i巧inned)、圓形的、掛鎖形的結(jié)構(gòu)。
[0078] 轉(zhuǎn)錄W5'到3'的方式沿著DNA鏈行進(jìn)。運(yùn)意味著通過向生長中的鏈的3'端連續(xù)添 加5'-核糖核巧Ξ憐酸而產(chǎn)生RNA(消除焦憐酸鹽是必不可少的）。在線性或環(huán)形核酸分子 中，如果離散元件(例如，特定的核巧酸序列）結(jié)合到或會結(jié)合到同一核酸上另一個元件的 5'方向，則所述離散元件可稱為處于相對所述另一個元件的"上游"。類似地，如果離散元件 結(jié)合到或?qū)⒁Y(jié)合到同一核酸上另一個元件的3'方向，則所述離散元件可處于相對于所述 另一個元件的"下游"。
[0079] 如本文中使用的，術(shù)語"堿基位置"是指在指定核酸之內(nèi)的給定堿基或核巧酸殘基 的位置。指定的核酸可通過與參考核酸的比對來定義。
[0080] 如本文中使用的，術(shù)語"雜交"是指其中寡核巧酸及其類似物通過互補(bǔ)堿基之間的 氨鍵雜交的過程，所述氨鍵包括Watson-CricKHoogsteen或反Hoogsteen氨鍵。通常，核酸 分子由含氮堿基組成，所述堿基為喀晚(胞喀晚(C )、尿喀晚化)和胸腺喀晚(T))或嚷嶺(腺 嚷嶺(A)和鳥嚷嶺(G))。運(yùn)些含氮堿基在喀晚和嚷嶺之間形成氨鍵，并且喀晚與嚷嶺的鍵合 被稱為"堿基配對"。更具體地，A會與Τ或U鍵合，而G會與C鍵合。"互補(bǔ)"指在兩條不同的核酸 序列或同一核酸序列的兩個不同區(qū)域之間發(fā)生的堿基配對。
[0081] 如本文中使用的，術(shù)語"可特異性雜交"和"特異性互補(bǔ)"是指足夠的互補(bǔ)程度，使 得在寡核巧酸與DNA或RNA祀標(biāo)之間發(fā)生穩(wěn)定的和特異性的結(jié)合。寡核巧酸不必與其特異性 雜交的祀序列100%互補(bǔ)。當(dāng)寡核巧酸與祀DNA或RNA分子的結(jié)合干擾DNA或RNA的正常功能， 并且存在足夠的互補(bǔ)程度W避免在期望特異性結(jié)合的條件(例如對于體內(nèi)測定或系統(tǒng)的情 形而言，生理條件)下的寡核巧酸與非祀序列的非特異性結(jié)合時，所述寡核巧酸是可特異性 雜交的。運(yùn)樣的結(jié)合稱為特異性雜交。導(dǎo)致具體的嚴(yán)格程度的雜交條件會根據(jù)選擇的雜交 方法的性質(zhì)和雜交的核酸序列的組成和長度而變化。通常，雜交溫度和雜交緩沖液的離子 強(qiáng)度化其是化+和/或Mgh濃度巧助于雜交的嚴(yán)格性，盡管洗涂時間也影響嚴(yán)格性。關(guān)于得 到特定嚴(yán)格程度所需要的雜交條件的考慮論述于Sambrook等(編），Molecular Cloning:A L曰bor曰tory Μ曰nu曰1,第2片反，1-3卷，Cold Spring Η曰rbor L曰bor曰tory Press,Cold Spring 化rbor，New化rk，1989,第9章和第11章中。
[0082] 如本文中使用的，"嚴(yán)格條件"涵蓋運(yùn)樣的條件：在該條件下，只有當(dāng)雜交分子與 DNA祀之間的錯配小于50%時才發(fā)生雜交。"嚴(yán)格條件"包括另外的具體嚴(yán)格性水平。因此， 如本文中使用的，"中等嚴(yán)格性"條件為具有50% W上序列錯配的分子不會雜交的條件；"高 嚴(yán)格性"條件為具有20% W上錯配的分子不會雜交的條件；"極高嚴(yán)格性"條件為具有10% W上錯配的序列不會雜交的條件。在特定的實施方案中，嚴(yán)格條件可包括:在65Γ雜交，然 后在65°C用0. lx SSC/0.1 % SDS洗涂40分鐘。W下是代表性的非限制性雜交條件：
[0083] ?極高嚴(yán)格性:在5x SSC緩沖液中65°C下雜交16小時；在2x SSC緩沖液中室溫下 洗涂兩次，每次15分鐘;再在0.5X SSC緩沖液中65°C下洗涂兩次，每次20分鐘。
[0084] ?高嚴(yán)格性:在5-6x SSC緩沖液中65-70°C雜交16-20小時；在2x SSC緩沖液中在 室溫下洗涂兩次，每次5-20分鐘;再在lx SSC緩沖液中55-70°C洗涂兩次，每次30分鐘。
[0085] ?中等嚴(yán)格性:在6x SSC緩沖液中室溫到55°C雜交16-20小時；再在2x-3x SSC緩 沖液中室溫到55°C下洗涂至少兩次，每次20-30分鐘。
[0086] 在一個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子可在極高嚴(yán)格性雜交條件下保持結(jié) 合。在一個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子可在高嚴(yán)格性雜交條件下保持結(jié)合。在一 個實施方案中，可特異性雜交的核酸分子可在中等嚴(yán)格性雜交條件下保持結(jié)合。
[0087] 如本文中使用的，術(shù)語"寡核巧酸"是指短的核酸聚合物。寡核巧酸可通過切割較 長核酸區(qū)段、或通過使單獨(dú)的核巧酸前體聚合而形成。自動合成儀能夠合成長度高達(dá)幾百 個堿基對的寡核巧酸。由于寡核巧酸可與互補(bǔ)的核巧酸序列結(jié)合，故它們可用作檢測DNA或 RNA的探針。由DNA組成的寡核巧酸(寡脫氧核糖核巧酸何用于PCR-一一種用于擴(kuò)增小DNA 序列的技術(shù)中。在PC帥，寡核巧酸一般被稱為"引物"，其允許DNA聚合酶延伸寡核巧酸并復(fù) 制互補(bǔ)鏈。
[0088] 如本文中使用的，術(shù)語"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"或"PCR"定義了如1987年7月28日公告的 美國專利No. 4，683，195中所描述的擴(kuò)增微量核酸、RNA和/或DNA的程序或技術(shù)。通常，需要 知曉感興趣區(qū)域的末端或在此之外的序列信息，W便能夠設(shè)計寡核巧酸引物;運(yùn)些引物與 有待擴(kuò)增的模板的相對鏈在序列上相同或相似。兩個引物的5'端核巧酸可與擴(kuò)增材料的末 端一致。PCR可用來擴(kuò)增特異性RNA序列、來自總的基因組DNA的特異性DNA序列、和從總的細(xì) 胞RNA、隧菌體或質(zhì)粒序列轉(zhuǎn)錄的cDNA，等等。一般可參見Mullis等，Cold Spring化rbor Symp .Quant .Biol. ,51: 263( 1987);Ehrlich編輯，PCR Technology, (Stockton Press ,ΝΥ, 1989)。
[0089] 如本文中使用的，術(shù)語"引物"是指當(dāng)條件適合于引物延伸產(chǎn)物的合成時，能夠充 當(dāng)沿著互補(bǔ)鏈合成的起始點(diǎn)的寡核巧酸。合成條件包括四種不同的脫氧核糖核巧Ξ憐酸、 W及至少一種聚合誘導(dǎo)劑(諸如逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶）的存在。運(yùn)些物質(zhì)處于適合的緩沖 液中，所述緩沖液可包括作為輔因子、或在不同的適當(dāng)溫度下影響抑等條件的組分。引物優(yōu) 選地是單鏈序列，使得擴(kuò)增效率最優(yōu)化，但也可W利用雙鏈序列。
[0090] 如本文中使用的，術(shù)語"探針"是指與祀序列雜交的寡核巧酸。在TaqMan"或 TaqMan"'型測定程序中，探針與位于兩個引物的退火位點(diǎn)之間的祀部分雜交。探針包含約 八個核巧酸、約十個核巧酸、約十五個核巧酸、約二十個核巧酸、約Ξ十個核巧酸、約四十個 核巧酸、或約五十個核巧酸。在一些實施方案中，探針包含從約八個核巧酸到約十五個核巧 酸。探針可進(jìn)一步包含可檢測標(biāo)記，例如，巧光團(tuán)(Texas_Red?、異硫氯酸巧光素，等）?？蓹z 測標(biāo)記可直接共價附接到探針寡核巧酸上，例如位于探針的5'端或探針的3'端。包含巧光 團(tuán)的探針還可進(jìn)一步包含澤滅劑，例如，Black化le如encher?、Iowa Black?,等。
[0091] 如本文中使用的，術(shù)語"序列同一性"或"同一性"可W互換地使用，指兩個序列W 指定比較窗口上的最大對應(yīng)性對齊時，兩個序列中相同的核酸殘基數(shù)。
[0092] 如本文中使用的，術(shù)語"序列同一性百分比"是指通過在比較窗口上比較兩個最優(yōu) 對齊的序列（例如核酸序列或氨基酸序列）而確定的值，其中為了實現(xiàn)兩個序列的最優(yōu)對 齊，該比較窗口中的序列部分相比于參考序列（不包含添加或缺失）可W包含添加或缺失 (即，空位）。通過確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)目來產(chǎn)生匹配 位置的數(shù)目，用匹配位置的數(shù)目除W比較窗口中的位置的總數(shù)，結(jié)果乘W100產(chǎn)生序列同一 性的百分比，從而計算出該百分比。用于比較的序列比對方法是熟知的。各種程序和比對算 法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl .Math.2:482;Needleman和Wunsch(1970) J·Mol·Biol·48:443;Pearson和Lipman(1988)Proc·Natl·Acad·Sci·U·S·A·85:2444; Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44;Higgins和Sharp(1989)CABI0S 5:151-3;Corpet 等（1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90;Huang等（1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65; Pear son等（1994)Methods Mol.Biol.24:307-31;Tatiana等（1999 )FEMS Microbiol丄ett.174:247-50。
[0093] 美國國家生物技術(shù)信息中屯、(NCBI)基本局部比對捜索工具(BLAST?;Altschul等 (1990) J.Mol. Biol. 215 :403-10)可從幾個來源獲得，包括美國國家生物技術(shù)信息中屯、 (Bethesda，MD)，并且在互聯(lián)網(wǎng)上也可供與幾種序列分析程序結(jié)合使用。如何使用該程序確 定序列同一性的描述可在互聯(lián)網(wǎng)的BLAST?的"幫助"部分獲得。為了比較核酸序列，可W采 用利用默認(rèn)參數(shù)的BLAST?(Blastn)程序的巧last 2序列"函數(shù)。在用運(yùn)種方法評估時，與參 考序列具有較大相似性的核酸序列將顯示出同一性百分比的增加。
[0094] 如本文中使用的，術(shù)語"可操作連接"指已被置于相互之間的功能關(guān)系中的兩種組 分。在有關(guān)調(diào)節(jié)序列和編碼序列的情況下使用時，術(shù)語"可操作連接"意味著該調(diào)節(jié)序列影 響該連接的編碼序列的表達(dá)。"調(diào)節(jié)序列"、"調(diào)節(jié)元件"、或"控制元件"是指影響轉(zhuǎn)錄的周期 和水平/量、RNA加工或穩(wěn)定性、或相關(guān)編碼序列的翻譯的核酸序列。調(diào)節(jié)序列可包括啟動 子;翻譯前導(dǎo)序列；5'和3'非翻譯區(qū)，內(nèi)含子；增強(qiáng)子;莖環(huán)結(jié)構(gòu)；抑制子結(jié)合序列；終止序 列；多腺巧酸化識別序列等。具體的調(diào)節(jié)序列可位于與其可操作連接的編碼序列的上游和/ 或下游。并且，與編碼序列可操作連接的具體調(diào)節(jié)序列可位于雙鏈核酸分子的相關(guān)互補(bǔ)鏈 上。連接可通過合適的限制性位點(diǎn)處的連接作用（ligation)來完成。如果運(yùn)樣的位點(diǎn)不存 在，則根據(jù)常規(guī)做法使用合成的寡核巧酸銜接子或接頭。然而，可操作連接的元件不需要是 郵連的。
[00%]如本文中使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"涵蓋所有可將核酸分子導(dǎo)入運(yùn)種細(xì)胞中的技術(shù)。實 例包括但不限于：用病毒載體轉(zhuǎn)染；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化；電穿孔；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；顯微注射 (Mueller等（1978)Cell 15: 579-85) ;±壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移;直接DNA攝?。痪ы毥閷?dǎo)的轉(zhuǎn) 化;和微粒轟擊。
[0096] 如本文中使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)導(dǎo)"是指病毒將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的過程。
[0097] 如本文中使用的術(shù)語"多接頭"或"多克隆位點(diǎn)"定義核酸序列上成簇的Ξ個或更 多個2型限制酶位點(diǎn)，彼此之間相距10個核巧酸W內(nèi)。包含多接頭的構(gòu)建體用于核酸序列 (諸如基因的編碼區(qū)）的插入和/或切除。
[0098] 如本文中使用的，術(shù)語"限制性內(nèi)切核酸酶"和"限制酶"是指多種細(xì)菌酶，它們各 自切割雙鏈DNA上的特異性核巧酸序列或附近。2型限制酶在同一位點(diǎn)識別和切割DNA，2型 限制酶包括但不限于甜 al、BamHI、HindIII、EcoRI、化〇1、SalI、ΚρηΙ、AvaI、PstI 和 Smal。
[0099] 術(shù)語"載體"與術(shù)語"構(gòu)建體"、"克隆載體"和"表達(dá)載體"可互換使用，意指一種媒 介物，可用其將DNA或RNA序列（例如，外來序列）導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，從而轉(zhuǎn)化宿主并促進(jìn)導(dǎo)入 序列的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯）。"非病毒載體"意圖表示任何不包含病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒的載 體。在一些實施方案中，"載體"為包含至少一個DNA復(fù)制起點(diǎn)和至少一個選擇標(biāo)志物基因的 DNA序列。實例包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、隧菌體、細(xì)菌人工染色體(BAC)、或攜帶外源DNA進(jìn) 入細(xì)胞的病毒。載體還可包括一個或多個基因、反義分子、和/或選擇標(biāo)志物基因和本領(lǐng)域 已知的其他遺傳元件。載體可W轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或感染細(xì)胞，由此導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)核酸分子和/或 由該載體編碼的蛋白質(zhì)。
[0100] 術(shù)語"質(zhì)粒"定義能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中進(jìn)行常染色體復(fù)制的環(huán)鏈核酸。該 術(shù)語包括可為DNA或RNA并且可為單鏈或雙鏈的核酸。質(zhì)粒的定義還可包括對應(yīng)于細(xì)菌復(fù)制 起點(diǎn)的序列。
[0101] 如本文中使用的術(shù)語"選擇標(biāo)志物基因"定義編碼蛋白質(zhì)的基因或其他表達(dá)盒，所 述蛋白質(zhì)可W幫助鑒定運(yùn)樣的細(xì)胞:該細(xì)胞中插入有選擇標(biāo)志物基因。例如，"選擇標(biāo)志物 基因"涵蓋報告基因 W及在植物轉(zhuǎn)化中使用的、例如用于保護(hù)植物細(xì)胞免受選擇劑的影響 或提供針對選擇劑的抗性/耐受性的基因。在一個實施方案中，只有那些接收功能性選擇標(biāo) 志物的細(xì)胞或植物才能在有選擇劑的條件下分化或生長。選擇劑的實例可W包括，例如包 括大觀霉素、新霉素、卡那霉素、己龍霉素、慶大霉素、和潮霉素之類的抗生素。運(yùn)些選擇標(biāo) 志物包括表達(dá)賦予抗生素卡那霉素抗性的酶的新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶基因 (npt II)，和針對有 關(guān)抗生素新霉素、己龍霉素、慶大霉素和G418的基因，或表達(dá)賦予潮霉素抗性的酶的潮霉素 憐酸轉(zhuǎn)移酶基因化pt)。其他選擇標(biāo)志物基因可W包括編碼除草劑抗性的基因，包括bar或 pat(針對草胺憐或麟絲菌素的抗性）、乙酷乳酸合酶(ALS，針對抑制劑諸如橫酷脈類(SU)、 咪挫嘟酬類(ΙΜΙ)、Ξ挫并喀晚類(TP)、喀晚氧基苯甲酸類(POB)、和阻止支鏈氨基酸合成第 一步的橫酷基氨基幾基Ξ挫嘟酬類的抗性）、草甘麟、2,4-D、和金屬抗性或敏感性?？捎米?選擇標(biāo)志物基因的"報告基因"的實例包括表達(dá)的報告基因蛋白的視覺觀察，所述報告基因 蛋白例如編碼的蛋白質(zhì):e-葡糖醒酸糖巧酶(GUS)、蛋光素酶、綠色巧光蛋白（GFP)、黃色巧 光蛋白（YFP)、DsRed、i3-半乳糖巧酶、氯霉素乙酷轉(zhuǎn)移酶(CAT)、堿性憐酸酶等。短語"標(biāo)志物 陽性"是指已被轉(zhuǎn)化而包含選擇標(biāo)志物基因的植物。
[0102] 如本文中使用的，術(shù)語"可檢測標(biāo)志物"是指能夠檢測的標(biāo)記，例如放射性同位素、 巧光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬整合劑、或酶?？蓹z測標(biāo)志物的實例包 括但不限于下列各項:巧光標(biāo)記(例如，F(xiàn)ITC、羅丹明、銅系憐光體）、酶標(biāo)記(例如，辣根過氧 化物酶、β-半乳糖巧酶、蛋光素酶、堿性憐酸酶）、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物素基；由二級報道分子 識別的預(yù)定多膚表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、第二抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、附 加表位）。在一個實施方案中，可檢測標(biāo)志物可通過不同長度的間隔臂附接，W降低潛在的 空間位阻。
[0103] 如本文中使用的，術(shù)語"檢測最廣義使用，包括特異性分子的定性和定量測量， 例如特異性多膚的測量。
[0104] 如本文中使用的，術(shù)語"盒"、"表達(dá)盒"和"基因表達(dá)盒"是指可在特異的限制性位 點(diǎn)插入核酸或多核巧酸中或通過同源重組插入核酸或多核巧酸中的DNA區(qū)段。如本文中使 用的，DNA區(qū)段包括編碼感興趣多膚的多核巧酸，所述盒和限制性位點(diǎn)被設(shè)計為確保所述盒 按照適于轉(zhuǎn)錄和翻譯的正確閱讀框插入。在一個實施方案中，表達(dá)盒可包含編碼感興趣多 膚的多核巧酸，并且除了所述多核巧酸之外，還具有便于特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的元件。在一個 實施方案中，基因表達(dá)盒還可包括允許編碼感興趣多膚的多核巧酸在宿主細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá) 的元件。運(yùn)些元件可包括但不限于：啟動子、最小啟動子、增強(qiáng)子、應(yīng)答元件、終止子序列、多 聚腺巧酸化序列，等。
[010引如本文中使用的"接頭"或"間隔區(qū)"是使兩個分開的實體彼此結(jié)合的鍵、分子或分 子基團(tuán)。接頭和間隔區(qū)可為兩個實體提供最佳間距，或者可進(jìn)一步提供允許兩個實體彼此 分開的不穩(wěn)定連接。不穩(wěn)定連接包括可光裂解的基團(tuán)、酸不穩(wěn)定性部分、堿不穩(wěn)定性部分和 酶可裂解的基團(tuán)。
[0106] 如本文中使用的，術(shù)語"對照"是指為比較目的而在分析程序中使用的樣品。對照 可為"陽性"的或"陰性"的。例如，在分析程序的目的是檢測細(xì)胞或組織中的差異表達(dá)的轉(zhuǎn) 錄物或多膚的情況下，通常優(yōu)選包括陽性對照，例如來自表現(xiàn)出期望的表達(dá)的已知植物的 樣品，W及陰性對照，例如來自缺乏該期望的表達(dá)的已知植物的樣品。
[0107] 如本文所使用的，術(shù)語"植物"包括整個植物及植物的任何后代、細(xì)胞、組織、或部 分?？捎糜诒景l(fā)明中的植物類別通常與適合于誘變的高等和低等植物類別一樣寬，包括被 子植物(單子葉和雙子葉植物）、裸子植物、藤類和多細(xì)胞藻類。因此，"植物"包括雙子葉和 單子葉植物。術(shù)語"植物部分"包括植物的任何部分，包括，例如但不限于:種子(包括成熟種 子和未成熟種子）；植物插條;植物細(xì)胞;植物細(xì)胞培養(yǎng)物;植物器官(如花粉、胚、花、果實、 芽（shoot)、葉、根、莖、和外植體）。植物組織或植物器官可W是種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、 或者任何其他被組織成一定結(jié)構(gòu)或功能單元的植物細(xì)胞群。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物可能能 夠再生出具有該細(xì)胞或組織所來源的植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，并且可能能夠再 生出與該植物具有基本上相同的基因型的植物。與之相反，一些植物細(xì)胞不能再生而產(chǎn)生 植物。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可W是胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈傷組 織、花粉、葉、花藥、根、根尖、須、花、果仁、穗、穗軸、殼、或莖。
[0108] 植物部分包括可收獲的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部 分包括，例如但不限于:種子;果實;插條;苗;塊莖;和根化木。植物的可收獲部分可W是植 物的任何有用部分，包括，例如但不限于:花;花粉;苗;塊莖;葉;莖;果實;種子;和根。
[0109] 植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理的單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可W是 分離的單細(xì)胞或細(xì)胞聚集體的形式(例如，松散型(friable)愈傷組織和培養(yǎng)細(xì)胞），也可W 是更高級的有組織單元(例如，植物組織、植物器官、和植物)的一部分。因此，植物細(xì)胞可W 是原生質(zhì)體、配子產(chǎn)生細(xì)胞、或可W再生成完整植物的細(xì)胞或細(xì)胞集合。運(yùn)樣，種子，因其包 含多個植物細(xì)胞并能夠再生為完整植物，在本文的實施方案中被認(rèn)為是"植物細(xì)胞"。
[0110] 如本文中使用的術(shù)語"原生質(zhì)體"是指其細(xì)胞壁已經(jīng)被完全或部分去除的植物細(xì) 胞，其脂質(zhì)雙層膜裸露，因此包括細(xì)胞壁已經(jīng)完全去除的原生質(zhì)體、W及其細(xì)胞壁僅被部分 去除的原生質(zhì)球，但并非僅限于此。原生質(zhì)體一般為沒有細(xì)胞壁的分離的植物細(xì)胞，具有再 生為細(xì)胞培養(yǎng)物或完整植物的潛能。
[0111] 除非另外特別地解釋，本文中使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與屬于本公開 的領(lǐng)域之內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義?？蒞在W下出版物中找到分子生物 學(xué)中常見術(shù)語的定義：例如，Lewin,Genes V,Oxford University Press, 1994QSBN 0-19- 854287-9);Kendrew等（編），The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9);和Meyers(編），Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1- 56081-569-8)。
[0112] 實施方案
[0113] 如本文中公開的，提供了新穎的重組構(gòu)建體，它們使用來自柳枝稷、二穗短柄草、 或粟的泛素基因的調(diào)節(jié)序列來表達(dá)非泛素轉(zhuǎn)基因。運(yùn)些構(gòu)建體可用來轉(zhuǎn)化包括植物細(xì)胞在 內(nèi)的細(xì)胞，W便產(chǎn)生在其細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)基因的基因產(chǎn)物的完整生物。
[0114] 調(diào)節(jié)元件
[0115] 用于基礎(chǔ)研究或生物技術(shù)應(yīng)用的植物啟動子通常是單向的，其僅僅指導(dǎo)一個已融 合在其3'端(下游)的基因。代謝工程和性狀堆疊常常需要將多個基因?qū)胫参镏校虼?，?轉(zhuǎn)基因作物中一般需要多個啟動子來驅(qū)動多個基因的表達(dá)。
[0116] 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的開發(fā)變得日益復(fù)雜，其需要在單基因座中堆疊多個轉(zhuǎn)基因。傳統(tǒng)上， 每個轉(zhuǎn)基因的表達(dá)通常都需要啟動子，其中需要多個啟動子來在一個基因堆疊中表達(dá)不同 的轉(zhuǎn)基因。運(yùn)經(jīng)常導(dǎo)致在一個轉(zhuǎn)基因堆疊內(nèi)重復(fù)使用相同的啟動子，W使得用于表達(dá)單一 多基因性狀的不同轉(zhuǎn)基因獲得表達(dá)模式的相似水平。已知由相同啟動子驅(qū)動的多基因構(gòu)建 體可導(dǎo)致基因沉默，結(jié)果降低轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在田間的效用。由于啟動子重復(fù)導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄因子 (TF)結(jié)合位點(diǎn)的過量可引起內(nèi)源TFs的消耗，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活。轉(zhuǎn)基因的沉默將很可能不 良地影響產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)轉(zhuǎn)基因的性能。轉(zhuǎn)基因內(nèi)的重復(fù)序列可引起基因座內(nèi) (intra-locus)同源重組，導(dǎo)致多核巧酸重排。
[0117] 使用多樣化的啟動子表達(dá)基因堆疊中的不同轉(zhuǎn)基因是有利的。在一個實施方案 中，從不同植物物種獲得的多樣化的組成型泛素能驅(qū)動多個轉(zhuǎn)錄單位，包括RNAi、人工 miRNA、或發(fā)夾環(huán)RNA序列的轉(zhuǎn)錄。
[0118] 提供了利用組成型泛素 (Ubil)啟動子在植物中表達(dá)非泛素轉(zhuǎn)基因的方法和構(gòu)建 體。在一個實施方案中，啟動子可W是二穗短柄草泛素 1C化bilC)啟動子。
[0119]
[0126] 在一個實施方案中，提供了包含泛素啟動子的核酸構(gòu)建體。在一個實施方案中，所 述泛素啟動子是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素啟動子。在一個實施方案中，提供了包含啟動 子的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動子與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、或SEQ ID NO: 35至少80%'85%'90%'91%'92%'93%'94%'95%'96%'97%'98%'99%'99.5%、 99.8%、或100%相同。在一個實施方案中，提供了包含與多接頭可操作連接的泛素啟動子 的核酸構(gòu)建體。在一個實施方案中，提供了包含與非泛素轉(zhuǎn)基因可操作連接的泛素啟動子 的基因表達(dá)盒。在一個實施方案中，所述啟動子由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3、或SEQ ID N0:35組成。在說明性實施方案中，基因表達(dá)盒包含與轉(zhuǎn)基因的5'端可操作連 接的泛素啟動子，其中所述轉(zhuǎn)基因可W是殺蟲劑抗性轉(zhuǎn)基因、除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因、氮利用 效率轉(zhuǎn)基因、水分利用效率轉(zhuǎn)基因、營養(yǎng)品質(zhì)轉(zhuǎn)基因、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)基因、選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因、 或它們的組合。
[0127] 除了啟動子之外，3 '非翻譯基因區(qū)（即，3 ' UTR)或終止子是轉(zhuǎn)錄終止和mRNA的多腺 巧酸化所需要的。正確的轉(zhuǎn)錄終止和mRNA的多腺巧酸化對于轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá)是重要的。 轉(zhuǎn)錄終止對于多基因堆疊更為關(guān)鍵，W免轉(zhuǎn)錄通讀到下一個轉(zhuǎn)基因中。類似地，非多腺巧酸 化的異常RNA(aRNA)是植物RNA依賴性RNA聚合酶(RdRPs)將aRNA轉(zhuǎn)化為雙鏈RNA(dsRNA)的 底物，從而導(dǎo)致小RNA的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)基因的沉默。因此，強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子對于單基因和多基因堆 疊都很有用。雖然啟動子對于驅(qū)動轉(zhuǎn)錄是必要的，但3'-UTR基因區(qū)能終止轉(zhuǎn)錄并起始用于 翻譯和蛋白質(zhì)合成的所得mRNA轉(zhuǎn)錄物的多腺巧酸化。3'-UTR基因區(qū)有助于轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表 達(dá)。
[0128] 根據(jù)一個實施方案，提供了包含泛素轉(zhuǎn)錄終止子的核酸構(gòu)建體。在一個實施方案 中，所述泛素轉(zhuǎn)錄終止子是柳枝稷、二穗短柄草或粟泛素轉(zhuǎn)錄終止子。在一個實施方案中， 提供了包含轉(zhuǎn)錄終止子的核酸構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)錄終止子與SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、 SEQ ID N0:6、或SEQ ID N0:36至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%、99.5%、99.8%、或100%相同。在一個實施方案中，提供了包含與多接頭 可操作連接的泛素轉(zhuǎn)錄終止子的核酸構(gòu)建體。在一個實施方案中，提供了包含與非泛素轉(zhuǎn) 基因的3'端可操作連接的泛素轉(zhuǎn)錄終止子的基因表達(dá)盒。在一