蔗糖脂肪酸酯嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系 統(tǒng)及其制備方法。 技術(shù)背景
[0002] 基因治療(gene therapy)是指將外源正?；?qū)腱爰?xì)胞，W糾正或補(bǔ)償因基因 缺陷和異常引起的疾病，W達(dá)到治療目的。1990年美國國立衛(wèi)生研究院采用基因治療方法 對腺巧脫氨酶缺陷癥進(jìn)行治療，首次將基因治療應(yīng)用到臨床并取得了成功。2000年采用基 因治療方法成功治療聯(lián)合免疫缺陷綜合癥，表明了基因治療策略的有效性?；蛑委熞?到進(jìn)一步的發(fā)展，必須克服=個(gè)方面的難題:一、要有用于治療的目的基因和接受目的基因 的細(xì)胞;二、實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的可調(diào)控性;=、獲得具有祀向性的高效的基因?qū)胂到y(tǒng)。其中， 具有祀向性高效的基因?qū)胂到y(tǒng)，即基因載體成為制約基因治療發(fā)展的關(guān)鍵因素。
[0003] 基因載體主要有兩大類:病毒基因載體，非病毒基因載體。自從首次成功進(jìn)行了基 因治療的臨床試驗(yàn)W來，大部分采用轉(zhuǎn)染效率高的病毒載體，但是病毒載體具有很高的免 疫原性，易于與野生型病毒重組，載量有限、生產(chǎn)成本高且易被污染。1999年美國賓州大學(xué) W重組病毒為載體的基因治療藥物在臨床試驗(yàn)中造成一名18歲受試者死亡。2000年法國內(nèi) 克爾醫(yī)院在治療重癥聯(lián)合免疫缺陷病的過程中應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，在2003年發(fā)現(xiàn)有幾名 兒童產(chǎn)生了白血病。因此病毒載體的發(fā)展受到了限制。非病毒基因載體與病毒基因載體相 比，雖然轉(zhuǎn)染效率相對較低，但具有低免疫原性、低毒、外源基因整合率低，無基因插入片段 大小限制、甚至可運(yùn)載細(xì)胞核或染色體、使用簡單，制備方便等優(yōu)勢。越來越多的研究人員 開始選擇非病毒載體進(jìn)行基因治療方面的研究。陽離子脂質(zhì)體是目前研究最透徹、技術(shù)最 成熟、應(yīng)用最廣泛的非病毒載體系統(tǒng)，具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物膜的特性，在體內(nèi)可降解，可 W保護(hù)其運(yùn)載基因片段的生物活性。但其也存在一定的局限性，如細(xì)胞毒性大，對器官的祀 向性不明顯，基因轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制不明確等，限制了陽離子脂質(zhì)體的發(fā)展。因此，人們一直致力于 對陽離子脂質(zhì)體的各種構(gòu)建及修飾，試圖尋求一種高效低毒的基因治療藥物。
[0004] 薦糖醋是一種非離子表面活性劑，由薦糖和脂肪酸經(jīng)醋化反應(yīng)生成的單質(zhì)或混合 物。薦糖醋具有廣泛的親水親油平衡值(化B)，具有良好的分散、增溶性能。因此，薦糖醋做 為助類脂用于制備脂質(zhì)體可W增強(qiáng)脂質(zhì)體的分散性，增強(qiáng)脂質(zhì)體與藥物的配伍作用，加快 藥物釋放速度、促進(jìn)分散、防止結(jié)晶沉淀，并延長藥物保質(zhì)期限。另外，薦糖醋生物相容性、 生物降解性強(qiáng)，用于制備陽離子脂質(zhì)體可降低脂質(zhì)體的毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞毒性小、在體外和體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染效率高的薦糖脂肪 酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)及其制備方法及其應(yīng)用，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)由薦糖脂肪酸醋嵌入 式陽離子脂質(zhì)體與基因物質(zhì)組成，所述的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體由陽離子類脂 和薦糖脂肪酸醋構(gòu)成。
[0007] 本發(fā)明的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其中所述薦糖脂肪酸 醋為單醋或雙醋，其中單醋結(jié)構(gòu)如下：
其中，R選自硬脂酸或月桂酸或油酸或棟桐酸或肉違酸或芥酸； 所述的薦糖脂肪酸醋的親水親油平衡值為:化B<1或1含化B < 16。
[0008] 本發(fā)明的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其中所述陽離子類脂 為膚型陽離子類脂，結(jié)構(gòu)式為：
或雙子型陽離子類脂，結(jié)構(gòu)式為：
或季錠鹽型陽離子類脂，結(jié)構(gòu)式為：
其中：X選自1~6;y選自1~8;R選自C8-2Q烷基，該烷基包括直鏈烷基和支鏈烷基;AA選 自精氨酸或組氨酸或天冬氨酸或丙氨酸或甘氨酸或鳥氨酸或賴氨酸;B選自O(shè)rn或Lys。
[0009] 本發(fā)明的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其中所述的陽離子類 脂與薦糖脂肪酸醋的質(zhì)量比為1:8~8:1;所述薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體與基因物 質(zhì)的質(zhì)量比為0.5:^32:1。
[0010] 本發(fā)明的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，其中所述的基因物質(zhì) 為質(zhì)粒DNA或小干擾RNA。
[0011] 本發(fā)明的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)的制備方法，步驟如 下： 薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體的制備： (1) 將陽離子類脂和薦糖脂肪酸醋按照質(zhì)量比1:8~8:1比例溶解于氯仿或甲醇中得溶 液； (2) 將（1)步驟得到的溶液在氮?dú)庀麓党删鶆虮∧?，真空干?~12h; (3)用乙醇或水或生理鹽水或憐酸作為緩沖液或W乙醇、水、生理鹽水、憐酸中的任意 兩種等質(zhì)量的混合液進(jìn)行水化，水化溫度為10~80°C;水化時(shí)間為1~lOh，超聲震蕩至澄 清，得到薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體，濃度為0.5~3.Omg/mL該薦糖脂肪酸醋嵌入 式陽離子脂質(zhì)體為分散在水相中形成的粒徑大小為150~250nm的均一穩(wěn)定的表面帶有正 電荷的陽離子脂質(zhì)體； 利用薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體與基因物質(zhì)制備薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子 脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)： 將薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA或小干擾RNA，通過靜電相互作用形成 分散在水相中均一穩(wěn)定的納米顆粒，具體步驟如下： (1) 取薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體分散在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM或RPMI1640中，混 勻，使?jié)舛葹?.0 1μg/μL~0.6化g/yL (2) 將0.5~1. Oyg質(zhì)粒DNA或小干擾RNA稀釋在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM或RPMI1640中，混勻， 使質(zhì)粒濃度為0.0化g/y L (3) 按照薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體與基因物質(zhì)質(zhì)量比0.5:1~32:1比例，將 (1)和(2)兩稀釋液混勻，室溫放置10~40min，即可得到薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體 基因載體系統(tǒng)。
[0012] 本發(fā)明的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)的制備方法制備的薦 糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用及在體內(nèi)轉(zhuǎn)染中的應(yīng) 用，主要包括： 1、所述薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體可進(jìn)入癌細(xì)胞中，完成目的基因在細(xì)胞內(nèi) 的轉(zhuǎn)染。
[0013] 2、所述細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞(Hela)和非小肺腺癌細(xì)胞(A549)。不同氮憐比下結(jié)合 獲得的所述薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，在不同細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所差 異。
[0014] 3、所述薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)可進(jìn)入荷瘤小鼠癌細(xì)胞中，完成 目的基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染。
[0015] 4、本發(fā)明提供的薦糖醋陽離子脂質(zhì)體基因載體適用于編碼巧光素酶、綠色巧光蛋 白報(bào)告基因，也適用于其他各種實(shí)驗(yàn)所需的siRNA。該載體能高效運(yùn)載pDNA和SiRNA轉(zhuǎn)染細(xì) 胞。
[0016] 5、所述薦糖醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)對細(xì)胞和小鼠幾乎不產(chǎn)生毒性。
[0017] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、本發(fā)明提供的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，采用的助類脂為薦 糖醋。薦糖醋是一種非離子表面活性劑，具有廣泛的親水親油平衡值(HLB),具有良好的分 散、增溶性能。薦糖醋做為助類脂用于制備脂質(zhì)體可W增強(qiáng)脂質(zhì)體的分散性，增強(qiáng)脂質(zhì)體與 藥物的配伍作用，加快藥物釋放速度、促進(jìn)分散、防止結(jié)晶沉淀，并延長藥物保質(zhì)期限。
[0018] 2、本發(fā)明提供的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，采用的薦糖 醋具有良好的生物相容性、良好的生物降解性，可降低季錠鹽型脂質(zhì)體的毒性。
[0019] 3、本發(fā)明提供的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，制備方法簡 單，采用的反應(yīng)試劑及得到的產(chǎn)物無毒無污染，且原料成本低，可廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究及生 產(chǎn)。
[0020] 4、本發(fā)明所述的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)穩(wěn)定性好，粒 徑為200nm左右，可壓縮更多帶負(fù)電的基因物質(zhì)，提高體外體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞相容性好、毒 性小，可作為新型高效低毒的非病毒基因載體和轉(zhuǎn)染試劑。
[0021] 5、本發(fā)明提供的薦糖脂肪酸醋嵌入式陽離子脂質(zhì)體基因載體系統(tǒng)，在運(yùn)載SiRNA 用于基因沉默時(shí)也有