HCII上游啟動(dòng)子序列
[0118] 本發(fā)明包括將β2πι、Ι型MHC(MHCI)或II型MHC(MHCII)啟動(dòng)子插入慢病毒載體中。本 文所用的巧2m上游啟動(dòng)子序列"是指在天然出現(xiàn)的的微球蛋白啟動(dòng)子中的Ets/ISRE結(jié)合位 點(diǎn)的緊鄰上游發(fā)現(xiàn)的序列的1100個(gè)堿基對(duì)或更少，如圖8A-B和圖9A-C所示。也參見Van den Elsen等，Current Opinion in Immunology 2004,16:67-75的圖 1，其通過引用納入本文。 本文所用的"I型MHC(MHCI)上游啟動(dòng)子序列"是指正好在天然出現(xiàn)的I型MHC啟動(dòng)子中的NF- 肺結(jié)合位點(diǎn)上游發(fā)現(xiàn)的序列的1100個(gè)堿基對(duì)或更少，如圖8A-B和圖9A-C所示。和I型MHC (MHCI)上游啟動(dòng)子序列的示例示于圖7。本文所用的"II型Μ肥(MHCII)上游啟動(dòng)子序列"是 指正好在天然出現(xiàn)的II型MHC啟動(dòng)子中的SXY模塊上游發(fā)現(xiàn)的序列的1100個(gè)堿基對(duì)或更少， 如圖8Α-Β和圖9A-C所不。
[0119] 在多個(gè)實(shí)施方式中，上游啟動(dòng)子序列包含少于I型MHC、II型Μ肥或的微球蛋白上游 啟動(dòng)子序列的 1100、1000、900、800、700、600、550、500、450、400或 350個(gè)核巧酸。
[0120] 在多個(gè)實(shí)施方式中，上游啟動(dòng)子序列包含至少I型MHC、II型Μ肥或的微球蛋白上游 啟動(dòng)子序列的 300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、500、600、700、800、 900或1000個(gè)核巧酸。
[0121] 在多個(gè)實(shí)施方式中，上游啟動(dòng)子序列包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng) 子序列的 300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、或500至305、310、315、 320、325、330、335、350、357、400、450、550、600、700、800、900、1000、或1100個(gè)核巧酸(在所 有可能的范圍組合內(nèi)）。優(yōu)選地，上游啟動(dòng)子序列包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟 動(dòng)子序列的300-400、300-500、300-600、300-700、或300-1100個(gè)核巧酸。最優(yōu)選地，上游啟 動(dòng)子序列包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列的300-335個(gè)核巧酸。
[0122] 優(yōu)選地，B2M上游啟動(dòng)子序列包含核巧酸序列： 「01731
[0124] 優(yōu)選地，I型Μ肥上游啟動(dòng)子序列包含HLA-A2、HLA-B7、HLA-CW5、HLA-E或HLA-G上游 啟動(dòng)子序列。
[01巧]優(yōu)選地，I型MHC上游啟動(dòng)子序列包含沈Q ID Ν0:2-7或沈Q ID Ν0:29-34中任意的 核巧酸序列。
[0126] 優(yōu)選地，I型MHC上游啟動(dòng)子序列包含核巧酸序列：
[0127]



[0149] 在一些實(shí)施方式中，載體包含SEQ ID N0:37-46中的任意。
[0150] 慢病毒載體的產(chǎn)生
[0151 ] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括一種方法，該方法包括將I型MHC、II型MHC或的微 球蛋白上游啟動(dòng)子序列插入慢病毒載體。該方法還可包括插入本文中所述任意其他核酸元 件，如DNA瓣序列。
[0152] 本發(fā)明包括生產(chǎn)慢病毒載體的方法，該方法包括將至少I型Μ肥、Π 型Μ肥或的微球 蛋白上游啟動(dòng)子序列的 300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、500、600、 700、800、900或1000個(gè)核巧酸插入慢病毒載體。
[0153] 在多個(gè)實(shí)施方式中，上游啟動(dòng)子序列包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng) 子序列的少于 1100、1000、900、800、700、600、550、500、450、400或 350個(gè)核巧酸。
[0154] 本發(fā)明包括生產(chǎn)慢病毒載體的方法，該方法包括將I型Μ肥、II型Μ肥或的微球蛋白 上游啟動(dòng)子序列的 300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、或 500 至 305、 310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、550、600、700、800、900、1000、或1100個(gè)核巧 酸(在所有可能的范圍組合內(nèi)）插入慢病毒載體。優(yōu)選地，上游啟動(dòng)子序列包含I型MHC、II型 MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列的300-400、300-500、300-600、300-700、或300-1100個(gè)核 巧酸。
[0155] 最優(yōu)選地，上游啟動(dòng)子序列包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列的 300-335個(gè)核巧酸。
[0156] 優(yōu)選地，將I型MHC、II型Μ肥或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列插入包含I型Μ肥或的微 球蛋白啟動(dòng)子的慢病毒載體。上游啟動(dòng)子序列可W是與啟動(dòng)子相同或相反的取向。
[0157] 本發(fā)明包括生產(chǎn)慢病毒載體的方法，該方法包括將至少I型Μ肥、Π 型Μ肥或的微球 蛋白上游啟動(dòng)子序列的 300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、500、600、 700、800、900或1000個(gè)核巧酸和I型MHC或的微球蛋白啟動(dòng)子插入慢病毒載體。
[0158] 在多個(gè)實(shí)施方式中，上游啟動(dòng)子序列包含少于I型MHC、II型Μ肥或的微球蛋白上游 啟動(dòng)子序列的 1100、1000、900、800、700、600、550、500、450、400或 350個(gè)核巧酸。
[0159] 本發(fā)明包括生產(chǎn)慢病毒載體的方法，該方法包括將I型Μ肥、II型Μ肥或的微球蛋白 上游啟動(dòng)子序列的 300、305、310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、或 500 至 305、 310、315、320、325、330、335、350、357、400、450、550、600、700、800、900、1000、或1100個(gè)核巧 酸(在所有可能的范圍組合內(nèi)）和I型MHC或的微球蛋白啟動(dòng)子插入慢病毒載體。優(yōu)選地，上 游啟動(dòng)子序列包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列的300-400、300-500、 300-600、300-700、或300-1100個(gè)核巧酸。最優(yōu)選地，上游啟動(dòng)子序列包含1型順(：、11型血10 或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列的300-335個(gè)核巧酸。
[0160] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在插入I型MHC或的微球蛋白啟動(dòng)子之前將I型MHC、II型MHC或 的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列插入慢病毒載體。
[0161] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在插入I型MHC或的微球蛋白啟動(dòng)子之后將I型MHC、II型MHC或 的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列插入慢病毒載體。
[0162] 在一個(gè)實(shí)施方式中，將I型MHC、II型Μ肥或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列和I型Μ肥或 的微球蛋白啟動(dòng)子一起插入慢病毒載體。
[0163] 在一個(gè)實(shí)施方式中，的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列W與I型MHC或的微球蛋白啟動(dòng)子 相同的取向插入上游。
[0164] 在一個(gè)實(shí)施方式中，I型MHC或II型MHC上游啟動(dòng)子序列W與I型MHC或的免疫球蛋 白啟動(dòng)子相同的取向插入上游。
[01化]優(yōu)選地，上游啟動(dòng)子序列包含的微球蛋白、HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E或HLA- G上游啟動(dòng)子序列并且該啟動(dòng)子是的微球蛋白、HLA-A2、HLA-B7、HLA-Cw5、HLA-E或HLA-G啟 動(dòng)子。所有的組合單獨(dú)被認(rèn)為是本發(fā)明的部分。
[0166] 優(yōu)選地，上游啟動(dòng)子序列包含包含SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:7或569 10顯:27- SEQ ID NO:36中任意的核巧酸序列。
[0167] 慢病毒顆粒載體的產(chǎn)生
[0168] 本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)慢病毒顆粒載體的方法，該載體含有I型Μ肥、II型MHC或的 微球蛋白上游啟動(dòng)子序列。因此，本發(fā)明包括一種慢病毒顆粒載體，該載體包含I型MHC、II 型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列。慢病毒顆粒載體(或慢病毒載體顆粒)包括與病毒蛋 白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的慢病毒載體。
[0169] 插入I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列可增加載體的效價(jià)。
[0170] 根據(jù)該方法的一個(gè)實(shí)施方式，顆粒載體在轉(zhuǎn)化有DNA質(zhì)粒的宿主細(xì)胞中獲得。
[0171] 運(yùn)種DNA質(zhì)粒可包含：
[0172] -細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)（如pUCori);
[0173] -用于選擇的抗生素抗性基因（如KanR);且更具體地：
[0174] --種慢病毒載體，該載體包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列。
[0175] 本發(fā)明允許產(chǎn)生重組載體顆粒，其包括W下步驟：
[0176] i)使用慢病毒載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0177] ii)使用包裝質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)所述宿主細(xì)胞，所述包裝質(zhì)粒載體含有編碼反 轉(zhuǎn)錄病毒(優(yōu)選慢病毒）的至少結(jié)構(gòu)和聚合酶蛋白的病毒DNA序列;運(yùn)類包裝質(zhì)粒在本領(lǐng)域 中已有描述(Dull等，1998，J Virol,72(ll):8463-71;Zuffer巧等，1998，J Virol 72(12): 9873-80)。
[0178] iii)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞W使所述慢病毒載體表達(dá)并包裝成慢病毒載體顆 粒；W及
[0179] iv)收獲所述培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中由步驟iii)的表達(dá)和包裝所得到的慢病毒載體顆 粒。
[0180] 用包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞可W是穩(wěn)定包裝細(xì)胞系。因此，該方法可包括：
[0181 ] i)使用慢病毒載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系；
[0182] ii)培養(yǎng)該細(xì)胞系W使所述慢病毒載體表達(dá)并包裝成慢病毒載體顆粒；W及
[0183] iii)收獲培養(yǎng)的培養(yǎng)的細(xì)胞系中由步驟ii)的表達(dá)和包裝所得的慢病毒載體顆 粒。
[0184] 基于不同原因，制備獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的假型（即增加或代替特定顆粒包膜 蛋白）可能是有幫助的。例如，具有不同的包膜蛋白w區(qū)分重組顆粒與天然顆粒或其他重組 顆?？赡苁怯欣摹Ｔ谝呙缃臃N策略中，當(dāng)患者已經(jīng)發(fā)展出針對(duì)慢病毒的免疫時(shí)，假型顆粒 載體更有可能逃避免疫系統(tǒng)。如果類似的顆粒載體的連續(xù)注射是使患者對(duì)疾病產(chǎn)生免疫所 必需的，那么運(yùn)是特別有幫助的。
[0185] 為制備本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的假型，還可使用編碼病毒包膜蛋白（優(yōu)選VSV-G 包膜蛋白）的一種或數(shù)種包膜DNA質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。
[0186] 合適的宿主細(xì)胞優(yōu)選是人培養(yǎng)細(xì)胞系，例如HEK細(xì)胞系。
[0187] 用于生產(chǎn)載體顆粒的方法可在宿主細(xì)胞中進(jìn)行，其基因組已使用如下一種或多種 組分穩(wěn)定轉(zhuǎn)化:慢病毒載體DNA序列、包裝基因和包膜基因。運(yùn)類DNA序列可被視作與本發(fā)明 的原病毒載體類似，包含額外的啟動(dòng)子W允許載體序列轉(zhuǎn)錄并提高顆粒生產(chǎn)率。
[0188] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，還對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其能夠在培養(yǎng)基中W連續(xù)的方式 生產(chǎn)病毒顆粒，同時(shí)整個(gè)細(xì)胞不發(fā)生溶脹或死亡。關(guān)于用于生產(chǎn)病毒顆粒的運(yùn)類技術(shù)，可參 見Strang等，2005，J Virol 79(3):1165-71;Relander等，2005，M〇口her 11(3):452-9; Stewa;rt等，2009，Gene Ther ,16(6) :805-14;和Stua;rt等，2011，Hum gene Ther(在版）。
[0189] 本發(fā)明的目的由用慢病毒顆粒載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞組成。
[0190] 慢病毒顆粒載體可包括W下元件，如前文所定義：
[0191] -cPPT/CTS多核巧酸