化A-A2上游啟動(dòng)子序列病毒效價(jià)增加了3 倍;而較小的（322bp)HLA-A2上游序列對HLA-A2啟動(dòng)子有負(fù)面影響（圖10)。
[0074] 將化A-B7的較大上游啟動(dòng)子序列（5Ubp)插入慢病毒載體，W與HLA-B7啟動(dòng)子相 同的取向并位于其上游。在運(yùn)種情況中，與較小的（352bp)HLA-B7上游序列相比，較大的 化A-B7上游啟動(dòng)子序列還增加病毒效價(jià)2-3倍（圖10)。將化A-E的較大上游啟動(dòng)子序列 (1047bp)插入慢病毒載體，W與HLA-E啟動(dòng)子相同的取向并位于其上游。與較小的（328bp) 上游序列相比，較大的上游啟動(dòng)子序列消除了病毒效價(jià)的增加(圖10)。
[0075] 將化A-DRa的較大上游啟動(dòng)子序列（52化P)插入慢病毒載體，W與化A-DRa啟動(dòng)子 相同的取向并位于其上游。在運(yùn)種情況中，與較小的（356bp)HLA-DRa上游序列相比，較大的 HLA-DRa上游啟動(dòng)子序列對病毒效價(jià)有相同的影響（圖10)。
[0076] 研究了插入多個(gè)上游啟動(dòng)子序列的影響。向慢病毒載體的的m啟動(dòng)子的上游、下游 W及上游和下游插入化A-E上游啟動(dòng)子序列。雖然插入上游導(dǎo)致效價(jià)的3-4倍的增加，插入 下游對效價(jià)沒有影響并且同時(shí)插入上游和下游導(dǎo)致病毒效價(jià)的降低。
[0077] 因此，本發(fā)明的主要目的是包含或MHCI或MHCII上游啟動(dòng)子序列的慢病毒載 體，W及制備和使用運(yùn)種載體的方法。
[0078] 慢病毒載體
[0079] 在本發(fā)明范圍內(nèi)，"慢病毒載體"指非復(fù)制型載體，其供于使用包含順式作用慢病 毒RNA或DNA序列的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，且需要W反式形式提供的慢病毒蛋白（例如Gag、 Pol和/或Env)。慢病毒載體含有順式作用包裝序列，但缺少功能性Gag、Pol和Env蛋白的表 達(dá)。慢病毒載體可WRNA或DNA分子的形式存在，運(yùn)取決于所述逆轉(zhuǎn)錄載體的產(chǎn)生或發(fā)展階 段。
[0080] 慢病毒載體可W是重組DNA分子的形式，如質(zhì)粒。慢病毒載體可W是慢病毒顆粒載 體的形式，如慢病毒和其他蛋白質(zhì)的復(fù)合物中的RNA分子。通常，對應(yīng)于修飾或重組的慢病 毒顆粒的慢病毒顆粒載體包含由兩個(gè)單鏈RNA拷貝組成的基因組。運(yùn)些RNA序列可通過從插 入宿主細(xì)胞基因組的雙鏈DNA序列(原病毒載體DNA)轉(zhuǎn)錄獲得，或者可由轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中 質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒載體DNA)的瞬時(shí)表達(dá)獲得。
[0081] 慢病毒載體來源于慢病毒，尤其是人免疫缺陷病毒化IV-1或HIV-2)、猿免疫缺陷 病毒(SIV)、馬傳染性腦炎病毒化IAV)、山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和貓免疫缺陷病毒(FIV)，其經(jīng)修飾W除去設(shè)及致病性的遺傳決定簇并導(dǎo)入對獲得治療效 果有用的新決定簇。
[0082] 運(yùn)類載體基于順式和反式作用序列的分離。為制備復(fù)制缺陷型載體，可刪除反式 作用序列（如gag、P〇l、化t、rev和env基因）并使用編碼轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒代替。
[0083] 非分裂細(xì)胞中的有效整合與復(fù)制通常需要慢病毒基因組中屯、存在兩種順式作用 序列：中屯、多嚷嶺序列（cPPT)和中屯、終止序列（CTS)。運(yùn)導(dǎo)致形成Ξ鏈DNA結(jié)構(gòu)，稱為中屯、 DNA"瓣(flap)"，其作為對核孔處的整合前復(fù)合物脫包被并將表達(dá)盒有效導(dǎo)入非分裂細(xì)胞 (如樹突細(xì)胞)的細(xì)胞核的信號。
[0084] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含稱為cPPT/CTS序列的中屯、多嚷嶺序列和中屯、 終止序列，具體如歐洲專利申請EP 2169073所述。
[0085] 其它序列通常W順式出現(xiàn)，如參與載體原病毒DNA序列整合到宿主細(xì)胞基因組的 長末端重復(fù)化TR)。可通過使LTR序列突變W獲得載體，例如在所述LTR的結(jié)構(gòu)域U3中突變 (AU3)(MiyosM Η等，1998，J Virol.72(10):8150-7;Zuffer巧等，1998，J Virol 72(12): 9873-80)。
[0086] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含LTR序列的慢病毒載體，優(yōu)選具有移除了3' LTR中啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的突變的U3區(qū)域（Δ U3)。
[0087] 整合包裝序列Ψ (psi) W支持多核巧酸序列衣殼化成載體顆粒化essler等，2007， Leukemia,21(9):1859-74;Paschen等，2004，Cance;r Immunol Immunother 12(6):196- 203) ο
[0088] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含慢病毒包裝序列W(psi)和I型MHC、II型MHC 或的微球蛋白上游啟動(dòng)子序列的慢病毒載體。
[0089] 其它額外的功能性序列，如轉(zhuǎn)運(yùn)RNA-結(jié)合位點(diǎn)或引物結(jié)合位點(diǎn)（PBSM±撥鼠后 調(diào)控元件(WPRE)也可優(yōu)選包含在本發(fā)明的慢病毒載體多核巧酸序列中，W得到轉(zhuǎn)基因在體 內(nèi)更穩(wěn)定的表達(dá)。
[0090] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含PBS的慢病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā) 明包括包含WPRE和/或IRES的慢病毒載體。
[0091] 因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，慢病毒載體包含I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游 啟動(dòng)子序列、至少一種cPPT/CTS序列、一種Ψ序列、一種(優(yōu)選巧巾化TR序列和包括在啟動(dòng)子 (尤其是I型MHC或的微球蛋白啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)錄控制下的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒。
[0092] 轉(zhuǎn)基因
[0093] 本發(fā)明包括含有轉(zhuǎn)基因的慢病毒載體。在本發(fā)明范圍內(nèi)，"轉(zhuǎn)基因"指待用慢病毒 載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的慢病毒載體中的核酸序列，其正常情況下不存在于細(xì)胞中。慢病毒用于將該序 列導(dǎo)入經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"不包括促進(jìn)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的那些載體序列。轉(zhuǎn)基因可W 是來自另一種生物體的核酸序列?；蛘?，轉(zhuǎn)基因可w是來自相同生物體的核酸序列，但具有 控制其表達(dá)的不同調(diào)控序列。轉(zhuǎn)基因可W是正義或反義核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施 方式，轉(zhuǎn)基因序列編碼免疫原性多膚。
[0094] 優(yōu)選地，免疫原性多膚是病毒、寄生蟲、細(xì)菌或真菌的。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫原 性多膚是腫瘤抗原。
[0095] 該免疫原性多膚優(yōu)選包括來自感染性疾病病原的一個(gè)或多個(gè)表位，例如來自HIV 的Gag Jo 1和/或化f蛋白的抗原。
[0096] 也可由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因編碼幾種表位形成多表位。
[0097] 在特定實(shí)施方式中，運(yùn)類表位來源于腫瘤中鑒定到的祀抗原，并可通過獲得針對 其本身的細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的方式進(jìn)行選擇。祀抗原是在本領(lǐng)域中已有詳細(xì)記錄，可相對 于數(shù)種腫瘤類型進(jìn)行選擇，且具體是黑色素瘤或癌中，包括腎癌、膀脫癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳 腺癌、白血病、和淋己瘤。
[009引 B2M和MHCI啟動(dòng)子
[0099] 本發(fā)明包括將腳η或I型MHC(M肥I)啟動(dòng)子插入慢病毒載體中。如本文中所用/'I型 MHC(MHCI)啟動(dòng)子"包括天然產(chǎn)生或合成的I型MHC啟動(dòng)子。術(shù)語"I型MHC啟動(dòng)子"并不包括0 2m啟動(dòng)子。
[0100] 天然產(chǎn)生的MHCI和的m啟動(dòng)子
[0101] 天然產(chǎn)生的MHCI啟動(dòng)子的示例是HLA-A2、HLA-B7、HLA-CW5、HLA-E、HLA-G基因啟動(dòng) 子。運(yùn)些天然產(chǎn)生的MHCI啟動(dòng)子一般從編碼I型MHC蛋白的基因的啟動(dòng)子區(qū)域中克隆或復(fù) 審IJ，后稱為推定的編碼，如基因組數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)（如NCBI多核巧酸數(shù)據(jù)庫http://WWW.ncbi . nlm.nih. gov/guide/dna-rna)。的111和I型Μ肥蛋白都進(jìn)入主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)。優(yōu)選的啟動(dòng)子列于美國專利公開號2014/0120132-Α1，其通過引用納入本文。
[0102] 運(yùn)些基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)于幾乎所有細(xì)胞類型中。MHCI蛋白一般存在于白細(xì)胞 膜的表面處，其中它們與的-微球蛋白W2m)蛋白結(jié)合。運(yùn)些相關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)的作用是將內(nèi)源 性來源的膚遞呈至CD8巧細(xì)胞。因此，其在抗原特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生過程中起核屯、作用。 因?yàn)槎嗄陙淼膍和Μ肥蛋白已得到了廣泛研究和描述，所W其基因已被成熟表征并可使用序 列比對工具（如BLAST法）良好地檢測（Altschul，S.F.等（1990) .Basic local alignment search tool.(局部比對捜索基本工具)J. Mol.Biol. 215(3) :403-410)。
[0103] 的m和I型MHC啟動(dòng)子也共有在樹突細(xì)胞中被強(qiáng)激活的能力，W及，在大多數(shù)其它人 體組織中W較低強(qiáng)度激活的能力。
[0104] 本發(fā)明的的m和I型MHC啟動(dòng)子還可含有其它調(diào)控元件，如一個(gè)或多個(gè)Spl和ETs結(jié) 合位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，I型MHC啟動(dòng)子含有2個(gè)Spl結(jié)合位點(diǎn)和1個(gè)Ets結(jié)合位點(diǎn)。在 其他實(shí)施方式中，Apl和/或Ap2位點(diǎn)也包含在I型MHC啟動(dòng)子中。
[0105] 優(yōu)選的 I 型 Μ肥啟動(dòng)子是人 HLA-A2、HLA-B7、HLA-05、HLA-E、HLA-F 和 HLA-G 啟動(dòng)子。
[0106] 合成的的m和I型MHC啟動(dòng)子
[0107] 02m和I型MHC啟動(dòng)子也可W是合成的。合成的的m和I型Μ肥啟動(dòng)子包括使用分子生 物學(xué)技術(shù)組裝的m和I型Μ肥啟動(dòng)子的單獨(dú)組分合成的啟動(dòng)子或者使用分子生物學(xué)技術(shù)由天 然產(chǎn)生的的m和I型MHC啟動(dòng)子衍生的啟動(dòng)子。
[010 引 ISRE
[0109] 02m和MHC型基因的轉(zhuǎn)錄通常由2種主要調(diào)控元件介導(dǎo)：干擾素刺激應(yīng)答元件 (1536)和5乂￥模塊(包括胖/5心1乂2/位點(diǎn)〇^及￥/增強(qiáng)子8調(diào)控元件）（參見圖1)。還參見￥曰11 den Elsen，Immunogenetics(1998)48:208-211。
[0110] 運(yùn)些調(diào)控啟動(dòng)子元件位于延伸自大約轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游第-220至-95核巧酸的區(qū) 域中。其介導(dǎo)的m和I型血1C基因的組織特異性和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。
[0111] 的m和I型MHC基因啟動(dòng)子的ISRE通常含有干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF)家族成員的結(jié)合 位點(diǎn)。因此，I型MHC啟動(dòng)子的一個(gè)特性是結(jié)合干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF)家族成員。運(yùn)可由，例 如，凝膠遷移試驗(yàn)驗(yàn)證。
[0112] NF-κΒ結(jié)合位點(diǎn)
[0113] 另一種調(diào)控元件，增強(qiáng)子A(含有細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)的結(jié)合位點(diǎn))存在于大 多數(shù)情況中。因此，的m和I型Μ肥啟動(dòng)子的一個(gè)特性是結(jié)合細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子kB(NF-kB)。運(yùn)可 由，例如，凝膠遷移試驗(yàn)驗(yàn)證。
[0114] SXY 模塊
[0115] 除了 ISRE，f32m和I型MHC啟動(dòng)子通常共有另一組保守的上游序列基序，由4種調(diào)控 元件組成：S或W盒、X1/CREX2盒或位點(diǎn)a、W及Y盒或增強(qiáng)子B，它們一起被稱為SXY模塊。該 SXY模塊通常與含有調(diào)節(jié)因子X(RFX;由RFX5、RFXB/ANK和RFXAP組成）、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋 白（CREB)/激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)和作為增強(qiáng)體驅(qū)動(dòng)運(yùn)些基因反式激活的核因子Y(NFY)的多 蛋白復(fù)合物協(xié)同地結(jié)合。因此，的m和I型Μ肥啟動(dòng)子的一個(gè)特性是結(jié)合運(yùn)些因子。運(yùn)可由，例 如，凝膠遷移試驗(yàn)驗(yàn)證。
[0116] 相反地，Π 型Μ肥啟動(dòng)子不顯示增強(qiáng)子A或ISRE元件(Van den Elsen,P.J等，1998， Immunogenetics . 48:208-221)。此外，如使用從裸淋己細(xì)胞綜合征(BLS; -種由于RFX亞基 之一或CIITA中發(fā)生突變產(chǎn)生的重癥聯(lián)合免疫缺陷）患者建立的細(xì)胞系進(jìn)行的研究所示，發(fā) 現(xiàn)II型MHC基因調(diào)控中的RFX和CIITA是至關(guān)重要的。此外，缺少CIITA或RFX亞基之一分別影 響MHC增強(qiáng)體的功能和組裝，導(dǎo)致缺少II型MHC且I型MHC轉(zhuǎn)錄水平下降（Van den Elsen， P.J.等，2004,Current Opinion in Immunology，16:67-75)。
[0117] 的M和MHCIW及M