ID NO: 1，且3'- UTR是SEQ ID N0:4。在一個實施方案中，基因表達盒可包括啟動子和3'-UTR，其中所述啟動 子是多核巧酸沈Q ID NO:35,且3'-UTR是沈Q ID NO:36。
[0200] 在一個實施方案中，基因表達盒包含與非泛素轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素啟動子、 泛素5'-UTR、和泛素3'-UTR。在一個實施方案中，基因表達盒包含與非泛素轉(zhuǎn)基因可操作連 接的泛素啟動子、泛素內(nèi)含子、泛素5'-UTR、和泛素3'-UTR。
[0201 ]當基因表達盒包含一個或多個轉(zhuǎn)基因時，啟動子、內(nèi)含子、5 ' -UTR和3 ' -UTR可與基 因表達盒之內(nèi)的不同轉(zhuǎn)基因可操作連接。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉(zhuǎn)基因 可操作連接的泛素啟動子，其中所述轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因、除草劑耐受性轉(zhuǎn)基 因、氮利用效率轉(zhuǎn)基因、水分利用效率轉(zhuǎn)基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因、選擇標志 物轉(zhuǎn)基因、或它們的組合。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛 素啟動子、內(nèi)含子、和5'-UTR，其中所述轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因、除草劑耐受性轉(zhuǎn) 基因、氮利用效率轉(zhuǎn)基因、水分利用效率轉(zhuǎn)基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因、選擇標 志物轉(zhuǎn)基因、或它們的組合。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉(zhuǎn)基因可操作連接的 泛素3'-UTR，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼可提高殺蟲劑抗性、除草劑耐受性、氮利用效率、水分利 用效率、營養(yǎng)品質(zhì)或它們的組合的基因產(chǎn)物。
[0202] 泛素內(nèi)含子和5'-UTR可與基因表達盒內(nèi)的不同啟動子可操作連接。在說明性實施 方案中，啟動子來源于植物(例如，玉米泛素1啟動子）、病毒(例如，木馨葉脈花葉病毒啟動 子)或細菌(例如，根癌±壤桿菌Smas)。在說明性實施方案中，基因表達盒包含與轉(zhuǎn)基因可 操作連接的泛素啟動子，其中所述轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因、除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因、 氮利用效率轉(zhuǎn)基因、水分利用效率轉(zhuǎn)基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因、選擇標志物轉(zhuǎn) 基因、或它們的組合。
[0203] 在一個實施方案中，載體包含如本文中公開的基因表達盒。在一個實施方案中，載 體可W是質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、隧菌體、病毒、或在直接轉(zhuǎn)化或基因打祀中使 用的切割的多核巧酸片段，如供體DM。
[0204] 根據(jù)一個實施方案，提供了包含重組基因盒的核酸載體，其中所述重組基因盒包 含與多接頭序列、非泛素轉(zhuǎn)基因、或它們的組合可操作連接的基于泛素的啟動子。在一個實 施方案中，所述重組基因盒包含與非泛素轉(zhuǎn)基因可操作連接的基于泛素的啟動子。在一個 實施方案中，所述重組基因盒包含與多接頭序列可操作連接的如本文中公開的基于泛素的 啟動子。所述多接頭W-定的方式與基于泛素的啟動子可操作連接，使得編碼序列插入到 所述多接頭的限制性位點之一中后會可操作地連接上，從而允許在載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中 時表達該編碼序列。
[0205] 根據(jù)一個實施方案，基于泛素的啟動子包含SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有 90%、95%或99%序列同一性的序列。根據(jù)一個實施方案，所述啟動子序列的總長度不超過 1.5、2、2.5、3或4kb。根據(jù)一個實施方案，基于泛素的啟動子由沈Q ID N0:1或與沈Q ID NO: 1具有90%、95%或99%序列同一性的102抓口序列組成。
[0206] 根據(jù)一個實施方案，提供了包含基因盒的核酸載體，所述基因盒的組成為SEQ ID NO: 15、非泛素轉(zhuǎn)基因、和3'-UTR，其中SEQ ID NO: 15與非泛素轉(zhuǎn)基因的5'端可操作連接，而 3'-UTR與非泛素轉(zhuǎn)基因的3'端可操作連接。在另一個實施方案中，3'非翻譯序列包含SEQ ID N0:4或與SEQ ID N0:4具有90%、95%、99%或100%序列同一性的序列。根據(jù)一個實施 方案，提供了包含基因盒的核酸載體，所述基因盒的組成為SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有90%、95%、或99%序列同一性的20776口序列、非泛素轉(zhuǎn)基因和3'-1711?，其中沈9 10 NO: 15與非泛素轉(zhuǎn)基因的5'端可操作連接，而3'-UTR與非泛素轉(zhuǎn)基因的3'端可操作連接。在 另一個實施方案中，3'非翻譯序列包含沈Q ID N0:4或與沈Q ID N0:4具有90%、95%、99% 或100%序列同一性的序列。在另一個實施方案中，3'非翻譯序列由SEQ ID N0:4、或與SEQ ID N0:4具有90%、95%、或99%序列同一性的10266口序列組成。
[0207] 根據(jù)一個實施方案，所述核酸載體進一步包含編碼選擇標志物的序列。根據(jù)一個 實施方案，所述重組基因盒與±壤桿菌T-DNA邊界可操作連接。根據(jù)一個實施方案，所述重 組基因盒進一步包含第一和第二T-DNA邊界，其中第一 T-DNA邊界與基因構(gòu)建體的一端可操 作連接，且所述第二T-DNA邊界與基因構(gòu)建體的另一端可操作連接。所述第一和第二±壤桿 菌T-DNA邊界可獨立地選自來源于細菌菌株的T-DNA邊界序列，所述T-DNA邊界序列選自合 成姻脂堿的±壤桿菌T-DNA邊界、合成章魚堿(〇。〇扣9山6)的±壤桿菌T-DNA邊界、合成班巧 堿的±壤桿菌T-DNA邊界、或它們的任何組合。在一個實施方案中，提供了±壤桿菌菌株，其 選自姻脂堿合成菌株、甘露堿合成菌株、班巧堿合成菌株、或章魚堿合成菌株，其中所述菌 株包含質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包含與選自56〇10^:1、569 10^:15或與56〇10^:1或56〇 ID NO: 15具有90%、95%、或99%序列同一性的序列可操作連接的轉(zhuǎn)基因。
[0208] 感興趣的且適合用于當前公開的構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)基因包括但不限于，賦予下列各項 的編碼序列：（1)對害蟲或疾病的抗性，（2)對除草劑的抗性，和（3)增值性狀，如公開于 W02013116700(DGT-28)、US20110107455(DSM-2)、美國專利 8,283,522(AAD-12);7,838,733 (八八0-1);5，188,960;5,691，308;6,096,708;和6,573,240((：巧1巧；美國專利6，114，138;5， 710,020;和6,251，656((：巧14。）；美國專利6，127，180;6,624，145和6，：340,593((：巧34461); 美國專利6,083,499;6,548,291和6,340,593((：巧35461)中，其公開內(nèi)容并入本文。根據(jù)一 個實施方案，所述轉(zhuǎn)基因編碼選擇標志物或賦予殺蟲劑抗性、除草劑耐受性、氮利用效率、 水分利用效率、或營養(yǎng)品質(zhì)的基因產(chǎn)物。
[0209] 根據(jù)一個實施方案，提供了包含基因盒的核酸載體，其中所述基因盒包含與轉(zhuǎn)基 因的5'端可操作連接的啟動子區(qū)，其中轉(zhuǎn)基因的3'端與3'非翻譯區(qū)連接。在一個實施方案 中，所述啟動子區(qū)包含SEQ ID N0:1或與SEQ ID N0:1具有90%、95%、或99%序列同一性的 序列。根據(jù)一個實施方案，所述啟動子區(qū)由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 15組成。在一個實施 方案，3'非翻譯序列包含沈Q ID N0:4或與沈Q ID N0:4具有90%、95%、99%或100%序列 同一性的序列，并且在一個實施方案中，3'非翻譯序列由SEQ ID N0:4、或與SEQ ID N0:4具 有90%、95%、或99%序列同一性的1026bp序列組成。
[0210] 根據(jù)一個實施方案，提供了包含基因盒的核酸載體，其中所述基因盒包含與5'非 翻譯區(qū)的5'端可操作連接的啟動子區(qū)，其中5'非翻譯區(qū)的3'端與轉(zhuǎn)基因的5'端可操作連 接，其中轉(zhuǎn)基因的3'端與3'非翻譯區(qū)連接。在一個實施方案中，所述啟動子區(qū)包含或為SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有90%、95%或99%序列同一性的序列。在一個實施方案中，所 述啟動子區(qū)由沈Q ID N0:1或與沈Q ID N0:1具有90%、95%或99%序列同一性的1029bp序 列組成。根據(jù)一個實施方案，所述5'非翻譯序列包含或為SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11 具有90%序列同一性的序列。根據(jù)一個實施方案，所述5'非翻譯序列由SEQ ID NO: 11或與 SEQ ID NO: 11具有90%序列同一性的55bp序列組成。在一個實施方案中，所述3'非翻譯序 列包含或為沈Q ID N0:4或與沈Q ID N0:4具有90%、95%或99%序列同一性的序列。在一 個實施方案中，所述3'非翻譯序列由SEQ ID NO:4或與SEQ ID NO:4具有90%、95%或99% 序列同一性的l〇26bp序列組成。在另一個實施方案中，所述核酸載體進一步包含插入在所 述5'非翻譯區(qū)與所述轉(zhuǎn)基因之間、并且與所述啟動子和所述轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素內(nèi)含 子。在一個實施方案中，所述泛素內(nèi)含子包含或為SEQ ID NO:7或與SEQ ID NO:7具有90%、 95%或99%序列同一性的序列。在一個實施方案中，所述泛素內(nèi)含子由SEQ ID N0:7或與 SEQ ID N0:7具有90%、95%或99%序列同一性的993bp序列組成。
[0211] 根據(jù)一個實施方案，提供了包含基因盒的核酸載體，其中所述基因盒包含與轉(zhuǎn)基 因的5'端可操作連接的啟動子區(qū)，其中轉(zhuǎn)基因的3'端與3'非翻譯區(qū)連接。在一個實施方案 中，所述啟動子區(qū)包含沈Q ID N0:40或與沈Q ID N0:40具有90%、95%或99%序列同一性 的序列。
[0212]
[0213] 根據(jù)一個實施方案，所述啟動子區(qū)由SEQ ID NO:40或與SEQ ID NO:40具有90%、 95%或99%序列同一性的1084bp序列組成。根據(jù)一個實施方案，所述啟動子區(qū)由SEQ ID N0:40組成。在一個實施方案中，所述3'非翻譯序列的由SEQ ID N0:4或與SEQ ID N0:4具有 90 %、95 %或99 %序列同一性的1026bp序列組成，在一個實施方案中，所述3 '非翻譯序列由 沈Q ID NO:4組成。
[0214] 在一個實施方案中，提供了包含如本文中公開的基因表達盒的細胞或植物。在一 個實施方案中，細胞或植物包含含有如本文中公開的基因表達盒的載體。在一個實施方案 中，載體可W是質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)、隧菌體、或病毒。由此，包含如本文中公 開的基因表達盒的細胞或植物分別是轉(zhuǎn)基因細胞或轉(zhuǎn)基因植物。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基 因植物可W是單子葉植物。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因單子葉植物可W是，但不限于，玉米、 小麥、水稻、高梁、燕麥、黑麥、香蕉、甘薦、和粟。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物可W是雙子 葉植物。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因雙子葉植物可W是，但不限于，大豆、棉花、向日葵、和蕓 苔。一個實施方案還包括來自如本文中公開的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。
[0215] 在一個實施方案中，基因表達盒包含兩個或更多個轉(zhuǎn)基因。所述兩個或更多個轉(zhuǎn) 基因可能不與相同的啟動子、內(nèi)含子、或如本文中公開的5'-UTR或3'-UTR可操作連接。在一 個實施方案中，基因表達盒包含一個或多個轉(zhuǎn)基因。在具有一個或多個轉(zhuǎn)基因的實施方案 中，至少一個轉(zhuǎn)基因與主題公開的啟動子、內(nèi)含子、5'-UTR、或3'-UTR可操作連接。
[0216] 選擇標志物
[0217] 可W將各種選擇標志物(亦稱報告基因）納入選定的表達載體中，W允許鑒定并選 擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物(轉(zhuǎn)化體）?？蒞用來確認選擇標志物在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中表達的方法有很多， 包括例如DNA測序和PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)）、Southern印跡法、RNA印跡法、用于檢測從載體 中表達出來的蛋白質(zhì)(例如介導麟絲菌素抗性的沉淀蛋白質(zhì)）的免疫學方法，或其他蛋白質(zhì) 的視覺觀察，所述其他蛋白質(zhì)如報告基因編碼的β-葡糖醒酸糖巧酶(GUS)、蛋光素酶、綠色 巧光蛋白（GFP)、黃色巧光蛋白（YFP)、DsRed、i3-半乳糖巧酶、氯霉素乙酷轉(zhuǎn)移酶(CAT)、堿性 憐酸酶，等（參閱Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition, Cold Spring化rbor Press,N.Y.,2001,其全部內(nèi)容通過提述并入本文）。
[0218] 利用選擇標志物基因來選擇轉(zhuǎn)化的細胞或組織。選擇標志物基因包括編碼抗生素 抗性的基因，例如編碼新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶IK肥0)和潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶化PT)的那些基因， W及賦予對除草化合物的抗性的基因。除草劑抗性基因通常編碼對該除草劑不敏感的修飾 的祀蛋白，或編碼在植物中在該除草劑起作用之前降解該除草劑或?qū)⒃摮輨┟摱镜拿浮?例如，已通過使用編碼突變體祀酶5-締醇式丙酬酷莽草酸-3-憐酸合酶化PSPS)的基因而獲 得了對草甘麟的抗性。針對EPSPS的基因和突變體是熟知的，并且在下文進一步描述。已經(jīng) 通過使用編碼使對應(yīng)的除草劑脫毒的pat或DSM-2、臘水解酶、aad-1、或aad-12基因的細菌 基因獲得了對草錠麟、漠苯臘、W及2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性。
[0219] 在一個實施方案中，除草劑，包括包括咪挫嘟酬或橫酷脈，可W抑制生長點或分生 組織，并且針對運些除草劑的抗性/耐受性的基因，乙酷徑酸合酶(AHAS)和乙酷乳酸合酶 (ALS)，是公知的。草甘麟抗性基因包括突變體5-締醇丙酬酷莽草酸-3-憐酸合酶化PSP)和 dgt-28基因（分別通過引入天然EPSP基因、aroA基因和草甘麟乙酷轉(zhuǎn)移酶(GAT)基因的重組 核酸和/或各種形式的體內(nèi)誘變）。其他麟酷基化合物的抗性基因包括來自鏈霉菌屬物種 (包括吸水鏈霉菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌）的bar基因、W及化晚氧基或苯氧基丙酸和環(huán)己酬 (ACC酶抑制劑編碼基因）。賦予對環(huán)己二酬和/或芳氧基苯氧基丙酸(包括氣化甲禾靈、禾草 靈、精惡挫禾草靈、化氣禾草靈、哇禾靈)抗性的示例性基因包括乙酷輔酶A簇化酶(ACC酶） 基因，一Accl-Sl、Accl-S2和ACC1-S3。在一個實施方案中，除草劑可W抑制光合作用，包括 Ξ嗦(psbA和ls+基因）或節(jié)臘(臘水解酶基因）。
[0220] 在一個實施方案中，選擇標志物基因包括但不限于，編碼下列物質(zhì)的基因：新霉素 憐酸轉(zhuǎn)移酶II;氯酷胺水合酶;天冬氨酸激酶;二氨化晚二簇酸合成酶;色氨酸脫簇酶;二氨 化晚二簇酸合酶和脫敏型天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脫簇酶；新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶 (肥0);潮霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶化PT或肌G);二氨葉酸還原酶化HFR);麟絲菌素乙酷轉(zhuǎn)移酶;2，2- 二氯丙酸脫面酶;乙酷徑酸合酶;5-締醇丙酬酷-莽草酸-憐酸合酶(aroA);面代芳基臘水解 酶；乙酷輔酶A簇化酶;二氨蝶酸合酶(sul I);和32kD光合體系II多膚(psbA)。
[0221] -個實施方案還包括編碼對下列物質(zhì)的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶嶺;潮霉素； 大觀霉素;漠苯臘;草甘麟;和麟絲菌素。
[0222] W上列出的選擇標志物基因并非意味著限制。本發(fā)明涵蓋任何報告基因或選擇標 志物基因。
[0223] 合成選擇標志物基因，W實現(xiàn)在植物中的最優(yōu)表達。例如，在一個實施方案中，基 因的編碼序列已通過密碼子優(yōu)化進行修飾，W增強在植物中的表達?？蒞為了在特定的植 物物種中表達而優(yōu)化選擇標志物基因，或者可W為了在雙子葉或單子葉植物中最優(yōu)表達而 修飾選擇標志物基因?？蒞從特定植物物種中表達量最大的蛋白質(zhì)中頻率最高的密碼子確 定出植物優(yōu)選的密碼子。在一個實施方案中，選擇標志物基因被設(shè)計為W較高水平在植物 中表達，從而導致較高的轉(zhuǎn)化效率。用于基因的植物優(yōu)化的方法是熟知的。關(guān)于合成的DNA 序列的優(yōu)化和生產(chǎn)的指導可例如在W02013016546、W02011146524、W01997013402、美國專利 6166302、美國專利5380831中找到，將它們通過提述并入本文。
[0224] 轉(zhuǎn)化
[0225] 用于植物轉(zhuǎn)化的適合方法包括任何將DNA導入細胞中的方法，例如但不限于：電穿 孔(參見，例如，美國專利5,384,253);微粒轟擊(參見，例如，美國專利5,015,580,5,550， 318，5,538,880，6,160,208，6,399,861、和6,403,865) ;±壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化(參見，例如， 美國專利 5,635,055,5,824,877,5,591，616;5,981，840、和 6,384,301);和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 (參見，例如，美國專利5,508，184)。
[0226] 可W使用諸如利用碳化娃纖維攬動的技術(shù)(參見，例如，美國專利5,302,523和5， 464,765)將DNA構(gòu)建體直接導入到植物細胞的基因組DNA中，或者可W使用生物射彈法如 DNA粒子轟擊將DNA構(gòu)建體直接導入到植物組織中（參見，例如，Klein等人（1987)化ture 327: 70-73)?；蛘?，可通過納米顆粒轉(zhuǎn)化將DNA構(gòu)建體導入植物細胞中（參見，例如，美國專 利公開20090104700,通過提述將其全文并入本文）。
[0227] 此外，基因轉(zhuǎn)移可W使用非±壤桿菌的細菌或病毒，例如根瘤菌菌種NGR234,首猜 中華根瘤菌、百脈根根瘤菌、馬鈴馨病毒X、花挪菜花葉病毒和木馨葉脈花葉病毒和/或煙草 花葉病毒來實現(xiàn)，參見，例如Chung等人(2006)Trends Plant Sci.ll(l):l-4。
[0228] 通過轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用，幾乎任何植物物種的細胞均可穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，并且可通過熟知 的技術(shù)使運些細胞發(fā)育為轉(zhuǎn)基因植物。例如，美國專利5,846,797、5，159，135、5,004,863、 和6,624,344中描述了在棉花轉(zhuǎn)化背景下可能特別有用的技術(shù);例如在美國專利5,750,871 中描述了用于轉(zhuǎn)化蕓苔屬植物的技術(shù)；用于轉(zhuǎn)化大豆的技術(shù)例如描述于美國專利6,384， 301中；用于轉(zhuǎn)化玉米的技術(shù)例如描述于美國專利7,060,876和5,591，616、^及國際口0'公 開W0 95/06722 中。
[0229] 在完成外源核酸到受體細胞的遞送之后，通常把轉(zhuǎn)化的細胞鑒定出來用于進一步 培養(yǎng)和植物再生。為了提高鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，可能期望與產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體用的轉(zhuǎn)化載體一道 使用選擇標志物基因。在說明性實施方案中，可通過使細胞暴露于一種或多種選擇劑來測 定轉(zhuǎn)化的細胞群，或者可篩選所述細胞的期望標志物基因性狀。
[0230] 對于暴露于選擇劑后存活的細胞、或者在篩選測定中已被評分為陽性的細胞，可 W在支持植物再生的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在一個實施方案中，可通過加入其他物質(zhì)，如生長 調(diào)節(jié)劑來改良任何適合的植物組織培養(yǎng)基?？蓪⒔M織維持在具有生長調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基 上，直到可得到足W啟動植物再生工作的組織為止，或者進行重復(fù)多輪的手工選擇，直到組 織的形態(tài)適合于再生為止(例如，至少2周），然后轉(zhuǎn)移到有助于芽形成的培養(yǎng)基中。定期轉(zhuǎn) 移培養(yǎng)物，直到已經(jīng)發(fā)生充分的芽形成為止。一旦形成芽，將它們轉(zhuǎn)移到有助于根形成的培 養(yǎng)基中。一旦形成足夠的根，可將植物轉(zhuǎn)移到±壤中，W便進一步生長和成熟。
[0231] 為了證實提供在再生植物中的包含期望核酸的構(gòu)建體的存在，可進行多種測定。 運樣的測定可包括:分子生物學測定，如Southern和nodhern印跡W及PCR;生物化學測定， 如檢測蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如通過免疫學手段化LISA、western印跡、和/或LC-MS MS分光 光度法)或借助于酶功能;植物部分測定，如葉或根測定;和/或再生的全植物的表型分析。
[0232] 可例如通過使用對感興趣核酸分子特異的寡核巧酸引物進行PCR擴增來篩選轉(zhuǎn)基 因事件。PCR基因分型理解為包括但不限于:對來源于分離的宿主植物愈傷組織(預(yù)期該愈 傷組織含有整合到基因組中的感興趣核酸分子）的基因組DNA的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴 增，然后進行PCR擴增產(chǎn)物的標準克隆和序列分析。PCR基因分型方法已有詳盡的描述(參 見，例如，Rios等(2002)Plant J.32:243-53)，并可應(yīng)用于來源于任何植物物種或組織類型 (包括細胞培養(yǎng)物）的基因組DNA。在PCR擴增反應(yīng)中可按順序使用、或者復(fù)用與祀序列和導 入序列兩者都結(jié)合的寡核巧酸引物的組合?？僧a(chǎn)生旨在與祀位點、導入的核酸序列、和/或 運兩者的組合退火的寡核巧酸引物。因此，PCR基因分型策略可包括，例如但不限于:植物基 因組中特異性序列的擴增;植物基因組中的多個特異性序列的擴增;植物基因組中的非特 異性序列的擴增；W及任何前述項的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)計其他引物組合和擴增反 應(yīng)來探查基因組。例如，可W設(shè)計一組正向和反向寡核巧酸引物，令它們退火到對導入的核 酸序列的邊界之外的祀標而言為特異性的核酸序列。
[0233] 可設(shè)計特異性地退火到導入的核酸分子的正向和反向寡核巧酸引物，例如，退火 到導入的核酸分子中包含的某個感興趣核巧酸序列內(nèi)的編碼區(qū)的相應(yīng)序列;或所述核酸分 子的其他部分。引物可W結(jié)合本文中描述的引物使用。寡核巧酸引物可根據(jù)期望的序列來 合成并且可商購（例如，來自 Integrated DNA Technologies, Inc. ,Coralvilie , IA)。擴增 之后可W進行擴增產(chǎn)物的克隆和測序、或直接序列分析。在一個實施方案中，PCR擴增中使 用對基因祀標特異性的寡核巧酸引物。
[0234] 表達轉(zhuǎn)基因的方法
[0235] 在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉(zhuǎn)基因的方法包括種植運樣的植物： 該植物包含與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素啟動子。在一個實施方案中，在植物中表 達至少一個轉(zhuǎn)基因的方法包括種植運樣的植物:該植物包含與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作連接 的泛素5'-UTR。在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉(zhuǎn)基因的方法包括種植運樣的 植物:該植物包含與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素內(nèi)含子。在一個實施方案中，在植物 中表達至少一個轉(zhuǎn)基因的方法包括種植運樣的植物:該植物包含與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作 連接的泛素啟動子、泛素5'-UTR、和泛素內(nèi)含子。在一個實施方案中，在植物中表達至少一 個轉(zhuǎn)基因的方法包括種植運樣的植物：該植物包含與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素 3'-UTR。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉(zhuǎn)基因的方法包括培 養(yǎng)運樣的植物組織或植物細胞:所述植物組織或植物細胞包含與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作連 接的泛素啟動子。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉(zhuǎn)基因的方 法包括培養(yǎng)運樣的植物組織或植物細胞:所述植物組織或植物細胞包含與至少一個轉(zhuǎn)基因 可操作連接的泛素5'-UTR。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉(zhuǎn) 基因的方法包括培養(yǎng)運樣的植物組織或植物細胞:所述植物組織或植物細胞包含與至少一 個轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素內(nèi)含子。在一個實施方案中，在植物組織或植物細胞中表達至 少一個轉(zhuǎn)基因的方法包括培養(yǎng)運樣的植物組織或植物細胞，所述植物組織或植物細胞包含 與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素啟動子、泛素5'-UTR、和泛素內(nèi)含子。在一個實施方案 中，在植物組織或植物細胞中表達至少一個轉(zhuǎn)基因的方法包括培養(yǎng)運樣的植物組織或植物 細胞，所述植物組織或植物細胞包含與至少一個轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素3'-UTR。
[0236] 在一個實施方案中，在植物中表達至少一個轉(zhuǎn)基因的方法包括種植包含含有與至 少一個轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素啟動子的基因表達盒的植物。在一個實施方案中，泛素啟 動子由選自沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、沈Q ID N0:35、沈Q ID N0:15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、和沈Q ID NO:39的序列或與選自沈Q ID NO: 1、SEQ ID NO:2、沈Q 10側(cè)：3、569 10腸：35、569 10側(cè)：15、沈9