的I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游 啟動子序列。
[0037] 優(yōu)選地，上游啟動子序列插入I型Μ肥或的微球蛋白啟動子的上游。最優(yōu)選地，上游 啟動子W與I型MHC或的微球蛋白啟動子相同的取向插入。
[0038] 在一些實施方式中，上游啟動子序列是I型MHC上游啟動子序列。在一些實施方式 中，上游啟動子序列是的微球蛋白上游啟動子序列，優(yōu)選包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 27。
[0039] 在一些實施方式中，該啟動子是I型MHC啟動子。在一些實施方式中，該啟動子是的 微球蛋白啟動子。
[0040] 本發(fā)明包括包含至少300個核巧酸，優(yōu)選300-400、300-600或300-1100個核巧酸的 I型MHC、II型MHC或的微球蛋白上游啟動子序列的慢病毒載體。
[0041 ]優(yōu)選地，上游啟動子序列在I型MHC或的微球蛋白啟動子的上游。最優(yōu)選地，上游啟 動子與I型MHC或的微球蛋白啟動子的取向相同。
[0042] 在一些實施方式中，上游啟動子序列是I型MHC上游啟動子序列。在一些實施方式 中，上游啟動子序列是的微球蛋白上游啟動子序列，優(yōu)選包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 27。在一些實施方式中，該啟動子是I型MHC啟動子。在一些實施方式中，該啟動子是的微球 蛋白啟動子。
[0043] 優(yōu)選地，I型Μ肥啟動子是HLA-A2啟動子、HLA-B7啟動子或HLA-E啟動子。
[0044] 優(yōu)選地，上游啟動子序列是HLA-A2、HLA-B7、或HLA-E、或HLA-DRa上游啟動子序列。
[0045] 優(yōu)選地，慢病毒載體包含慢病毒cPPT/CTS序列。優(yōu)選地，慢病毒載體包含慢病毒Ψ (psi)序列。
[0046] 本發(fā)明包括包含本發(fā)明的慢病毒載體的分離的宿主細胞。本發(fā)明包括用作藥物或 疫苗，尤其是用于基因療法的本發(fā)明的慢病毒載體。
[0047] 在優(yōu)選的實施方式中，上游啟動子序列包含W下任意一種的核巧酸序列：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、沈Q ID NO: 27、沈Q ID N0:28、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID NO:33、沈Q ID NO:34、沈Q ID NO:35或沈Q ID NO:36。
【附圖說明】
[004引圖1A、B和C顯示W(wǎng)下示意圖：（A)的m啟動子（啟動子區(qū)域和上游染色體區(qū)域），（B)I 型MHC啟動子，和(C)n型MHC啟動子。
[0049] 圖2顯示了在各種啟動子上游克隆有或沒有的m上游啟動子序列的各種慢病毒構(gòu) 建體的產(chǎn)率。上游啟動子序列通過融合PCR克隆到各種啟動子的上游。所得的慢病毒載 體產(chǎn)生并用于轉(zhuǎn)導HEK-293T細胞，并且通過?？?qPCR來評價經(jīng)轉(zhuǎn)導的細胞的百分比。
[0050] 圖3顯示了在各種啟動子上游W正向或反向取向克隆有或沒有的m上游啟動子序 列的各種慢病毒構(gòu)建體的產(chǎn)率。的m上游啟動子序列通過融合PCRW正向（5'-3'）或反向 (3'-5'）取向克隆到各種啟動子的上游。所得的慢病毒載體產(chǎn)生并用于轉(zhuǎn)導肥1(-2931'細胞， 并且通過?？?qPCR來評價經(jīng)轉(zhuǎn)導的細胞的百分比。
[0051] 圖4顯示了在轉(zhuǎn)基因（GFP)下游W正向或反向取向克隆有或沒有的m上游啟動子序 列的各種慢病毒構(gòu)建體的產(chǎn)率。的m上游啟動子序列W正向（5'-3'）或反向（3'-5'）取向克 隆到攜帶各種啟動子的慢病毒構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因（GFP)的下游。所得的慢病毒載體產(chǎn)生并用 于轉(zhuǎn)導HEK-293T細胞，并且通過專口 qPCR來評價經(jīng)轉(zhuǎn)導的細胞的百分比。
[0052] 圖5顯示了在原病毒序列外部W正向或反向取向克隆有巧Ij質(zhì)粒主鏈中）或沒有0 2m上游啟動子序列的各種慢病毒構(gòu)建體的產(chǎn)率。上游啟動子序列W正向（5'-3'）或反向 (3'-5'）取向克隆到攜帶各種啟動子的原病毒構(gòu)建體W外（質(zhì)粒主鏈內(nèi)）。所得的慢病毒載 體產(chǎn)生并用于轉(zhuǎn)導HEK-293T細胞，并且通過?？?qPCR來評價經(jīng)轉(zhuǎn)導的細胞的百分比。
[0053] 圖6顯示了在各種啟動子上游W正向或反向取向克隆有或沒有HLA-E上游啟動子 序列的各種慢病毒構(gòu)建體的產(chǎn)率。HLA-E上游啟動子序列通過融合PCRW正向（5'-3'）或反 向（3'-5'）取向克隆到各種啟動子的上游。所得的慢病毒載體產(chǎn)生并用于轉(zhuǎn)導皿1(-2931'細 胞，并且通過FACS分析來評價經(jīng)轉(zhuǎn)導的細胞的百分比。
[0054] 圖7顯示了的-微球蛋白（569 10顯：1)和1型順"569 10顯：2-7)上游啟動子序 列的核巧酸序列。顯示了共有序列（SEQ ID NO:8)。
[0化引圖84-8顯示了的-微球蛋白（569 10^:40)、1型順(：（沈9 10^:37-39)、和11型 MHC (SEQ ID NO: 41)啟動子和短上游啟動子序列的核巧酸序列。顯示了 κΒ、ISRE和SXY模塊 的位置。
[0化6] 圖94-(：顯示了的-微球蛋白（569 10^:45)、1型血1(：(沈9 10^:42-44)、和11型 MHC(SEQ ID Ν0:46)啟動子和長上游啟動子序列的核巧酸序列。顯示了kB、ISRE和SXY模塊 的位置。
[0化7] 圖10顯示了具有W正向取向位于其天然啟動子上游的短或長i32-m、HLA-A2、HLA- B7、HLA-E或HLA-DRa上游啟動續(xù)序列的各種慢病毒構(gòu)建體的產(chǎn)率。
[0化引發(fā)明詳述
[0059]檢測了 I型MHC、II型Μ肥或的微球蛋白上游啟動子序列對慢病毒載體效價的作用。 上游啟動子序列位于在的微球蛋白和I型Μ肥啟動子中發(fā)現(xiàn)的化s/ISRE和NF-肺結(jié)合位點的 上游（圖1)。上游啟動子序列位于在II型血1C啟動子中發(fā)現(xiàn)的SXY模塊的上游（圖1)。人的-微 球蛋白（02m)啟動子與I型MHC啟動子有一定的相似性，因為其包含ISRE，盡管是在單個NF- Kb結(jié)合位點的上游。
[0060] 的m和I型MHC啟動子的上游啟動子序列在核巧酸水平上顯示出一些相似性（圖7)。 選擇巧巾上游啟動子序列的m和HLA-E用于分析。
[0061 ] 首先，將的上游啟動子序列插入慢病毒載體，W與和MHCI啟動子化A-A2、 化A-B7和HLA-E相同的取向并位于它們的上游。為了進行比較，將的m的上游啟動子序列插 入慢病毒載體，W與泛素化BC)基因啟動子、CMV啟動子或MHCII啟動子化LA-DRa)相同的取 向并位于它們的上游。在運些載體中，啟動子驅(qū)動綠色巧光蛋白（GFP)的表達。
[0062] 為尋找表達，通過將殼體化質(zhì)粒和提供VSV.G包膜的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染皿K-293T細胞來 對載體進行包裝，基本如化Idini等，1996，Science272:263-7中所述。然后用不同載體的顆 粒來轉(zhuǎn)化HEK-293T細胞。在含有所有載體的細胞中檢測表達。
[0063] 向帶有腳ii、HLA-A2、HLA-B7或HLA-E啟動子的慢病毒載體中加入上游啟動子序 列導致病毒效價大約2-5倍的增加。相反，向帶有CMV啟動子、UBC啟動子或HLA-A2啟動子的 慢病毒載體中加入的m上游啟動子序列證明對效價的影響很?。▓D2)。因此，的m上游啟動子 序列可從含有的m或MHCI啟動子的慢病毒載體中增加效價。
[0064] 接著，將02m的上游啟動子序列插入慢病毒載體，W與02m和MHCI啟動子化A-A2、 化A-B7和HLA-E相反的取向并位于它們的上游。為了進行比較，將的m的上游啟動子序列插 入慢病毒載體，W與泛素化BC)基因啟動子、CMV啟動子或MHCII啟動子化LA-DRa)相反的取 向并位于它們的上游。W與HLA-A2、HLA-B7或化A-E相反的取向向它們的上游加入的m上游 啟動子序列至慢病毒載體不會導致病毒效價的增加（圖3)。事實上，幾種帶有W相反取向插 入的的m上游啟動子序列的慢病毒載體顯示效價降低。因此，由的m上游啟動子序列導致的 慢病毒載體的效價增加是依賴于取向的。
[0(?日]接著，將的m的上游啟動子序列W與的m和Μ肥I啟動子HLA-A2、HLA-B7和HLA-E相同 或相反的取向插入慢病毒載體的轉(zhuǎn)基因下游。為了進行比較，將的m的上游啟動子序列W與 泛素(UBC)基因啟動子、CMV啟動子或MHCII啟動子化LA-DRa)相同或相反的取向插入慢病毒 載體轉(zhuǎn)基因的下游。W與02m、HLA-A2、HLA-B7或HLA-E啟動子相同的取向向轉(zhuǎn)基因下游加入 02m上游啟動子序列僅導致病毒效價的少許增加（圖4)。因此，由的m上游啟動子序列導致的 慢病毒載體的效價增加是依賴于位置的。
[0066] 接著，將的m的上游啟動子序列W與的m和Μ肥I啟動子HLA-A2、HLA-B7和HLA-E相同 或相反的取向插入慢病毒載體的LTR-LTR區(qū)域外側(cè)。為了進行比較，將的m的上游啟動子序 列W與泛素化BC)基因啟動子、CMV啟動子或MHCII啟動子化LA-DRa)相同或相反的取向插入 慢病毒載體LTR-LTR區(qū)域外側(cè)。W相同或相反取向加入將的m上游啟動子序列加入LTR-LTR 區(qū)域外側(cè)導致病毒效價沒有明顯差異（圖5)。因此，由的m上游啟動子序列導致的來自慢病 毒載體的效價增加依賴于其在載體中LTR之間的存在。
[0067] 接著，將HLA-E的上游啟動子序列插入慢病毒載體，W與的m和MHCI啟動子HLA-A2、 化A-B7和HLA-E相同或相反的取向并位于它們的上游。為了進行比較，將HLA-E的上游啟動 子序列插入慢病毒載體，W與泛素化BC)基因啟動子、CMV啟動子或MHCII啟動子化LA-DRa) 相同或相反的取向并位于它們的上游。
[006引向慢病毒載體的腳ii、HLA-A2、HLA-B7或HLA-E啟動子上游加入HLA-E上游啟動子序 列導致病毒效價大約2-4倍的增加（圖6)。在大多數(shù)構(gòu)建體中，HLA-E上游啟動子序列在兩個 取向上類似地作用。向帶CMV啟動子或UBC啟動子的慢病毒載體中加入HLA-E上游啟動子序 列證明在效價上大約2倍的增加（圖6)。然而，向帶HLA-DRa啟動子的慢病毒載體中加入HLA- E上游啟動子序列證明在效價上有很少或沒有影響。因此，HLA-E上游啟動子序列可從含有0 2m、MHCI、CMV或UBC啟動子的慢病毒載體中增加效價。
[0069] 將Η LA-A2的上游啟動子序列插入慢病毒載體，W與的m啟動子相同或相反的取向 并位于其上游。向慢病毒載體的的m啟動子的上游加入HLA-A2上游啟動子序列導致兩種取 向中病毒效價大約3-4倍增加。
[0070] HLA-B7的上游啟動子序列插入慢病毒載體，W與的m啟動子相同或相反的取向并 位于其上游。向慢病毒載體的的m啟動子上游加入HLA-B7上游啟動子序列導致在相同取向 上大約10倍的病毒效價增加和在相反取向上大約4倍的病毒效價增加。
[0071] 將HLA-DRa的上游啟動子序列插入慢病毒載體，W與的m啟動子相同或相反的取向 并位于其上游。向慢病毒載體的的m啟動子上游加入HLA-DRa上游啟動子序列導致在相同取 向上大約6倍的病毒效價增加和在相反取向上大約4倍的病毒效價增加。
[0072] 由于上游序列的尺寸都為約300-400nt，研究了較大的上游序列（500-1100nt)的 影響。將02m的較大上游啟動子序列（1058bp)插入慢病毒載體W與02m啟動子相同或相反的 取向并位于其上游。與較小(330bp)的上游序列相比，較大的上游啟動子序列并不進一步增 加病毒效價，而是保留大部分已增加的病毒效價(圖10)。
[0073] 將化A-A2的較大上游啟動子序列（53化P)插入慢病毒載體，W與HLA-A2啟動子相 同的取向并位于其上游。在運種情況中，較大的