利用來自短柄草屬泛素1c基因的調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)基因表達用構(gòu)建體的制作方法
【專利說明】利用來自短柄草屬泛素1C基因的調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)基因表達用構(gòu) 建體
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年8月30日提交的美國臨時專利申請No.61/872,134的優(yōu)先權(quán)，通 過提述將上述申請全部并入本申請。
[0003] 通過提述并入W電子方式提交的材料
[0004] 通過提述將其全部內(nèi)容并入與此申請同時提交的計算機可讀核巧酸/氨基酸序 列，其如下：建立于2014年8月15日的名稱為"Brach_UBI_lC_WQ_LIST_ST25"的一個64邸的 ACII (文本)文件"。
[0005] 背景
[0006] 植物轉(zhuǎn)化是一種有吸引力的用于將農(nóng)藝學(xué)上期望性狀或特性導(dǎo)入不同作物物種 中的技術(shù)。開發(fā)具有特定的期望性狀的植物物種，和/或?qū)⒅参镂锓N修飾為具有特定的期望 性狀。通常，期望性狀的例子包括:提高營養(yǎng)價值質(zhì)量，增加產(chǎn)量，賦予抗蟲性或抗病性，增 加干旱和脅迫耐受性，提高園藝質(zhì)量(例如，著色和生長），賦予除草劑抗性，使得可能從植 物生產(chǎn)在工業(yè)上有用的化合物和/或材料的能力，和/或使得可能生產(chǎn)藥品。
[0007] 通過植物轉(zhuǎn)化技術(shù)來生產(chǎn)包含堆疊在單個基因組基因座處的多個轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基 因植物。植物轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因?qū)胫参锛毎?、在植物基因組中含有轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定整 合拷貝的能育轉(zhuǎn)基因植物的恢復(fù)、并且通過轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的后續(xù)轉(zhuǎn)基因表達導(dǎo)致具 有期望性狀和表型的轉(zhuǎn)基因植物。堆疊中的每個轉(zhuǎn)基因一般需要獨立的啟動子用于基因表 達，因此在轉(zhuǎn)基因堆疊中需使用多個啟動子。
[000引經(jīng)常由于需要共表達調(diào)節(jié)同一性狀的多個轉(zhuǎn)基因而重復(fù)使用同一啟動子來驅(qū)動 多個轉(zhuǎn)基因的表達。然而，重復(fù)使用包含享有高水平序列同一性的序列的多個啟動子可能 導(dǎo)致基于同源性的基因沉默化BGS)。觀察到轉(zhuǎn)基因植物(Peremarti et al. ,2010)中當(dāng)在 轉(zhuǎn)基因中使用重復(fù)的DM序列時頻繁出現(xiàn)皿GS。另外，在±壤桿菌中，已經(jīng)證明由于質(zhì)粒的 重組和不穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中重復(fù)使用相似的DNA序列是困難的。
[0009]本文描述了與玉米泛素1啟動子享有低水平序列同一性或同源性的泛素調(diào)節(jié)元件 (例如，啟動子和3'-UTR)。進一步描述了利用泛素調(diào)節(jié)元件的構(gòu)建體和方法。
[0010] 概述
[0011] 本文公開了用于在植物細胞和/或植物組織中表達轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建體和方法。在一 個實施方案中，從柳枝稷（Pani州m vi;rgatum)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、 或粟(Setaria italics)基因組中純化泛素基因調(diào)節(jié)元件，并且將其與不和該調(diào)節(jié)元件天 然連接的序列重組，從而創(chuàng)制用于在對于所述泛素調(diào)節(jié)序列而言非天然的植物細胞中表達 轉(zhuǎn)基因的表達載體。在一個實施方案中，提供了表達載體，其中泛素基因的調(diào)節(jié)元件與多接 頭序列可操作地連接。運樣的表達載體使得基因或基因盒W與泛素基因調(diào)節(jié)序列的可操作 連接狀態(tài)插入到所述載體中變得容易。
[0012] 在一個實施方案中，提供了構(gòu)建體，其包含柳枝稷、二穗短柄草、或粟泛素啟動子。 在一個實施方案中，提供了基因表達盒，其包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接的柳枝稷、二穗短柄草 或粟泛素啟動子。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接的柳枝稷、二穗 短柄草或粟泛素5'-UTR。在一個實施方案中，基因表達盒包含與啟動子可操作連接的柳枝 稷、二穗短柄草或粟泛素5'-UTR。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接 的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素內(nèi)含子。在一個實施方案中，基因表達盒包含與啟動子可操 作連接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素內(nèi)含子。在一個實施方案中，構(gòu)建體包含含有柳枝 稷、二穗短柄草、或粟泛素3'-UTR的基因表達盒。在一個實施方案中，基因表達盒包含與轉(zhuǎn) 基因可操作連接的柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素3'-UTR。在一個實施方案中，基因表達盒包 含至少一個、兩個三個、五個、六個、屯個、八個、九個、十個、或更多個轉(zhuǎn)基因。
[0013] 在一個實施方案中，基因表達盒獨立地包含:a)柳枝稷、二穗短柄草、或粟泛素啟 動子，b)柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素內(nèi)含子，C)柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素5'-UTR，W及 d)柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素3'-UTR。
[0014] 根據(jù)一個實施方案，提供了核酸載體，其包含與非泛素轉(zhuǎn)基因可操作連接的啟動 子，其中所述啟動子由SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有90%序列同一性的序列組成。 在另一個實施方案中，所述核酸載體包括基因盒，其中所述基因盒包含啟動子、非泛素轉(zhuǎn)基 因和3'非翻譯區(qū)，其中所述啟動子由與轉(zhuǎn)基因的第一端可操作連接的SEQ ID N0:15組成， 其中所述轉(zhuǎn)基因的第二端與由SEQ ID N0:4組成的3'非翻譯序列可操作連接。
[0015] 本文公開了種植利用柳枝稷、二穗短柄草、或粟啟動子、5'-UTR、內(nèi)含子、和3'-UTR 表達轉(zhuǎn)基因的植物的方法。本文還公開了培養(yǎng)利用柳枝稷、二穗短柄草或粟啟動子、5'- UTR、內(nèi)含子、和3 ' -UTR表達轉(zhuǎn)基因的植物組織和細胞的方法。
[0016] 根據(jù)一個實施方案，提供了包含與非泛素轉(zhuǎn)基因可操作連接的啟動子的植物、植 物組織、或植物細胞，其中所述啟動子包含SEQ ID N0:1。根據(jù)一個實施方案，提供了包含與 轉(zhuǎn)基因可操作連接的SEQ ID NO: 1、或與SEQ ID NO: 1具有90%序列同一性的序列的非短柄 草屬(non-Brachypodium)植物或植物細胞。在一個實施方案中，所述植物為玉米品種。在一 個實施方案中，提供了包含與非泛素轉(zhuǎn)基因可操作連接的啟動子的植物、植物組織、或植物 細胞，其中所述啟動子由SEQ ID NO: 15或SEQ ID N0:40組成。在一個實施方案中，提供了包 含基因盒的非短柄草屬植物或植物細胞，其中所述基因盒包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接的啟動 子，且其中所述啟動子由SEQ ID NO: 15組成。在另一個實施方案中，所述啟動子與轉(zhuǎn)基因的 第一端可操作連接，其中所述轉(zhuǎn)基因的第二端與由SEQ ID N0:4組成的3'非翻譯序列可操 作連接。
[0017] 附圖簡述
[0018] 圖1顯示了玉米泛素 (ZM Ubil)蛋白質(zhì)序列與用于啟動子鑒定的二穗短柄草和粟 泛素序列的蛋白質(zhì)比對。Zm化η蛋白質(zhì)序列在本文中公開為SEQ ID NO: 22。粟化i2蛋白質(zhì) 序列在本文中公開為SEQ ID NO: 23。二穗短柄草師il啟動子序列在本文中公開為SEQ ID N0:24。二穗短柄草化ilC蛋白質(zhì)序列在本文中公開為SEQ ID N0:25。共有序列在本文中公 開為沈Q ID NO:26。
[0019] 圖2顯示了玉米泛素 (ZM Ubil)啟動子多核巧酸序列與本文中鑒定的二穗短柄草 和粟泛素啟動子多核巧酸的比對。玉米泛素 l(Zm-Ubi)啟動子序列在本文中公開為SEQ ID NO:27。二穗短柄草化il啟動子序列在本文中公開為SEQ ID NO: 16。二穗短柄草化il-C啟動 子序列在本文中公開為SEQ ID NO: 15。粟化i2啟動子序列在本文中公開為SEQ ID NO: 17。
[0020] 圖3為顯示合成的粟泛素2啟動子遺傳元件的質(zhì)粒圖譜。
[0021] 圖4為顯示合成的二穗短柄草泛素1C啟動子遺傳元件和側(cè)翼無縫克隆突出端位置 的質(zhì)粒圖譜。
[0022] 圖5為顯示合成的二穗短柄草泛素1啟動子遺傳元件和側(cè)翼無縫克隆突出端位置 的質(zhì)粒圖譜。
[0023] 圖6為顯示含有融合于化iYFP報告基因的粟泛素2(SI-Ubi2)啟動子的表達載體的 質(zhì)粒圖譜。
[0024] 圖7為顯示含有融合于化iYFP報告基因的二穗短柄草泛素1C啟動子的表達載體的 質(zhì)粒圖譜。
[0025] 圖8為顯示含有融合于化巧FP報告基因的二穗短柄草泛素1啟動子的表達載體的 質(zhì)粒圖譜。
[00%]圖9為顯示含有融合于化iYFP報告基因的0S Actl(水稻肌動蛋白1)啟動子的表達 載體的質(zhì)粒圖譜。
[0027]圖10為顯示含有融合于PhiYFP報告基因的ZM師η啟動子的表達載體的質(zhì)粒圖 譜。
[00%]圖11為顯示利用Gateway技術(shù)用來建立二元表達載體的二元目標(biāo)載體的質(zhì)粒圖 譜。
[0029] 圖12為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有粟泛素2(SI-Ubi2)啟 動子，其融合于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（Phi YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包 含來自馬鈴馨的StPinll 3'UTR的片段。
[0030] 圖13為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有二穗短柄草泛素1C啟 動子，其融合于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（Phi YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包 含來自馬鈴馨的StPinll 3'UTR的片段。
[0031] 圖14為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有二穗短柄草泛素1啟 動子，其融合于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（Phi YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包 含來自馬鈴馨的StPinll 3'UTR的片段。
[0032] 圖15為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有0S Actl啟動子，其融 合于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（PM YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包含來自馬 鈴馨的StPinll 3'UTR的片段。
[0033] 圖16為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有ZM化η啟動子，其融 合于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（ΡΜ YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包含來自馬 鈴馨的StPinll 3'UTR的片段。
[0034] 圖17顯示了To葉中的YFP表達，其中YFP由如圖12、13、14、15、和16描繪的跨物種泛 素啟動子和Os Act 1啟動子驅(qū)動。
[0035] 圖18顯示了1'〇葉中的4401表達，其中4401由如圖12、13、14、15、和16描繪的2111化1 1啟動子驅(qū)動。
[0036] 圖19顯示了由新穎的二穗短柄草和粟啟動子驅(qū)動的瞬時YFP表達，與由ZM化i 1和 0S Actl啟動子驅(qū)動的YFP表達比較。
[0037] 圖20顯示了由新穎的二穗短柄草和粟啟動子驅(qū)動的愈傷組織中的YFP表達，與由 ZM化il和OS Actl啟動子驅(qū)動的YFP表達比較。
[003引圖21顯示了由新穎的二穗短柄草和粟啟動子驅(qū)動的根組織中的YFP表達，與由ZM 化η和0S Actl啟動子驅(qū)動的YFP表達比較。
[0039] 圖22為顯示合成的柳枝稷泛素1啟動子遺傳元件和側(cè)翼無縫克隆突出端位置的質(zhì) 粒圖譜。
[0040] 圖23為顯示合成的柳枝稷泛素1 3'UTR遺傳元件和側(cè)翼無縫克隆突出端位置的質(zhì) 粒圖譜。
[0041] 圖24為顯示合成的二穗短柄草泛素 1C 3'UTR遺傳元件和側(cè)翼無縫克隆突出端位 置的質(zhì)粒圖譜。
[0042] 圖25為顯示合成的二穗短柄草泛素1 3'UTR遺傳元件和側(cè)翼無縫克隆突出端位置 的質(zhì)粒圖譜。
[0043] 圖26為顯示合成的粟泛素2(SI-Ubi2)3'UTR遺傳元件和側(cè)翼無縫克隆突出端位置 的質(zhì)粒圖譜。
[0044] 圖27為顯示含有融合于PMYFP報告基因的柳枝稷泛素1啟動子和3'UTR的表達載 體的質(zhì)粒圖譜。
[0045] 圖28為顯示含有融合于化iYFP報告基因的二穗短柄草泛素1C啟動子和3'UTR的表 達載體的質(zhì)粒圖譜。
[0046] 圖29為顯示含有融合于PMYFP報告基因的粟泛素2啟動子和3'UTR的表達載體的 質(zhì)粒圖譜。
[0047] 圖30為顯示含有融合于PMYFP報告基因的二穗短柄草泛素1啟動子和3'UTR的表 達載體的質(zhì)粒圖譜。
[004引圖31為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有二穗短柄草泛素1C啟 動子，融合于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（PM YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包含 二穗短柄草泛素1C 3'UTR的片段。
[0049] 圖32為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有柳枝稷泛素1啟動子， 融合于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（Phi YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包含柳枝 稷泛素1 3'UTR的片段。
[0050] 圖33為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有粟泛素2啟動子，融合 于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（PM YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包含粟泛素2 3'UTR的片段。
[0051] 圖34為顯示二元表達載體的質(zhì)粒圖譜，該二元表達載體含有二穗短柄草泛素1啟 動子，融合于含有ST-LS1內(nèi)含子的黃色巧光蛋白（PM YFP)標(biāo)志物基因編碼區(qū)，之后為包含 二穗短柄草泛素1 3'UTR的片段。
[0052] 圖35呈現(xiàn)了二穗短柄草泛素 1C編碼序列和推定的啟動子(ATG的上游序列）。上游 啟動子序列加下劃線，5 ' -UTR序列W大寫字母表示，內(nèi)含子加框，Ub i 1CDS為斜體，3 ' -UTR (加有下劃線)和轉(zhuǎn)錄終止序列在TAA(翻譯終止密碼子)的下游。
[0053] 圖36呈現(xiàn)了二穗短柄草泛素 1編碼序列和推定的啟動子。上游啟動子加下劃線，5' UTR序列W大寫字母表示，內(nèi)含子加框，CDS為斜體，3 ' -UTR (加有下劃線)和轉(zhuǎn)錄終止序列在 TAA(翻譯終止密碼子)的下游。
[0054] 圖37呈現(xiàn)了粟泛素 2編碼序列和推定的啟動子。上游啟動子加下劃線，5'UTR序列 W大寫字母表示，內(nèi)含子加框，CDS為斜體，3 ' -UTR (加有下劃線的）和轉(zhuǎn)錄終止序列在TAA (翻譯終止密碼子)的下游。
[0055] 圖38呈現(xiàn)了柳枝稷(Switchgrass)泛素 1編碼序列和推定的啟動子。上游啟動子加 下劃線，5'UTR序列W大寫字母表示，內(nèi)含子加框，CDS為斜體，3'-UTR(加有下劃線)和轉(zhuǎn)錄 終止序列在TAA(翻譯終止密碼子)的下游。
[0化6] 發(fā)明詳述 [0057] 定義
[0058] 在描述和要求本發(fā)明時，下列術(shù)語將根據(jù)下文陳述的定義使用。
[0059] 如本文中使用的術(shù)語"大約"意指比言明的值或值的范圍大或小10%，但不意圖將 任何值或值的范圍僅僅指定運個更寬的定義。在每個值或值的范圍之前的術(shù)語"大約"同樣 意圖涵蓋所陳述的絕對值或值的范圍的實施方案。
[0060] 如本文中使用的，術(shù)語"回交"是指其中育種者使雜交后代與親本之一雜交，例如， 第一代雜種F1與F1雜種的親本基因型之一雜交的過程。
[0061] "啟動子"是能夠結(jié)合細胞中的RNA聚合酶并啟動編碼序列的下游(3'方向）轉(zhuǎn)錄的 DNA調(diào)節(jié)區(qū)。啟動子可含有被轉(zhuǎn)錄因子識別的特異性序列。運些因子可與啟動子DNA序列結(jié) 合，導(dǎo)致RNA聚合酶的募集。為了定義本發(fā)明的目的，啟動子序列在其3'端W轉(zhuǎn)錄起始位點 為界，并向上游(5'方向）延伸，W包含為啟動高于背景的可檢測水平的轉(zhuǎn)錄所需的最小數(shù) 目的堿基或元件。在啟動子序列內(nèi)可見轉(zhuǎn)錄起始位點(通過例如核酸酶S1作圖來方便地界 定）、W及負責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列）。啟動子可與其他表達控制序 列(包括增強子和阻抑物序列)可操作地關(guān)聯(lián)。
[0062] 為本公開的目的，"基因"包括編碼基因產(chǎn)物(如上所述）的DNA區(qū)域，也包括所有調(diào) 芐基因產(chǎn)物之產(chǎn)生的DNA區(qū)域，無論運類調(diào)控序列是否位于編碼和/或轉(zhuǎn)錄序列的附近。因 此，基因包括，而不一定限于，啟動子序列、終止子、翻譯調(diào)節(jié)序列（如核糖體結(jié)合位點和內(nèi) 部核糖體進入位點）、增強子、沉默子、隔離子、邊界元件、復(fù)制起點、核基質(zhì)附著位點和基因 座控制區(qū)。
[0063] 如本文中使用的術(shù)語"天然的"或"自然的"定義了在自然界中發(fā)現(xiàn)的狀況。"天然 DNA序列"是通過自然手段或傳統(tǒng)育種技術(shù)產(chǎn)生的而不是通過基因工程(例如，使用分子生 物學(xué)/轉(zhuǎn)化技術(shù))產(chǎn)生的存在于自然界中的DNA序列。
[0064] 如本文中使用的"轉(zhuǎn)基因"定義為編碼基因產(chǎn)物(包括，例如但不限于mRNA)的核酸 序列。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因為外源核酸，其中轉(zhuǎn)基因序列已通過基因工程導(dǎo)入通常未 發(fā)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)基因的宿主細胞(或其后代）中。在一個實例中，轉(zhuǎn)基因編碼在工業(yè)上或藥學(xué)上 有用的化合物、或編碼期望的農(nóng)藝性狀的基因（例如，除草劑抗性基因）。在又另一個實例 中，轉(zhuǎn)基因為反義核酸序列，其中所述反義核酸序列的表達抑制祀核酸序列的表達。在一個 實施方案中，轉(zhuǎn)基因是內(nèi)源核酸，其中所述內(nèi)源核酸的額外基因組拷貝是期望的，或者是相 對于宿主生物中的祀核酸序列處于反義取向的核酸。
[0065] 如本文中使用的術(shù)語"非泛素轉(zhuǎn)基因"是與玉米泛素 1編碼序列（SEQ ID N0:27)具 有小于80%序列同一性的任何轉(zhuǎn)基因。
[0066] 如本文中定義的"基因表達"是包含在基因中的信息到基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。
[0067] 如本文中定義的"基因產(chǎn)物"是由基因產(chǎn)生的任何產(chǎn)物。例如，基因產(chǎn)物可W是基 因直接轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、干擾RNA、核酶、結(jié)構(gòu)RNA或任何其他類 型的RNA)或mRNA翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?；虍a(chǎn)物還包括修飾過的RNA，例如通過加帽、多聚腺 巧酸化、甲基化和編輯修飾過的RNA，W及修飾的蛋白質(zhì)，例如通過甲基化、乙酷化、憐酸化、 泛素化、ADP核糖基化、豆違酷化(myristilation)和糖基化修飾的蛋白質(zhì)。基因表達可能受 到外部信號的影響，例如細胞、組織、或生物被暴露于可增加或降低基因表達的物質(zhì)?；?表達也可W在從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的途徑中的任何位置受到調(diào)節(jié)?；虮磉_的調(diào)節(jié)發(fā)生 的方式有，例如，對轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA運輸和加工的控制;對于中間分子比如mRNA的降解;或在 特定蛋白分子已經(jīng)產(chǎn)生之后對它們的活化、失活化、區(qū)室化、或降解，或上述方式的組合?；?因表達可W在RNA水平或蛋白質(zhì)水平上通過本領(lǐng)域已知的任何方法來測量，運些方法包括 但不限于，No;rthe;rn印跡、RT-PCR、Weste;rn印跡，或體外、原位或體內(nèi)蛋白活性測定。
[0068] 如本文中使用的，術(shù)語"內(nèi)含子"定義為包含在基因（或表達的感興趣核巧酸序列） 中的任何被轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的核酸序列。內(nèi)含子包括表達的DNA序列之內(nèi)的非翻譯核酸序 列、W及從所述DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA分子中的相應(yīng)序列。本文中描述的構(gòu)建體還可W含有強 化翻譯和/或mRNA的穩(wěn)定性的序列，如內(nèi)含子。一種運樣的內(nèi)含子的實例是擬南芥組蛋白H3 變體的基因 II的第一內(nèi)含子或任何其他公知的內(nèi)含子序列。內(nèi)含子可與啟動子序列聯(lián)合使 用來強化翻譯和/或mRNA的穩(wěn)定性。
[0069] 如本文中使用的，術(shù)語巧'非翻譯區(qū)"或巧' -UTR"定義為前mRNA或成熟mRNA的5 '端 中的非翻譯區(qū)段。例如，在成熟mRNA上，5 ' -UTR-般在其5 '端上包含7-甲基鳥巧帽，且設(shè)及 許多過程，如剪接、多腺巧酸化、mRNA朝向細胞質(zhì)輸出、翻譯機構(gòu)識別mRNA的5 '端、W及保護 mRNA免于降解。
[0070] 如本文中使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)錄終止子"定義為前mRNA或成熟mRNA的3 '端中的轉(zhuǎn)錄區(qū) 段。例如，超過"多腺巧酸化信號"位點的更長DNA段被轉(zhuǎn)錄為mRNA。運個DNA序列常常含有用 于將前mRNA正確加工為成熟mRNA的一個或多個轉(zhuǎn)錄終止信號。
[0071] 如本文中使用的，術(shù)語"3 '非翻譯區(qū)"或"3 ' -UTR"定義為前mRNA或成熟mRNA的3 '端 中的非翻譯區(qū)段。例如，在成熟的mRNA上，運個區(qū)域包含多聚(A)尾，并且已知其在mRNA穩(wěn)定 性、翻譯起始、和mRNA輸出中具有多種作用。
[0072] 如本文中使用的，術(shù)語"多腺巧酸化信號"指示存在于mRNA轉(zhuǎn)錄物中的一種核酸序 列，其允許轉(zhuǎn)錄物在多聚(A)聚合酶的存在下在多腺巧酸化位點上(例如位于多聚(A)信號 的下游的10到30個堿基的多腺巧酸化位點上）多腺巧酸化。許多多腺巧酸化信號在本領(lǐng)域 是已知的，并可用于本發(fā)明。示例序列AAUAAA及其變體，正如描述于Loke J.等人的（2005) Plant I^ysiology 138(3);1457-1468。
[0073] 如本文中使用的術(shù)語"分離的"意指已經(jīng)從其自然環(huán)境中移出，或者已經(jīng)與該化合 物最初形成時存在的其他化合物分開。術(shù)語"分離的"包括從天然來源分離的物質(zhì)，W及在 宿主細胞中重組表達之后回收的物質(zhì)(例如，核酸和蛋白質(zhì)），或化學(xué)合成的化合物，如核酸 分子、蛋白質(zhì)、和膚類。
[0074] 如本文中使用的術(shù)語"純化的"設(shè)及分子或化合物W運樣的形式分離:基本上不含 通常在天然或自然環(huán)境中與所述分子或化合物相關(guān)聯(lián)的污染物，或相對于在所述化合物最 初形成時存在的其他化合物而言在濃度上高度富集;該術(shù)語還意指作為與原始組成中其他 組分分離的結(jié)果，在純度上已經(jīng)增加。術(shù)語"純化的核酸"在本文中用來描述已經(jīng)從其他生 物化合物(包括但不限于，多膚、脂質(zhì)和碳水化合物)分離、分開產(chǎn)生、或純化出來，同時影響 組分的化學(xué)或功能變化(例如，通過移除蛋白質(zhì)污染物并使連接核酸與染色體中的其余DNA 的化學(xué)鍵斷裂，可將核酸從染色體中純化出來)的核酸序列。
[0075] 如本文中使用的，術(shù)語"基于同源性的基因沉默"或"HBGS"為通用術(shù)語，包括轉(zhuǎn)錄 基因沉默和轉(zhuǎn)錄后基因沉默兩者。非連鎖的沉默基因座對祀基因座的沉默作用可W是轉(zhuǎn)錄 抑制(轉(zhuǎn)錄基因沉默;TGS)或mRNA降解(轉(zhuǎn)錄后基因沉默;PTGS)的結(jié)果，二者分別是由對應(yīng) 于啟動子的雙鏈RNA(dsRNA)或?qū)?yīng)于轉(zhuǎn)錄序列的雙鏈RNA的產(chǎn)生所導(dǎo)致的。每一過程設(shè)及 獨特的細胞組分，運表明dsRNA誘導(dǎo)的TGS和PTGS很可能是從某個古老的共同機制的多樣化 而來。然而，迄今為止TGS和PTGS的嚴(yán)格比較是難于實現(xiàn)的，因為運種比較通常依賴于對獨 特的沉默基因座的分析。由于產(chǎn)生對應(yīng)于不同祀基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄序列的dsRNA，單轉(zhuǎn)基 因基因座可W說既可觸發(fā)TGS又可觸發(fā)PTGS。
[0076] 如本文中使用的，術(shù)語"核酸分子"、"核酸"、或"多核巧酸"（所有運Ξ個術(shù)語彼此 同義）是指核巧酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因組DNA、和合成形式的有義和反義 鏈、及其混合聚合物。"核巧酸"可W指核糖核巧酸、脫氧核糖核巧酸、或運兩種類型核巧酸 的任一者的修飾形式。除非另外指明，核酸分子通常長度為至少10個堿基。前述術(shù)語可W指 具有不確定長度的RNA或DNA分子。所述術(shù)語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。核酸分子可W包括 天然存在的核巧酸和/或修飾核巧酸，藉由天然存在和/或非天然存在的核巧酸聯(lián)接而連接 在一起。
[0077] 正如本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的，核酸分子可被化學(xué)修飾或生物化學(xué)修飾，或者 可W含有非天然或衍生的核巧堿基。運些修飾包括，例如，標(biāo)記物、甲基化、用類似物取代一 個或多個天然存在的核巧酸、核巧酸間修飾(例如，如不帶電聯(lián)接(uncharged 1 inkage)的 修飾：例如甲基麟酸鹽、憐酸Ξ醋、氨基憐酸醋、氨基甲酸醋等；帶電連接（charged 1 inkage)的修飾:例如，硫代憐酸醋、二硫代憐酸醋等;懸垂部分的修飾:例如膚類;嵌入劑 修飾:例如叮晚、補骨脂素等;馨合劑修飾;燒化劑(a化ylator)修飾;和修飾的連接:例如α 異頭核酸等）。術(shù)語"核酸分子"還包括任何拓撲結(jié)構(gòu)，包括單鏈的、雙鏈的、部分雙鏈體的、 Ξ鏈體的、發(fā)夾形的化a