含有I型MHC、II型MHC或β2微球蛋白上游啟動(dòng)子序列的慢病毒載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于重組疫苗技術(shù)的領(lǐng)域并設(shè)及慢病毒載體的改進(jìn)，其可用作治療性和預(yù) 防性疫苗。含有I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列的載體提供了比其它載體改 善的特性。
[000^ 背景
[0003] 重組疫苗已隨重組DNA技術(shù)的進(jìn)步而發(fā)展，允許修飾病毒基因組W產(chǎn)生修飾的病 毒。通過運(yùn)種方式，已能夠?qū)⑦z傳序列引入非致病性病毒，從而它們編碼需要在干擾后于祀 細(xì)胞內(nèi)得W表達(dá)的免疫原性蛋白質(zhì)，W在其宿主內(nèi)發(fā)展特定免疫應(yīng)答。
[0004] 運(yùn)類載體構(gòu)成了疫苗技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)化utzler 等，NatRevGenet，9(10):776- 788,2008)。具體而言，它們具有優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)勢(shì):避免活(減毒的）病毒和消除滅活疫 苗制造的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。
[0005] 在二十世紀(jì)八十年代早期由Mann等引入使用改性的逆轉(zhuǎn)錄病毒（逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體）的基因遞送（Cell，33( 1):153-9,1983)。最常用的致瘤性逆轉(zhuǎn)錄病毒基于莫洛尼 (Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。它們具有簡(jiǎn)單的基因組，從中產(chǎn)生多蛋白GagJol和Env并 且要求為反式 W用于病毒復(fù)制（Breckpot等，2007，Gene Ther，14( 11):847-62;He等，2007， Expert Rev vaccines，6(6) :913-24)。一般需要的順式序列是長(zhǎng)末端重復(fù)序列(；LTR)及其 周邊序列：用于整合的反向重復(fù)序列（IR或att位點(diǎn)）、包裝序列Ψ、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA結(jié)合位點(diǎn)（引物 結(jié)合位點(diǎn)，PBS)，和設(shè)及逆轉(zhuǎn)錄的一些其它序列（正鏈起始必需的LTR內(nèi)的重復(fù)RW及多嚷嶺 序列(PPT))。為了生成復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并 且用表達(dá)盒替代。
[0006] 源自慢病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（即，慢病毒載體)已涌現(xiàn)為用于基因治療和 免疫治療目的的有希望的工具，因?yàn)樗鼈冿@示優(yōu)于其它病毒系統(tǒng)的若干優(yōu)勢(shì)。具體地，慢病 毒本身沒有毒性，并且與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，慢病毒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞，尤其是樹突狀 細(xì)胞化e等，2007，Expe;rt Rev vaccines，6(6) :913-24)，使得通過內(nèi)源性途徑呈遞抗原。
[0007] 慢病毒通過遺傳組成相似性、復(fù)制的分子機(jī)制和與其宿主的生物相互作用連接。 它們最常稱為緩慢疾病綜合征的試劑，該綜合征在延長(zhǎng)的亞臨床感染之后開始并緩慢發(fā) 展；因此，它們被稱作豎'病毒(Narayan等，1989,J Gen Virol,70(7): 1617-39)。其基本構(gòu) 成與所用逆轉(zhuǎn)錄病毒相同但由于附屬基因（例如vif、vp;r、vpu、nef、tat和rev)的存在而更 為復(fù)雜，所述附屬基因在慢病毒的體內(nèi)復(fù)制中起關(guān)鍵作用。
[000引慢病毒代表逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)的一個(gè)慢病毒（slow virus)屬，其包括 人免疫缺陷病毒化IV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、馬傳染性腦炎病毒化IAV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦 炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和貓免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可W無限地持續(xù)存 在于其宿主內(nèi)，并且在一生的感染期間W不同速度連續(xù)復(fù)制。病毒在其宿主內(nèi)的持續(xù)復(fù)制 取決于其避開宿主防御的能力。
[0009]重組整合型慢病毒載體的設(shè)計(jì)基于慢病毒的順式與反式作用序列的分離。非分裂 細(xì)胞中的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)需要慢病毒基因組中存在兩種順式作用序列：中屯、多嚷嶺序列kPPT)和 中屯、終止序列（CTS)。它們導(dǎo)致形成ミ鏈DNA結(jié)構(gòu)，稱為中屯、DNA"瓣(f lapΓ，該結(jié)構(gòu)使基因 進(jìn)入非分裂細(xì)胞(包括樹突細(xì)胞(DC))核內(nèi)的效率最大化(Zennou等，2000，Cell，101(2) 173-85;Arhel等，2007，EMB0 J，26(12):3025-37)。
[0010] 樹突細(xì)胞對(duì)于抗原遞呈而言具有重要作用，因?yàn)槠錁?gòu)成了 W遞呈抗原和起始免疫 應(yīng)答為主要功能的抗原遞呈細(xì)胞(APC)的主要類型。
[0011] 為產(chǎn)生免疫應(yīng)答，須由細(xì)胞將抗原蛋白加工成膚，所述膚通過主要組織相容性復(fù) 合物蛋白（MHC)在細(xì)胞表面顯示。循環(huán)的APC在引流淋己結(jié)內(nèi)將膚復(fù)合物遞呈至T細(xì)胞， 其在此處與T細(xì)胞受體相互作用并聯(lián)合共刺激信號(hào)一起激活T細(xì)胞。
[0012] 多項(xiàng)研究已顯示，使用慢病毒載體的接種導(dǎo)致DC進(jìn)行抗原呈遞和抗原特異性細(xì)胞 毒性T淋己細(xì)胞(CTL;CD8+T細(xì)胞）的強(qiáng)激活。因此，慢病毒載體已經(jīng)工程改造用于基因轉(zhuǎn)化 和免疫療法應(yīng)用。
[0013] 已通過移除LTR U3序列，產(chǎn)生完全不含原先在LTR中存在的病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子 序列的"自動(dòng)失活"載體，從而改善了慢病毒載體的安全性。
[0014] 可通過在不同的DNA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肥K 293T人培養(yǎng)細(xì)胞后由重組技術(shù)產(chǎn)生含有慢 病毒載體的慢病毒顆粒：
[001日](i)包裝質(zhì)粒，其表達(dá)至少GagJol Rev、化t，并在一些情況下表達(dá)轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的 包裝所必需的結(jié)構(gòu)和酶蛋白；
[0016] (ii)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所必需的表達(dá)盒和HIV順式作用因子； W及
[0017] (iii)編碼包膜的質(zhì)粒，在多數(shù)情況下是水泡性口炎病毒(VSV.G)的糖蛋白，該蛋 白允許形成能夠祀向多種細(xì)胞(尤其是主要組織相容性(MHC)抗原遞呈細(xì)胞(APC)，包括DC) 的混合顆粒(假型）。
[0018] 該方法能夠使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瞬時(shí)生產(chǎn)慢病毒顆粒載體。然而，也可通過向細(xì)胞基因 組中穩(wěn)定地插入包裝基因、原病毒編碼DNA和包膜基因來連續(xù)產(chǎn)生慢病毒顆粒載體。運(yùn)使得 能夠由細(xì)胞連續(xù)產(chǎn)生慢病毒顆粒載體而不需要瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。當(dāng)然，也可使用運(yùn)些方法的組合， 其中將一些DNA/質(zhì)粒整合至細(xì)胞基因組而其他的通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染提供。
[0019] 非整合型慢病毒載體正被設(shè)計(jì)嘗試用于降低與插入誘變事件相聯(lián)系的潛在癌發(fā) 生的風(fēng)險(xiǎn)，特別用于疫苗接種目的。
[0020] 在基于直接注射抗原編碼整合型慢病毒載體的疫苗接種中，表達(dá)相關(guān)抗原的轉(zhuǎn)導(dǎo) 的細(xì)胞成為引發(fā)的免疫應(yīng)答的祀標(biāo)并在數(shù)天或數(shù)周內(nèi)從接種疫苗的生物體中清除。
[0021] 此外，自動(dòng)失活的慢病毒載體中病毒啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的3/LTR的U3區(qū)域的缺 失限制了內(nèi)源性啟動(dòng)子激活的可能性。該缺失直接體現(xiàn)了 1998-1999年進(jìn)行的SCID-X1基因 治療試驗(yàn)所獲得的經(jīng)驗(yàn)，該試驗(yàn)使用基于莫羅尼病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體針對(duì)患有罕見類型 的X連鎖（SCID-X1基因）嚴(yán)重免疫缺陷疾病的兒童進(jìn)行（Cavazzana-Calvo等，2000， Science. ,288(5466) :669-72)。在該試驗(yàn)中，9名兒童中的4名由于莫羅尼衍生的慢病毒載 體在非?？拷?^102原癌基因處整合而發(fā)展出白血病（化。6；[]1-1367-413；[]1曰等，2008， J. Clin. Invest. ,118(9) :3132-3142)。運(yùn)表明，惡性腫瘤是病毒U3啟動(dòng)子/增強(qiáng)子接近LM02 原癌基因的結(jié)果。
[0022] 增強(qiáng)子是順式作用序列，其可相隔一定距離作為轉(zhuǎn)錄激活因子起作用。它們已經(jīng) 在病毒衍生的載體中廣泛采用，因?yàn)樗鼈兯坪鯇?duì)于在多種細(xì)胞類型，尤其是DC中獲得轉(zhuǎn)基 因強(qiáng)表達(dá)而言最高效（化innasamy，Qiinnasamy等，2000，Hum Gene Ther 11(13): 1901-9; Rouas等，2008，Cancer Gene Ther9(9):715-24;Kimura等，2007，M〇1 Ther 15(7):1390-9: Gr化等，2008,J Gene Med 10(1)21-32)。然而，考慮到插入誘變的安全問題，應(yīng)將運(yùn)類轉(zhuǎn)錄 增強(qiáng)子序列從慢病毒載體構(gòu)建體中刪除W破壞增強(qiáng)子鄰近效應(yīng)所產(chǎn)生的插入誘變風(fēng)險(xiǎn)。迄 今為止，該增強(qiáng)子鄰近效應(yīng)是最常見的插入突變機(jī)制并且是基因轉(zhuǎn)移后人或動(dòng)物腫瘤發(fā)生 事件的病例中描述的唯一效應(yīng)。
[0023] 因此，需要研發(fā)不包括病毒增強(qiáng)子的逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是慢病毒載體，其允許轉(zhuǎn)基 因編碼的免疫原性膚足量表達(dá)，如果可能，表達(dá)量與使用CMV啟動(dòng)子時(shí)觀察到的相當(dāng)。具體 地，存在對(duì)具有改進(jìn)效價(jià)的載體的需求。
[0024] 一項(xiàng)最近的研究報(bào)道了使用主要組織相容性復(fù)合物II型基因（II型MHCKKimura 等，2007，MolTher 15(7) :1390-9)和dectin-2基因化opes等，2008，J Virol 82(1):86-95) 來源的DC特異性啟動(dòng)子代替病毒啟動(dòng)子。Lop e s等使用的de c t i n-2基因啟動(dòng)子包含推定的 增強(qiáng)子和腺病毒保守序列（腺病毒啟動(dòng)子中的反向末端重復(fù)KBonkabara等，2001， J. Immunology, 167:6893-6900) Jimura等使用的MHC II型基因啟動(dòng)子不含任何已知增強(qiáng) 子。
[0025] 然而，在沒有增強(qiáng)子的情況下，發(fā)現(xiàn)II型MHC啟動(dòng)子無法在DC中提供足夠的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)。具體而言，與使用CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子所觀察到的免疫應(yīng)答相反，包含II型MHC啟動(dòng)子 的慢病毒載體未能在免疫活性巧7BL/6小鼠中引起免疫反應(yīng)。雖然在小鼠中注射后觀察到 了整合和持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但通過II型MHC啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的慢病毒載體無法刺激抗原特異 性CD8+細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞應(yīng)答，甚至在疫苗接種加強(qiáng)后也是如此。因此，運(yùn)些研究的作者 的結(jié)論是使用II型MHC啟動(dòng)子僅對(duì)于在基因替換療法中尋求持續(xù)表達(dá)的應(yīng)用而言有興趣， 但在免疫療法中沒有興趣。
[0026] 因此，對(duì)于針對(duì)抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，Π 型MHC啟動(dòng)子不是適當(dāng)?shù)穆《据d體啟動(dòng) 子。此外，dectin-2啟動(dòng)子具有樹突細(xì)胞特異性，其無法消除整合至其他非表達(dá)細(xì)胞類型中 的載體。而且，dectin-2啟動(dòng)子似乎含有增強(qiáng)子。因此，由于安全原因，dectin-2啟動(dòng)子不是 良好的慢病毒載體啟動(dòng)子。
[0027] 優(yōu)選地，在免疫治療中，慢病毒載體提供了有效的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，其引發(fā)所需的特異 性免疫應(yīng)答。運(yùn)需要APC(如樹突細(xì)胞)中的表達(dá)處于高水平。
[0028] 還優(yōu)選通過免疫應(yīng)答除去慢病毒載體所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞W提供更高水平的安全性。 即，針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可在宿主中引發(fā)足W除去慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的免疫應(yīng) 答。消除經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞消除了慢病毒載體在宿主中的持續(xù)存在，W及該載體的可能二級(jí)作 用。為了消除經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，在非樹突細(xì)胞中需要一定水平的表達(dá)W由免疫應(yīng)答進(jìn)行消除。
[0029] 同時(shí)，啟動(dòng)子應(yīng)通過原初和記憶T細(xì)胞的激活中設(shè)及的關(guān)鍵細(xì)胞（即樹突細(xì)胞)使 免疫刺激最大化并應(yīng)使導(dǎo)致惡性腫瘤的干細(xì)胞中的插入誘變和基因毒性的風(fēng)險(xiǎn)最小化。因 此，啟動(dòng)子應(yīng)在樹突和其他細(xì)胞中具有足夠高的活性，但不含增強(qiáng)子?；谶\(yùn)些標(biāo)準(zhǔn)，由于 強(qiáng)增強(qiáng)子的存在，病毒啟動(dòng)子(如CMV啟動(dòng)子)不是理想的。運(yùn)些標(biāo)準(zhǔn)歸納如下：
[0030] 1.樹突細(xì)胞中的高表達(dá)W誘導(dǎo)最大免疫應(yīng)答；
[0031] 2.在其他轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類型中w足夠的水平表達(dá)，該表達(dá)水平足w供于通過誘導(dǎo)的 免疫應(yīng)答進(jìn)行消除；W及
[0032] 3.缺少增強(qiáng)子元件W避免插入效應(yīng)。
[0033] 載體應(yīng)該能夠W高效價(jià)生成W最大化遞送和表達(dá)，而最小化污染。
[0034] 因此，本領(lǐng)域中存在對(duì)于改良載體的需要。本發(fā)明滿足本領(lǐng)域中的運(yùn)些需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0035] 本發(fā)明包括包含慢病毒載體的組合物W及制備和使用該載體的方法。在一個(gè)實(shí)施 方式中，本發(fā)明涵蓋包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列，優(yōu)選進(jìn)一步包含I 型血1C或的微球蛋白啟動(dòng)子的慢病毒載體。
[0036] 本發(fā)明包括生產(chǎn)慢病毒載體的方法，該方法包括向慢病毒載體中插入至少300個(gè) 核巧酸，優(yōu)選300-400、300-600或300-1100個(gè)核巧酸