專利名稱：淀粉酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及相對(duì)于親本酶而言具有改良的性質(zhì)(如，改良的熱和/或氧化穩(wěn)定性和/或降低的鈣離子依賴性)并由此改良了洗滌和/或餐具洗滌(和/或紡織品去漿)性能的α-淀粉酶變體。本發(fā)明也涉及編碼所說的變體的DNA構(gòu)建體以及攜帶DNA構(gòu)建體的載體和細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生淀粉酶變體的方法以及包含淀粉酶變體的去垢劑添加劑和去垢組合物。本發(fā)明還涉及淀粉酶變體在紡織品去漿上的用途。

背景技術(shù)：
α-淀粉酶在工業(yè)上使用了很多年，用途很廣，其中最重要的是淀粉液化、紡織品去漿、在造紙和紙漿工業(yè)方面淀粉改性以及用于釀酒和烘烤。另一個(gè)日益重要的α-淀粉酶的用途是在洗滌或餐具洗滌期間除去含淀粉的污垢。
近年來試圖構(gòu)建具有對(duì)特定用途(如淀粉液化和紡織品去漿)的改良的性質(zhì)的α-淀粉酶變體。
例如，美國(guó)5,093,257公開了包含嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶N-末端部分和地衣芽孢桿菌α-淀粉酶C-末端部分的嵌合α-淀粉酶。據(jù)記載，嵌合α-淀粉酶具有獨(dú)特的性質(zhì)，如與其親本α-淀粉酶相比不同的熱穩(wěn)定性。然而，所有具體描述的嵌合α-淀粉酶與其親本α-淀粉酶相比表現(xiàn)出降低的酶促活性。
EP252666描述了通式為Q-R-L的雜種淀粉酶，其中Q是55至60個(gè)氨基酸殘基的N-末端多肽殘基，它與已說明的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的57個(gè)N-末端氨基酸殘基至少75％是同源的，R是已說明的多肽，L是包含390至400個(gè)氨基酸殘基的C-末端多肽，它與已說明的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的395個(gè)C-末端氨基酸殘基至少75％是同源的。
Suzuki等(1989)公開了嵌合α-淀粉酶，其中地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的指定區(qū)域已被解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的相應(yīng)區(qū)域替代。為了鑒別對(duì)熱穩(wěn)定性起作用的區(qū)域，構(gòu)建了嵌合α-淀粉酶。發(fā)現(xiàn)這樣的區(qū)域包括解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的氨基酸殘基第177-186和氨基酸殘基255-270。在嵌合α-淀粉酶中氨基酸殘基的改變似乎不影響酶除其熱穩(wěn)定性以外的性質(zhì)。
WO91/00353公開了至少一個(gè)氨基酸殘基與其親本α-淀粉酶不同的α-淀粉酶突變體。在所說的專利申請(qǐng)中公開的α-淀粉酶突變體由于其氨基酸取代應(yīng)用于淀粉降解和/或紡織品去漿表現(xiàn)出改良的性質(zhì)。一些突變體表現(xiàn)出穩(wěn)定性提高，但是沒有報(bào)道或指出酶促活性的改進(jìn)。僅作為例子說明的突變體從親本地衣芽孢桿菌α-淀粉酶制備，它攜帶下列突變之一H133Y或H133Y+T1491。已推薦的另一個(gè)突變是A111T。
FR2,676,456公開了地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的突變體，其中在組氨酸133附近的一個(gè)氨基酸殘基和/或丙氨酸209附近的一個(gè)氨基酸殘基已被一種更疏水的氨基酸殘基取代。據(jù)記載，產(chǎn)生的α-淀粉酶突變體具有改良的熱穩(wěn)定性，在紡織品、造紙、釀酒和淀粉液化工業(yè)中是有用的。
EP285123公開了進(jìn)行核苷酸序列隨機(jī)誘變的方法。作為這樣的序列的一個(gè)例子提到了編碼嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶的核苷酸序列。當(dāng)突變時(shí)，獲得了在低pH值下具有改良的活性的α-淀粉酶變體。
在上述參考中沒有一個(gè)提到甚至暗示可以構(gòu)建對(duì)去垢劑工業(yè)來說有改良的性質(zhì)的α-淀粉酶突變體。
EP525610涉及具有對(duì)離子表面活性劑(表面活性劑)改良的穩(wěn)定性的突變體酶。突變體酶通過親本酶的表面部分的一個(gè)氨基酸殘基已被另一種氨基酸殘基取代產(chǎn)生。在EP525610中具體描述的唯一突變體酶是蛋白酶。淀粉酶作為可獲得對(duì)離子表面活性劑改良的穩(wěn)定性的酶的例子被提到，但是淀粉酶的類型、起源或具體突變都沒指明。
WO94/02597公開了在氧化劑存在下表現(xiàn)出改良的穩(wěn)定性和活性的α-淀粉酶突變體。在突變體α-淀粉酶中，一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基已被不同于半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸殘基取代。據(jù)記載，α-淀粉酶突變體可用于去垢劑和/或餐具洗滌添加劑以及紡織品去漿。
WO9418314公開了對(duì)氧化穩(wěn)定的α-淀粉酶突變體，包括在地衣芽孢桿菌α-淀粉酶M197位置的突變。
EP368341描述了與/不與用于洗滌和餐具洗滌的α-淀粉酶組合的支鏈淀粉酶和其它淀粉分解酶。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供α-淀粉酶變體，該變體相對(duì)于其親本α-淀粉酶具有改良的重要性質(zhì)，特別是有關(guān)所說的變體的洗滌和/或餐具洗滌性能，例如，增加的熱穩(wěn)定性、增加的氧化穩(wěn)定性、降低的對(duì)Ca2+離子的依賴性和/或在適當(dāng)?shù)膒H值區(qū)域中(例如，洗衣或餐具洗滌)改良的穩(wěn)定性或活性。這樣的變體α-淀粉酶有優(yōu)勢(shì)，其中，它們可以在比其親本α-淀粉酶更低的劑量下使用。而且，α-淀粉酶變體可以除去含淀粉的污垢，而此污垢不能(或有困難)用目前已知的α-淀粉酶去垢劑酶除去。
發(fā)明的簡(jiǎn)要說明 作為本發(fā)明基礎(chǔ)的工作的目的在于改良(如果可能的話)α-淀粉酶(特別是，具體來說可從芽孢桿菌菌株獲得的α-淀粉酶)的穩(wěn)定性，這些α-淀粉酶以其在堿性介質(zhì)(如在洗衣或餐具洗滌中典型使用的去垢劑溶液)中除去淀粉的性能為基礎(chǔ)相對(duì)于目前市售的α-淀粉酶選擇。在這方面，本發(fā)明的發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)事實(shí)上有可能通過親本α-淀粉酶的氨基酸序列的不同區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的合理修飾來改良這樣的親本α-淀粉酶的上述類型(見上)的性質(zhì)。本發(fā)明以此發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及親本α-淀粉酶的變體，所說的親本α-淀粉酶是一種 i)具有分別在本文的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.7中所示的氨基酸序列之一；或 ii)與在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的一種或多種氨基酸序列表現(xiàn)出至少80％的同源性；和/或顯示出與由抗具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶產(chǎn)生的抗體的免疫交叉反應(yīng)性；和/或由與編碼具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶之DNA序列相同的探針雜交的DNA序列編碼。
本發(fā)明的α-淀粉酶變體所符合的條件為該變體是氨基酸序列不與在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列相同的變體。
編碼所述的前三個(gè)α-淀粉酶氨基酸序列的DNA序列在SEQ ID No.4(編碼在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列)、SEQ ID No.5(編碼在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列)和SEQ ID No.6(編碼在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列)中顯示。
在WO95/26397中也公開了SEQ ID No.1和SEQ ID No.2親本α-淀粉酶的氨基酸序列和相應(yīng)的DNA序列(分別為SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)(和本專利申請(qǐng)的SEQ ID NOs.相同)。
本發(fā)明的變體是這樣的變體，其中(a)所說的親本α-淀粉酶的至少一個(gè)氨基酸殘基已被缺失；和/或(b)所說的親本α-淀粉酶的至少一個(gè)氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基取代；和/或(c)相對(duì)親本α-淀粉酶而言至少有一個(gè)氨基酸殘基已被插入；所說的變體具有α-淀粉酶活性并且相對(duì)于親本α-淀粉酶表現(xiàn)出至少一種下列性質(zhì) 增加的熱穩(wěn)定性，即在比使用親本酶適合的溫度更高的溫度下令人滿意地保持酶促活性； 增加的氧化穩(wěn)定性，即對(duì)氧化劑(如氧，氧化的漂白劑等等)降解的抗性提高； 降低的Ca2+依賴性，即在比親本α-淀粉酶更低濃度的Ca2+存在時(shí)令人滿意地起作用的能力。有這種降低的Ca2+依賴性的α-淀粉酶在用于去垢組合物中時(shí)是十分合乎需要的，因?yàn)檫@樣組合物典型地包含較大量的強(qiáng)烈結(jié)合鈣離子的物質(zhì)(如磷酸鹽，EDTA等等)。
其它可用按照本發(fā)明的變體達(dá)到的合乎需要的性質(zhì)改良或修飾(與所說的親本α-淀粉酶相比)的例子有 在中性或比較高的pH值(例如，pH值在7-10.5的范圍內(nèi)(如8.5-10.5的范圍))下穩(wěn)定性和/或α-淀粉分解活性提高； 在比較高的溫度下(例如，在40-70℃范圍內(nèi)的溫度)α-淀粉分解活性提高； 提高或降低等電點(diǎn)(pI)以使所說的α-淀粉酶變體與變體在其中使用的介質(zhì)(例如，洗衣介質(zhì)、餐具洗滌介質(zhì)或紡織品-去漿介質(zhì))(見下)的pH值更好地匹配； 改良的對(duì)特定類型的底物的結(jié)合，改良的對(duì)底物的特異性，和/或改良的對(duì)底物裂解(水解)的特異性。
如果通過已知算法(如Lipman和Pearson，科學(xué)，227(1985)，1435所述)進(jìn)行的某氨基酸序列與親本α-淀粉酶各自氨基酸序列的比較揭示出X％的同一性，就可認(rèn)為該氨基酸序列與親本α-淀粉酶X％同源。使用缺省的GAP懲罰值，可適當(dāng)?shù)厥褂?.3版的GCG軟件包(1993，6)的GAP計(jì)算機(jī)程序[遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(1991)，GCG軟件包程序手冊(cè)，第7版，575 Science Drive，Madison，威斯康辛州，美國(guó)53711]。
在本發(fā)明中，如上所述，和洗滌與餐具洗滌一起使用的“改良的性能”意思是分別在洗滌或餐具洗滌期間改良的含淀粉的污垢(即包含淀粉的污垢)的去除?？梢栽诔Ｒ?guī)洗滌的和餐具洗滌實(shí)驗(yàn)中確定性能，通過與所說的親本α-淀粉酶的比較來評(píng)價(jià)改良。在下面的實(shí)驗(yàn)部分中描述了可用于餐具洗滌性能指示的一個(gè)小規(guī)模的“小、型餐具洗滌測(cè)試”的例子。
可以理解，α-淀粉酶變體的許多不同特征單獨(dú)或組合起來可以促成其改良的性能，這些特征包括比活、底物特異性、Km(所謂的在Michaelis-Menten方程中的“米氏常數(shù)”)、Vmax[給定底物在Michaelis-Menten方程基礎(chǔ)上測(cè)定的最大轉(zhuǎn)化速率(平臺(tái)值(plateau))、pI、最適pH值、最適溫度、熱激活、對(duì)氧化劑或表面活性劑(例如，在除垢劑中的)的穩(wěn)定性，等等。技術(shù)人員清楚變體的性能不能在上述特征的基礎(chǔ)上單獨(dú)預(yù)測(cè)，而必須伴隨著洗滌和/或餐具洗滌性能測(cè)試。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含編碼本發(fā)明的α-淀粉酶變體的DNA序列的DNA構(gòu)建體、攜帶該DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體、用此DNA構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以及通過在有益于α-淀粉酶變體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)這樣的細(xì)胞然后從培養(yǎng)物中回收α-淀粉酶變體以產(chǎn)生α-淀粉酶變體的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及制備親本α-淀粉酶變體的方法，該變體由于如上所述的改良的性質(zhì)和親本α-淀粉酶比較表現(xiàn)出改良洗滌和/或餐具洗滌性能。這種方法包括 a)構(gòu)建包含編碼所說的親本α-淀粉酶變體的基因的細(xì)胞群， b)在模擬至少一種洗滌和/或餐具洗滌的條件下篩選該細(xì)胞群的α-淀粉酶活性， c)從包含編碼所說的親本α-淀粉酶變體基因的細(xì)胞群中分離出細(xì)胞，其中的變體在步驟b)選擇的條件下和親本α-淀粉酶相比具有改良的活性， d)在適合條件下的適當(dāng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)步驟c)中分離的細(xì)胞， e)從在步驟d)中獲得的培養(yǎng)物中回收α-淀粉酶變體。
本發(fā)明也涉及通過后一種方法制備的變體(該變體是按照本發(fā)明的變體)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“模擬至少一種洗滌和/或餐具洗滌條件”意思是指這樣的模擬，例如，在洗滌或餐具洗滌期間最普通的溫度或pH值，或在洗滌或餐具洗滌處理中所用的去垢組合物中的化學(xué)組合物。術(shù)語“化學(xué)組合物”是指包括所說的去垢組合物的一種成分，或兩種或多種的成分的組合。許多不同的去垢組合物的成分列于下面。
步驟a)所指的細(xì)胞群可通過克隆編碼親本α-淀粉酶的DNA序列并使DNA進(jìn)行本文下述的定點(diǎn)或隨機(jī)誘變適當(dāng)?shù)貥?gòu)建。
在本發(fā)明中，術(shù)語“變體”與術(shù)語“突變體”可互換使用。術(shù)語“變體”意思是包括雜種α-淀粉酶，即包含至少兩種不同α-淀粉分解酶的部分的α-淀粉酶。這樣，這樣一種雜種可以從，例如，從以上定義的變體衍生的一部分或多部分；或從以上定義的變體衍生的一部分或多部分以及從一種未改良的親本α-淀粉酶衍生的一部分或多部分構(gòu)建。在這方面，本發(fā)明也涉及一種產(chǎn)生這樣的雜種α-淀粉酶的方法，其中的α-淀粉酶于與它的成分酶任一相比(即與組成雜種的一部分的任何一種酶相比)具有改良的洗滌和/或餐具洗滌性能，該方法包括 a)使一種組分α-淀粉酶的α-淀粉酶基因或相應(yīng)cDNA的N-末端編碼區(qū)與另一種組分α-淀粉酶的α-淀粉酶基因或相應(yīng)cDNA的C-末端編碼區(qū)體內(nèi)或體外重組以形成重組體， b)選擇產(chǎn)生與其組分α-淀粉酶相比具有改良的洗滌和/或餐具洗滌性能的雜種α-淀粉酶的重組體， c)在適合條件下的適當(dāng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)步驟b)中選擇的重組體， d)從在步驟c)中獲得的培養(yǎng)物中回收雜種α-淀粉酶。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及本發(fā)明的α-淀粉酶變體[包括通過上述方法之一制備的任何變體或雜種]作為去垢劑酶(具體來說是用于洗滌或餐具洗滌)的用途，本發(fā)明也涉及包含α-淀粉酶變體的去垢劑添加劑和去垢劑組合物以及本發(fā)明的α-淀粉酶變體在紡織品去漿上的用途。
按照本發(fā)明的變體可通過隨機(jī)誘變產(chǎn)生，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種制備親本α-淀粉酶變體的方法，該方法包括 (a)隨機(jī)誘變編碼親本α-淀粉酶的DNA序列， (b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)在步驟(a)中獲得突變的DNA序列， (c)篩選表達(dá)突變的淀粉分解酶的宿主細(xì)胞，該淀粉分解酶和親本α-淀粉酶相比具有如上所述的改良性質(zhì)(例如，性質(zhì)如降低的Ca2+依賴性、增加的氧化穩(wěn)定性、增加的熱穩(wěn)定性和/或在較高的pH值下改良的活性)。
發(fā)明詳述 表示法 在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，使用了常規(guī)的核苷酸單字母碼和常規(guī)的氨基酸殘基的單字母和三字母代碼。為易于參考，本發(fā)明的α-淀粉酶變體通過使用下列表示法描述 原來的氨基酸位置取代的氨基酸 按照該表示法的例子是，天冬酰胺在位置30取代丙氨酸可表示為 Ala 30 Asn或A30N 相同位置的丙氨酸缺失表示為 Ala 30*或A30* 一種附加的氨基酸殘基(如賴氨酸)的插入可表示為 Ala 30 AlaLys或A30AK 一段連續(xù)的氨基酸殘基的缺失，以氨基酸殘基30-33為例可表示為(30-33)*。
特定α-淀粉酶包含與其它α-淀粉酶相比的“缺失”(即缺少一個(gè)氨基酸殘基)和在這一位置上產(chǎn)生插入，這可表示為 *36 Asp或*36D 表示在位置36中插入一個(gè)天冬氨酸 多重突變通過加號(hào)分開，即 Ala30Asp+Glu34Ser 或A30N+E34S 代表在位置30和34的突變(其中丙氨酸和谷氨酸分別被天冬酰胺和絲氨酸取代)。
當(dāng)一種或多種擇一的氨基酸殘基可以插入到給定的位置時(shí)，可以表示為 A30N、E或 A30N或A30E 而且，本文中當(dāng)適于修飾的位置被指明，而沒有任何特定的修飾被建議時(shí)，可理解為任何其它的氨基酸殘基都可取代那個(gè)位置上存在的氨基酸殘基(即選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V的任何氨基酸殘基-而非在所說的位置正常存在的氨基酸殘基)。這樣，例如，當(dāng)在位置202的甲硫氨酸的修飾(取代)被提到、但沒有指定時(shí)，可以理解為任何其它的氨基酸，即任何選自A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y和V中的其它氨基酸可用于取代甲硫氨酸。
親本α-淀粉酶 已經(jīng)提到，本發(fā)明的α-淀粉酶變體非常適于在具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的親本α-淀粉酶的基礎(chǔ)上制備。
具有分別在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶可從親堿的(alkaliphilic)芽孢桿菌屬菌株(分別為菌株NCIB 12512和菌株NCIB 12513)獲得，它們?cè)贓P 0 277 216 B1中詳盡描述。這兩種親本α-淀粉酶的制備、純化和測(cè)序在WO95/26397中詳細(xì)描述[參見本文的實(shí)驗(yàn)部分(見下)]。
具有SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶可從嗜熱脂肪芽孢桿菌獲得并在(特別是)細(xì)菌學(xué)雜志，166(1986)，635-643中描述。
具有SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶(它和在

圖1中的第4個(gè)序列相同)可從“芽孢桿菌屬一個(gè)種#707”中獲得并由Tsukamoto等在生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊，151(1988)，25-31頁描述。
除了上述的具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.7中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的變體之外，按照本發(fā)明的其它感興趣的變體包括具有表現(xiàn)出和后面的四種氨基酸序列至少一種之高度同源性的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的變體，如至少70％同源，優(yōu)選的(如上所述的)至少80％同源，希望至少85％同源，更優(yōu)選的至少90％同源，例如，≥95％同源。
如上所述，鑒別適當(dāng)?shù)挠H本α-淀粉酶的進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)是a)α-淀粉酶顯示出與如下抗體的免疫交叉反應(yīng)性，所述抗體針對(duì)具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示氨基酸序列之一的α-淀粉酶產(chǎn)生，和/或b)α-淀粉酶由如下DNA序列編碼，所述DNA與編碼具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7所示氨基酸序列之一的α-淀粉酶的DNA序列與相同的探針雜交。
已經(jīng)提到，對(duì)于多肽(如酶)同源程度的測(cè)定，可以使用已知算法進(jìn)行(如Lipman和Pearson所描述的(1985))氨基酸序列比較。
可以使用抗體進(jìn)行免疫交叉反應(yīng)性測(cè)定，所述抗體是抗具有SEQ IDNo.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的、或具有在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的至少一種表位所產(chǎn)生的或與之反應(yīng)的。
抗體可是單克隆或多克隆的，可通過本領(lǐng)域已知的方法(例如，象由Hudson等所描述的(1989))產(chǎn)生。在本領(lǐng)域中熟知的適當(dāng)測(cè)定技術(shù)的例子包括Western印跡法和徑向免疫擴(kuò)散測(cè)定，例如，由Hudson等所描述的(1989)。
以探針雜交[上述標(biāo)準(zhǔn)b)]為基礎(chǔ)用于鑒別適當(dāng)?shù)挠H本α-淀粉酶的寡核苷酸探針可以，例如，適當(dāng)?shù)卦谶@樣的α-淀粉酶的全部或部分氨基酸序列的基礎(chǔ)上制備(該α-淀粉酶具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.7中所示的序列之一)，或者在此α-淀粉酶相應(yīng)的核苷酸序列的全部或部分的基礎(chǔ)上制備。
用以測(cè)試雜交的適當(dāng)條件包括在5×SSC中預(yù)浸漬，在～40℃的pH 6.8的20％甲酰胺、5×Denhardt’s溶液、50mM磷酸鈉以及50μg變性的超聲處理小牛胸腺DNA的溶液中預(yù)雜交1小時(shí)，接著在～40℃下和補(bǔ)充了100μMATP的相同溶液中雜交18小時(shí)，或者使用其它由，例如，Sambrook等(1989)描述的方法。
突變對(duì)特定性質(zhì)的影響 從本發(fā)明發(fā)明人獲得的結(jié)果可以看出，相對(duì)于所說的親本α-淀粉酶，變體表現(xiàn)出的特定性質(zhì)(例如，熱穩(wěn)定性或氧化穩(wěn)定性)的變化在相當(dāng)大的程度上與變體中突變(氨基酸的取代、缺失與插入)的類型和位置有關(guān)。然而，可以理解，特定的突變或突變方式導(dǎo)致給定性質(zhì)的變化的觀察結(jié)果決不排除所說的突變也能影響其它性質(zhì)的可能性。
氧化穩(wěn)定性對(duì)于提高相對(duì)于其親本α-淀粉酶的α-淀粉酶變體的氧化穩(wěn)定性，看來特別需要親本的至少一個(gè)(優(yōu)選的是多個(gè))可氧化的氨基酸殘基被缺失或被一種比原來的可氧化的氨基酸殘基對(duì)氧化敏感性低的不同的氨基酸殘基取代。
具體來說，在這一點(diǎn)上有關(guān)的可氧化的氨基酸殘基是半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸。這樣，例如，在包含半胱氨酸的親本α-淀粉酶的情況下，可預(yù)期半胱氨酸殘基的缺失或被可氧化性低的氨基酸殘基的取代在獲得相對(duì)于親本α-淀粉酶具有改良的氧化穩(wěn)定性的變體中是重要的。
在上述具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的情況下(所有這些親本α-淀粉酶不包含半胱氨酸殘基但具有較多的甲硫氨酸含量)，甲硫氨酸殘基的缺失或取代對(duì)于達(dá)到產(chǎn)生的變體的改良的氧化穩(wěn)定性是尤其有關(guān)的。這樣，在SEQ ID No.1、SEQID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的M9、M10、M105、M202、M208、M261、M309、M382、M430和M440位置和/或在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的M323位置的一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基的缺失或取代[例如，被蘇氨酸(T)或已被以上所列其它氨基酸之一取代](或符合上述親本α-淀粉酶的其它標(biāo)準(zhǔn)之一的另一種α-淀粉酶序列的相當(dāng)?shù)?equivalent)位置的甲硫氨酸殘基的缺失或取代)對(duì)于提高氧化穩(wěn)定性看來是尤其有效的。
在具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的情況下，對(duì)于以改良氧化穩(wěn)定性為目的而缺失或取代的有關(guān)氨基酸殘基包括單一的半胱氨酸殘基(C363)以及-通過和在SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中所示的序列類比-定位在位置M8、M9、M96、M200、M206、M284、M307、M311、M316和M438的甲硫氨酸殘基。
在這方面，術(shù)語“相當(dāng)?shù)奈恢谩敝傅氖沁@樣的位置，在以所說的親本α-淀粉酶氨基酸序列和所說的“參比”α-淀粉酶的氨基酸序列(如在SEQ ID No.1中所示的序列)的序列對(duì)比為基礎(chǔ)使二者共同的氨基酸殘基/區(qū)域?qū)蠒r(shí)，該位置最接近地對(duì)應(yīng)于所說參比序列中的特定位置(例如，被相同的氨基酸殘基占據(jù))。
與具有分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的氧化穩(wěn)定性的改良(提高)有關(guān)的特定的目的突變是一種或多種下列的甲硫氨酸取代(或其在符合本發(fā)明的親本α-淀粉酶要求的其它α-淀粉酶的氨基酸序列中的相當(dāng)?shù)娜〈?M202A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。
在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中的其它有關(guān)甲硫氨酸取代是M323A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。
與具有在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的氧化穩(wěn)定性的改良(提高)有關(guān)的特定的目的突變是一種或多種下列的甲硫氨酸取代M200A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V；M311A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V；以及M316A、R、N、D、Q、E、G、H、I、L、K、F、P、S、T、W、Y、V。
熱穩(wěn)定性就相對(duì)于其親本α-淀粉酶提高α-淀粉酶變體的熱穩(wěn)定性而言，缺失在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中的至少一個(gè)，優(yōu)選的是兩個(gè)或甚至三個(gè)下列氨基酸殘基(或其相當(dāng)物)顯得特別合乎需要F180、R181、G182、T183、G184和K185。相應(yīng)地，分別在SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中的相應(yīng)的特別相關(guān)的(和相當(dāng)?shù)?氨基酸殘基是F180、R181、G182、D183、G184和K185(SEQ ID No.2)；F178、R179、G180、I181、G182和K183(SEQ ID No.3)；以及F180、R181、G182、H183、G184和K185(SEQ ID No.7)。
這種類型的特別感興趣的成對(duì)(pairwise)缺失如下 R181*+G182*；以及T183*+G184*(SEQID No.1)； R181*+G182*；以及D183*+G184*(SEQ ID No.2)； R179*+G180*；以及I181*+G182*(SEQ ID No.3)；和 R181*+G182*；以及H183*+G184″(SEQ ID No.7)。
(或在另一種符合本發(fā)明的親本α-淀粉酶的要求的α-淀粉酶中這些成對(duì)缺失的相當(dāng)?shù)娜笔?。
其它顯得重要的與熱穩(wěn)定性有關(guān)的突變是在SEQ ID No.1中所示的序列中的P260至I275的氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)取代(或其在本發(fā)明的另一個(gè)親本α-淀粉酶中的相當(dāng)?shù)娜〈?，如在位置269賴氨酸殘基的取代。
與相對(duì)于所說的親本α-淀粉酶的α-淀粉酶變體的熱穩(wěn)定性有關(guān)的顯得重要的具體突變的例子是在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)下列取代(或其在本發(fā)明的另一個(gè)親本α-淀粉酶中的相當(dāng)?shù)娜〈?K269R；P260E；R124P；M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L217I；V206I、L、F。
對(duì)于具有SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶，重要的進(jìn)一步(相當(dāng)?shù)?突變是相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)下列取代M1O5F、I、L、V；M208F、W、Y；L217I；V206I、L、F；K269R。
對(duì)于具有SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶，重要的進(jìn)一步(相當(dāng)?shù)?突變是相應(yīng)的一個(gè)或兩個(gè)下列取代M206F、W、Y；L215I。
對(duì)于具有SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶，重要的進(jìn)一步(相當(dāng)?shù)?突變是相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)下列取代M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L217I；K269R。
顯得重要的(特別是與所說的親本α-淀粉酶相比達(dá)到改良的熱穩(wěn)定性的α-淀粉酶變體)突變的其它例子是在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ IDNo.7中所示的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)下列取代(或其在本發(fā)明的另一個(gè)親本α-淀粉酶中的相當(dāng)?shù)娜〈?A354C+V479C；L351C+M430C；N457D，E+K385R；L355D，E+M430R，K；L355D，E+I411R，K；N457D，E。
Ca2+依賴性就達(dá)到α-淀粉酶變體相對(duì)于其親本α-淀粉酶降低的Ca2+依賴性[即就獲得一種變體而言，該變體在外部介質(zhì)中的鈣離子濃度比親本酶所必需的更低時(shí)表現(xiàn)出令人滿意的淀粉分解活性，因此，該變體，例如，比親本對(duì)消減鈣離子的條件(如在包含鈣絡(luò)合劑(如某些增強(qiáng)去垢劑去污能力的物質(zhì))的介質(zhì)中獲得的條件)的敏感性低]而言，在SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中摻入一個(gè)或多個(gè)下列取代(或在本發(fā)明的另一個(gè)親本α-淀粉酶中的相當(dāng)?shù)娜〈?顯得尤其合乎需要Y243F、K108R、K179R、K239R、K242R、K269R、D163N、D188N、D192N、D199N、D205N、D207N、D209N、E190Q、E194Q和N106D。
在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的情況下，特別合乎需要的取代相應(yīng)地(相當(dāng)?shù)?表現(xiàn)為下列的一個(gè)或多個(gè)K107R、K177R、K237R、K240R、D162N、D186N、D190N、D197N、D203N、D205N、D207N、E188Q和E192Q。
另外，上述的用N殘基取代D殘基以及用Q殘基取代E殘基，其它在降低的Ca2+依賴性中的有關(guān)的取代是所說的D和/或E殘基用任何其它的氨基酸殘基取代。
在達(dá)到降低的Ca2+依賴性中顯得重要的其它取代是存在于下列位置的氨基酸殘基的成對(duì)取代在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列的位置113和151以及位置351和430；以及在SEQ IDNo.3中所示的氨基酸序列的位置112和150以及位置349和428(或在本發(fā)明中另一個(gè)親本α-淀粉酶中的相當(dāng)?shù)某蓪?duì)取代)，即下列氨基酸殘基的成對(duì)取代 G113+N151(涉及SEQ ID No.1)；A113+T151(涉及SEQ ID No.2和SEQ IDNo.7)；G112+T150(涉及SEQ ID No.3)；L351+M430(涉及SEQ ID No.1，SEQID No.2和SEQ ID No.7)；L349+I428(涉及SEQ ID No.3)。
關(guān)于達(dá)到降低的Ca2+依賴性，這類特別感興趣的成對(duì)取代如下 G113T+N151I(涉及SEQ ID No.1)；A113T+T151I(涉及SEQ ID No.2和SEQ ID No.7)；G112T+T150I(涉及SEQ ID No.3)；以及 L351C+M430C(涉及SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.7)；L349C+I428C(涉及SEQ ID No.3)。
就Ca2+依賴性的適當(dāng)取代而言，一些其它取代(這些取代在穩(wěn)定酶構(gòu)象中是重要的，而且可以考慮通過，例如，提高鈣離子在α-淀粉分解酶之內(nèi)的鈣結(jié)合位點(diǎn)之上或之內(nèi)結(jié)合或保持的能力，達(dá)到這種結(jié)果)是在SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)下列取代(或在本發(fā)明中另一個(gè)親本α-淀粉酶中的相當(dāng)?shù)娜〈?G304W、F、Y、R、I、L、V、Q、N、G305A、S、N、D、Q、E、R、K；H408Q、E。
在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列中的相應(yīng)的(相當(dāng)?shù)?取代是G302W、F、Y、R、I、L、V、Q、N；G303A、S、N、D、Q、E、R、K。
在達(dá)到降低的Ca2+依賴性中顯得重要的其它突變是選自下列位置的氨基酸的成對(duì)缺失(即兩個(gè)氨基酸的缺失)在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中的R181、G182、T183和G184(或在本發(fā)明中符合親本α-淀粉酶要求的另一種α-淀粉酶的氨基酸序列中的相當(dāng)位置)。這樣的成對(duì)缺失如下 R181*+G182*；T183*+G184*；R181*+T183*；G182*+T183*； G182*+G184*；R181*+G184*(SEQ ID No.1)； R181*+G182*；D183*+G184*；R181*+D183*；G182*+D183*； G182*+G184*；R181*+G184*(SEQ ID No.2)； R179*+G180*；I181*+G182*；R179*+I181*；G180*+I181*； G180*+G182*；R179*+G182*(SEQ ID No.3)； R181*+G182*；H183*+G184*；R181*+H183*；G182*+H183*； G182*+G184*；R181*+G184*(SEQ ID No.7)； (或這些成對(duì)缺失在另一種符合本發(fā)明的親本α-淀粉酶要求的另一種α-淀粉酶中相當(dāng)?shù)娜笔?。
等電點(diǎn)(pI)初步結(jié)果表明α-淀粉酶的洗滌性能，例如，洗衣洗滌性能在洗滌液(洗滌介質(zhì))的pH值接近所說的α-淀粉酶的pI值時(shí)是最優(yōu)的。這樣，適當(dāng)時(shí)產(chǎn)生具有和介質(zhì)(如洗滌介質(zhì))(在其中使用所說的酶)的pH值更好匹配(與所說的親本α-淀粉酶的等電點(diǎn)相比)的等電點(diǎn)(pI值)的α-淀粉酶變體時(shí)是合乎需要的。
關(guān)于降低等電點(diǎn)，在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中的優(yōu)選的突變包括下列取代中的一個(gè)或多個(gè)Q86E、R124P、S154D、T183D、V222E、P260E、R310A、Q346E、Q391E、N437E、K444Q和R452H。這些降低等電點(diǎn)的取代的適當(dāng)組合包括Q391E+K444Q；Q391E+K444Q+S154D。
相應(yīng)地，有關(guān)降低等電點(diǎn)的在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列的優(yōu)選的突變包括下列取代中的一個(gè)或多個(gè)L85E、S153D、I181D、K220E、P258E、R308A、P344E、Q358E和S435E。
就提高等電點(diǎn)而言，在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中的優(yōu)選的突變包括下列取代中的一個(gè)或多個(gè)E86Q、L；D154S；D183T、I；E222V、K；E260P；A310R；E346Q、P；E437N、S；和H452R。
在下面的實(shí)驗(yàn)部分中描述了按照本發(fā)明的許多變體的構(gòu)建。
本發(fā)明的α-淀粉酶變體，除了具有一種或多種上述的改良的性質(zhì)之外，優(yōu)選地是這樣的變體，該變體在低的底物濃度下具有比親本α-淀粉酶更高的淀粉水解速度?；蛘撸景l(fā)明的α-淀粉酶變體優(yōu)選地是這樣的變體，該變體在相同條件下測(cè)試時(shí)比親本α-淀粉酶具有更高的Vmax和/或更低的Km。在雜種α-淀粉酶的情況下，用于進(jìn)行比較的“親本α-淀粉酶”應(yīng)該是具有最好性能的組份酶之一。
Vmax和Km(Michaelis-Menten方程的參數(shù))可通過眾所周知的方法測(cè)定。
制備α-淀粉酶變體的方法 在本領(lǐng)域中已知幾種用于把突變導(dǎo)入基因的方法。在簡(jiǎn)要地討論編碼α-淀粉酶的DNA序列的克隆之后，將討論在編碼α-淀粉酶的序列之內(nèi)的特定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的方法。
克隆編碼α-淀粉酶的DNA序列 使用本領(lǐng)域各種熟知的方法可從產(chǎn)生所說的α-淀粉酶的任何細(xì)胞或微生物中分離編碼親本α-淀粉酶的DNA序列。第一，使用得自產(chǎn)生所研究的α-淀粉酶的有機(jī)體的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，就可以合成并使用同源、標(biāo)記的寡核苷酸探針以從所說的從有機(jī)體制備的基因組文庫(kù)中鑒別編碼α-淀粉酶的克隆?；蛘撸鸵阎?淀粉酶基因同源的序列的標(biāo)記寡核苷酸探針可用作在較不嚴(yán)格的雜交和洗滌條件下鑒別編碼α-淀粉酶的克隆的探針。
另一個(gè)用于鑒別編碼α-淀粉酶的克隆的方法包括把基因組DNA片段插入到表達(dá)載體(如質(zhì)粒)中以產(chǎn)生的基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化α-淀粉酶陰性細(xì)菌，然后把轉(zhuǎn)化的細(xì)菌平板接種到包含α-淀粉酶底物的瓊脂上，由此使得可以鑒別表達(dá)α-淀粉酶的克隆。
或者，編碼酶的DNA序列可以通過已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如，由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的phosphoamidite方法或Matthes等(1984)描述的方法。在phosphoamidite方法中，寡核苷酸，例如，在一臺(tái)自動(dòng)化DNA合成儀上合成、純化、退火、連接和克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中。
最后，DNA序列可以是混合的基因組和合成的起源，混合的合成和cDNA起源或混合的基因組和cDNA起源，可按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接合成的、基因組的或cDNA起源的片段(適當(dāng)時(shí)，對(duì)應(yīng)于整個(gè)DNA序列不同部分的片段)來制備。DNA序列也可以使用特異性的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備，例如在美國(guó)4,683,202中或R.K.Saiki等(1988)描述的方法。
定點(diǎn)誘變 一旦分離到編碼α-淀粉酶的DNA序列以及鑒別到所需的突變位點(diǎn)后，就可以使用合成的寡核苷酸導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸包含在所需的突變位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸序列；在寡核苷酸合成期間插入突變體核苷酸。在特異性的方法中，在攜帶α-淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生橋連接編碼α-淀粉酶的序列的DNA單鏈缺口。然后，使攜帶所需突變的合成核苷酸與單鏈DNA的同源部分退火。以DNA聚合酶I(Klenow片段)填充剩余的缺口，然后使用T4連接酶連接構(gòu)建體。Morinaga等(1984)描述了這種方法的具體例子。美國(guó)4,760,025公開了通過進(jìn)行微小盒式改變而導(dǎo)入編碼多種突變的寡核苷酸。然而，通過Morinaga的方法在任何一次都可以導(dǎo)入甚至更多種類的突變，因?yàn)榭梢詫?dǎo)入很多各種長(zhǎng)度的寡核苷酸。
Nelson和Long(1989)描述了另一種把突變導(dǎo)入編碼α-淀粉酶的DNA序列的方法。它包括包含所需的突變(通過使用化學(xué)合成的DNA鏈作為PCR反應(yīng)中的引物之一導(dǎo)入)的PCR片段的3步生成?？梢酝ㄟ^用限制性核酸內(nèi)切酶裂解從PCR生成的片段中分離攜帶突變的DNA片段，然后再插入到表達(dá)質(zhì)粒中。
隨機(jī)誘變 隨機(jī)誘變適合在翻譯成所說的氨基酸序列的基因中的至少三個(gè)部分或在整個(gè)基因之內(nèi)以定位或區(qū)域特異性隨機(jī)誘變進(jìn)行。
對(duì)于以提高熱穩(wěn)定性為目的的區(qū)域特異性隨機(jī)誘變，具體來說，下列的密碼子位置可適當(dāng)?shù)刈鳛槟繕?biāo)(使用單字母氨基酸縮寫和氨基酸殘基在所說的序列中的編號(hào)) 在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中 120-140＝VEVNRSNRNQETSGEYAIEAW 178-187＝Y(jié)KFRGTGKAW 264-277＝VAEFWKNDLGAIEN 在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中 120-140＝VEVNPNNRNQEISGDYTIEAW 178-187＝Y(jié)KFRGDGKAW 264-277＝VAEFWKNDLGALEN 在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列中 119-139＝VEVNPSDRNQEISGTYQIQAW 176-185＝Y(jié)KFRGIGKAW 262-275＝VGEYWSYDINKLHN 在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中 120-140＝VEVNPNNRNQEVTGEYTIEAW 178-187＝Y(jié)KFRGHGKAW 264-277＝VAEFWKNDLGAIEN 以達(dá)到降低的Ca2+依賴性為目的時(shí)，具體來說，下列密碼子位置可適當(dāng)?shù)刈鳛槟繕?biāo) 在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中 178-209＝Y(jié)KFRGTGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADVDMD 237-246＝AVKHIKYSFT 在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列中 178-209＝Y(jié)KFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMD 237-246＝AVKHIKYSFT 在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列中 178-209＝Y(jié)KFRGHGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADIDMD 237-246＝AVKHIKYSFT 以達(dá)到α-淀粉酶變體增加的底物結(jié)合(即增加的碳水化物類-如直鏈淀粉或支鏈淀粉這些α-淀粉分解酶的底物的結(jié)合)、改良的(例如，更高的)底物特異性和/或改良的(例如，更高的)對(duì)底物裂解(水解)的特異性為目的時(shí)，在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的下列密碼子位置(或在本發(fā)明中另一個(gè)親本α-淀粉酶的相當(dāng)?shù)拿艽a子位置)顯得尤其適合作為目標(biāo) 在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列中 15-20＝WYLPND 52-58＝SQNDVGY 72-78＝KGTVRTK 104-111＝VMNHKGGA 165-174＝TDWDQSRQLQ 194-204＝ENGNYDYLMYA 234-240＝RIDAVKH 332-340＝HDSQPGEAL 按照本發(fā)明的上述方法的步驟a)進(jìn)行的編碼親本α-淀粉酶的DNA序列的隨機(jī)誘變可以使用本領(lǐng)域任何已知的方法方便地進(jìn)行。例如，可以通過使用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑、使用適當(dāng)?shù)墓押塑账峄蚴笵NA序列經(jīng)受PCR產(chǎn)生的誘變進(jìn)行隨機(jī)誘變。而且，可以通過使用這些誘變劑的任何組合進(jìn)行隨機(jī)誘變。
誘變劑可以是一種，例如，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換、顛換、倒位、亂序(scrambling)、缺失和/或插入的誘變劑。
適于此目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸以及核苷酸類似物。
當(dāng)使用這樣的試劑時(shí)，誘變典型地通過在選擇的誘變劑存在時(shí)，于適合誘變產(chǎn)生的條件下，溫育需誘變的編碼親本酶的DNA序列并選擇具有所需性質(zhì)的突變DNA進(jìn)行。
當(dāng)誘變通過使用寡核苷酸進(jìn)行時(shí)，在寡核苷酸合成期間，在要改變的位置，寡核苷酸可以以三個(gè)非親本的核苷酸摻入或摻加。進(jìn)行摻入或摻加以避免不合需要的氨基酸的密碼子。摻入或摻加的寡核苷酸可以通過任何已發(fā)表的技術(shù)使用，例如，PCR、LCR或任何DNA聚合酶和連接酶摻入到編碼淀粉分解酶的DNA中。
使用PCR產(chǎn)生的誘變時(shí)，在增加核苷酸的錯(cuò)誤摻入的條件下使化學(xué)處理的或非處理的編碼親本α-淀粉酶的基因經(jīng)受PCR(Deshler，1992；Leung等，技術(shù)，第1卷，1989，11-15)。
大腸桿菌(Fowler等，分子基因遺傳學(xué)，133，1974，179-191)、釀酒酵母或任何其它微生物的增變菌株(可通過，例如，把包含親本酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)增變菌株，培養(yǎng)含質(zhì)粒的增變菌株并從增變菌株中分離突變的質(zhì)粒)用于編碼淀粉分解酶的DNA的隨機(jī)誘變。其后，突變的質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)有機(jī)體。
要誘變的DNA序列可以方便地存在于從表達(dá)親本淀粉分解酶的有機(jī)體中制備的基因組或cDNA文庫(kù)中。或者，DNA序列可以存在于合適的載體如質(zhì)?；蚴删w中，這些載體可以和誘變劑溫育或以其它方式暴露于誘變劑。需誘變的DNA也可以通過整合進(jìn)所說的細(xì)胞的基因組或存在于細(xì)胞所含載體中而存在于宿主細(xì)胞中。最后，需誘變的DNA可以以隔離形式存在?？梢岳斫?，要經(jīng)受隨機(jī)誘變的DNA序列優(yōu)選地是cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況下，在進(jìn)行表達(dá)步驟(b)或篩選步驟(c)之前可以方便地?cái)U(kuò)增突變的DNA序列。這種擴(kuò)增可以按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行，目前優(yōu)選的方法是使用在親本酶的DNA或氨基酸序列的基礎(chǔ)上制備的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR產(chǎn)生的擴(kuò)增。
在和誘變劑溫育或暴露于誘變劑之后，突變的DNA通過使得可以產(chǎn)生表達(dá)的條件下培養(yǎng)攜帶DNA序列的適當(dāng)宿主細(xì)胞表達(dá)。用于這個(gè)目的的宿主細(xì)胞可以是用在或不在載體中的突變的DNA序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或在誘變處理期間攜帶編碼親本酶的DNA序列的細(xì)胞。適合的宿主細(xì)胞的例子如下革蘭氏陽性細(xì)菌如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；以及革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌。
突變的DNA序列還包括編碼允許突變DNA序列表達(dá)的功能的DNA序列。
定位隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變有利地是定位在所說的親本α-淀粉酶的一部分。這在，例如，當(dāng)鑒別出酶的某些區(qū)域?qū)τ诿傅慕o定性質(zhì)特別重要以及當(dāng)期望改良可產(chǎn)生具有改良性質(zhì)的變體時(shí)可能是有利的。當(dāng)對(duì)親本酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)闡明并與酶的功能有關(guān)時(shí)，通?？梢澡b別這樣的區(qū)域。
通過使用上述的PCR產(chǎn)生的誘變技術(shù)或任何其它在本領(lǐng)域中已知的合適技術(shù)可以方便地進(jìn)行定位隨機(jī)誘變。
或者，可以通過，例如，插入到合適的載體中以分離編碼要改良的DNA序列部分的DNA序列，其后，所說的部分通過使用上述的任何誘變方法經(jīng)受誘變。
關(guān)于在本發(fā)明的上述的方法中的篩選步驟，可以使用通過基于下列原理的濾膜測(cè)定方便地進(jìn)行 能表達(dá)突變的目的淀粉分解酶的微生物在適于酶分泌的條件下在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基具有包括第一層結(jié)合蛋白質(zhì)的濾膜和其上表現(xiàn)出低的蛋白質(zhì)結(jié)合能力的第二層濾膜的雙層濾膜。微生物位于第二層濾膜上。爾后進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，把包含微生物分泌的酶的第一層濾膜從包含微生物的第二層濾膜上分離下來。第一層濾膜進(jìn)行所需的酶促活性篩選，同時(shí)鑒別存在于第二層濾膜上的相應(yīng)微生物菌落。
用于結(jié)合酶促活性的濾膜可以是任何結(jié)合蛋白質(zhì)的濾膜，例如，尼龍或硝化纖維膜。攜帶表達(dá)有機(jī)體的菌落的上層濾膜可以是對(duì)結(jié)合蛋白質(zhì)沒有親和力或親和力低的任何濾膜，例如，乙酸纖維素或DuraporeTM。濾膜可用用于篩選的任何條件預(yù)處理或在酶促活性檢測(cè)期間處理。
酶促活性可以通過染料、熒光、沉淀、pH指示劑、IR-吸收率或任何其它已知的用于檢測(cè)酶促活性的技術(shù)來檢測(cè)。
檢測(cè)化合物可以通過任何固定劑固定，例如，瓊脂糖、瓊脂、明膠、聚丙烯酰胺、淀粉、濾紙、布；或固定劑的任何組合。
α-淀粉酶活性可通過在瓊脂糖上固定的Cibacron Red標(biāo)記的支鏈淀粉檢測(cè)。為了篩選具有增加的熱和高pH值穩(wěn)定性的變體，結(jié)合有α-淀粉酶變體的濾膜在pH為10.5以及60℃或65℃下的緩沖液中溫育指定的時(shí)間，在去離子水中簡(jiǎn)短漂洗并置于支鏈淀粉-瓊脂糖基質(zhì)上進(jìn)行活性檢測(cè)。剩余的活性通過支鏈淀粉降解導(dǎo)致的Cibacron Red裂解可以看出來。選擇這樣的條件是因?yàn)榫哂性赟EQ ID No.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性幾乎不能檢測(cè)出來。由于Cibacron Red的釋放增加，穩(wěn)定變體在相同的條件下表現(xiàn)出較高的顏色強(qiáng)度。
為了篩選在更低的溫度下和/或更寬的溫度范圍內(nèi)活性最優(yōu)的變體，把結(jié)合有變體的濾膜直接放置在支鏈淀粉-Cibacron Red的底物平板上并在所需的溫度下(例如，4℃，10℃或30℃)溫育指定的時(shí)間。在這個(gè)時(shí)間之后由于具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性幾乎不能檢測(cè)出來，而在更低的溫度下有最優(yōu)活性的變體顯示出提高了支鏈淀粉的裂解。為了篩選所說的變體對(duì)所述添加劑改變的依賴性或反應(yīng)性，在支鏈淀粉基質(zhì)上溫育之前可以在所有種類所需的培養(yǎng)基-例如，包含Ca2+、除垢劑、EDTA或其它有關(guān)添加劑的溶液-中溫育。
制備雜種α-淀粉酶的方法 作為位點(diǎn)特異性誘變的替代性方法，可以通過結(jié)合所說的各個(gè)的基因的有關(guān)部分制備是至少兩種成分α-淀粉酶的雜種的α-淀粉酶變體。
天然產(chǎn)生的酶可通過上述的隨機(jī)或定點(diǎn)誘變遺傳改良?；蛘?，一種酶的一部分可以已被另一種的一部分取代以獲得嵌合酶。這種取代可以通過常規(guī)的體外基因剪接技術(shù)或體內(nèi)重組或這兩種技術(shù)的組合達(dá)到。使用常規(guī)的體外基因剪接技術(shù)時(shí)，α-淀粉酶基因的編碼序列的所需部分使用適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)特異性限制酶缺失；然后編碼序列缺失的部分可以通過不同α-淀粉酶的編碼序列的所需部分的插入取代，這樣就產(chǎn)生了編碼新的α-淀粉酶的嵌合核苷酸序列。或者，可以通過，例如，使用由Higuchi等(1988)描述的PCR重疊延伸方法融合α-淀粉酶基因。
體內(nèi)重組技術(shù)取決于下列事實(shí)具有高度同源區(qū)(DNA序列相同)的不同DNA片斷可以重組，即切斷和交換DNA，然后在同源區(qū)建立新鍵。因此，當(dāng)兩種不同但同源的淀粉酶的編碼序列用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，在體內(nèi)同源序列的重組就導(dǎo)致嵌合基因序列的產(chǎn)生。這些編碼序列通過宿主細(xì)胞的翻譯將導(dǎo)致嵌合淀粉酶基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。特異性體內(nèi)重組技術(shù)在美國(guó)5,093,257和EP252666中描述。
或者，可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法合成雜種酶。例如，參見Hunkapiller等(1984)。因此，具有適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄械碾目扇炕虿糠趾铣刹⑦B接以形成本發(fā)明的雜種酶(變體)。
α-淀粉酶變體的表達(dá) 按照本發(fā)明，通過上述方法或本領(lǐng)域已知的任何替代方法產(chǎn)生的編碼突變的α-淀粉酶的DNA序列可以使用表達(dá)載體以酶的形式表達(dá)，該表達(dá)載體典型地包括編碼啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)的控制序列以及可有可無的阻遏物基因或各種激活基因。
攜帶編碼本發(fā)明的α-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是任何可方便地經(jīng)受重組DNA過程的載體，載體的選擇常取決于它要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。這樣，載體可以是自主復(fù)制載體(即作為染色體外實(shí)體存在的載體，它的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制)，例如，質(zhì)粒、噬菌體或染色體外成分、微型染色體或人工染色體?；蛘?，載體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組并與它所整合的染色體一道復(fù)制的載體。
在載體中，DNA序列應(yīng)可操作地連接到合適的啟動(dòng)子序列上。啟動(dòng)子可以是任何在選擇的宿主細(xì)胞中所示出轉(zhuǎn)錄活性并可衍生自編碼對(duì)宿主細(xì)胞來說是同源的或異源的蛋白質(zhì)的基因的DNA序列。指導(dǎo)編碼本發(fā)明的α-淀粉酶變體的DNA序列的轉(zhuǎn)錄的適合的啟動(dòng)子的例子(尤其是在細(xì)菌宿主中)是大腸桿菌乳糖操縱子的啟動(dòng)子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因的dagA啟動(dòng)子、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因的啟動(dòng)子(amyM)、解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的啟動(dòng)子(amyQ)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動(dòng)子等。對(duì)于真菌宿主中的轉(zhuǎn)錄，有用的啟動(dòng)子的例子是那些衍生自編碼下列酶的基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。
本發(fā)明的表達(dá)載體也可以包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中還包含可操作地連接到編碼本發(fā)明的α-淀粉酶變體的DNA序列上的聚腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可以適當(dāng)?shù)貜呐c啟動(dòng)子相同的來源衍生。
載體還可以包括使載體能夠在所說的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這樣的序列的例子是質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和plJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可以包含選擇標(biāo)記，例如，其產(chǎn)物補(bǔ)充了宿主細(xì)胞中的缺陷的基因，如來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因或賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。進(jìn)而，載體可包括曲霉屬的選擇標(biāo)記如amdS、argB、niaD和引起潮霉素抗性的標(biāo)記sC，選擇也可以通過，例如，在WO91/17243中描述的共轉(zhuǎn)化完成。
盡管在某些方面胞內(nèi)表達(dá)有優(yōu)勢(shì)，例如，當(dāng)使用某些細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時(shí)，通常優(yōu)選的表達(dá)是胞外表達(dá)。
適于構(gòu)建本發(fā)明的編碼α-淀粉酶變體并分別包含啟動(dòng)子、終止子以及其它成分的載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的[參見，例如，Sambrook等(1989)]。
包含上述本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明的細(xì)胞在本發(fā)明α-淀粉酶變體的重組產(chǎn)生中用作宿主細(xì)胞是有優(yōu)勢(shì)的。細(xì)胞可以方便地通過把DNA構(gòu)建體(一個(gè)或多個(gè)拷貝)整合進(jìn)宿主染色體中以用本發(fā)明的編碼變體的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。由于DNA序列在細(xì)胞中更可能穩(wěn)定保持，這種整合通常已被認(rèn)為是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。DNA構(gòu)建體整合進(jìn)宿主染色體可按照常規(guī)方法(例如，通過同源或異源重組)進(jìn)行?；蛘?，細(xì)胞可以用上述與不同類型的宿主細(xì)胞聯(lián)系的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等有機(jī)體的細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物或昆蟲的細(xì)胞，但是優(yōu)選的是微生物細(xì)胞，例如，細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
合適的細(xì)菌的例子如下革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；以及革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過，例如，原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化或以本來已知的方式使用感受態(tài)細(xì)胞完成。
酵母有機(jī)體有利的選自酵母屬或裂殖酵母屬的物種，例如，釀酒酵母。絲狀真菌可有利地屬于曲霉屬的物種，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法包括按本來已知的方式形成和轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體以及然后的細(xì)胞壁再生。用于曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的適當(dāng)方法在EP238023中描述。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明的α-淀粉酶變體的方法，該方法包括如上所述的在有利于變體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞以及從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于培養(yǎng)所說的宿主細(xì)胞并獲得本發(fā)明的α-淀粉酶變體表達(dá)的常規(guī)培養(yǎng)基。合適培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)者得到，或按照已發(fā)表的處方制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心的目錄中所描述的)。
分泌自宿主細(xì)胞的α-淀粉酶變體可通過眾所周知的方法方便地從培養(yǎng)基中回收，該方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，通過鹽(如硫酸銨)的方式沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分然后再使用層析(如離子交換層析、親和層析等等)。
工業(yè)應(yīng)用 由于在堿性pH值下本發(fā)明的α-淀粉酶變體的活性，它們特別適合在各種工業(yè)加工中使用。具體來說，在洗滌、餐具洗滌和硬表面清潔去垢組合物(見下)中它們都有潛在的應(yīng)用，但是在從淀粉中產(chǎn)生增甜劑和乙醇也是有用的。常規(guī)淀粉轉(zhuǎn)化加工和液化和/或糖化加工的條件在，例如，美國(guó)3,912,590、EP252,730和EP63,909中描述。
本發(fā)明的α-淀粉酶變體的應(yīng)用的某些領(lǐng)域概述如下。
有關(guān)紙的應(yīng)用本發(fā)明的α-淀粉酶變體具有從淀粉加固(starch-reinforced)的廢紙和廢紙板產(chǎn)生木質(zhì)纖維素材料(如紙漿、紙和紙板)的有價(jià)值的性質(zhì)，尤其是重新紙漿化發(fā)生在pH值高于7的地方以及淀粉酶通過加固淀粉的降解有利于廢材料分解的地方。本發(fā)明的α-淀粉酶變體特別適于從淀粉包衣的或包含淀粉的廢印刷紙?jiān)旒埖拿撃?再利用加工。為了產(chǎn)生高亮度的新紙，除去印刷墨通常是合乎需要的；本發(fā)明的變體如何以這種方法使用的例子在PCT/DK94/00437中描述。
本發(fā)明的α-淀粉酶變體在改良淀粉中也是十分有用的，酶促改良的淀粉用于和堿性填料(如碳酸鈣、高嶺土和粘土)一起造紙。對(duì)于本發(fā)明的堿性α-淀粉酶變體，在填料存在下改良淀粉是切實(shí)可行的，這樣就使得可以進(jìn)行更簡(jiǎn)單、更完整的加工。
紡織品去漿(desizing)本發(fā)明的α-淀粉酶變體也特別適于紡織品去漿。在紡織品加工工業(yè)中，在去漿加工中傳統(tǒng)地使用α-淀粉酶作為助劑來促進(jìn)除去包含淀粉的漿糊(size)，這種漿糊在紡織期間作為對(duì)織物紗的保護(hù)性包衣。
在紡織后完全除去漿糊對(duì)于確保在隨后加工中的最優(yōu)效果是重要的，其中對(duì)所說的織物進(jìn)行洗滌、漂白和染色。酶促淀粉降解是優(yōu)選的，因?yàn)樗粨p害紡織品或織物的纖維。
為了減少加工成本并增加制造廠的生產(chǎn)量，去漿處理有時(shí)與洗滌和漂白步驟結(jié)合使用。在這種情況下，非酶助劑(如堿或氧化劑)典型地用于分解淀粉，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的α-淀粉酶不是十分與高pH水平和漂白劑相容。淀粉漿糊的非酶促分解由于所使用的相當(dāng)攻擊性的(aggressive)化學(xué)藥品確實(shí)導(dǎo)致了一些纖維的破壞。
本發(fā)明的在較高的pH水平并有氧化(漂白)劑存在下顯示出增加的淀粉降解性能的α-淀粉酶變體特別適合用于上述的去漿加工，尤其是適于代替當(dāng)前使用的非酶去漿劑。α-淀粉酶變體可單獨(dú)使用或在去漿包含纖維素的織物或紡織品時(shí)與纖維素酶結(jié)合使用。
啤酒生產(chǎn)本發(fā)明的α-淀粉酶變體在啤酒釀造過程中也已被認(rèn)為是非常有用的；在這個(gè)過程中，典型地是在搗碎處理時(shí)添加變體。
在用于洗滌或餐具洗滌的去垢劑添加劑和去垢組合物中的應(yīng)用由于改良的洗滌和/或餐具洗滌性能常是上述性質(zhì)改良的結(jié)果，本發(fā)明的許多α-淀粉酶變體(包括雜種)尤其適于摻入去垢組合物，例如，有意在pH值7-13的范圍中，具體來說是pH值8-11的范圍內(nèi)使用的去垢組合物。按照本發(fā)明，α-淀粉酶變體可作為去垢組合物的組分添加。這樣，它可以以去垢劑添加劑的形式包括在去垢組合物中。
這樣，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含按照本發(fā)明的α-淀粉酶變體的去垢劑添加劑。酶可以通過添加包含一種或多種酶的分開的添加劑或添加包含所有這些酶的組合添加劑包括在去垢組合物中。本發(fā)明的去垢劑添加劑(即一種分離的添加劑或組合的添加劑)可以制成例如，粒狀、液體、漿體等。去垢劑添加劑的優(yōu)選的酶制劑是粒劑(具體來說是非粉狀粒劑)、液體(具體來說是穩(wěn)定的液體)、漿體或受保護(hù)酶(見下)。
去垢組合物以及去垢劑添加劑還可以包含一種或多種通常在除垢劑中使用的其它酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉分解酶、氧化酶(包括過氧物酶)或纖維素酶。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)α-淀粉酶與另一種淀粉分解酶(如支鏈淀粉酶、異淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉葡糖甙酶以及CTG酶)結(jié)合時(shí)可以在洗滌和/或餐具洗滌性能中獲得實(shí)質(zhì)上的改進(jìn)。適于給定目的的市售淀粉分解酶的例子是AMGTM、NovamylTM和PromozymeTM，它們都可從Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Demark得到。因此，本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的α-淀粉酶變體與至少一種其它的淀粉分解酶(例如，在上述的那些酶中選擇)結(jié)合的去垢劑添加劑。
非粉狀粒劑可以如，例如在美國(guó)4,106,991和美國(guó)4,661,452中公開的方法產(chǎn)生，可有可無地通過本領(lǐng)域已知的方法包衣；有關(guān)包衣的細(xì)節(jié)如下所述。當(dāng)不同的去垢劑酶的組合使用時(shí)，酶可以在成為粒狀之前或之后混合。
液態(tài)酶制劑可按照已知的技術(shù)通過，例如，添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸使其穩(wěn)定。其它酶穩(wěn)定劑在本領(lǐng)域中是已知的。受保護(hù)酶可按照EP 238 216中公開的方法制備。
如上所述，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及去垢組合物(例如，用于洗衣洗滌、餐具洗滌或硬表面清潔)，該組合物包含本發(fā)明的α-淀粉酶變體(包括雜種)以及表面活性劑。
本發(fā)明的去垢組合物可以是任何方便的形式，例如，粉劑，粒劑或液體。液態(tài)的去垢劑可以是含水的(典型地包含多達(dá)90％的水和0-20％的有機(jī)溶劑)或是不含水的(如在EP120,659中所描述的)。
去垢組合物 當(dāng)本發(fā)明的α-淀粉酶變體用作去垢組合物(例如，洗衣洗滌去垢組合物或餐具洗滌去垢組合物)的組分時(shí)，它可以，例如，以非粉狀粒劑、穩(wěn)定液體或受保護(hù)酶的形式包括在去垢組合物中。如上所述，非粉狀粒劑可如，例如，美國(guó)4,106,991和4,661,452(兩者都屬于Novo Industri A/S)公開的方法產(chǎn)生，并可有可無地用本領(lǐng)域已知的方法包衣。蠟質(zhì)包衣材料的例子是聚(環(huán)氧乙烷)的產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)，平均分子量為1000至20000；具有16至50個(gè)環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化的脂肪醇(其中醇包含12至20個(gè)碳原子)，其中具有15至80個(gè)環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；脂肪酸甘油單、雙、三酯。適于通過液化床技術(shù)應(yīng)用的膜形成包衣材料在GB1483591中給出。
以液態(tài)酶制劑形式添加的酶可以如上所述，按照已知的技術(shù)通過，例如，添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸穩(wěn)定。其它酶穩(wěn)定劑在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
包含在本發(fā)明的去垢組合物中的受保護(hù)酶可以如上所述按照在EP238,216中公開的方法制備。
本發(fā)明的去垢組合物可以是任何方便的形式，例如，粉劑、粒劑、糊劑或液體。液態(tài)的去垢劑可以是含水的(典型地包含多達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑)或是不含水的。
去垢組合物包含一種或多種表面活性劑，每種可以是陰離子的、非離子的、陽離子的或兩性的(兼性離子的)。去垢劑通常包含0-50％的陰離子表面活性劑如線性烷基苯磺酸鹽(LAS)、α-烯烴磺酸鹽(AOS)、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)(AS)、醇乙氧基硫酸鹽(AEOS或AES)、仲烷烴磺酸鹽(SAS)、α-磺基脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。它也可以包含0-40％的非離子表面活性劑如醇乙氧基化物(AEO或AE)、醇丙氧基化物、羧基化醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚糖甙、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺或聚羥基烷基脂肪酸酰胺(例如，在WO92/06154中所描述的)。
去垢組合物還包含一種或多種其它酶，如支鏈淀粉酶、酯酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶、過氧化物酶或氧化酶，例如，漆酶。
通常去垢劑包含1-65％增強(qiáng)去垢劑去垢作用的物質(zhì)(雖然某些餐具洗滌去垢劑可包含多達(dá)90％的增強(qiáng)去垢劑去垢作用的物質(zhì))或絡(luò)合物劑如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、檸檬酸鹽、次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或分層硅酸鹽(例如，得自Hoechst的SKS-6)。
增強(qiáng)去垢劑去垢作用的物質(zhì)可細(xì)分為含磷或不含磷類型。含磷的無機(jī)堿性增強(qiáng)去垢劑去垢作用的物質(zhì)例子包括水溶性鹽，尤其是堿金屬焦磷酸鹽、正磷酸鹽、多磷酸鹽和膦酸鹽。不含磷的無機(jī)的增強(qiáng)去垢劑去垢作用的物質(zhì)的例子包括水溶性堿金屬碳酸鹽、硼酸鹽和硅酸鹽，以及分層二硅酸鹽和各種類型的水不溶性結(jié)晶或無定形的鋁硅酸鹽，其中沸石是最熟知的代表。
合適的有機(jī)的增強(qiáng)去垢劑去垢作用的物質(zhì)的例子包括琥珀酸、丙二酸、脂肪酸丙二酸、脂肪酸磺酸、羧基甲氧基琥珀酸、聚醋酸、羧酸、聚羧酸、氨基聚羧酸和聚乙酰基羧酸的堿金屬、銨或取代的銨鹽。
去垢劑也可以不增強(qiáng)去垢作用，即基本上不含增強(qiáng)去垢劑去垢作用的物質(zhì)。
去垢劑可以包括一種或多種聚合物。例子是羧甲基纖維素(CMC；典型地以鈉鹽形式)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、聚馬來酸酯、馬來酸/丙烯酸的共聚物以及異丁烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
去垢組合物也可以包含氯/溴型或氧型的漂白劑。漂白劑可以是包衣的或膠囊化的。無機(jī)氯/溴型的漂白劑的例子是鋰、鈉或鈣的次氯酸鹽或次溴酸鹽以及氯化磷酸三鈉。漂白系統(tǒng)也可以包含H2O2源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，它們可以與過酸形式的漂白激活劑如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰羥苯磺酸鹽(NOBS)組合。
有機(jī)氯/溴型漂白劑的例子是雜環(huán)N-溴化和N-氯化亞胺如三氯異氰尿酸、三溴異氰尿酸、二溴異氰尿酸、二氯異氰尿酸及其與水增溶性陽離子如鉀和鈉的鹽。乙內(nèi)酰脲化合物也是合適的。漂白系統(tǒng)也可以包含，例如，酰胺、亞胺或砜型過氧酸(peroxyacids)。
在餐具洗滌去垢劑中，氧漂白劑是優(yōu)選的，例如無機(jī)過酸鹽形式，優(yōu)選地是帶有漂白劑前體或作為過氧酸化合物。適合的過氧漂白劑化合物的典型例子是堿金屬過硼酸鹽、四氫鹽和單氫鹽、堿金屬過碳酸鹽、過硅酸鹽和過磷酸鹽。優(yōu)選的激活劑材料是TAED或NOBS。
本發(fā)明的去垢組合物的酶可以使用常規(guī)的穩(wěn)定劑穩(wěn)定，例如，多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如，例如，芳族硼酸鹽，以及組合物可以如在WO92/19709和WO92/19708中所述的方法配制。本發(fā)明的酶也可通過添加可逆的酶抑制劑穩(wěn)定，例如，蛋白質(zhì)型(如在EP0544777B1中所描述的)或硼酸型酶抑制劑。
去垢劑也可以包含其它的常規(guī)去垢劑成分如，例如，織物調(diào)節(jié)物(fabricconditioners)包括粘土、抗絮凝劑物質(zhì)、泡沫激發(fā)劑/泡沫壓制劑(在餐具洗滌去垢劑泡沫壓制劑中)、起泡肥皂水的泡沫壓制劑、抗腐蝕劑、污物懸浮劑、抗污物再沉積劑、染料、脫水劑、殺菌劑、光學(xué)增白劑、或香料。
pH值(在水溶液中以使用時(shí)的濃度測(cè)量)通常是中性或堿性，例如，在7-11之間。
本發(fā)明的范圍之內(nèi)的洗衣去垢組合物的特定的形式包括 1)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒劑的去垢組合物，其包含 2)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒劑的去垢組合物，其包含 3)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒劑的去垢組合物，其包含 4)制配制成具有至少600g/l的堆密度的粒劑的去垢組合物，其包含 5)含水的液態(tài)去垢組合物，其包含 6)含水的有結(jié)構(gòu)的(structured)液態(tài)去垢組合物，其包含 7)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒劑的去垢組合物，其包含 8)配制成粒劑的去垢組合物，其包含 9)配制成粒劑的去垢組合物，其包含 10)含水的液態(tài)去垢組合物，其包含 11)含水的液態(tài)去垢組合物，其包含 12)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒劑的去垢組合物，其包含 13)如1)-12)中所描述的去垢劑制劑，其中線性烷基苯基磺酸鹽的所有或部分以(C12-C18)烷基硫酸鹽替代。
14)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒劑的去垢組合物，其包含 15)配制成具有至少600g/l的堆密度的粒劑的去垢組合物，其包含 16)如1)-15)所述的去垢劑制劑，該制劑包含作為添加的組分或作為已指定的漂白系統(tǒng)的替代物的穩(wěn)定的或膠囊化的過酸。
17)如1)、3)、7)、9)和12)所述的去垢組合物，其中過硼酸鹽由過碳酸鹽替代。
18)如1)、3)、7)、9)、12)、14)和15)所述的去垢組合物，該組合物還包含錳催化劑。錳催化劑可以是，例如，在“低溫漂白的有效錳催化劑”，自然，369，1994，637-639中描述的化合物之一。
19)配制成不含水的去垢劑液體的去垢組合物，該組合物包含液態(tài)非離子表面活性劑如，例如，線性的烷氧基化的伯醇、增強(qiáng)去垢劑去垢作用的系統(tǒng)(例如，磷酸鹽)、酶和堿。去垢劑也可以包括陰離子表面活性劑和/或漂白系統(tǒng)。
在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的餐具洗滌組合物的具體形式包括 1)粉劑機(jī)用(automatic)餐具洗滌組合物 2)粉劑機(jī)用餐具洗滌組合物 3)粉劑機(jī)用餐具洗滌組合物 4)粉劑機(jī)用餐具洗滌組合物 5)粉劑機(jī)用餐具洗滌組合物 6)具有清潔表面活性劑系統(tǒng)的粉劑和液態(tài)餐具洗滌組合物 7)不含水的液態(tài)機(jī)用餐具洗滌組合物 8)不含水的液態(tài)餐具洗滌組合物 9)搖溶的(thixotropic)液態(tài)機(jī)用餐具洗滌組合物 10)液態(tài)機(jī)用餐具洗滌組合物 11)包含受保護(hù)的漂白顆粒的液體機(jī)用餐具洗滌組合物 11)如1)、2)、3)、4)、6)和10)描述的機(jī)用餐具洗滌組合物，其中過硼酸鹽由過碳酸鹽替代。
12)如1)-6)所述的機(jī)用餐具洗滌組合物，該組合物還包含錳催化劑。錳催化劑可以是，例如，在“低溫漂白的有效錳催化劑”，自然，369，1994，637-639中描述的化合物之一。
本發(fā)明的α-淀粉酶變體可以以通常用于去垢劑的濃度摻入。現(xiàn)在設(shè)想在本發(fā)明的去垢組合物中，α-淀粉酶變體可以以相當(dāng)于每升洗滌/餐具洗滌液體0.00001-1mg(以純酶蛋白質(zhì)計(jì)算)的量添加。
另外，本發(fā)明還可進(jìn)一步通過參考附圖描述，其中 圖1是本發(fā)明的四種親本α-淀粉酶的氨基酸序列的序列對(duì)比。最左邊的數(shù)字分別指代的氨基酸序列如下 1在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列； 2在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列； 3在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列； 4在SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列。
在圖最右邊的數(shù)字給出了所說的每種序列的連續(xù)的氨基酸總數(shù)。應(yīng)該注意的是編號(hào)為3的序列(對(duì)應(yīng)于在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列)，在序列對(duì)比中，其在分別編號(hào)為1(SEQ ID No.1)、2(SEQ ID No.)、4(SEQ ID No.7)的序列中的相應(yīng)的第1氨基酸和第175氨基酸的位置上產(chǎn)生“間隙”。
圖2是質(zhì)粒pTVB106的限制性圖。
圖3是質(zhì)粒pPM103的限制性圖。
圖4是質(zhì)粒pTVB112的限制性圖。
圖5是質(zhì)粒pTVB114的限制性圖。
實(shí)驗(yàn)部分 具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列(分別得自芽孢桿菌菌株NCIB 12512和NCIB 12513)的親本α-淀粉酶的制備、純化和測(cè)序在WO 95/26397中描述。這兩種親本α-淀粉酶的pI值和分子量(在WO95/26397中給出)如下 SEQ ID No.1pI大約為8.8-9.0(在LKB AmpholineTM PAG平板上通過等電聚焦測(cè)定)；分子量大約為55kD(通過SDS-PAGE測(cè)定)。
SEQ ID No.2pI大約為5.8(在LKB AmpholineTM PAG平板上通過等電聚焦測(cè)定)；分子量大約為55kD(通過SDS-PAGE測(cè)定)。
本發(fā)明的α-淀粉酶變體的純化 按照本發(fā)明的變體的構(gòu)建和表達(dá)在下面的實(shí)施例2中描述。本發(fā)明的變體的純化在本文中參考分別在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的變體說明 SEQ ID No.1變體(pI大約為9.0)的純化過濾包含表達(dá)的α-淀粉酶變體的發(fā)酵液，加入硫酸銨至其濃度達(dá)到飽和度的15％。然后把液體加進(jìn)疏水柱(Toyopearl butyl/TOSOH)中。用pH 7.0的20mM二甲基戊二酸緩沖液洗滌柱。α-淀粉酶結(jié)合得非常牢固，然后用在pH 7.0的20mM二甲基戊二酸緩沖液中的25％w/w 2-丙醇洗脫。在洗脫之后，2-丙醇通過蒸發(fā)除去，濃縮物施用到用pH6.0的20mM二甲基戊二酸緩沖液平衡的陽離子交換柱(S-SepharoseTM FF，Pharmacia，瑞典)中。
在相同的緩沖液中使用0-250mM NaCl的線性梯度洗脫淀粉酶。在對(duì)pH8.0的10mM硼酸鹽/KCl緩沖液透析之后，把樣品的pH值調(diào)整到9.6，然后施用到用pH 9.6的10mM硼酸鹽/KCl緩沖液平衡的陰離子交換柱(Q-SepharoseTM FF，Pharmacia)中。用0-250mM NaCl的線性梯度洗脫淀粉酶。把pH調(diào)整到7.5。α-淀粉酶通過rSDS-PAGE判斷是純的。為了穩(wěn)定淀粉酶，所有緩沖液均包含2mM CaCl2。
SEQ ID No.2變體(pI大約為5.8)的純化過濾包含表達(dá)的α-淀粉酶變體的發(fā)酵液，加入硫酸銨至其濃度達(dá)到飽和度的15％。然后把液體加進(jìn)疏水柱(Toyopearl butyl/TOSOH)中。用在pH 8.0的10mM Tris緩沖液中的15％-0％w/w的硫酸銨的線性梯度洗脫結(jié)合的淀粉酶。在洗脫物對(duì)pH 8.0的10mM硼酸鹽/KCl緩沖液透析之后，把液體的pH值調(diào)整到9.6，然后施用到用相同緩沖液平衡的陰離子交換柱(Q-SepharoseTM FF，Pharmacia)中。用150mMNaCl分步洗脫淀粉酶。
在洗脫之后，為了除去NaCl，淀粉酶樣品對(duì)pH 8.0的相同緩沖液透析。透析之后，把pH調(diào)整到9.6，淀粉酶再次結(jié)合到陰離子交換柱上。用0-250mMNaCl的線性梯度洗脫淀粉酶。把pH調(diào)整到7.5。淀粉酶通過rSDS-PAGE判斷是純的。為了穩(wěn)定淀粉酶，所有緩沖液均包含2mM CaCl2。
α-淀粉酶活性測(cè)定 α-淀粉酶活性通過使用Phadebas_片劑作為底物的方法測(cè)定。Phadebas片劑(Phadebas_淀粉酶測(cè)試，由Pharmacia Diagnostic供應(yīng))包含交聯(lián)的不溶性藍(lán)色淀粉聚合物，這種聚合物與牛血清清蛋白和緩沖物質(zhì)混合并制成片劑。
對(duì)于每一次測(cè)量的測(cè)定，把一片藥劑懸浮在包含5ml 50mMBritton-Robinson緩沖液(50mM醋酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mMCaCl2，pH用NaOH調(diào)整到目的值)的試管中。測(cè)試在目的溫度的水浴中進(jìn)行。測(cè)試的α-淀粉酶在×ml的50mM Britton-Robinson緩沖液中稀釋。1ml的這種α-淀粉酶溶液加到5ml 50mM的Britton-Robinson緩沖液中。淀粉通過α-淀粉酶水解給出可溶性的藍(lán)色片段。產(chǎn)生的藍(lán)色溶液的吸光度在620nm處用分光光度法測(cè)量，它是α-淀粉酶活性的函數(shù)。
重要的是在15分鐘的溫育(測(cè)試時(shí)間)之后測(cè)得的620nm處的吸光度在620nm處在0.2至2.0個(gè)吸光度單位之間。在這個(gè)吸光度范圍內(nèi)在活性和吸光度之間有線性關(guān)系(朗伯-比爾定律)。因此對(duì)酶的稀釋必須加以調(diào)整以適合這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。
在指定的條件下(溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間、緩沖液條件)，1mg給定的α-淀粉酶水解一定量的底物，產(chǎn)生藍(lán)色。顏色強(qiáng)度在620nm處測(cè)量。測(cè)量吸光度直接和在給定條件下所說的α-淀粉酶的比活成比例(活性/mg純?chǔ)?淀粉酶蛋白質(zhì))。這樣，在相同條件下測(cè)試了不同的目的α-淀粉酶(包括參比α-淀粉酶，在這種情況中是所說的親本α-淀粉酶)之后，在給定溫度和給定的pH下每種α-淀粉酶的比活就可以直接比較，可以測(cè)定每種目的α-淀粉酶的比活相對(duì)于參比α-淀粉酶的比活的比率。
小型餐具洗滌測(cè)定 使用了下列的小型餐具洗滌測(cè)定煮沸含淀粉材料的懸浮液，然后冷卻到20℃。冷卻的淀粉懸浮液施加到各個(gè)鑒定的小玻璃平板(大約2×2cm)上，然后在干燥櫥中以約140℃的溫度干燥。然后對(duì)單個(gè)平板稱重。為了測(cè)定，制備了具有55℃溫度的標(biāo)準(zhǔn)歐洲型機(jī)用餐具洗滌去垢劑溶液(5g/l)。使去垢劑溶解1分鐘，其后向去垢劑溶液(包含在裝備有磁性攪拌的燒杯中)中加入所說的α-淀粉酶以使酶濃度達(dá)到0.5mg/l。同時(shí)，把置于小支持架的稱重的玻璃平板以基本上垂直位置浸沒在α-淀粉酶/去垢劑溶液中，然后在55℃下攪拌15分鐘。然后把玻璃平板從α-淀粉酶/去垢劑溶液中取出，以蒸餾水漂洗，于60℃下在干燥櫥中干燥并再次稱重。然后所說的α-淀粉酶的性能[以相對(duì)于選擇的參比α-淀粉酶(指數(shù)為100)-在下面(實(shí)施例1)的實(shí)施例中是具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶-的指數(shù)表達(dá)]從處理前后的玻璃平板的重量差別中測(cè)定，結(jié)果如下
下列的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。它們無意于以任何方式限制本發(fā)明所要求的范圍。
實(shí)施例1 具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的變體的小型餐具洗滌測(cè)試 上述的小型餐具洗滌測(cè)試在pH 10.5下用具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶及其下列變體進(jìn)行(它們的構(gòu)建與純化描述如下)T183*+G184*；Y243F；K269R。測(cè)試結(jié)果如下 親本(SEQ ID No.1) 指數(shù)100 T183*+G184*指數(shù)120 Y243F 指數(shù)120 K269R 指數(shù)131 很明顯，測(cè)試的變體T183*+G184*(它比親本α-淀粉酶表現(xiàn)出特別高的熱穩(wěn)定性)、Y243F(它比親本α-淀粉酶表現(xiàn)出更低的Ca2+離子依賴性)和K269R(它比親本α-淀粉酶表現(xiàn)出更低的Ca2+離子依賴性以及在高pH下更高的穩(wěn)定性)的每一種相對(duì)于親本α-淀粉酶表現(xiàn)出明顯改良的餐具洗滌性能。
實(shí)施例2 具有分別在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的變體的構(gòu)建 引物下述的變體構(gòu)建中使用的DNA引物包括下列引物[所有的DNA引物以從5’到3’的方向(從左到右)給出；P指代5’-磷酸鹽] #7113 GCT GCG GTG ACC TCT TTA AAA AAT AAC GGC Y296 CC ACC GCT ATT AGA TGC ATT GTA C #6779 CTT ACG TAT GCA GAC GTC GAT ATG GAT CAC CC #6778 G ATC CAT ATC GAC GTC TGC ATA CGT AAG ATA GTC #3811 TT A(C/G)G GGC AAG GCC TGG GAC TGG #7449 C CCA GGC CTT GCC C(C/G)T AAA TTT ATA TAT TTT GTT TTG #3810 G GTT TCG GTT CGA AGG ATT CAC TTC TAC CGC #7450 GCG GTA GAA GTG AAT CCT TCG AAC CGA AAC CAG B1 GGT ACT ATC GTA ACA ATG GCC GAT TGC TGA CGC TGT TAT TTG C #6616 P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C #8573 CTA CTT CCC AAT CCC AAG CTT TAC CTC GGA ATT TG #8569 CAA ATT CCG AGG TAA AGC TTG GGA TTG GGA AGT AG #8570 TTG AAC AAC CGT TCC ATT AAG AAG A具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶變體的構(gòu)建 質(zhì)粒pTVB106的描述具有在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶及其變體從在圖2中所示的質(zhì)粒攜帶的基因SF16表達(dá)。質(zhì)粒pTVB106包含從質(zhì)粒pUB110獲得的復(fù)制起點(diǎn)(Gryczan等，1978)以及賦予氯霉素抗性的cat基因。淀粉酶分泌得到TermamylTM信號(hào)序列的幫助，該信號(hào)序列準(zhǔn)確地融合到(即成熟蛋白質(zhì)的第一密碼子)編碼具有分別在SEQID No.4和SEQ ID No.1中所示的核苷酸和氨基酸序列(成熟蛋白質(zhì))的親本α-淀粉酶基因中。Termamyl啟動(dòng)子啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。
質(zhì)粒pTVB 106類似于pDN1528(參見丹麥公開專利申請(qǐng)1155/94)。在圖2的質(zhì)粒圖譜上指出了一些單一限制位點(diǎn)，包括BstBI、BamHI、BstEII、EcoNI、DrdI、AflIII、DraIII、XmaI、SalI和BglII。
變體M202T的構(gòu)建使用了PCR重疊延伸誘變(overlap extensionmutagenesis)構(gòu)建這個(gè)變體(Higuchi等，1988)。使用引物#7113和誘變引物#6778在PCR反應(yīng)A中擴(kuò)增pTVB 106的大約350bp的DNA片段。在一個(gè)類似的PCR反應(yīng)B中，使用引物Y296和#6779擴(kuò)增大約300bp的DNA片段。使用這些引物和在反應(yīng)A和B中純化的DNA片段，在PCR反應(yīng)C中擴(kuò)增了跨從引物#7113到引物Y296的突變位點(diǎn)(M202)的全DNA片段。
以限制性核酸內(nèi)切酶BstEII和AflIII消化PCR C DNA，使用用相同的酶消化的質(zhì)粒pTVB106連接480bp片段并轉(zhuǎn)化進(jìn)低蛋白酶和低淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株中(例如，在WO92/11357中提到的SHA273菌株)。
其它M202變體以類似的方式構(gòu)建。
變體T183*+G184*和R181*+G182*的構(gòu)建使用了PCR重疊延伸誘變方法構(gòu)建這些變體(Higuchi等，1988)。使用在一個(gè)位置的C和G(相等部分)的混合物合成了誘變的寡核苷酸，因此通過這種方法可以構(gòu)建兩種不同的突變。使用引物#7113和誘變引物#7449在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增pTVB106的大約300bp的DNA片段。在類似的PCR反應(yīng)B中，使用引物Y296和#3811擴(kuò)增了大約400bp的DNA片段。使用這些引物和在反應(yīng)A和B中純化的DNA片段，在PCR反應(yīng)C中擴(kuò)增了跨從引物#7113到引物Y296的突變位點(diǎn)(氨基酸181-184)的全DNA片段。
以限制性核酸內(nèi)切酶BstEII和AflIII消化PCR C DNA，使用用相同的酶消化的質(zhì)粒pTVB106連接480bp片段并轉(zhuǎn)化進(jìn)低蛋白酶和低淀粉酶的枯草芽孢桿菌菌株中(例如，在WO92/11357中提到的SHA273菌株)。得自這些轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA的測(cè)序鑒別出兩個(gè)正確的突變即R181*+G182*和T183*+G184*。
變體R124P的構(gòu)建使用了PCR重疊延伸誘變方法以類似于變體M202T構(gòu)建(見上)的方式構(gòu)建這種變體。PCR反應(yīng)A(用引物#3810和B1)產(chǎn)生大約500bp的片段，PCR反應(yīng)B(用引物7450和Y296)產(chǎn)生大約550bp的片段。用限制性核酸內(nèi)切酶BstEII和AflIII消化基于PCR反應(yīng)A和B的產(chǎn)物、引物B 1和Y296的PCR反應(yīng)C，并將所得的跨氨基酸位置124的480bp的片段亞克隆進(jìn)以相同的酶消化的pTVB106中，并轉(zhuǎn)化進(jìn)以上的枯草芽孢桿菌中。
變體R124P+T183*+G184*的構(gòu)建為了構(gòu)建結(jié)合R124P和T183*+G184*突變的變體，使用了兩個(gè)EcoNI限制位點(diǎn)(一個(gè)定位在位置1.774kb，即在R124P突變和T183*+G184*突變之間，一個(gè)定位在位置0.146kb)。把包含T183*+G184*突變的pTVB106樣質(zhì)粒的大約1630bp的EcoNI片段亞克隆進(jìn)以相同的酶消化的另一種包含R124P突變的pTVB106樣質(zhì)粒的載體部分(包含復(fù)制起點(diǎn)的大約3810bp的DNA片段)。如上所述轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌。
變體G182*+G184*；R181*+T183*；Y243F；K269R和L351C+M430C的構(gòu)建這些變體構(gòu)建如下 制備了包含在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列編碼區(qū)的主要部分的特異性誘變載體。這個(gè)載體(定名為pPM103)的重要特征包括衍生自pUC質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、賦予氯霉素抗性的cat基因、包含移碼突變的bla基因以及通常賦予氨芐青霉素抗性的野生型(ampR表型)。突變的bla基因?qū)е铝薬mps表型。質(zhì)粒pPM103如圖3所示，在質(zhì)粒上指出了大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、5’-截短的SF16淀粉酶基因、ori、bla、cat以及選擇的限制位點(diǎn)。
除了具有摻入的“選擇性引物”(#6616)的質(zhì)?；跀y帶具有修復(fù)的bla基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞的ampR表型被選擇，而非使用Deng和Nickoloff概述的通過限制酶消化來選擇之外，按照Deng和Nickoloff所述的方法[分析生物化學(xué)，200(1992)，81-88]把突變導(dǎo)入目的基因。用于誘變的化學(xué)藥品和酶從Stratagene的ChameleonTM誘變?cè)噭┖蝎@得(目錄號(hào)200509)。
在對(duì)變體質(zhì)粒中的DNA序列校驗(yàn)之后，包含所要求的變化的截短的基因作為大約1440bp的BstBI-SalI片段從pPM103樣質(zhì)粒亞克隆進(jìn)pTVB106，并轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌以表達(dá)變體酶。
構(gòu)建成對(duì)缺失變體G182*+G184*使用了下列誘變引物 P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT TGT CCT GAA TTTATA TAT TTT GTT TTG AAG 構(gòu)建成對(duì)缺失變體R181*+T183*使用了下列誘變引物 P CTC TGT ATC GAC TTC CCA GTC CCA AGC TTT GCC TCC GAA TTTATA TAT TTT GTT TTG AAG 構(gòu)建取代變體Y243F使用了下列誘變引物 P ATG TGT AAG CCA ATC GCG AGT AAA GCT AAA TTT TAT ATG TTTCAC TGC ATC 構(gòu)建取代變體K269R使用了下列誘變引物 P GC ACC AAG GTC ATT TCG CCA GAA TTC AGC CAC TG 構(gòu)建成對(duì)取代變體L351C+M430C，同時(shí)使用了下列誘變引物 1)P TGT CAG AAC CAA CGC GTA TGC ACA TGG TTT AAA CCA TTG 2)P ACC ACC TGG ACC ATC GCT GCA GAT GGT GGC AAG GCC TGAATT 變體L351C+M430C+T183*+G184*的構(gòu)建這個(gè)變體通過把L351C+M430C成對(duì)取代突變和T183*+G184*成對(duì)缺失突變結(jié)合構(gòu)建，二者的結(jié)合通過把包含L351C+M430C的大約1430bp的HindIII-AflIII片段亞克隆進(jìn)用相同的酶消化的pTVB 106樣質(zhì)粒(帶有T183*+G184*突變)完成。
變體Y243F+T183*+G184*的構(gòu)建這個(gè)變體通過把Y243F突變和T183*+G184*突變結(jié)合構(gòu)建，二者的結(jié)合通過把包含T183*+G184*的大約1148bp的DrdI片段亞克隆進(jìn)用相同的酶消化的pTVB106樣質(zhì)粒(帶有Y243突變)完成。
在含淀粉的瓊脂平板上篩選具有α-淀粉酶活性的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體，通過DNA測(cè)序檢查正確突變的存在。
變體Y243F+T183*+G184*+L351C+M430C的構(gòu)建把L351C+M430C成對(duì)取代突變作為大約470bp的Xmal-SalI片段亞克隆進(jìn)用相同的酶消化的pTVB106樣載體(包含Y243F+T183*+G184*)。
變體Y243F+T183*+G184*+L351C+M430C+Q391E+K444Q的構(gòu)建通過用包含所說的五種突變的pTVB106樣載體的大約1440bp的BstB1-SalI片段取代pPM103中截短的SF16，構(gòu)建了包含突變Y243F+T183*+G184*+L351C+M430C的pPM103樣載體。通過使用下列兩種誘變引物以類似于上述的對(duì)pPM103誘變的方式同時(shí)把Q391E和K444Q突變導(dǎo)入pPM103樣載體(包含Y243F+T183*+G184*+L351C+M430C)中 P GGC AAA AGT TTG ACG TGC CTC GAG AAG AGG GTC TAT P TTG TCC CGC TTT ATT CTG GCC AAC ATA CAT CCA TTT B具有在SEQ ID No.2中所示氨基酸序列的親本α-淀粉酶變體的構(gòu)建 質(zhì)粒pTVB112的描述構(gòu)建了用于具有在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列α-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的定名為pTVB112的載體。該載體除了編碼SEQ ID No.2中的成熟α-淀粉酶的基因插入到pTVB106的Pstl和HindIII位點(diǎn)之間外，與pTVB106十分類似。這樣，這種α-淀粉酶(SEQ IDNo.2)的表達(dá)也受amyL啟動(dòng)子與信號(hào)序列指導(dǎo)。質(zhì)粒pTVB112在圖4中所示。
變體D183*+G184*的構(gòu)建這個(gè)變體的構(gòu)建使用較早提及的PCR重疊延伸誘變方法(見上)完成。引物#8573和B1用于PCR反應(yīng)A，引物#8569和#8570用于PCR反應(yīng)B。從反應(yīng)A和反應(yīng)B純化的片段和引物1B和#8570用于PCR反應(yīng)C，產(chǎn)生了大約1020bp的DNA片段。該這片段用限制性內(nèi)切核酸酶Pstl和MluI消化，亞克隆進(jìn)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌。
其它變體的構(gòu)建通過和用于SEQ ID No.1的氨基酸序列的突變體產(chǎn)生的質(zhì)粒pPM103構(gòu)建類似的方法(見上)，構(gòu)建了一種對(duì)變體D183*+G184*(SEQ ID No.2)繼續(xù)誘變的質(zhì)粒(定名為pTVB114；在圖5中所示)。以類似于pPM103(SEQ ID No.1)的方式把突變導(dǎo)入pTVB 114中(SEQ IDNo.2；D183*+G184*)。構(gòu)建成對(duì)缺失變體R181*+D183*和R181*+G182*，選擇的是改變變體D183*+G184*中的側(cè)翼氨基酸，而不是缺失SEQ ID No.2的野生型基因中的特定氨基酸。下列誘變引物和作為模板的pTVB114一起用于誘變 PCC CAA TCC CAA GCT TTA CCA(T/C)CG AAC TTG TAG ATA CG 兩種堿基的混合物(T/C)在一個(gè)位置的存在使得基于一種誘變引物的兩種不同的缺失側(cè)翼氨基酸可以存在。形成的質(zhì)粒的DNA測(cè)序證明一種或另一種突變的存在。突變的目的基因作為Pstl-DraIII片段亞克隆進(jìn)以相同的酶消化的pTVB112中，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌。
構(gòu)建G182*+G184*和R181*+G184*使用了下列誘變引物和作為模板的pTVB114 PCC CAA TCC CAA GCT TTA TCT C(C/G)G AAC TTG TAG ATA CG 如上所述，兩種堿基的混合物(C/G)在一個(gè)位置的存在使得基于一種誘變引物的兩種不同的缺失側(cè)翼氨基酸可以存在。形成的質(zhì)粒的DNA測(cè)序證明一種或另一種突變的存在。突變的目的基因作為Pstl-DraIII片段亞克隆進(jìn)以相同的酶消化的pTVB112中，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌。
構(gòu)建D183*+G184*+M202L使用了下列誘變引物 PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAC AGT AAA TAA TC 構(gòu)建D183*+G184*+M202I使用了下列誘變引物 PGA TCC ATA TCG ACG TCT GCA TAA ATT AAA TAA TC 實(shí)施例3 具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶的M202取代變體的氧化穩(wěn)定性測(cè)定 ASEQ ID No.1中的序列的變體的氧化穩(wěn)定性 測(cè)定使用各自的變體在pH 9.0的50mM Britton-Robinson緩沖液(50mM醋酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mM CaCl2、以NaOH把pH調(diào)整到目的值)中的溶液進(jìn)行，并向溶液中加入過氧化氫(在時(shí)間t＝0時(shí))使其最終濃度達(dá)到200mM H2O2。然后溶液在40℃的水浴中溫育。
加入過氧化氫后溫育5、10、15和20分鐘后，剩余的α-淀粉酶活性使用上述的Phadebas測(cè)定法測(cè)定。樣品中剩余活性使用pH7.3的50mMBritton-Robinson緩沖液在37℃下測(cè)定(參見Novo分析出版物AF207-1/1，可從Novo Nordisk A/S得到)。測(cè)定了相對(duì)于沒有和過氧化氫溫育的同樣的酶的相應(yīng)參比溶液在0分鐘時(shí)(100％活性)的活性下降。
初始活性的百分比作為時(shí)間的函數(shù)在下面所說的親本酶(SEQ ID No.1)和變體的表中所示。
所有測(cè)試的M202取代變體相對(duì)于親本α-淀粉酶(SEQ ID No.1)清楚地表現(xiàn)出明顯改良的氧化穩(wěn)定性。
BSEQ ID No.2中的序列的變體的氧化穩(wěn)定性 使用所說的親本α-淀粉酶(SEQ ID No.2)、變體M202L+D183*+G184*(在下表中稱為L(zhǎng))、變體M202I+D183*+G184*(在下表稱為I)如上所述分別進(jìn)行測(cè)量。在這種情況下，使用了5、10、15和30分鐘的溫育時(shí)間(在添加過氧化氫之后)。如上表，初始活性的百分比作為時(shí)間的函數(shù)在下面所說的親本酶和變體的表中所示。
測(cè)試的兩個(gè)“取代+成對(duì)缺失”變體(它們都包含M202取代)相對(duì)于親本α-淀粉酶(SEQ ID No.2)清楚地表現(xiàn)出明顯改良的氧化穩(wěn)定性。
實(shí)施例4 具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶變體的熱穩(wěn)定性測(cè)定 A在SEQ ID No.1序列中的成對(duì)缺失變體的熱穩(wěn)定性 測(cè)定使用各自的變體在pH 9.0的50mM Britton-Robinson緩沖液(見上)中的溶液進(jìn)行。溶液在65℃的水浴中溫育，溫育指定的時(shí)間之后樣品取出。各取出樣品的剩余α-淀粉酶活性使用以上所述的Phadebas測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)量。測(cè)定了相對(duì)于沒有溫育的同樣的酶的相應(yīng)參比溶液在0分鐘時(shí)(100％活性)的活性下降。
初始活性的百分比作為時(shí)間的函數(shù)在下面所說的親本酶(SEQ ID No.1)和下列的成對(duì)缺失變體的表中所示。
變體1R181*+G182* 變體2R181*+T183* 變體3G182*+G184* 變體4T183*+G184* 變體5T183*+G184*+R124P 很明顯，所有測(cè)試的成對(duì)缺失變體相對(duì)于親本α-淀粉酶(SEQ ID No.1)表現(xiàn)出明顯改良的熱穩(wěn)定性，變體5(除了變體4的成對(duì)缺失突變之外還包括取代R124P)的熱穩(wěn)定性比其它的變體顯著地高。因?yàn)槿〈凅wR124P(僅包含取代R124P)的量熱結(jié)果表明其相對(duì)于親本α-淀粉酶大約7℃的熱穩(wěn)定性，看起來突變R124P和成對(duì)缺失的熱穩(wěn)定性效果分別相互加強(qiáng)。
B在SEQ ID No.2中的序列的成對(duì)缺失變體的熱穩(wěn)定性 對(duì)親本酶(SEQ ID No.2)和下列成對(duì)缺失變體進(jìn)行了相應(yīng)的測(cè)定 變體AD183*+G184* 變體BR181*+G182* 變體CG182*+G184* 還是很明顯，所說的成對(duì)缺失變體相對(duì)于親本α-淀粉酶(SEQ ID No.2)表現(xiàn)出明顯改良的熱穩(wěn)定性。
CSEQ ID No.1中序列的多組合變體的熱穩(wěn)定性 對(duì)在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列的下列變體進(jìn)行了相應(yīng)的比較測(cè)量。
變體4T183*+G184* 變體6L351C+M430C 變體7Y243F 變體8Q391E+K444Q 變體9T183*+G184*+L351C+M430C+Y243F+Q391E+K444Q 再一次明顯說明，多重突變的熱穩(wěn)定效果(多重突變中的每一種都有熱穩(wěn)定效果)是-至少是定性地-累積性的。
實(shí)施例5 本發(fā)明的α-淀粉酶變體的Ca2+結(jié)合親和力 淀粉酶暴露于熱或變性劑如鹽酸胍的解折疊伴隨著熒光的減弱。失去鈣離子導(dǎo)致解折疊，一系列α-淀粉酶對(duì)鈣的親和力可通過每種α-淀粉酶(如以10μg/ml的濃度)在緩沖液中(如pH 7的50mM HEPES)和不同濃度的鈣(如在1μM至100mM的范圍內(nèi))或EGTA(如在1-1000μM的范圍內(nèi))[EGTA＝1，2-雙(2-氨基乙氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸]溫育足夠長(zhǎng)的時(shí)間(如在55℃下22小時(shí))之前和之后的熒光測(cè)量來測(cè)量。
所測(cè)得的熒光F是由折疊和解折疊形式的酶的貢獻(xiàn)組成的。可以推導(dǎo)下列的方程式以描述F對(duì)鈣濃度([Ca])的依賴 F＝[Ca]/(Kdiss+[Ca])(αN-βNlog([Ca]))+(Kdiss/(Kdiss+[Ca])(αU-βUlog([Ca])) 其中αN是天然的(折疊的)形式的酶的熒光，βN是αN對(duì)鈣濃度對(duì)數(shù)的線性依賴性(實(shí)驗(yàn)觀察得到)，αU是解折疊形式的熒光，βU是αU對(duì)鈣濃度對(duì)數(shù)的線性依賴性。Kdiss是平衡過程的表觀鈣結(jié)合常數(shù)，所述平衡過程表示如下 事實(shí)上，解折疊過程極慢而且不可逆。解折疊速率依賴于鈣濃度，對(duì)給定的α-淀粉酶的依賴性提供了酶的Ca-結(jié)合親和力測(cè)量方法。通過定義一組標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件(例如，55℃下22小時(shí))，可以進(jìn)行不同α-淀粉酶的Kdiss的有意義的比較。通常α-淀粉酶的鈣解離曲線可擬合上述的方程式，使得可以進(jìn)行相應(yīng)的Kdiss值的測(cè)定。
下列的Kdiss值是具有在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列的親本α-淀粉酶和按照本發(fā)明的指出的α-淀粉酶變體獲得的值(親本α-淀粉酶在括弧中指出) 從上述可明顯看到后者的α-淀粉分解酶的鈣結(jié)合親和力在上述表中以降低的方向減少，即成對(duì)缺失變體D183*+G184*(SEQ ID No.2)結(jié)合鈣能力最強(qiáng)(即有最低的Ca2+依賴性)，而SEQ ID No.1的親本α-淀粉酶結(jié)合鈣能力最弱(即有最高的Ca2+依賴性)。
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序列表
(1)一般信息
(i)申請(qǐng)人
(a)姓名NOVO NORDISK A/S
(b)街道NOVO Alle
(c)城市DK-2880 Bagsvaerd
(e)國(guó)家丹麥
(f)郵區(qū)代碼(ZIP)DK-2880
(g)電話+4544448888
(h)電傳+4544493256
(ii)發(fā)明題目淀粉酶變體
(iii)序列數(shù)7
(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式
(A)介質(zhì)類型軟盤
(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)
(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)
(2)SEQ ID No.1的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度485個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.1
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Gly Thr Glu Ile Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Thr Ser Gly Glu Tyr Ala Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Asn His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Ile His Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Thr His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Gln Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Val Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Phe Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Val Trp Val Lys Gln
485
(2)SEQ ID No.2的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度485個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.2
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Glu Ser Ala Ile His Ala Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Val Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Glu Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys
305 310 315 320
His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr
385 390 395 400
Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Thr His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly
435 440 445
Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Lys Arg
485
(2)SEQ ID No.3的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度514個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.3
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Typ Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
180 185 190
Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His
195 200 205
Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn
210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
340 345 350
Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp
355 360 365
Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
405 410 415
Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
435 440 445
Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr
485 490 495
Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val
500 505 510
Ala Trp
(2)SEQ ID No.4的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度1455個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID No.4
CATCATAATG GAACAAATGG TACTATGATG CAATATTTCG AATGGTATTT GCCAAATGAC 60
GGGAATCATT GGAACAGGTT GAGGGATGAC GCAGCTAACT TAAAGAGTAA AGGGATAACA 120
GGTGTATGGA TCCCACCTGC ATGGAAGGGG ACTTCCCAGA ATGATGTAGG TTATGGAGCC 180
TATGATTTAT ATGATCTTGG AGAGTTTAAC CAGAAGGGGA CGGTTCGTAC AAAATATGGA 240
ACACGCAACC AGCTACAGGC TGCGGTGACC TCTTTAAAAA ATAACGGCAT TCAGGTATAT 300
GGTGATGTCG TCATGAATCA TAAAGGTGGA GCAGATGGTA CGGAAATTGT AAATGCGGTA 360
GAAGTGAATC GGAGCAACCG AAACCAGGAA ACCTCAGGAG AGTATGCAAT AGAAGCGTGG 42O
ACAAAGTTTG ATTTTCCTGG AAGAGGAAAT AACCATTCCA GCTTTAAGTG GCGCTGGTAT 480
CATTTTGATG GGACAGATTG GGATCAGTCA CGCCAGCTTC AAAACAAAAT ATATAAATTC 54O
AGGGGAACAG GCAAGGCCTG GGACTGGGAA GTCGATACAG AGAATGGCAA CTATGACTAT 600
CTTATGTATG CAGACGTGGA TATGGATCAC CCAGAAGTAA TACATGAACT TAGAAACTGG 660
GGAGTGTGGT ATACGAATAC ACTGAACCTT GATGGATTTA GAATAGATGC AGTGAAACAT 720
ATAAAATATA GCTTTACGAG AGATTGGCTT ACACATGTGC GTAACACCAC AGGTAAACCA 780
ATGTTTGCAG TGGCTGAGTT TTGGAAAAAT GACCTTGGTG CAATTGAAAA CTATTTGAAT 840
AAAACAAGTT GGAATCACTC GGTGTTTGAT GTTCCTCTCC ACTATAATTT GTACAATGCA 900
TCTAATAGCG GTGGTTATTA TGATATGAGA AATATTTTAA ATGGTTCTGT GGTGCAAAAA 960
CATCCAACAC ATGCCGTTAC TTTTGTTGAT AACCATGATT CTCAGCCCGG GGAAGCATTG 1020
CAATCCTTTG TTCAACAATG GTTTAAACCA CTTGCATATG CATTGGTTCT GACAAGGGAA 1080
CAAGGTTATC CTTCCGTATT TTATGGGGAT TACTACGGTA TCCCAACCCA TGGTGTTCCG 1140
GCTATGAAAT CTAAAATAGA CCCTCTTCTG CAGGCACGTC AAACTTTTGC CTATGGTACG 1200
CAGCATGATT ACTTTGATCA TCATGATATT ATCGGTTGGA CAAGAGAGGG AAATAGCTCC 1260
CATCCAAATT CAGGCCTTGC CACCATTATG TCAGATGGTC CAGGTGGTAA CAAATGGATG 1320
TATGTGGGGA AAAATAAAGC GGGACAAGTT TGGAGAGATA TTACCGGAAA TAGGACAGGC 1380
ACCGTCACAA TTAATGCAGA CGGATGGGGT AATTTCTCTG TTAATGGAGG GTCCGTTTCG 1440
GTTTGGGTGA AGCAA 1455
(2)SEQ ID No.5的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度1455個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID No.5
CATCATAATG GGACAAATGG GACGATGATG CAATACTTTG AATGGCACTT GCCTAATGAT60
GGGAATCACT GGAATAGATT AAGAGATGAT GCTAGTAATC TAAGAAATAG AGGTATAACC 120
GCTATTTGGA TTCCGCCTGC CTGGAAAGGG ACTTCGCAAA ATGATGTGGG GTATGGAGCC 180
TATGATCTTT ATGATTTAGG GGAATTTAAT CAAAAGGGGA CGGTTCGTAC TAAGTATGGG 240
ACACGTAGTC AATTGGAGTC TGCCATCCAT GCTTTAAAGA ATAATGGCGT TCAAGTTTAT 300
GGGCATGTAG TGATGAACCA TAAAGGAGGA GCTGATGCTA CAGAAAACGT TCTTGCTGTC 360
GAGGTGAATC CAAATAACCG GAATCAAGAA ATATCTGGGG ACTACACAAT TGAGGCTTGG 420
ACTAAGTTTG ATTTTCCAGG GAGGGGTAAT ACATACTCAG ACTTTAAATG GCGTTGGTAT 480
CATTTCGATG GTGTAGATTG GGATCAATCA CGACAATTCC AAAATCGTAT CTACAAATTC 540
CGAGGTGATG GTAAGGCATG GGATTGGGAA GTAGATTCGG AAAATGGAAA TTATGATTAT 600
TTAATGTATG CAGATGTAGA TATGGATCAT CCGGAGGTAG TAAATGAGCT TAGAAGATGG 660
GGAGAATGGT ATACAAATAC ATTAAATCTT GATGGATTTA GGATCGATGC GGTGAAGCAT 720
ATTAAATATA GCTTTACACG TGATTGGTTG ACCCATGTAA GAAACGCAAC GGGAAAAGAA 780
ATGTTTGCTG TTGCTGAATT TTGGAAAAAT GATTTAGGTG CCTTGGACAA CTATTTAAAT 840
AAAACAAACT GGAATCATTC TGTCTTTGAT GTCCCCCTTC ATTATAATCT TTATAACGCG 900
TCAAATAGTG GAGGCAACTA TGACATGGCA AAACTTCTTA ATGGAACGGT TGTTCAAAAG 960
CATCCAATGC ATGCCGTAAC TTTTGTGGAT AATCACGATT CTCAACCTGG GGATTCATTA 1020
GAATCATTTG TACAAGAATG GTTTAAGCCA CTTGCTTATG CGCTTATTTT AACAAGAGAA 1080
CAAGGCTATC CCTCTGTCTT CTATGGTGAC TACTATGGAA TTCCAACACA TAGTGTCCCA 1140
GCAATGAAAG CCAAGATTGA TCCAATCTTA GAGGCGCGTC AAAATTTTGC ATATGGAACA 1200
CAACATGATT ATTTTGACCA TCATAATATA ATCGGATGGA CACGTGAAGG AAATACCACG 1260
CATCCCAATT CAGGACTTGC GACTATCATG TCGGATGGGC CAGGGGGAGA GAAATGGATG 1320
TACGTAGGGC AAAATAAAGC AGGTCAAGTT TGGCATGACA TAACTGGAAA TAAACCAGGA 1380
ACAGTTACGA TCAATGCAGA TGGATGGGCT AATTTTTCAG TAAATGGAGG ATCTGTTTCC 1440
ATTTGGTGA AACGA1455
(2)SEQ ID No.6的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度1548個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型DNA(基因組)
(xi)序列描述SEQ ID No.6
GCCGCACCGT TTAACGGCAC CATGATGCAG TATTTTGAAT GGTACTTGCC GGATGATGGC60
ACGTTATGGA CCAAAGTGGC CAATGAAGCC AACAACTTAT CCAGCCTTGG CATCACCGCT 120
CTTTGGCTGC CGCCCGCTTA CAAAGGAACA AGCCGCAGCG ACGTAGGGTA CGGAGTATAC 180
GaCTTGTATG ACCTCGGCGA ATTCAATCAA AAAGGGACCG TCCGCACAAA ATACGGAACA 240
AAAGCTCAAT ATCTTCAAGC CATTCAAGCC GCCCACGCCG CTGGAATGCA AGTGTACGCC 300
GATGTCGTGT TCGACCATAA AGGCGGCGCT GACGGCACGG AATGGGTGGA CGCCGTCGAA 360
GTCAATCCGTCCGACCGCAA CCAAGAAATC TCGGGCACCTATCAAATCCA AGCATGGACG 420
AAATTTGATT TTCCCGGGCG GGGCAACACC TACTCCAGCT TTAAGTGGCG CTGGTACCAT 480
TTTGACGGCG TTGATTGGGA CGAAAGCCGA AAATTGAGCC GCATTTACAA ATTCCGCGGC 540
ATCGGCAAAG CGTGGCATTG GGAAGTAGAC ACGGAAAACG GAAACTATGA CTACTTAATG 600
TATGCCGACC TTGATATGGA TCATCCCGAA GTCGTGACCG AGCTGAAAAA CTGGGGGAAA 660
TGGTATGTCA ACACAACGAA CATTGATGGG TTCCGGCTTG ATGCCGTCAA GCATATTAAG 720
TTCAGTTTTT TTCCTGATTG GTTGTCGTAT GTGCGTTCTC AGACTGGCAA GCCGCTATTT 780
ACCGTCGGGG AATATTGGAG CTATGACATC AACAAGTTGC ACAATTACAT TACCAAAACA 840
GACGGAACGA TGTCTTTGTT TGATGCCCCG TTACACAACA AATTTTATAC CGCTTCCAAA 900
TCAGGGGGCG CATTTGATAT GCGCACGTTA ATGACCAATA CTCTCATGAA AGATCAACCG 960
ACATTGGCCG TCACCTTCGT TGATAATCAT GACACCGAAC CCGGCCAAGC GCTGCAGTCA 1020
TGGGTCGACC CATGGTTCAA ACCGTTGGCT TACGCCTTTA TTCTAACTCG GCAGGAAGGA 1080
TACCCGTGCG TCTTTTATGG TGACTATTAT GGCATTCCAC AATATAACAT TCCTTCGCTG 1140
AAAAGCAAAA TCGATCCGCT CCTCATCGCG CGTCATCGCG CGCAGGGATT AACGCAACAT 1200
GATTATCTTG ATCACTCCGA CATCATCGGG TGGACAAGGG AAGGGGGCAC TGAAAAACCA 1260
GGATCCGGAC TGGCCGCACT GATCACCGAT GGGCCGGGAG GAAGCAAATG GATGTACGTT 1320
GGCAAACAAC ACGCTGGAAA AGTGTTCTAT GACCTTACCG GCAACCGGAG TGACACCGTC 1380
ACCATCAACA GTGATGGATG GGGGGAATTC AAAGTCAATG GCGGTTCGGT TTCGGTTTGG 1440
GTTCCTAGAA AAACGACCGT TTCTACCATC GCTCGGCCGA TCACAACCCG ACCGTGGACT 1500
GGTGAATTCG TCCGTTGGAC CGAACCACGG TTGGTGGCAT GGCCTTGA 1548
(2)SEQ ID No.7的信息
(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度485個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii)分子類型肽
(xi)序列描述SEQ ID No.7
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
20 25 30
Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp
35 40 45
Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60
Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Thr Arg Ser Gln Leu Gln Ala Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly
85 90 95
Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Val Thr Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Arg Phe Asp
130 135 140
Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
145 150 155 160
His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Arg Leu Asn Asn Arg
165 170 175
Ile Tyr Lys Phe Arg Gly His Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
180 185 190
Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205
Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr
210 215 220
Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala
245 250 255
Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu
260 265 270
Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
275 280 285
Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300
Gly Asn Tyr Asp Met Arg Asn Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg
305 310 315 320
His Pro Ser His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
325 330 335
Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
340 345 350
Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365
Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Arg Ser
370 375 380
Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Lys
385 390 395 400
Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp
420 425 430
Gly Ala Gly Gly SerLys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly
435440 445
Gln Val Trp Ser Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Ile Trp Val Asn Lys
48權(quán)利要求
1.一種親本α-淀粉酶的變體，該親本α-淀粉酶(i)具有選自分別在SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示氨基酸序列的氨基酸序列；或(ii)與這些氨基酸序列中的一種或多種顯示出至少80％的同源性；和/或顯示出與如下抗體的免疫交叉反應(yīng)性，所述抗體針對(duì)具有這些氨基酸序列之一的α-淀粉酶產(chǎn)生；和/或由如下DNA序列編碼，所述DNA序列與編碼具有這些氨基酸序列之一的α-淀粉酶之DNA序列與相同的探針雜交；在這種變體中
(a)所說的親本α-淀粉酶的至少一個(gè)氨基酸殘基已被缺失；和/或
(b)所說的親本α-淀粉酶的至少一個(gè)氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基取代；和/或
(c)相對(duì)所說的親本α-淀粉酶而言至少有一個(gè)氨基酸殘基已被插入；
所說的變體具有α-淀粉酶活性并且相對(duì)于所說的親本α-淀粉酶表現(xiàn)出至少一種下列性質(zhì)增加的熱穩(wěn)定性；增加的氧化穩(wěn)定性；和降低的Ca2+依賴性；
其條件是所說的變體的氨基酸序列不與分別在SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之任一相同。
2.按照權(quán)利要求1的變體，其中所說的親本α-淀粉酶的至少一個(gè)可氧化的氨基酸殘基已被缺失或已被不同的氨基酸殘基取代，后者對(duì)氧化不如所說的可氧化的氨基酸殘基敏感。
3.按照權(quán)利要求2的變體，其中所說的可氧化的氨基酸殘基選自由甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸組成的組。
4.按照權(quán)利要求2或3的變體，其中所說的可氧化的氨基酸殘基是甲硫氨酸，該甲硫氨酸是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的M9、M10、M105、M202、M208、M261、M309、M382、M430或M440。
5.按照權(quán)利要求4的變體，該變體包含甲硫氨酸取代，此甲硫氨酸取代是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的下列取代之一M9L；M10L；M105L；M202L、T、F、I、V；M208L；M261L；M309L；M382L；M430L；M440L。
6.按照權(quán)利要求3-5任一之變體，其中所說的甲硫氨酸殘基已被蘇氨酸取代。
7.根據(jù)以上權(quán)利要求任一之變體，其中至少一個(gè)氨基酸已被缺失，該氨基酸是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列的F180、R181、G182、T183、G184.或K185。
8.按照權(quán)利要求7的變體，其中所說的缺失的氨基酸是或等同于所說的氨基酸殘基中的任何兩個(gè)。
9.按照權(quán)利要求8的變體，其中所說的缺失是或等同于R181*+G182*或T183*+G184*。
10.根據(jù)以上權(quán)利要求任一之變體，該變體包含氨基酸取代，此取代是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列中的下列取代之一K269R；P260E；R124P；M105F、I、L、V；M208F、W、Y；L2171；V206I、L、F。
11.按照以上權(quán)利要求任一之變體，該變體包含氨基酸取代，此取代是或等同于在SEQ ID No.1中所示氨基酸序列中的下列取代之一Y243F、K108R、K179R、K239R、K242R、K269R、D163N、D188N、D192N、D199N、D205N、D207N、D209N、E190Q、E194Q、N106D。
12.一種包含編碼按照權(quán)利要求1-11任一之α-淀粉酶變體的DNA序列的DNA構(gòu)建體。
13.一種攜帶按照權(quán)利要求12的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
14.一種用按照權(quán)利要求12的DNA構(gòu)建體或按照權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
15.按照權(quán)利要求14的細(xì)胞，該細(xì)胞是微生物。
16.按照權(quán)利要求15的細(xì)胞，該細(xì)胞是細(xì)菌或真菌。
17.按照權(quán)利要求16的細(xì)胞，該細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、淺青紫鏈霉菌、鼠灰鏈霉菌，或者是革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。
18.一種產(chǎn)生按照權(quán)利要求1-11任一之α-淀粉酶變體的方法，其中在有利于α-淀粉酶變體生成的條件下培養(yǎng)按照權(quán)利要求14-17任一之細(xì)胞，隨后從所用的培養(yǎng)基中回收所說的α-淀粉酶變體。
19.按照權(quán)利要求1-11任一之α-淀粉酶變體在洗滌和/或餐具洗滌上的用途。
20.一種包含按照權(quán)利要求1-11任一之α-淀粉酶變體的去垢劑添加劑，其可以以或不以無粉塵粒狀、穩(wěn)定的液體或受保護(hù)酶形式存在。
21.按照權(quán)利要求20的去垢劑添加劑，該添加劑每克包含0.02-200mg的酶蛋白質(zhì)。
22.按照權(quán)利要求20或21的去垢劑添加劑，該添加劑還包括另一種酶，如蛋白酶、脂酶、過氧物酶、另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
23.一種包含按照權(quán)利要求1-11任一之α-淀粉酶變體和表面活性劑的去垢組合物。
24.按照權(quán)利要求23的去垢組合物，該組合物還包含另一種酶如蛋白酶、脂酶、過氧物酶、另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
25.一種手工或機(jī)用餐具洗滌劑組合物，該組合物包含按照權(quán)利要求1-11任一之α-淀粉酶變體和表面活性劑。
26.按照權(quán)利要求25的餐具洗滌劑組合物，該組合物還包含另一種酶如蛋白酶、脂酶、過氧物酶、另一種淀粉分解酶和/或纖維素酶。
27.一種手工或機(jī)用洗衣組合物，該組合物包含按照權(quán)利要求1-11任一之α-淀粉酶變體和表面活性劑。
28.按照權(quán)利要求27的洗衣組合物，該組合物還包含另一種酶如蛋白酶、脂酶、過氧物酶、淀粉分解酶和/或纖維素酶。
29.按照權(quán)利要求1-11任一之α-淀粉酶變體在紡織品去漿上的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種親本α-淀粉酶的變體，該親本α-淀粉酶(i)具有選自分別在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示氨基酸序列的氨基酸序列；或(ii)與這些氨基酸序列中的一種或多種顯示出至少80％的同源性；和/或顯示出與如下抗體的免疫交叉反應(yīng)性，所述抗體針對(duì)具有這些氨基酸序列之一的α-淀粉酶產(chǎn)生；和/或由如下DNA序列編碼，所述DNA序列與編碼具有這些氨基酸序列之一的α-淀粉酶之DNA序列與相同的探針雜交；在這種變體中(a)所說的親本α-淀粉酶的至少一個(gè)氨基酸殘基已被缺失；和/或(b)所說的親本α-淀粉酶的至少一個(gè)氨基酸殘基已被不同的氨基酸殘基取代；和/或(c)相對(duì)親本α-淀粉酶而言至少有一個(gè)氨基酸殘基已被插入；所說的變體具有α-淀粉酶活性并且相對(duì)于親本α-淀粉酶表現(xiàn)出至少一種下列性質(zhì)增加的熱穩(wěn)定性；增加的氧化穩(wěn)定性；和降低的Ca2+依賴性；其條件是所說的變體的氨基酸序列不與分別在SEQ ID No.1、SEQID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示氨基酸序列之任一相同。
文檔編號(hào)C12N15/56GK101117629SQ20071012834
公開日2008年2月6日 申請(qǐng)日期1996年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年2月3日
發(fā)明者H·比斯加德-佛蘭茨, A·斯文森, T·V·伯切爾特 申請(qǐng)人:諾維信公司