augmentedDNAvaccination(用增大細胞因子的DNA接種對恒河猴病毒血癥的控制和臨床愛滋病的預防)″.(2000)Science290(5491)486-92。Barouch，D.H.，Santra，S.，Kuroda，M.J.，Schmitz，J.E.，Plishka，R.，Buckler-White，A.，Gaitan，A.E.，Zin，R.，Nam，J.H.，Wyatt，L.S.，Lifton，M.A.，Nickerson，C.E.，Moss，B.，Montefiori，D.C.，Hirsch，V.M.和Letvin，N.L.″Reductionofsimian-humanimmunodeficiencyvirus89.6PviremiainrhesusmonkeysbyrecombinantmodifiedvacciniavirusAnkaravaccination(用重組修飾痘苗病毒Ankara疫苗降低恒河猴的猿猴-人免疫缺陷病毒89.6P病毒血癥)″.(2001)JVirol.75(11)5151-8。Bender，B.S.，Rowe，C.A.，Taylor，S.F.，Wyatt，L.S.，Moss，B.，Small，P.A.Jr.″Oralimmunizationwithareplication-deficientrecombinantvacciniavirusprotectsmiceagainstinfluenza(復制缺陷型重組痘苗病毒口服免疫保護小鼠免患流感)″.(1996)Jvirol.70(9)6418-24。Beyrer，C.，Razak，M.H.，Lisam，K.，Chen，J.，Lui，W.和Yu，X.F.″OverlandherointraffickingroutesandHIV-1spreadinSouthandSoutheastAsia(陸路海洛因交易路線和HIV-1在南亞和東南亞的擴散)″.(2000)AIDS14(1)75-83。Blanchard，T.J.，Alcami，A.，Andrea，P.和Smith，G.L.″ModifiedvacciniavirusAnkaraundergoeslimitedreplicationinhumancel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0ProGlnGluValValLeuValAsnValThrGluAsnPheAsnMetTrp859095LysAsnAspMetValGluGlnMetHisGluAspIleIleSerLeuTrp100105110AspGlnSerLeuLysProCysValLysLeuThrProLeuCysValSer115120125LeuLysCysThrAspLeuLysAsnAspThrAsnThrAsnSerSerSer130135140GlyArgMetIleMetGluLysGlyGluIleLysAsnCysSerPheAsn145150155160IleSerThrSerIleArgGlyLysValGlnLysGluTyrAlaPhePhe165170175TyrLysLeuAspIleIleProIleAspAsnAspThrThrSerTyrLys180185190LeuThrSerCysAsnThrSerValIleThrGlnAlaCysProLysVal195200205SerPheGluProIleProIleHisTyrCysAlaProAlaGlyPheAla210215220IleLeuLysCysAsnAsnLysThrPheAsnGlyThrGlyProCysThr225230235240AsnValSerThrValGlnCysThrHisGlyIleArgProValValSer245250255ThrGlnLeuLeuLeuAsnGlySerLeuAlaGluGluGluValValIle260265270ArgSerValAsnPheThrAspAsnAlaLysThrIleIleValGlnLeu275280285AsnThrSerValGluIleAsnCysThrArgProAsnAsnAsnThrArg290295300LysArgIleArgIleGlnArgGlyProGlyArgAlaPheValThrIle305310315320GlyLysIleGlyAsnMetArgGlnAlaHisCysAsnIleSerArgAla325330335LysTrpAsnAsnThrLeuLysGlnIleAlaSerLysLeuArgGluGln340345350PheGlyAsnAsnLysThrIleIlePheLysGlnSerSerGlyGlyAsp355360365ProGluIleValThrHisSerPheAsnCysGlyGlyGluPhePheTyr370375380CysAsnSerThrGlnLeuPheAsnSerThrTrpPheAsnSerThrTrp385390395400SerThrGluGlySerAsnAsnThrGluGlySerAspThrIleThrLeu405410415ProCysArgIleLysGlnIleIleAsnMetTrpGlnLysValGlyLys420425430AlaMetTyrAlaProProIleSerGlyGlnIleArgCysSerSerAsn435440445IleThrGlyLeuLeuLeuThrArgAspGlyGlyAsnSerAsnAsnGlu450455460SerGluIlePheArgProGlyGlyGlyAspMetArgAspAsnTrpArg465470475480SerGluLeuTyrLysTyrLysValValLysIleGluProLeuGlyVal485490495AlaProThrLysAlaLysArgArgValValGlnArgGluLysArgAla500505510ValGlyIleGlyAlaLeuPheLeuGlyPheLeuGlyAlaAlaGlySer515520525ThrMetGlyAlaAlaSerMetThrLeuThrValGlnAlaArgGlnLeu530535540LeuSerGlyIleValGlnGlnGlnAsnAsnLeuLeuArgAlaIleGlu545550555560AlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeuThrValTrpGlyIleLysGlnLeu565570575GlnAlaArgIleLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeu580585590LeuGlyIleTrpGlyCysSerGlyLysLeuIleCysThrThrAlaVal595600605ProTrpAsnAlaSerTrpSerAsnLysSerLeuGluGlnIleTrpAsn610615620HisThrThrTrpMetGluTrpAspArgGluIleAsnAsnTyrThrSer625630635640LeuIleHisSerLeuIleGluGluSerGlnAsnGlnGlnGluLysAsn645650655GluGlnGluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrp660665670PheAsnIleThrAsnTrpLeuTrpTyrIleLysLeuPheIleMetIle675680685ValGlyGlyLeuValGlyLeuArgIleValPheAlaValLeuSerIle690695700ValAsnArgValArgGlnGlyTyrSerProLeuSerPheGlnThrHis705710715720LeuProThrProArgGlyProAspArgProGluGlyIleGluGluGlu725730735GlyGlyGluArgAspArgAspArgSerIleArgLeuValAsnGlySer740745750LeuAlaLeuIleTrpAspAspLeuArgSerLeuCysLeuPheSerTyr755760765HisArgLeuArgAspLeuLeuLeuIleValThrArgIleValGluLeu770775780LeuGlyArgArgGlyTrpGluAlaLeuLysTyrTrpTrpAsnLeuLeu785790795800GlnTyrTrpSerGlnGluLeuLysAsnSerAlaValSerLeuLeuAsn805810815AlaThrAlaIleAlaValAlaGluGlyThrAspArgValIleGluVal820825830ValGlnGlyAlaCysArgAlaIleArgHisIleProArgArgIleArg835840845GlnGlyLeuGluArgIleLeuLeu850855<210>40<211>372<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒1型<220><221>CDS<222>(1)..(372)<223>SEQIDNO23的位置8343-8714上的CDS。<400>40atgggtggcaagtggtcaaaaagtagtgtgattggatggcctactgta48MetGlyGlyLysTrpSerLysSerSerValIleGlyTrpProThrVal151015agggaaagaatgagacgagctgagccagcagcagatagggtgggagca96ArgGluArgMetArgArgAlaGluProAlaAlaAspArgValGlyAla202530gcatctcgagacctggaaaaacatggagcaatcacaagtagcaataca144AlaSerArgAspLeuGluLysHisGlyAlaIleThrSerSerAsnThr354045gcagctaccaatgctgcttgtgcctggctagaagcacaagaggaggag192AlaAlaThrAsnAlaAlaCysAlaTrpLeuGluAlaGlnGluGluGlu505560gaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgact240GluValGlyPheProValThrProGlnValProLeuArgProMetThr65707580tacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagggggga288TyrLysAlaAlaValAspLeuSerHisPheLeuLysGluLysGlyGly859095ctggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctg336LeuGluGlyLeuIleHisSerGlnArgArgGlnAspIleLeuAspLeu100105110tggatctaccacacacaaggctacttccctgattag372TrpIleTyrHisThrGlnGlyTyrPheProAsp115120<210>41<211>123<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>41MetGlyGlyLysTrpSerLysSerSerValIleGlyTrpProThrVal151015ArgGluArgMetArgArgAlaGluProAlaAlaAspArgValGlyAla202530AlaSerArgAspLeuGluLysHisGlyAlaIleThrSerSerAsnThr354045AlaAlaThrAsnAlaAlaCysAlaTrpLeuGluAlaGlnGluGluGlu505560GluValGlyPheProValThrProGlnValProLeuArgProMetThr65707580TyrLysAlaAlaValAspLeuSerHisPheLeuLysGluLysGlyGly859095LeuGluGlyLeuIleHisSerGlnArgArgGlnAspIleLeuAspLeu100105110TrpIleTyrHisThrGlnGlyTyrPheProAsp115120權利要求1.一種核酸載體，所述載體包含至少一個與啟動子有效連接的HIV序列，其中所述HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。2.一種包含至少兩個HIV序列的核酸載體，其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接，并且其中所述HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。3.權利要求1或2的核酸載體，其中所述HIV序列選自env、gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx、其突變體、融合體及其部分。4.權利要求1或2的核酸載體，其中所述啟動子是異源啟動子。5.權利要求4的核酸載體，其中所述異源啟動子選自原核啟動子、真核啟動子和病毒啟動子。6.權利要求2的核酸載體，其中所述啟動子是不同的啟動子。7.權利要求1或2的核酸載體，所述載體還包含所述HIV序列的下游轉錄終止子。8.權利要求7的核酸載體，其中所述轉錄終止子是聚腺苷酸化信號。9.權利要求8的核酸載體，其中所述轉錄終止子是選自以下的聚腺苷酸化信號牛生長激素(bGH)聚腺苷酸化信號、SV40聚腺苷酸化信號和痘苗病毒聚腺苷酸化信號。10.權利要求1或2的核酸載體，其中至少一個HIV序列與異源前導序列有效連接。11.權利要求10的核酸載體，其中所述前導序列選自組織纖溶酶原激活物(tPA)前導序列、α-因子前導序列、前胰島素原前導序列、轉化酶前導序列、免疫球蛋白A前導序列、卵白蛋白前導序列和β-珠蛋白前導序列。12.權利要求10的核酸載體，其中病毒顆粒因tPA-gag導致不能裝配。13.權利要求1或2的核酸載體，其中所述HIV序列選自SEQIDNO7、SEQIDNO9、SEQIDNO11、SEQIDNO13、SEQIDNO17和SEQIDNO19。14.權利要求1或2的核酸載體，所述載體還包括復制起點。15.權利要求1或2的核酸載體，所述載體還包括選擇性標記基因。16.一種包含至少兩個HIV序列的核酸載體，其中所述HIV序列a)分別與各自的啟動子有效連接，b)編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白，c)至少一個HIV序列與異源前導序列有效連接，所述載體還任選包含下游轉錄終止子、復制起點和選擇性標記基因。17.權利要求16的核酸載體，其中所述HIV序列編碼tPA-env和tPA-gag。18.權利要求16的核酸載體，其中所述HIV序列是SEQIDNO7和SEQIDNO9。19.權利要求16的核酸載體，其中所述HIV序列編碼tPA-pol和tPA-nef-tat。20.權利要求16的核酸載體，其中所述HIV序列是SEQIDNO11和SEQIDNO13。21.前述權利要求中任一項的核酸載體，其中所述載體是病毒載體。22.權利要求21的核酸載體，其中所述病毒載體選自修飾疫苗病毒Ankara(MVA)、ALVAC、NYVAC.1和NYVAC.2。23.權利要求22的核酸載體，其中所述載體是修飾痘苗病毒Ankara(MVA)載體。24.權利要求22的核酸載體，其中所述啟動子選自痘病毒7.5K啟動子、痘病毒40K啟動子、痘病毒H5啟動子、痘病毒11K啟動子、痘病毒I3啟動子、痘病毒合成(SYN)啟動子和痘病毒合成早期/晚期啟動子。25.一種核酸載體，其中所述載體是修飾痘苗病毒Ankara(MVA)載體，所述載體包含a)至少兩個插入到MVA基因組缺失位點III的HIV序列；和b)至少一個插入到MVA基因組缺失位點II的HIV序列；其中所述HIV序列分別與各自的啟動子有效連接，并且其中所述HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。26.權利要求25的核酸載體，其中所述HIV序列選自env、gag、pol、tat、rev、nef、vif、vpr、vpu、vpx、其突變體、融合體及其部分。27.權利要求25的核酸載體，其中所述啟動子選自痘病毒7.5K啟動子、痘病毒40K啟動子、痘病毒H5啟動子、痘病毒11K啟動子、痘病毒I3啟動子、痘病毒合成(SYN)啟動子和痘病毒合成早期/晚期啟動子。28.權利要求25的核酸載體，其中所述HIV序列還包含異源前導序列。29.權利要求25的核酸載體，其中所述異源前導序列選自組織纖溶酶原激活物(tPA)前導序列、α-因子前導序列、前胰島素原前導序列、轉化酶前導序列、免疫球蛋白A前導序列、卵白蛋白前導序列和β-珠蛋白前導序列。30.權利要求25的核酸載體，其中tPA-δV2env和tPA-gag-pol插入到MVA的缺失位點III，而tPA-nef-tat插入到MVA的缺失位點II。31.權利要求25的核酸載體，其中SEQIDNO17和SEQIDNO19插入到MVA的缺失位點III，而SEQIDNO21插入到MVA的缺失位點II。32.一種組合物，所述組合物包含至少一種前述權利要求中任一項的核酸載體。33.權利要求32的組合物，其中tPA-env和tPA-gag是在第一核酸載體上，而tPA-pol和tPA-nef-tat是在第二核酸載體上。34.權利要求32的組合物，其中SEQIDNO7和SEQIDNO9是在第一核酸載體上，而SEQIDNO11和SEQIDNO13是在第二核酸載體上。35.權利要求32的組合物，其中至少一種載體是病毒載體。36.權利要求35的組合物，其中所述病毒載體選自修飾疫苗病毒Ankara(MVA)、ALVAC、NYVAC.1和NYVAC.2。37.權利要求36的組合物，其中所述病毒載體是MVA載體。38.權利要求37的組合物，其中a)tPA-env和tPA-gag是在第一核酸載體上，而tPA-pol和tPA-nef-tat是在第二核酸載體上；b)tPA-δV2env和tPA-gag-pol插入到MVA的缺失位點III，而tPA-nef-tat插入到MVA的缺失位點II。39.權利要求37的組合物，其中a)SEQIDNO7和SEQIDNO9是在第一核酸載體上，而SEQIDNO11和SEQIDNO13是在第二核酸載體上；b)SEQIDNO17和SEQIDNO19插入到MVA的缺失位點III，而SEQIDNO21插入到MVA的缺失位點II。40.一種藥用組合物，所述組合物包含權利要求1-31中任一項的核酸載體，以及藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑。41.一種藥用組合物，所述組合物包含權利要求32-39中任一項的組合物，以及藥學上可接受的載體、輔料或賦形劑。42.一種在對HIV相關疾病易感的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的方法，所述方法包括將權利要求1-31中任一項的核酸載體給予所述受試者，從而引發(fā)抗HIV的免疫應答。43.一種在對HIV相關疾病易感的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的方法，所述方法包括將權利要求32-39中任一項的組合物給予所述受試者，從而引發(fā)抗HIV的免疫應答。44.一種在對HIV相關疾病易感的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的方法，所述方法包括將權利要求40或41的組合物給予所述受試者，從而引發(fā)抗HIV的免疫應答。45.一種核酸載體，所述載體包含至少一個有效連接啟動子的慢病毒序列，其中所述慢病毒序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。46.權利要求45的核酸載體，其中所述慢病毒序列包含HIV、FIV、SIV和EIAV序列。47.一種包含至少兩個慢病毒序列的核酸載體，其中所述慢病毒序列分別與各自的啟動子有效連接，并且其中所述HIV序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。48.權利要求47的核酸載體，其中所述慢病毒序列包含HIV、FIV、SIV和EIAV序列。49.一種包含至少兩個慢病毒序列的核酸載體，其中所述慢病毒序列a)分別與各自的啟動子有效連接，b)編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白，c)至少一個慢病毒序列與異源前導序列有效連接，所述載體還任選包含下游轉錄終止子、復制起點和選擇性標記基因。50.權利要求49的核酸載體，其中所述慢病毒序列包含HIV、FIV、SIV和EIAV序列。51.一種核酸載體，其中所述載體是修飾痘苗病毒Ankara(MVA)載體，所述載體包含a)至少兩個插入到MVA基因組缺失位點III的慢病毒序列；和b)至少一個插入到MVA基因組缺失位點II的慢病毒序列；其中所述慢病毒序列分別與各自的啟動子有效連接，并且其中所述慢病毒序列編碼不能裝配成病毒顆粒的蛋白。52.權利要求51的核酸載體，其中所述慢病毒序列包含HIV、FIV、SIV和EIAV序列。全文摘要本發(fā)明涉及用于預防HIV感染的核酸和減毒痘苗病毒載體，以及在對HIV感染易感的受試者體內(nèi)引發(fā)免疫應答的方法。本發(fā)明的預防性疫苗方案包括用包含兩種新型DNA載體的接種物進行初次免疫，然后用表達相應HIV蛋白的修飾痘苗病毒Ankara(MVA)重組病毒載體進行加強免疫。文檔編號C12N15/00GK1726285SQ200380106085公開日2006年1月25日申請日期2003年10月17日優(yōu)先權日2002年10月18日發(fā)明者Y·黃,D·D·侯,Z·陳申請人:艾倫·戴蒙德愛滋病研究中心