序列；W及
[0192] -啟動子控制下的轉(zhuǎn)基因序列，
[0193] -I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動子序列，
[0194] 和任選的上述其它元件之一。
[01M]細(xì)胞中表達轉(zhuǎn)基因的方法
[0196] 本發(fā)明包括用于在細(xì)胞(優(yōu)選非分裂細(xì)胞）中表達轉(zhuǎn)基因的方法。該方法包括在允 許轉(zhuǎn)基因表達的條件下，使用本發(fā)明的慢病毒載體或慢病毒顆粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
[0197] 細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞，特別是人細(xì)胞。特別優(yōu)選的是人非分裂細(xì)胞。
[0198] 轉(zhuǎn)基因優(yōu)選編碼免疫原性多膚。該方法還可包括收獲或分離所述多膚。
[0199] 慢病毒載體或慢病毒顆粒載體優(yōu)選包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動 子序列。優(yōu)選地，該載體還包含I型血1C或的微球蛋白啟動子。
[0200] 在一個實施方式中，本發(fā)明包括一種表達轉(zhuǎn)基因的方法，該方法包括向慢病毒載 體中插入I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動子序列并且用含有I型MHC、II型MHC或的 微球蛋白上游啟動子序列的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。
[0201 ]慢病毒載體的治療性用途
[0202] 本發(fā)明還設(shè)及本發(fā)明的慢病毒載體，尤其是慢病毒顆粒載體形式，用于制備治療 性組合物或疫苗的用途，該治療性組合物或疫苗能夠誘導(dǎo)或造成針對表位的免疫反應(yīng)發(fā)生 或增強，更具體地，由存在于含有I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動子序列的載體中 的轉(zhuǎn)基因編碼的那些。
[0203] 因此，本發(fā)明提供了用作藥物或疫苗，尤其是用于基因療法的載體。
[0204] 運些載體優(yōu)先用于感染性疾病的治療或預(yù)防，特別是與病毒感染相關(guān)聯(lián)的疾病， 且更特別的是與逆轉(zhuǎn)錄病毒感染(如AIDS和其他免疫缺陷)相關(guān)聯(lián)的疾病。
[0205] 本發(fā)明還可用于針對腫瘤和癌癥的治療方案，特別可用于針對腫瘤的免疫治療或 疫苗接種治療的方案。
[0206] 由于本發(fā)明的載體更特異性地祀向樹突細(xì)胞W獲得細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，特別是 與運些細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達的抗原相關(guān)聯(lián)的CTL應(yīng)答，其作為祀向緩慢或內(nèi)源性病原微生 物(如分枝桿菌或HIV病毒)的疫苗時其特別有用。
[0207] 因此，本發(fā)明設(shè)及包含前文所定義的慢病毒載體的免疫原性組合物。
[0208] 本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選包含載體和載體顆粒中的cPPT和CTS序列，W誘導(dǎo) 或刺激載體基因組在祀細(xì)胞中的核輸入。
[0209] 逆轉(zhuǎn)錄期間，cPPT和CTS序列誘導(dǎo)稱作DNAS鏈體的Ξ鏈DNA結(jié)構(gòu)的形成，其刺激 DNA載體序列的核輸入。優(yōu)選地，該載體包含轉(zhuǎn)基因 W及逆轉(zhuǎn)錄病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒樣來源逆 轉(zhuǎn)錄、表達和殼體化的調(diào)控信號，該組合物能夠誘導(dǎo)或刺激CTL(細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞)或CD4 對載體中存在的轉(zhuǎn)基因序列所編碼的一種或數(shù)種表位產(chǎn)生應(yīng)答。
[0210] 通過在載體中包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動子序列來改善慢病毒 載體的效價。
[0211] 因此，本發(fā)明的慢病毒載體能夠誘導(dǎo)、提高記憶CTL應(yīng)答的發(fā)生或通常與之相關(guān) 聯(lián)。換言之，通過誘導(dǎo)、刺激或參與細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答(特別是CTL應(yīng)答或記憶應(yīng)答)的發(fā)生， 它們可用于制備用于治療腫瘤疾病或感染性疾病的治療性組合物。
[0212] 本發(fā)明的慢病毒載體可用于治療方法和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括向宿主給予慢 病毒載體并在宿主中產(chǎn)生針對轉(zhuǎn)基因的特異性免疫應(yīng)答。運些宿主中生成的細(xì)胞和抗體可 用作診斷試劑。
[0213] 本發(fā)明的慢病毒載體可通過已知給藥途徑直接給予患者，包括系統(tǒng)性、局部或表 皮、肌內(nèi)、真皮內(nèi)，例如瘤內(nèi)給藥途徑。本發(fā)明還包括離體給藥，例如祀細(xì)胞的離體轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨 后將經(jīng)處理的細(xì)胞給予待治療的患者。
[0214] 在特定實施方式中，本發(fā)明的免疫原性組合物可直接給予患者，W可誘導(dǎo)、提高或 在體內(nèi)參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(特別是CTL介導(dǎo)的免疫應(yīng)答)的發(fā)生的方式給予。
[0215] 在另一個實施方式中，免疫原性組合物可單次使用或重復(fù)給予后使用，使其能夠 產(chǎn)生長期記憶型細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。
[0216] 本發(fā)明的免疫原性組合物可用于引發(fā)或刺激針對多種表位的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng) 答，所述表位由感興趣的核巧酸序列或者載體或載體顆粒中存在的轉(zhuǎn)基因編碼，且其還可 用于引發(fā)或刺激針對某一基因整個序列產(chǎn)物的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，例如病原體基因或能 夠編碼至少8至15個氨基酸(優(yōu)選9至12個氨基酸)的所述基因的片段。
[0217] 本發(fā)明還包括包含核巧酸序列的慢病毒載體，所述核巧酸序列編碼誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答 的氨基酸序列的多個重復(fù)(至少2條相同序列）和/或含有至少2條不同序列(對應(yīng)于不同病 原體或腫瘤抗原的2個表位)的氨基酸序列。
[0218] 因此，本發(fā)明包括可用于預(yù)防性和/或治療性疫苗接種方案的組合物，其用于腫瘤 的治療且特別是用作抗癌或抗感染性疾病治療。
[0219] 具體而言，其可與佐劑、其他免疫原性組合物、化療或任何其他治療性處理聯(lián)用。
[0220] 因此，已經(jīng)描述了本發(fā)明的不同實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)注意，本文所公開的 內(nèi)容僅是示例性的，且多種其他替代、調(diào)整或修改可包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明 不限于本文所示特定實施方式。 實施例
[0扣。實施例1.細(xì)胞系
[0222] 將肥K 293T(人胚胎腎細(xì)胞系，ATCC C化-11268，（Gr址am等，1977))細(xì)胞保持在補 充了 10%胎牛血清(FBS，PAA)、l%k谷氨酷胺化urobio)、l%青霉素-鏈霉素（生命技術(shù)公 司化ife technologies)的Gibco)和1 %丙酬酸鋼(生命技術(shù)公司的Gibco)的達氏改良伊氏 培養(yǎng)基(DMEM/高改良，Hyclone)中。該細(xì)胞系保持在37°C下含5%C02的濕潤氣氛的解育器 中。
[0223] 實施例2.質(zhì)粒構(gòu)建
[0224] 啟動子在pFLAP-GFP原病毒質(zhì)粒的Mlul和BamHI位點之間克隆。
[0225] 的111_上游序列(的m_US)在啟動子的上游克?。?br>[0。6] HLA-B7和HLA-E啟動子購自GeneArt(生命技術(shù)公司），并且它們設(shè)計為包括在原始 啟動子序列的5 '端上游的的m上游啟動子序列(的m_US)。為了生成HLA-B7和HLA-E原病毒質(zhì) 粒，進行PCR反應(yīng)W僅擴增野生型啟動子序列，其克隆在pFlap-GFP質(zhì)粒的Mlul和BamHI位點 之間。
[0227] 為了將β2πι-上游序列(02m_US)加到HLA-A2、HLA-DRa、CMV和UBC啟動子的5'端，進 行融合PCR反應(yīng)。簡言之，進行3次分開的PCR反應(yīng):第一次PCR擴增的m_US，第二次PCR擴增啟 動子，包括與的m_US的末端同源的25bp突出端。PCR 1和2的產(chǎn)物然后在瓊脂糖凝膠(QIA快 速凝膠提取試劑盒，凱杰公司(QIAGEN))中純化并用作第Ξ次PCR的基質(zhì)，第Ξ次PC時尋生成 最終的DNA產(chǎn)物(的m_US-啟動子）。用于各啟動子的Ξ次PCR的引物描述于表1 dPCR 3產(chǎn)物經(jīng) 凝膠純化并在pCR忠2.1-TOPO忠(生命技術(shù)公司）中克隆、測序、由Mlu巧郵a恤I限制性酶 消化并克隆到pFlap-GFP中。
[022引的111_上游序列W反向取向克隆到啟動子的上游：
[0229] 如上所述，使用融合PC時尋反向取向的的m上游啟動子序列(的m_USR)克隆到各啟 動子的上游。所有1151?_啟動子在AscI和BamHI位點之間擴增，然后使用Mlul和BamHI位點克 隆到時lap-GFP中。用于各啟動子的Ξ次PCR的引物列于表2。
[0230] 的111_上游序列W正向取向克隆到GFP下游：
[0231] 使用趾〇1和ΚρηΙ限制性位點將f32m_US克隆到GFP報告基因的下游。首先，進行PCR W將Xho I和Κρη I位點分別加到f32m_US的5 '和3 '。PCR使用的引物是：正向：5 ' - CTCGAGGAGAAACCCTGCAGGGAATTC-3 '（ SEQ ID N0:9)，反向：5'- GGTACCGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3'（SEQ ID NO: 10) JCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化、在 pCR?2.1-TO：PO? (生命技術(shù)公司）中克隆、測序、由趾0巧日ΚρηΙ限制性酶消化并克隆到 pFlap-GFP的化〇1和ΚρηΙ位點之間。
[0232] 的111_上游序列W反向取向克隆到GFP下游：
[0233] 使用趾〇1和ΚρηΙ限制性位點將反向取向的的m上游啟動子序列(f32m_USR)克隆到 GFP報告基因的下游。首先，進行PCRW將化〇1和ΚρηΙ位點分別加到的m_US的5'和3'。使用的 引物是：正向：5 ' -GGTACCGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAG-3 '（ SEQ ID NO: 11)，反向：5'- CTCGAGGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3'（SEQ ID NO: 12) ePCR產(chǎn)物然后經(jīng)凝膠純化、在 昨反魄.1-ΤΟΡ?愈（生命技術(shù)公司）中克隆、測序、由趾0巧日ΚρηΙ限制性酶消化并克隆到 pFlap的化ol和ΚρηΙ位點之間。 腳4] 克隆到pUCor巧日KanR之間的的m上游序列:
[0235] 由于pUCor巧日KanR序列之間存在的限制性位點的數(shù)量受到限制，我們選擇將腳11_ US克隆到化II位點中。由于化II位點也存在于pFlap主鏈的5'LTR中，我們首先使用融合PCR 將的m_US加到pUCori的上游，然后克隆2個化II位點之間的整個片段。PCR1使用的引物(β 2m_US的擴增）是：Fl_5'-CACGTGGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAG-3'（SEQ ID NO: 13)和Rl_ 5'-GAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCA-3'（SEQ ID N0:14)dPCR2使用的引物(pUCori和SV40的擴 增）是：F25-TGCCTTCTTAAACATCACGAGACTCCTAAAACTTCATTTTTAATTT-3 '（SEQ ID NO:15)，含 有與的m_US的末端同源的突出端(粗體），和R2_5 ' -CACGTGATGAAATGCTAGGCGGCTGTC-3 '（ SEQ ID NO: 16) dPCR 1和2產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化并用作第Ξ次PCR的基質(zhì)，并且FI和R2引物 用于擴增。PCR 3產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化并在1>€：11愈2^-了0口〇|忠(生命技術(shù)公司）中克隆、測序、由 化II消化并克隆至IjpFlap-GFP中的相同位點之間。由酶促消化來控制克隆取向。
[0236] W反向取向克隆到pUCor巧日KanR之間的02111_上游序列：
[0237] 如上所述，f32m_USR克隆到化II位點之間。
[0238] PCR1 使用的引物(02m_US 的擴增)是:Fl_5 ' -CACGTGGAGTCTCGTGATGTTTAAGAAGGCAT 0-3'（沈9 10側(cè)：17)和1?1_5'-646444〔〇：了6〔46664417〇：〇：46-3'（沈9 10側(cè)：18)?？讴?2使 用的引物(pUCor i 和SV40 的擴增）是:F2_5-TGGGGAATTCCCTGCAGGGTTTCTCCTAAAACTTCATTTTT AATTT-3'（SEQIDN0:19)，含有與β2m_US的末端同源的突出端（粗體），和R2_5'- CACGTGATGAAATGCTAGGCGGCTGTC-3'（SEQ ID NO:2〇KPCR 巧日2產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化并用作第Ξ 次PCR的基質(zhì)，并且F1和R2引物用于擴增。PCR 3產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化并在pCR?2.1-TCXPO愈 (生命技術(shù)公司）中克隆、測序、由化II消化并克隆到pFlap-GFP中的相同位點之