本發(fā)明屬于生物制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)方法，主要是一種發(fā)酵過程中添加亮氨酸生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法。

背景技術(shù)：

γ- 聚谷氨酸是一種由D型谷氨酸和L型谷氨酸通過 α- 氨基和 γ- 羧基間的酰胺鍵結(jié)合而成的一種多功能生物可降解高分子材料。

γ-聚谷氨酸具有優(yōu)良的水溶性、超強的 吸附性和生物可降解性，降解產(chǎn)物為無公害的谷氨酸，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等，在化妝品、環(huán)境保護、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、沙漠治理等產(chǎn)業(yè)均具有很高的商業(yè)價值和社會價值。

目前針對聚谷氨酸主要包括對其性質(zhì)的研究，產(chǎn)生菌的改良和基因研究，發(fā)酵過程研究和提取純化過程研究，以及衍生物的生產(chǎn)和性質(zhì)的研究。近幾年來，由于人們環(huán)境意識的增強和國家可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求，發(fā)展對環(huán)境友好的材料和開發(fā)改善環(huán)境問題的產(chǎn)品成為一種產(chǎn)業(yè)上的趨勢，它也推動了聚谷氨酸產(chǎn)業(yè)化研究和探索的進程。

在研究中發(fā)現(xiàn)，不同構(gòu)型組成的 γ- 聚谷氨酸有不同的應(yīng)用，例如，含有較高含量 L- 谷氨酸的 γ- 聚谷氨酸因其對皮膚的兼容性在化妝品行業(yè)應(yīng)用廣泛，在一些其他的領(lǐng)域，含有較高 D-谷氨酸的γ-聚谷氨酸因其降解較慢而被廣泛應(yīng)用。而且目前市場上對于無污染，環(huán)保的高分子材料需求越來越高，應(yīng)用范圍也越來越廣。所以，在目前的階段下，提高聚谷氨酸的產(chǎn)量以及控制構(gòu)型變得越來越重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種發(fā)酵過程中添加亮氨酸生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，該方法通過將一定濃度的亮氨酸添加到發(fā)酵液中，使發(fā)酵代謝過程中前體增加，從而使得γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量得到提高，并通過添加量和添加時間控制γ- 聚谷氨酸的構(gòu)型。

在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種發(fā)酵過程中添加亮氨酸生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步驟：

1）CGMCC3336 菌種的活化：在富含營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基斜面上于 37℃培養(yǎng) 16 小時，制備得到成熟的斜面種子，固體培養(yǎng)基的成分包含 ：蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl10g/ L，瓊脂 20g/L， pH7.2 ；

2）種子液的制備 ：

將一環(huán)上述種子轉(zhuǎn)入裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，220rpm 培養(yǎng)16小時至對數(shù)生長期 ；其中，種 子 液 培 養(yǎng) 基 組 成（g/L）：葡萄糖 30 ；酵母膏 7 ；胰蛋白胨 10 ； 磷酸氫二鉀0.5；硫酸鎂0.5，pH7.2；500ml 的三角瓶中分裝 50ml 培養(yǎng)基 ；

3)發(fā)酵罐發(fā)酵：

發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為（g/L）：葡萄糖 80，谷氨酸鈉 80，硝酸銨 18，氯化鈉10， 硫酸鎂0.5， 氯化鈣1.0， 硫酸亞鐵0.01，精氨酸 0.44，組氨酸 0.26，蘇氨酸 0.5， 蛋氨酸 0.4，谷氨酰胺 0.5，吡哆醇 0.001， pH7.2 ；

發(fā)酵條件：5L 發(fā)酵罐裝液量為 3L，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度 37℃，發(fā)酵中添加亮氨酸，通風量 1.0vvm，轉(zhuǎn)速 400rpm，初始 pH 為7.2 。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的適用于兒童的新型用藥劑型，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

在本發(fā)明的一些實施例中，步驟（3）中發(fā)酵中添加亮氨酸濃度為0.2~1.0g/L。

在本發(fā)明的一些實施例中，步驟（3）中發(fā)酵中，添加亮氨酸時間為發(fā)酵20~48小時。

本發(fā)明采用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）生產(chǎn)γ-聚谷氨酸。菌種來源：發(fā)明所用菌種見天津北洋百川生物技術(shù)有限公司申請專利名稱為惰性載體固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法專利，申請?zhí)?：200910228297。該菌種為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號 CGMCC3336。

本發(fā)明采用高效液相色譜儀測定D-谷氨酸濃度與 L-谷氨酸濃度，其高效液相色譜儀的工作條件：

儀器：Agilent1200 高效液相色譜儀，配紫外可見檢測器和工作站；

色譜柱：大賽璐 CR(+)/(CR-) 手性柱；

流動相：pH2.0 高氯酸水溶液；

流速：0.4mL/min；

柱溫：25℃ ；

檢測波長：UV200nm

樣品制備：發(fā)酵液經(jīng)二次醇沉復溶后，與等體積 6mol/L 鹽酸在 110℃進行水解，水解前樣品用流動相稀釋適當倍數(shù)，水解后樣品用流動相稀釋適當倍數(shù)，經(jīng) 0.22μm 濾膜過濾，濾液供液相色譜分析。

本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是：

本發(fā)明生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，其γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量得到顯著提高，該方法可以同時控制γ-聚谷氨酸中L/D谷氨酸的比例，因此可以得到不同用途的γ- 聚谷氨酸。

具體實施方式

下面將結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種發(fā)酵過程中添加亮氨酸生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法。下面對本發(fā)明實施例的一種發(fā)酵過程中添加亮氨酸生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法進行詳細描述。

實施例：

本發(fā)明提出了一種發(fā)酵過程中添加亮氨酸生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步驟：

1）CGMCC3336 菌種的活化：在富含營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基斜面上于 37℃培養(yǎng) 16 小時，制備得到成熟的斜面種子，固體培養(yǎng)基的成分包含 ：蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 10g/ L，瓊脂 20g/L， pH7.2 ；

2）種子液的制備 ：

將一環(huán)上述種子轉(zhuǎn)入裝有液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，220rpm 培養(yǎng)16小時至對數(shù)生長期 ；其中，種 子 液 培 養(yǎng) 基 組 成（g/L）：葡萄糖 30 ；酵母膏 7 ；胰蛋白胨 10 ； 磷酸氫二鉀0.5 ； 硫酸鎂0.5， pH7.2 ； 500ml 的三角瓶中分裝 50ml 培養(yǎng)基 ；

3) 發(fā)酵罐發(fā)酵 ：

發(fā)酵罐培養(yǎng)基成分為（g/L）：葡萄糖 80，谷氨酸鈉 80，硝酸銨 18，氯化鈉10， 硫酸鎂0.5， 氯化鈣1.0， 硫酸亞鐵0.01，精氨酸 0.44，組氨酸 0.26，蘇氨酸 0.5， 蛋氨酸 0.4，谷氨酰胺 0.5，吡哆醇 0.001， pH7.2 ；

發(fā)酵條件：5L 發(fā)酵罐裝液量為 3L，種子液的接種量為10%，發(fā)酵溫度 37℃，發(fā)酵中添加亮氨酸，通風量 1.0vvm，轉(zhuǎn)速 400rpm，初始 pH 為7.2 。

本發(fā)明采用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）生產(chǎn)γ-聚谷氨酸。菌種來源：發(fā)明所用菌種見天津北洋百川生物技術(shù)有限公司申請專利名稱為惰性載體固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法專利，申請?zhí)?：200910228297。該菌種為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號 CGMCC3336。

本發(fā)明采用高效液相色譜儀測定D-谷氨酸濃度與 L-谷氨酸濃度，其高效液相色譜儀的工作條件：

儀器：Agilent1200 高效液相色譜儀，配紫外可見檢測器和工作站；

色譜柱：大賽璐 CR(+)/(CR-) 手性柱；

流動相：pH2.0 高氯酸水溶液；

流速：0.4mL/min；

柱溫：25℃ ；

檢測波長：UV200nm

樣品制備：發(fā)酵液經(jīng)二次醇沉復溶后，與等體積 6mol/L 鹽酸在 110℃進行水解，水解前樣品用流動相稀釋適當倍數(shù)，水解后樣品用流動相稀釋適當倍數(shù)，經(jīng) 0.22μm 濾膜過濾，濾液供液相色譜分析。

對照試驗：與實施例不同之處在于，發(fā)酵過程中，不添加亮氨酸；發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)檢測 γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為 19g/L，γ- 聚谷氨酸中 L- 谷氨酸與 D- 谷氨酸含量比例為 1 ：1。

實施例 1

發(fā)酵 24小時，添加0.5g/L亮氨酸，實驗結(jié)果：γ- 聚谷氨酸產(chǎn)量由對照組的 19g/L 提高到 22g/L，L/D 構(gòu)型比例為1.5 ：1。

實施例 2

發(fā)酵 24小時，添加1g/L亮氨酸，實驗結(jié)果：γ- 聚谷氨酸產(chǎn)量由對照組的 19g/L 提高到 25g/L，L/D 構(gòu)型比例為 1.8 ：1.2。

實施例 3

發(fā)酵 48小時，添加0.5g/L亮氨酸，實驗結(jié)果：發(fā)酵小時添加亮氨酸結(jié)果 ： γ- 聚谷氨酸產(chǎn)量由對照組的 19g/L 提高到 25g/L，L/D 構(gòu)型比例為 1 ：1.8。

實施例 4

發(fā)酵 48小時，添加1g/L亮氨酸，實驗結(jié)果：γ- 聚谷氨酸產(chǎn)量由對照組的 19g/L 提高到 28g/L，L/D 構(gòu)型比例為 1：2。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。