一種紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自從1990年瑞士 Ciba-Geigy公司的Manz和Widmer [I]首次提出微型全分析系統(tǒng)(μ-TAS)以來，微流控芯片以其體積小、液流可控、分離效率高、試劑和樣品用量少、分析速度快、操作易自動(dòng)化、低耗以及集成度高等等優(yōu)點(diǎn)引起了國(guó)內(nèi)外分析化學(xué)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛關(guān)注，在其方法學(xué)研宄迅速發(fā)展的基礎(chǔ)上，微流控芯片在生物醫(yī)學(xué)研宄、臨床診斷、藥物分析、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、法醫(yī)和軍事等領(lǐng)域顯示了良好的應(yīng)用前景[2-4]，是發(fā)展生物醫(yī)藥等領(lǐng)域高通量、多組分和低成本檢測(cè)技術(shù)的理想平臺(tái)。目前制約其廣泛應(yīng)用的瓶頸之一就是其較高的價(jià)格和較低的產(chǎn)量。
[0003]微流控芯片以微機(jī)電加工技術(shù)為依托，以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征，以生命科學(xué)研宄為目前主要應(yīng)用對(duì)象，是當(dāng)前芯片實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)域發(fā)展的重點(diǎn)。微流控芯片是把生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、食品、藥品和環(huán)境監(jiān)測(cè)等分析過程中的采樣、稀釋、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成到一塊幾個(gè)平方厘米大的芯片上，自動(dòng)完成分析全過程，具有廣泛的適用性。由于它在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力，已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機(jī)械等多學(xué)科交叉的嶄新研宄領(lǐng)域。
[0004]微流控芯片微流通道尺寸在微米級(jí)，是納升到微升級(jí)小體積樣品的理想操作和分析平臺(tái)，特別適用于生物醫(yī)藥分析和臨床檢測(cè)中小體積樣品的酶法和免疫法分析，其最重要用途之一蛋白質(zhì)的酶解和分析[5]。蛋白質(zhì)酶解是蛋白組學(xué)中蛋白質(zhì)分析的一個(gè)關(guān)鍵步驟，待測(cè)樣品中的蛋白通過凝膠電泳分離后用蛋白水解酶水解成肽，然后用質(zhì)譜測(cè)定其分子量得肽質(zhì)量圖譜，經(jīng)檢索有關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫后完成蛋白鑒定。傳統(tǒng)的溶液酶解耗時(shí)(12小時(shí)以上)，加上蛋白水解酶自身酶解產(chǎn)生的肽也會(huì)干擾目標(biāo)蛋白的鑒定，所以溶液酶解時(shí)蛋白和酶的比例通常要求在20~40:1 [5]，以降低游離蛋白酶自身酶解的干擾，但由于使用蛋白酶濃度較低，酶解效率不高，所以建立高效快速的新型蛋白質(zhì)酶解方法具有重要意義。解決上述溶液酶解問題的主要途徑就是使用固定化酶技術(shù)，通常使用的微流控芯片酶反應(yīng)器是將蛋白酶如胰蛋白酶通過溶膠-凝膠包埋[6，7]技術(shù)固定在微流控芯片通道內(nèi)表面。存在的問題是由于酶不是通過共價(jià)鍵固定，容易流失，影響酶解效果。此外，使用的微流控芯片采用微機(jī)電加工技術(shù)制作，成本較高。研制低成本的微流控芯片酶反應(yīng)器具有重要的實(shí)際意義。
[0005]本發(fā)明將濾紙切成條狀或需要的形狀，通過熱壓封裝在兩片熱塑性透明塑料片之間得紙芯微流控芯片，具有紙纖維填充通道。紙芯不僅是熱壓印時(shí)形成通道的模板，也是通道中的多孔填充材料，可用于蛋白酶等生物大分子的固定。經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外有關(guān)數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)紙芯微流控芯片的報(bào)道。由于紙芯中的纖維素中的糖鏈含有鄰二羥基和羥甲基，通過化學(xué)處理可引入多種基團(tuán)，可用于蛋白酶等生物大分子的固定。
[0006]本發(fā)明采用高碘酸氧化法氧化紙芯微流控芯片中的纖維素得含有醛基的氧化纖維素，胰蛋白酶等蛋白酶水解酶通過氨基與通道中氧化紙纖維上的醛基形成共價(jià)鍵從而獲得固定。由于酶通過共價(jià)鍵固定，其自身酶解被抑制，故可以使用較大的酶量，使酶解效率大幅提高。該反應(yīng)器可將蛋白質(zhì)的酶解時(shí)間從傳統(tǒng)的溶液酶解的12小時(shí)以上大幅度降低到18秒以內(nèi)，大大節(jié)約了酶解時(shí)間，提高了工作效率。本發(fā)明可為蛋白組學(xué)中蛋白的高效酶解和高通量鑒定提供新的技術(shù)手段，提出的紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器具有制作簡(jiǎn)便、酶解時(shí)間短、樣品用量少、價(jià)格低廉和穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。
[0007]參考文獻(xiàn)
[1]ManzA, Graber N, Widmer HM.Sens.Actuators B 1990, I, 244-248.[2]Dittrich,PS, Tachikawa K, Manz A.Anal.Chem.2006, 78, 3887-3908.[3]AurouxPA, 1ssifidis D, Reyes DR, et al.Anal.Chem.2002, 74,2637-2652.[4]VerpoorteE.Electrophoesis 2002, 23, 677-712.[5]Liu S, Bao HM, Zhang LY, et al.Journal of Proteomics, 2013, 82, 1-13.[6]Qu HY, Wang H., Huang Y, et al.Anal.Chem.2004，76，6426-6433.[7]WuHL, Tian YP, Liu BH, et al.J.Proteome Res.2004, 3, 1201-1209.。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提出一種能夠批量低成本生產(chǎn)，且可提高蛋白酶解效率的紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器及其制備方法。
[0009]本發(fā)明提出的紙芯微流控芯片蛋白酶解反應(yīng)器的制備方法，具體步驟為:
(1)將濾紙切成寬度為0.5-3毫米的長(zhǎng)條狀或其他需要的形狀，用水潤(rùn)濕后貼在裁成芯片大小的熱塑性透明塑料片上，晾干后蓋上另外一片同樣尺寸的鉆有溶液連接孔的透明塑料片，夾于兩片玻璃片間后用夾具加壓；然后，連同夾具一起置于一溫度為110-180°C的烘箱中加熱5-15分鐘，紙芯被封裝在兩片塑料片間，得具有紙纖維填充通道的紙芯微流控芯片，紙纖維填充通道寬度為0.5-3毫米；溶液連接孔位于紙纖維填充通道的末端；
(2)將高碘酸溶液注入紙纖維填充通道，使紙芯中纖維素糖鏈中的鄰二羥基氧化生成醛基，用乙二醇水溶液清洗后，注入胰蛋白酶等蛋白酶溶液，酶分子中的游離氨基與氧化纖維素中的醛基反應(yīng)形成席夫(Schiff)堿，從而實(shí)現(xiàn)蛋白酶的共價(jià)鍵固定，得蛋白酶解微流控芯片。
[0010]本發(fā)明中，步驟(I)中所述的濾紙可通過割字機(jī)、刀片、打花器和紙張模切機(jī)進(jìn)行切割。切割的濾紙形狀可為需要長(zhǎng)度的長(zhǎng)條狀，也可為單十字交叉狀、柵欄狀、多角形狀、螺旋狀等其他形狀。
[0011]本發(fā)明中，步驟(I)中所述的透明塑料片材質(zhì)可為有機(jī)玻璃、聚苯乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯或聚氯乙烯等熱塑性塑料。
[0012]本發(fā)明的步驟(I)中熱壓封裝溫度為110-180°c，熱壓封裝時(shí)間為5-15分鐘。
[0013]本發(fā)明的步驟(I)中使用的濾紙為厚度為100-300微米的定性或定量濾紙。
[0014]本發(fā)明的步驟(I)中，可使用長(zhǎng)尾票價(jià)、金屬文具夾和其他能產(chǎn)生壓力的夾具對(duì)夾有紙芯的兩片塑料片施加壓力，使用的壓力為1-15公斤/平方厘米。
[0015]本發(fā)明步驟(I)中，所述的紙芯微流控芯片中紙纖維填充通道的末端位置的溶液連接孔為直徑1~3毫米的圓形小孔。
[0016]本發(fā)明步驟(2)中，所述蛋白酶可為胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白水解酶。
[0017]本發(fā)明步驟(2)中，所述高碘酸溶液的濃度為0.01-0.5 mol/L，蛋白酶的濃度為
0.5-10暈克/暈升。
[0018]本發(fā)明步驟(2)中，所述高碘酸溶液氧化紙纖維填充通道的時(shí)間為10-60分鐘，溫度為 10-40 °C。