[0019]本發(fā)明步驟(2)中，所述蛋白酶溶液與通道內(nèi)的氧化纖維素的反應(yīng)時(shí)間為10-60分鐘，溫度為0-20 °C。
[0020]本發(fā)明提出的一種紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器的制備方法，進(jìn)一步詳述如下:
將厚度為0.1-2毫米的熱塑性透明塑料板裁成需要制備的芯片尺寸的小片2或4，一般長(zhǎng)30-100毫米，寬10-20毫米。塑料片材質(zhì)可為有機(jī)玻璃、聚苯乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚氯乙烯等熱塑性塑料。將厚度為100-300微米的定性或定量濾紙通過(guò)割字機(jī)、刀片、打花器或紙張模切機(jī)切成寬度為0.5-3毫米的條狀，或其他需要的形狀，如單十字交叉、柵欄、多角形、螺旋等。如圖1所示，濾紙條或其他需要形狀的濾紙片I可用水潤(rùn)濕后貼在裁成芯片大小的熱塑性透明塑料片2 (下塑料片)上，晾干后蓋上另外一片同樣尺寸的鉆有直徑為1~3毫米的溶液連接孔的透明塑料片4 (上塑料片)，夾于玻璃片3和6間后用夾具施加外壓5。然后，將該裝置置于一溫度為110-180°C的烘箱中加熱5-15分鐘，紙芯被封裝在兩片塑料片2和4間，可得具有紙纖維填充通道7的紙芯微流控芯片，含有紙芯的通道7的寬度為0.5-3毫米。紙芯微流控芯片中紙纖維填充通道7的末端與溶液連接孔9連接。可使用長(zhǎng)尾票價(jià)、金屬文具夾和其他能產(chǎn)生壓力的夾具對(duì)夾有紙芯的兩片塑料片2和4施加壓力，封裝使用的壓力為1-15公斤/平方厘米。本發(fā)明的制備的芯片可為單通道(圖2A)、多通道(圖2B)、單十字交叉(圖4A)、柵欄式(圖4B)、多角形和螺旋紙芯微流控芯片。
[0021]將含有0.01-0.5 mol/L高碘酸的100mmol/L乙酸鹽緩沖溶液(pH 4.0)溶液通過(guò)溶液連接孔9注入紙纖維填充通道7，在室溫下反應(yīng)10-60分鐘，使紙芯中纖維素糖鏈中的鄰二羥基氧化生成醛基，用0.2 mol/L乙二醇水溶液清洗后，注入0.5-10毫克/毫升蛋白酶溶液，在0-20°C反應(yīng)10-60分鐘。酶分子中的游離氨基與氧化纖維素中的醛基反應(yīng)形成席夫(Schiff)堿，從而實(shí)現(xiàn)蛋白酶的共價(jià)鍵固定(反應(yīng)式見(jiàn)圖5)，得蛋白酶解微流控芯片。蛋白酶可為胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白組學(xué)和蛋白質(zhì)分析中常用的蛋白水解酶，其中最常用的是胰蛋白酶。
[0022]將本發(fā)明制備的紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器14通過(guò)硅橡膠連接管12與注射泵10相連接，構(gòu)成紙芯微流控芯片蛋白酶解系統(tǒng)(見(jiàn)圖6)，蛋白質(zhì)樣品溶液11用20毫摩爾/升碳酸氫銨水溶液(pH 8.1)制備，通過(guò)注射泵10注入紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器14，流速為5-50微升/分鐘。流出的酶解液收集在小離心管中。質(zhì)譜分析時(shí)，樣品點(diǎn)在質(zhì)譜點(diǎn)樣板15上，用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定，可得蛋白樣品酶解液的肽質(zhì)量圖譜16，經(jīng)檢索有關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)后完成蛋白鑒定。
[0023]本發(fā)明首次提出了一種紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器及其制備方法，通過(guò)熱壓封裝紙芯的方法制備紙芯微流控芯片，在紙纖維填充通道中通過(guò)共價(jià)鍵固定蛋白酶后得蛋白酶解反應(yīng)器。由于紙纖維填充通道為多孔材料，表面積大，可提高蛋白酶的固定量。紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器提高了酶試劑的使用效率，節(jié)約了蛋白酶，不僅降低了蛋白酶解的成本，也大幅提高了蛋白酶解的效率。本發(fā)明中提出的紙芯微流控芯片制備方法，不需要使用昂貴的微機(jī)電加工技術(shù)和設(shè)備，具有快速簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單和成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，在微流控芯片的批量低成本生產(chǎn)方面有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明中制備的紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器，在蛋白質(zhì)研宄、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生命科學(xué)研宄和食品分析等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明中熱壓封裝法制備紙芯微流控芯片流程示意圖。其中，(A)將濾紙條或其他需要形狀的濾紙片1，用水潤(rùn)濕后貼在裁成芯片大小的熱塑性透明塑料片2上；(B)蓋上另外一片同樣尺寸的鉆有溶液連接孔的透明塑料片4 ; (C)夾于兩片玻璃片3和6間后用夾具施加外壓5 ; (D)該裝置于烘箱中加熱5-15分鐘，紙芯被封裝在兩片塑料片2和4間；(E)移去玻璃片3和6后得具有紙纖維填充通道7的紙芯微流控芯片8。
[0025]圖2為采用本發(fā)明中熱壓封裝技術(shù)制備的(A)單通道和(B)Il通道紙芯微流控芯片的實(shí)物照片以及(C)通道末端連接有紙纖維填充通道7的溶液連接孔9的顯微鏡照片。
[0026]圖3為本發(fā)明制備的紙芯微流控芯片中紙纖維填充通道7斷面的顯微鏡照片的顯微鏡照片。其中，(A)為放大10倍，(B)為放大50倍。
[0027]圖4為(A)采用本發(fā)明中熱壓封裝技術(shù)制備的(A)單十字交叉和(B)柵欄式紙芯微流控芯片的實(shí)物照片。
[0028]圖5為本發(fā)明中紙芯微流控芯片中紙纖維高碘酸氧化形成氧化纖維素及其胰蛋白酶與氧化纖維素固定化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)共價(jià)鍵固定的反應(yīng)式。
[0029]圖6為圖5為本發(fā)明中蛋白微流控芯片酶解系統(tǒng)示意圖。
[0030]圖7為使用本發(fā)明制備的紙芯微流控芯片酶反應(yīng)器酶解牛血清白蛋白(A)和溶菌酶(B)產(chǎn)物的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜圖。流速10微升/分鐘，酶解時(shí)間〈18秒，蛋白質(zhì)溶液濃度200納克/微升(溶于20毫摩爾/升碳酸氫銨水溶液(pH 8.1)中)，所有匹配的肽段用標(biāo)出。
[0031 ] 圖中標(biāo)號(hào):I為濾紙條或其他需要形狀的濾紙片，2為下塑料片，3為下玻璃片，4為上塑料片，5為外壓，6上玻璃片，7為紙纖維填充通道，8為紙芯微流控芯片，9為溶液連接孔，10注射泵，11為待酶解的蛋白質(zhì)樣品溶液，12為硅橡膠連接管，13為蛋白酶解液收集孔，14為紙芯微流控芯片酶反應(yīng)器，15為質(zhì)譜點(diǎn)樣板，16為蛋白樣品酶解后獲得含肽段的酶解液基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜圖示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面通過(guò)實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明:
1、單通道紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器及其制備方法
將厚度為I毫米的有機(jī)玻璃板裁成需要制備的芯片尺寸(60毫米X 16毫米X I毫米)的小片2或4。將厚度為200微米的定性濾紙通過(guò)刀片切成長(zhǎng)度為54毫米寬度為2毫米的紙條I。如圖1所示，用水潤(rùn)濕后貼在裁成芯片大小的有機(jī)玻璃片2上，晾干后蓋上另外一片同樣尺寸的鉆有直徑為2毫米的溶液連接孔的有機(jī)玻璃片4，夾于玻璃片3和6 (76.2毫米X 25毫米X 1.2毫米)間后用彈簧驅(qū)動(dòng)加壓裝置施加外壓5，壓力為6公斤/平方厘米。然后，將該裝置置于一溫度為130°C的鼓風(fēng)烘箱中加熱10分鐘后，紙芯被封裝在兩片塑料片2和4間，與玻璃片3和6分離后可得具有紙纖維填充通道7的單通道紙芯微流控芯片，含有紙芯的通道7的寬度為2毫米。圖2A為單通道紙芯微流控芯片的實(shí)物照片。如圖2C所示，紙芯微流控芯片中紙纖維填充通道7的末端與溶液連接孔9連接。圖3為本發(fā)明制備的紙芯微流控芯片中紙纖維填充通道7斷面的顯微鏡照片的顯微鏡照片。可見(jiàn)紙纖維微流通道完整，兩有機(jī)玻璃片2和4間無(wú)裂縫，封裝質(zhì)量良好。
[0033]將含有0.2 mol/L高碘酸的100 mmol/L乙酸鹽緩沖溶液(pH 4.0)溶液通過(guò)溶液連接孔9注入單通道紙纖維填充通道7，在室溫下反應(yīng)30分鐘，使紙芯中纖維素糖鏈中的鄰二羥基氧化生成醛基。通道中殘留的未反應(yīng)的去高碘酸需用0.2 mol/L乙二醇水溶液清洗除去。然后，通過(guò)溶液連接孔9注入0.5-10毫克