專利名稱：:二芳基甲基哌嗪衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新化合物，其制備方法，其用途以及包括該新化合物的藥物組合物。所述的新化合物可用于治療，尤其可用于治療疼痛、焦慮癥和功能性胃腸道病癥(functionalgastrointestinaldisorder)。
背景技術(shù)：
：已經(jīng)確證δ受體在許多身體機(jī)能如循環(huán)以及疼痛體系中發(fā)揮作用。因此δ受體配體具有可用作鎮(zhèn)痛藥，和/或以及作為抗高血壓藥的潛在用途。也已經(jīng)證實(shí)δ受體配體具有免疫調(diào)節(jié)活性。目前已經(jīng)充分確證了至少三種不同的阿片受體(μ、δ和κ)，并且所有這三種明顯存在于許多物種(包括人)的中樞以及外周神經(jīng)系統(tǒng)中。當(dāng)一或多種這些受體被激活時(shí)，已經(jīng)在許多動(dòng)物模型中觀察到痛覺消失。除了少數(shù)例外，目前已有的選擇性阿片δ配體本質(zhì)上是肽類物質(zhì)，并且不適合經(jīng)全身路徑給藥。非肽類δ-激動(dòng)劑的一個(gè)實(shí)例為SNC80(BilskyE.J.等，JournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics，273(1)，pp.359-366(1995))?，F(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)證實(shí)的許多δ激動(dòng)劑化合物具有許多缺點(diǎn)，藥代動(dòng)力學(xué)差并且當(dāng)全身路徑給藥時(shí)不具有鎮(zhèn)痛作用。此外，已有記載，當(dāng)全身給藥時(shí)，許多δ激動(dòng)劑化合物顯示顯著的驚厥作用。PCT公開文本W(wǎng)O02/094794描述了一些δ-激動(dòng)劑。因此，仍然存在改善的δ-激動(dòng)劑的需求。
發(fā)明內(nèi)容我們現(xiàn)已意料不到發(fā)現(xiàn)某些化合物顯示一種或多種改善的性質(zhì)，即，改善的δ激動(dòng)效力、體內(nèi)效力、藥動(dòng)學(xué)、生物利用度、體外穩(wěn)定性、體內(nèi)穩(wěn)定性、腦滲透性和/或低毒性。在本說明書中除非另有說明，本發(fā)明書中的命名法通常遵循在NomenclatureofOrganicChemistry，SectionsA，B，C，D，E，F(xiàn)，andH，PergamonPress，Oxford，1979中表述的實(shí)例以及規(guī)則，其示例性化學(xué)結(jié)構(gòu)名稱以及命名化學(xué)結(jié)構(gòu)的規(guī)則這里引入作為參考。任選地，化合物名稱可根據(jù)可使用化學(xué)命名程序產(chǎn)生ACD/ChemSketch，Version5.09/September2001，AdvancedChemistryDevelopment，Inc.，Toronto，Canada?！皩?duì)映異構(gòu)體純(enantiomericallypure)”是指化合物在其所包含的兩種可能的對(duì)映異構(gòu)體總量中含有至少占75％的指定對(duì)映異構(gòu)體。在具體的實(shí)施方式中，“對(duì)映異構(gòu)體純”是指化合物在其所包含的兩種可能的對(duì)映異構(gòu)體總量中含有至少占90％的指定對(duì)映異構(gòu)體。在更具體的實(shí)施方式中，“對(duì)映異構(gòu)體純”是指化合物在其所包含的兩種可能的對(duì)映異構(gòu)體總量中含有至少占95％的指定對(duì)映異構(gòu)體?！皽匮?jiǎng)游铩卑ㄈ?。一方面，本發(fā)明提供式I化合物，其藥學(xué)上可接受的鹽、其溶劑化物、其前藥、其非對(duì)映異構(gòu)體、其一種或多種對(duì)映異構(gòu)體以及它們的混合物在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明化合物可選自其藥學(xué)上可接受的鹽、其一種或多種分離的對(duì)映異構(gòu)體及其混合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明化合物選自及其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可選自及其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可選自及其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可選自及其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物可選自4-{(S)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟芐基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟芐基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺；4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺及其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明化合物可選自對(duì)映異構(gòu)體純的4-{(S)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟芐基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；對(duì)映異構(gòu)體純的4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟芐基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；對(duì)映異構(gòu)體純的4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺；對(duì)映異構(gòu)體純的4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺及其藥學(xué)上可接受的鹽。應(yīng)該理解，當(dāng)本發(fā)明的化合物含有一個(gè)或多個(gè)手性中心時(shí)，本發(fā)明的化合物可以以對(duì)映或非對(duì)映形式存在或分離成對(duì)映或非對(duì)映形式，或者作為外消旋混合物存在。本發(fā)明包括式I化合物的任何可能的對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、外消旋物或它們的混合物。本發(fā)明化合物的光學(xué)活性形式可以通過如下方式制備例如外消旋物的手性色譜分離、從光學(xué)活性原料合成，或者基于下面所描述的不對(duì)稱合成。還可以理解，本發(fā)明的某些化合物可以以溶劑化形式，例如水合形式或者非溶劑化的形式存在。還可以理解，本發(fā)明包含式I化合物的所有這些溶劑化形式。式I化合物的鹽也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明化合物的藥學(xué)可接受的鹽通?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)操作獲得，例如通過使足夠堿性的化合物(例如烷基胺)與合適的酸(例如，HCl或乙酸)反應(yīng)，得到生理學(xué)可接受的陰離子。也可以通過在含水介質(zhì)中，用一當(dāng)量堿金屬或堿土金屬氫氧化物或烷氧化物(例如乙氧化物或甲氧化物)或合適的堿性有機(jī)胺(例如膽堿或甲葡胺)處理具有合適酸性質(zhì)子(例如羧酸或苯酚)的本發(fā)明化合物，接著通過常規(guī)純化技術(shù)處理以制備相應(yīng)的堿金屬(例如鈉、鉀或鋰)鹽或堿土金屬(例如鈣)鹽。在一個(gè)實(shí)施方式中，上述式I的化合物可以被轉(zhuǎn)化為藥學(xué)可接受的鹽或其溶劑化物，特別是酸加成鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽或?qū)妆交撬猁}。本發(fā)明的新化合物可用于治療，尤其是用于治療各種疼痛病癥如慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛(neuropathicpain)、急性疼痛、癌癥疼痛、由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的疼痛、偏頭痛、內(nèi)臟疼痛等。然而，這種列舉不能被解釋為是窮舉性的。本發(fā)明化合物用于治療腹瀉、抑郁、焦慮和應(yīng)激相關(guān)的病癥例如創(chuàng)傷后的應(yīng)激障礙、驚恐性障礙、泛化性焦慮癥、社交恐怖癥和強(qiáng)迫癥、尿失禁、早泄、各種精神疾病、咳嗽、肺水腫、各種胃-腸病，例如便秘、功能性胃腸道病癥例如過敏性腸綜合征和機(jī)能性消化不良，帕金森疾病和其它運(yùn)動(dòng)障礙、創(chuàng)傷性腦損傷、中風(fēng)、心肌梗塞后的心臟保護(hù)(cardioprotection)、脊椎傷損和藥癮，包括治療酒精、尼古丁、阿片樣物質(zhì)及其它藥物濫用，和交感神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如高血壓。本發(fā)明化合物可用作免疫調(diào)節(jié)劑，特別是用于自身免疫性疾病，例如關(guān)節(jié)炎，用于皮膚移植、器官移植和類似的手術(shù)需要，用于膠原疾病、各種變態(tài)反應(yīng)，用作抗腫瘤劑和抗病毒劑。本發(fā)明化合物可用于存在或牽涉在范例中的阿片受體退化或功能紊亂的那些病癥。這包括在診斷技術(shù)和影像應(yīng)用例如正電子發(fā)射層析成象(PET)中使用本發(fā)明化合物的同位素標(biāo)記形式。本發(fā)明化合物可在全身麻醉和監(jiān)視麻醉護(hù)理期間用作鎮(zhèn)痛劑。往往可使用具有不同性質(zhì)藥物的聯(lián)合藥物以獲得需要維持麻醉狀態(tài)(例如遺忘、痛覺消失、肌肉放松和鎮(zhèn)靜)的平衡效果。在聯(lián)合藥物中包括吸入麻醉劑、安眠藥、抗焦慮藥、神經(jīng)肌肉阻斷劑和阿片樣物質(zhì)。在本發(fā)明范圍內(nèi)包括上述式I的任何化合物在制備藥物中的用途。在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括，本發(fā)明的任何化合物在制備用于治療疼痛病癥的藥物中的用途，包括但不局限于急性疼痛、慢性疼痛、神經(jīng)性疼痛、背痛、癌癥疼痛和內(nèi)臟疼痛。在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括，本發(fā)明的任何化合物在制備用于治療焦慮的藥物中的用途，包括但不限于，社交恐怖癥、泛化性焦慮癥、急性焦慮。在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括，本發(fā)明的任何化合物在制備用于治療抑郁的藥物中的用途。在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括，本發(fā)明的任何化合物在制備用于治療帕金森病的藥物中的用途。在本發(fā)明范圍內(nèi)包括，本發(fā)明的任何化合物在制備用于治療上述任何疾病的藥物中的用途。本發(fā)明的另一方面是提供治療患有上述任何病癥的患者的方法，其中對(duì)需要這種治療的患者給藥有效量的本發(fā)明化合物。因此，本發(fā)明提供用于治療的上述式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其溶劑化物。除非另有相反說明，在說明書中，術(shù)語“治療”還包括“預(yù)防”。術(shù)語“治療的”和“治療地”也應(yīng)該相應(yīng)理解。本發(fā)明中的術(shù)語″治療″還包括給藥有效量的本發(fā)明化合物，以減輕預(yù)先存在的急性或慢性疾病狀況或復(fù)發(fā)病癥。該定義還包括用于防止復(fù)發(fā)病癥的預(yù)防性治療和用于慢性疾病的持續(xù)治療。在用于治療溫血?jiǎng)游锢缛藭r(shí)，本發(fā)明的化合物可以以常規(guī)的藥物組合物的形式通過各種路徑給藥，包括口服、肌內(nèi)、皮下、局部地、鼻內(nèi)、腹腔內(nèi)、胸內(nèi)(intrathoracially)、靜脈內(nèi)、硬膜外、鞘內(nèi)、腦室內(nèi)(intracerebroventricularly)和注入關(guān)節(jié)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，給藥路徑可以為口服、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)。當(dāng)確定對(duì)于特定患者最適合的個(gè)用藥法和劑量水平時(shí)，劑量將取決于給藥路徑、疾病的嚴(yán)重性、患者的年齡和體重以及主治醫(yī)師通?？紤]的其它因素。此外，還提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明化合物、其溶劑化物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及結(jié)合有藥學(xué)上可接受載體。特別地，提供用于治療，更具體用于治療疼痛和焦慮的藥物組合物，包含本發(fā)明化合物、其溶劑化物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及結(jié)合有藥學(xué)上可接受載體。此外，提供用于治療上述任何病癥的藥物組合物，包含本發(fā)明化合物、其溶劑化物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及結(jié)合有藥學(xué)上可接受載體。為了從本發(fā)明的化合物制備藥物組合物，惰性、藥學(xué)可接受的載體可以是固體或液體。固體形式的制劑包括粉劑、片劑、可分散顆粒劑、膠囊劑、扁囊劑和栓劑。固體載體可以為一種或多種物質(zhì)，其可以作為稀釋劑、調(diào)味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、粘合劑或片狀崩解劑(tabledisintegratingagents)；其也可以是包封材料。在粉劑中，載體為微細(xì)粉碎固體，其可以為與本發(fā)明微細(xì)粉碎的化合物或者活性組分的混合物。在片劑中，活性組分與具有必要粘合性質(zhì)的載體以合適的比例混合，并壓制成所需的形狀和尺寸。為了制備栓劑組合物，首先熔化低熔點(diǎn)蠟(例如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物)，然后例如通過攪拌，在其內(nèi)分散活性組分。然后將熔化的均勻混合物倒入適當(dāng)尺寸的模具中并使之冷卻和硬化。合適的載體可以為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石、乳糖、蔗糖、果膠、糊精、淀粉、黃蓍膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、低熔點(diǎn)蠟、可可脂等。術(shù)語“組合物”還意圖包括活性組分與作為載體并提供膠囊的包封材料的制劑，其中活性組分(有或沒有其它載體)由此被與之結(jié)合的載體包裹著。相似地，還包括扁囊劑。片劑、粉劑、扁囊劑和膠囊劑可以用作適合口服的固體劑型。液體形式的組合物包括溶液劑、混懸劑和乳劑。例如，活性組分的無菌水或水丙二醇溶液可以為適合腸胃外給藥的液體制劑。液體組合物也可以配制為聚乙二醇水溶液的形式?？诜盟芤嚎梢酝ㄟ^將活性組分溶解在水中并根據(jù)需要加入合適的著色劑、調(diào)味劑、增溶劑和增稠劑來制備?？诜玫暮鞈覄┛梢酝ㄟ^將微細(xì)粉碎的活性組分和粘性材料分散在水中來制備，所述粘性材料例如天然合成膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和藥物配制領(lǐng)域已知的其它懸浮劑?；诮o藥的方式，藥物組合物優(yōu)選地包括0.05％至99w％(重量％)，更優(yōu)選0.10至50w％的本發(fā)明化合物，所有百分比都是基于組合物總重。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以利用已知的標(biāo)準(zhǔn)來確定實(shí)踐本發(fā)明的治療有效量，所述標(biāo)準(zhǔn)包括單個(gè)患者的年齡、體重和反應(yīng)，并可以在正在被治療或預(yù)防的疾病的范圍內(nèi)解釋。另一方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)明人提供制備式I化合物的方法，包括將N，N-二乙基-4-[(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺與R-CH2X或R-CHO反應(yīng)，形成硝基中間體；用合適的還原劑還原所述中間體。其中，R選自2-氟苯基，3-氟苯基和4-氟苯基；并且X選自Cl、I、Br、-OTs(甲苯磺?；?和-OMs(甲磺?；?，mesylate)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述還原劑可選自氫、鋅或鐵。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述N，N-二乙基-4-[(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺可選自N，N-二乙基-4-[(S)-(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺和N，N-二乙基-4-[(R)-(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方式中，R可以是2-氟苯基；式I化合物可以是4-[(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方式中，R可以是3-氟苯基；式I化合物可以是4-[(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺。在另一個(gè)實(shí)施方式中，R可以是4-氟苯基；式I化合物可以是4-[(3-氨基苯基)[4-[(4-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺。更特別地，本發(fā)明化合物和用于制備其的中間體可按照下圖1和2中所示的合成路線制備。方案1方案2生物學(xué)評(píng)價(jià)和性質(zhì)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物對(duì)溫血?jiǎng)游锢缛说摩氖荏w具有活性。特別是發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的化合物為有效的δ受體配體。下文中的體外測定、紅外證明了這些意料不到的活性，尤其是如在大鼠腦功能測定和/或人δ受體功能測定(low)中所證明的有關(guān)激動(dòng)劑效力和功效。該特征可能與體內(nèi)活性有關(guān)并且可能與結(jié)合親和力不呈線性關(guān)系。在這些體外測定中，測試了化合物對(duì)δ受體的活性，并且獲得了IC50，以確定特定化合物對(duì)δ受體選擇性活性。在目前的上下文中，IC50通常指觀察到50％的標(biāo)準(zhǔn)放射性δ受體配體被替換的化合物濃度?；衔飳?duì)κ和μ受體的活性也以類似的試驗(yàn)測定。體外模型細(xì)胞培養(yǎng)將表達(dá)克隆的人κ、δ和μ受體和耐新霉素的人293S細(xì)胞在37℃和5％的CO2下，在含有無鈣DMEM10％FBS、5％BCS、0.1％PluronicF-68和600μg/ml遺傳霉素的搖瓶中懸浮生長。將大鼠腦稱重并且用冰冷卻的PBS(含有2.5mMEDTA，pH7.4)沖洗。將腦在用冰冷卻的溶解緩沖液(50mMTris，pH7.0，2.5mMEDTA，臨用前將苯基甲磺酰氟從0.5M的DMSO乙醇儲(chǔ)液加至0.5mM)中用polytron勻化30秒(大鼠)。膜制備將細(xì)胞沉淀并且再懸浮在溶解緩沖液(50mMTris，pH7.0，2.5mMEDTA，臨用前將PMSF用0.1M乙醇儲(chǔ)液加至0.1mM)中，在冰上培育15分鐘，然后用polytron勻化30秒。在4℃，以1000克(max)離心該懸浮液10分鐘，將上清液保留在冰上并且將沉淀如前面再懸浮并且離心。合并兩次離心的上清液并且以46,000克(max)離心30分鐘。將沉淀再次懸浮在冷Tris緩沖液(50mMTris/Cl，pH7.0)中并且再次離心。將最終的沉淀再次懸浮在膜緩沖液(50mMTris，0.32M蔗糖，pH7.0)中。在干冰/乙醇中冷凍聚丙烯試管中的等分試樣(1ml)并且在-70℃儲(chǔ)存直到使用時(shí)。用十二烷基磺酸鈉改進(jìn)的Lowry試驗(yàn)確定蛋白質(zhì)的濃度。結(jié)合測定在37℃將膜解凍，在冰上冷卻，(或者如果不立刻使用，將其保存在冰上)從25-號(hào)針頭中通過3次，并且稀釋至結(jié)合緩沖液(50mMTris，3mMMgCl2，1mg/mlBSA(SigmaA-7888)，pH7.4中，用0.22m過濾器過濾之后在4℃儲(chǔ)存，并且其中新加入5μ克/毫升的抑肽酶、10μM苯丁抑制素、10μMdiprotinA如果膜來源于組織(大鼠、小鼠、猴子，無DTT)。將100μl等分試樣加入到含有100μl合適的放射性配體和100μl各種濃度被測試的化合物、冰凍的12×75mm聚丙烯的試管中。分別在沒有納洛酮和存在10μM納洛酮下確定總結(jié)合(TB)和非特異性結(jié)合(NS)。將試管渦旋并且在25℃培養(yǎng)60-75分鐘，之后將試管中的物質(zhì)快速地真空過濾并且在0.1％的聚乙烯亞胺中至少預(yù)浸2小時(shí)的GF/B過濾器(Whatman)，用約12ml/試管冰凍的洗滌緩沖液(50mMTris，pH7.0，3mMMgCl2)洗滌。將過濾器浸在含有6-7ml閃爍液的小管形瓶中至少12小時(shí)后，用β計(jì)數(shù)器測量保留在過濾器上的放射性(dpm)。如果該測定在96-位深孔板上進(jìn)行，則通過96-位PEI-浸過的單一過濾器過濾，用3×1ml洗滌緩沖液洗滌，并且在55℃烘箱中干燥2小時(shí)。加入50μlMS-20閃爍液/孔之后，濾板在TopCount(Packard)上計(jì)數(shù)。如果測定在96深孔的孔板上進(jìn)行，用10-點(diǎn)δ置換曲線，和5-點(diǎn)μ和κ置換曲線計(jì)算化合物的IC50。該測定在含有適量的膜蛋白(2μg、35μg和1μg，如果分別采用δ、μ和κ)和50000-80000dpm/孔適當(dāng)?shù)氖聚櫸?125I-DeltorphinII，125I-FK33824和125I-DPDYN分別用于Delta，Mu，和Kappa)的300μl液體中進(jìn)行。總結(jié)合和非特異性結(jié)合在10μM納洛酮存在與不存在的情況下測定。功能測定通過確定化合物受體復(fù)合物激活受體偶合的G-蛋白與GTP的結(jié)合程度，測定化合物的激動(dòng)劑活性。在GTP結(jié)合測定中，將GTP[γ]35S與被測試的化合物及表達(dá)克隆的人的阿片受體的HEK-293S細(xì)胞膜或勻化大鼠和小鼠的腦膜混合。激動(dòng)劑在這些膜中刺激GTP[γ]35S結(jié)合。由劑量-反應(yīng)曲線確定化合物的EC50和Emax值。用由δ拮抗劑納屈吲哚(naltrindole)產(chǎn)生的劑量反應(yīng)曲線右移來驗(yàn)證激動(dòng)劑活性通過δ受體介導(dǎo)。對(duì)于人類δ受體功能測定，當(dāng)測定中所用的人類δ受體的表達(dá)比那些用于測定EC50(high)更低時(shí)，測量EC50(low)。Emax值確定與標(biāo)準(zhǔn)δ激動(dòng)劑SNC80有關(guān)，即高于100％為比SNC80更有效的化合物。大鼠腦GTP測定方法在37℃將大鼠腦膜解凍，從25-號(hào)平端針中通過3次并且在GTPγS結(jié)合液(50mMHepes、20mMNaOH、100mMNaCl、1mMEDTA、5mMMgCl2，pH7.4，新鮮加入1mMDTT，0.1％BSA)中稀釋。向膜稀釋液中加入最終的120μMGDP。由在300μl、用適量的膜蛋白(20μg/孔)和每孔100000-130000dpm的GTPγ35S(0.11-0.14nM)完成的10-點(diǎn)劑量-反應(yīng)曲線，計(jì)算化合物的EC50和Emax值。在無和存在3μMSNC80下確定基礎(chǔ)和最大刺激結(jié)合。該測定在穩(wěn)定表達(dá)克隆Delta受體的HEK293S細(xì)胞上進(jìn)行，所用的緩沖液有少許不同(50mMHepes、20mMNaOH、200mMNaCl、1mMEDTA、5mMMgCl2、pH7.4、新加入0.5％BSA，無DTT)以及3μM最終濃度的GDP。數(shù)據(jù)分析特異性結(jié)合(SB)以TB-NS計(jì)算，并且在各種受試化合物存在下的SB用對(duì)照SB的百分比表示。對(duì)于替換特異性結(jié)合放射性配體的配體，IC50和Hill系數(shù)(nH)值由logit圖或曲線擬合程序如Ligand、GraphPadPrism、SigmaPlot或ReceptorFit計(jì)算。由Cheng-Prussoff方程計(jì)算Ki值。報(bào)告了在至少三個(gè)替換曲線中測試的配體IC50、Ki和nH的平均值±S.E.M.。表1顯示本發(fā)明化合物用上述測定方法測量的生物學(xué)數(shù)據(jù)。N/A無法測得受體飽和實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞膜上用合適的放射性配體，以估計(jì)Kδ值的0.2到5倍的濃度范圍(如果所需放射性配體的量可行，最高可達(dá)10倍)進(jìn)行結(jié)合測定，確定放射性配體的Kδ值。特異性放射性配體結(jié)合表示為pmole/mg膜蛋白。根據(jù)一點(diǎn)(one-site)模型由特異性結(jié)合(B)對(duì)nM游離(F)放射性配體的非線性擬合，獲得每個(gè)實(shí)驗(yàn)的Kδ值和Bmax值。用VonFrey實(shí)驗(yàn)確定機(jī)械性-異常性疼痛(allodynia)用Chaplan等(1994)描述的方法、在08:00和16:00小時(shí)之間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠置于有機(jī)玻璃(Plexiglas)籠內(nèi)，在允許爪子進(jìn)入的絲網(wǎng)底部之上，并使其習(xí)慣10-15分鐘。受試區(qū)域?yàn)樽蠛笞Φ字胁?，避免較不敏感的足墊。將爪與一系列具有對(duì)數(shù)遞增堅(jiān)度(stiffness)(0.41、0.69、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51和15.14克；Stoelting，Ill，USA)的8VonFrey毛發(fā)接觸。將VonFrey毛發(fā)從與跖面垂直的網(wǎng)底下面，以足夠的力量輕輕扣住爪，并保持大約6-8秒。如果爪急促地縮回，表示為陽性反應(yīng)。對(duì)移開毛發(fā)立即產(chǎn)生退縮也認(rèn)為是陽性反應(yīng)。移動(dòng)被認(rèn)為是不明確的反應(yīng)，并且在這種情況下重復(fù)刺激。實(shí)驗(yàn)方案對(duì)FCA-處理組在手術(shù)后的1天測試動(dòng)物。用Dixon(1980)的升降(up-down)方法確定50％的收縮閾值。測試以該系列的中間值2.04克毛發(fā)開始。不論遞增或遞減，刺激始終以連續(xù)方式存在。在爪對(duì)最初選擇的毛發(fā)無縮回反應(yīng)的情況下，進(jìn)行更強(qiáng)的刺激；如果發(fā)生爪縮回反應(yīng)，下次選擇較弱的刺激。用該方法在最接近50％閾值的反應(yīng)中計(jì)算最佳閾值需要6次，并且當(dāng)?shù)谝淮畏磻?yīng)變化出現(xiàn)例如閾值首次交叉時(shí)開始記錄這6次反應(yīng)。當(dāng)閾值在刺激范圍外時(shí)，分別指定15.14(正常敏感性)或0.41(最大異常性疼痛)兩值。按慣例將所得陽性和陰性反應(yīng)的模式列表，X＝無縮回；O＝縮回，50％縮回閾值用下式計(jì)算50％g閾值＝10(Xf+kδ)/10,000其中Xf＝最后所用的vonFrey毛發(fā)的值(對(duì)數(shù)單位)；k＝陽性/陰性反應(yīng)模式的列表值(自Chaplan等(1994))；δ＝刺激之間的平均差(對(duì)數(shù)單位)。在此δ＝0.224。根據(jù)Chaplan等1994，將vonFrey閾值轉(zhuǎn)換成最大可能效應(yīng)的百分比(％MPE)。下列方程用于計(jì)算％MPE受試物質(zhì)的給藥在進(jìn)行vonFrey測試前給大鼠注射(皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)口)受試物質(zhì)，給予受試化合物和vonFrey測試之間的時(shí)間取決于該受試化合物的性質(zhì)而變化。扭曲試驗(yàn)(writhingtest)當(dāng)在小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)給予乙酸時(shí)將引起腹部收縮。然后這些反應(yīng)將以典型模式擴(kuò)展到其身體。當(dāng)給予止痛藥時(shí)，觀察到所述活動(dòng)較不頻繁，并且將該藥選為潛在的好候選藥。僅當(dāng)下列因素存在時(shí)才認(rèn)為是完全并且典型的扭曲反射該動(dòng)物不活動(dòng)；下背輕微降低；兩爪底面可觀察到。在該試驗(yàn)中，經(jīng)口給藥1-100μmol/kg后，本發(fā)明化合物顯示出顯著的扭曲反應(yīng)抑制作用。(i)溶液制備乙酸(AcOH)將120μL乙酸加入到19.88ml蒸餾水中以獲得最終體積為20ml、最終濃度為0.6％AcOH。然后將該溶液混合(渦旋)并等待注射?；衔?藥物)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，在最合適的載體中制備并溶解各化合物。(ii)溶液給藥將化合物(藥物)以10ml/kg(考慮小鼠平均體重)，在測試前20、30或40分鐘(根據(jù)化合物的類別及其性質(zhì))經(jīng)口、腹膜內(nèi)(i.p.)、皮下(s.c.)或靜脈內(nèi)(i.v.)給藥。當(dāng)化合物中樞釋放時(shí)腦室內(nèi)(i.c.v.)或鞘內(nèi)(i.t.)給予5μL體積。在測試前，以10ml/kg(考慮小鼠的平均體重)立即在兩個(gè)部位經(jīng)腹膜內(nèi)(i.p.)給予AcOH。(iii)測試觀察動(dòng)物(小鼠)20分鐘并記錄出現(xiàn)(扭曲反射)的次數(shù)，并且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)匯總。將小鼠置于單獨(dú)的并且具有接觸基床的“鞋盒(shoebox)”籠中。通常同時(shí)共觀察4只小鼠一只對(duì)照和三只給藥。對(duì)焦慮癥和焦慮樣適應(yīng)征，用大鼠geller-seifter沖突實(shí)驗(yàn)確定有效性。對(duì)功能性胃腸道病癥，通過CoutinhoSV等在AmericanJournalofPhysiology-Gastrointestinal&LiverPhysiology.282(2)G307-16，2002年2月所描述的試驗(yàn)用大鼠確定有效性。另外的體內(nèi)試驗(yàn)方案受試動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境將首次接受試驗(yàn)的雄性SpragueDawley大鼠(175-200克)以5只一組，飼養(yǎng)在溫度控制室(22℃，40-70％濕度，12小時(shí)光照/黑暗)。實(shí)驗(yàn)在循環(huán)的光照階段進(jìn)行。動(dòng)物自由進(jìn)食和水且在獲得數(shù)據(jù)后立即被處死。樣品化合物(藥物)測試包括未接受任何處理的大鼠組以及用大腸桿菌(E.coli)脂多糖(LPS)處理的其他組。對(duì)于LPS-處理的實(shí)驗(yàn)，四組用LPS注射，然后四組之一用載體處理而其他三組注射藥物及其載體。進(jìn)行第二批實(shí)驗(yàn)，涉及五組大鼠；所有大鼠均沒有接受LPS處理。首次接受試驗(yàn)的組(group)不接受化合物(藥物)或載體；其他四組用有或無藥物的載體處理。進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)以確定藥物抗焦慮或鎮(zhèn)靜作用，可將其歸因于USV的減少。LPS給藥在處理前使大鼠在實(shí)驗(yàn)室中習(xí)慣15-20分鐘。通過給予LPS(革蘭氏陰性大腸桿菌血清型內(nèi)毒素0111B4，Sigma)誘發(fā)炎癥。在異氟烷麻醉下、用標(biāo)準(zhǔn)立體定位手術(shù)技術(shù)，經(jīng)腦室內(nèi)(i.c.v.)以10μl體積注射LPS(2.4μg)。將耳之間的皮膚以喙?fàn)钔崎_并縱向切開約1cm的切口使頭蓋骨表面暴露。穿刺位置由下列坐標(biāo)確定前囪后O.8mm，人字點(diǎn)(矢狀縫)側(cè)面(左側(cè))1.5mm及側(cè)腦室內(nèi)、頭蓋骨(垂直)表面下5mm。用消毒的5mm長并且由聚乙烯管(PE20；10-15cm)接至100-μlHamilton注射器上的不銹鋼針(26-G3/8)注射LPS。將由穿刺針(20-G)制備的4mm的塞子放置在其上并通過硅樹脂膠固定至26-G針以產(chǎn)生所需的5mm深度。注射LPS之后，再保留針10秒使化合物擴(kuò)散，然后撤去。封閉切口，將該大鼠返回到原先的籠中并使其在測試前休息最少3.5小時(shí)。建立噴氣刺激實(shí)驗(yàn)注射LPS后大鼠保留在實(shí)驗(yàn)室中并給予化合物(藥物)。在測試時(shí)，所有大鼠移開并置于實(shí)驗(yàn)室外。將大鼠一次一只帶進(jìn)測試實(shí)驗(yàn)室并且置于干凈的盒(9×9×18cm)中，然后將該盒置于大小為62(w)×35(d)×46(h)cm(BRS/LVE，Div.Tech-ServInc)的消音并且通風(fēng)的小室中。通過0.32cm的空氣輸出噴嘴輸送噴氣，由能夠輸送固定持續(xù)時(shí)間(0.2秒)和固定強(qiáng)度的空氣噴氣系統(tǒng)(AirStim，SanDiegoIntruments)以每10秒噴1次的頻率控制。最多噴10次或直到開始發(fā)聲，總是首先開始發(fā)聲。第一次空氣噴氣標(biāo)志著記錄的開始。建立超聲記錄實(shí)驗(yàn)用放置在各個(gè)小室內(nèi)并且用LMS(LMSCADA-X3.5B，DataAcquisitionMonitor，Troy，Michigan)軟件控制的麥克風(fēng)(G.R.A.s.聲音和振動(dòng)，Vedbaek，Denmark)記錄發(fā)聲10分鐘。記錄0至32000Hz之間的頻率，保存并用相同的軟件分析(LMSCADA-X3.5B，TimeDataProcessingMonitorandUPA(用戶程序設(shè)計(jì)和分析))?；衔?藥物)將所有化合物(藥物)均調(diào)節(jié)pH為6.5至7.5并且以體積為4ml/kg給藥。給予化合物(藥物)后，將動(dòng)物返回其原先的籠中直到測試時(shí)間。分析將記錄進(jìn)行一系列的統(tǒng)計(jì)和Fourier分析以篩選(在20-24kHz之間)和計(jì)算目標(biāo)參數(shù)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。用T-檢驗(yàn)比較首次接受試驗(yàn)的大鼠和LPS處理大鼠來評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用單側(cè)ANOVA，接著用Dunnett的多重比較檢驗(yàn)(post-hoc)來評(píng)價(jià)藥物的有效性。最小p值≤0.05，則認(rèn)為組間差異顯著。實(shí)驗(yàn)重復(fù)最少兩次。用Hargreaves跖肌試驗(yàn)測定熱刺激痛覺過敏給藥FCA或角叉菜膠Freund’s完全佐劑(FCA)SIGMAcat.#F5881，Mycabacteriumtuberculosis(H37Ra，ATCC25177)，1mg/ml，加熱殺滅，干燥，0.85ml石蠟，0.15ml二縮甘露醇單油酸酯。或角叉菜膠Lambda型IV(Cg)SIGMAcat.#C-3889，(明膠，植物的；Irishmoss)，(1.0％溶液)于NaCl中。用裝備26G5/8”號(hào)的滅菌針頭的Hamilton注射器注射。捉持大鼠并放置在室中用異氟烷麻醉。當(dāng)達(dá)到期望效果時(shí)，移開大鼠并使其處于腹臥位(胸骨位置)。抓緊左后爪，將針頭插入皮下，腹面，在#2和#3爪指的足墊之間，到達(dá)爪子的中部(跖骨部分)。最后，慢慢向爪子注射100μlFCA，或100μl角叉菜膠溶液，除去針頭后，輕輕壓迫3-4秒。如果動(dòng)物在操作中醒來，將其放回吸入室直到到達(dá)期望效果。跖肌內(nèi)(intraplantar)注射后，動(dòng)物其籠子中醒來待觀察。用FCA處理后，等待48小時(shí)大鼠發(fā)展炎癥。用角叉菜膠處理后，等待3小時(shí)大鼠發(fā)展炎癥。在測試初期，大鼠被放置在實(shí)驗(yàn)室(在其籠子里)。使它們有至少30分鐘熟悉場所。測試點(diǎn)熱刺激作用于跖面的中心，在足墊之間。測試點(diǎn)必須與玻璃接觸，其間沒有尿液或糞便，使保持從玻璃到皮膚的正常熱傳遞性質(zhì)。跖肌裝置(plantarapparatus)包括一個(gè)有玻璃頂部/平臺(tái)的盒子，玻璃表面通過內(nèi)部的反饋機(jī)制維持在30℃。在該玻璃平臺(tái)下面，電燈泡安裝在可移動(dòng)臂上，其下面放置一面鏡子，使燈光照射在大鼠爪子下面。當(dāng)燈光打開時(shí)，其通過一個(gè)直徑為～2mm的孔照射。試驗(yàn)者打開燈光，當(dāng)爪子移開時(shí)，自動(dòng)感應(yīng)器會(huì)關(guān)掉燈光；關(guān)閉20.48秒保證不會(huì)發(fā)生組織損傷，使大鼠不能移動(dòng)爪子。試驗(yàn)者也可以在任何時(shí)間關(guān)掉燈光。計(jì)時(shí)器將紀(jì)錄燈光打開的持續(xù)時(shí)間。流量計(jì)測量燈光打開時(shí)的流量/cm2。應(yīng)維持在～97-98；流量可通過調(diào)整跖肌裝置進(jìn)行更改，但不能在試驗(yàn)中間改變。時(shí)間過程本試驗(yàn)可在誘導(dǎo)炎癥之后不同時(shí)間長度時(shí)進(jìn)行。在FCA注射后48h或角叉菜膠注射后3h測量痛覺過敏。試驗(yàn)方案首次接受試驗(yàn)的大鼠(naiverats)為建立劑量響應(yīng)曲線，將一組7只大鼠用作對(duì)照組；它們與其他的28只大鼠被麻醉，但不接受任何注射。首次接受試驗(yàn)的組測試可在試驗(yàn)開始之前或之后立刻進(jìn)行，盡可能減小大鼠的緊張狀態(tài)，將其放在跖肌裝置頂部單獨(dú)的有機(jī)玻璃盒(Plexiglasboxes)(14×21×9cm)中；使它們適應(yīng)環(huán)境30分鐘。當(dāng)動(dòng)物可用于測試，將燈直接放置在測試點(diǎn)下方并打開，紀(jì)錄爪子回縮前的等待時(shí)間。5-8分鐘后，待皮膚溫度恢復(fù)到正常，進(jìn)行第二次讀數(shù)，然后將大鼠放回籠子中?；€值將已經(jīng)注射過FCA(或角叉菜膠)的28只大鼠(分為4組)分別放于機(jī)器上的單獨(dú)盒子中，并讓其適應(yīng)環(huán)境30分鐘。試驗(yàn)者驗(yàn)證爪子炎癥的程度，并察看是否褪色。將熱刺激放置于測試點(diǎn)下方，紀(jì)錄爪子回縮前的等待時(shí)間；如上讀取兩次。將這些基線值與首次接受試驗(yàn)的動(dòng)物的基線值相比較，確定是否痛覺過敏。給藥后測試一旦證實(shí)痛覺過敏，向這些大鼠注射所研究的化合物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作制備每個(gè)化合物，并溶解于最合適的載體中。給藥路徑、劑量、體積、以及注射后測試的時(shí)間對(duì)該化合物(或該類化合物)是特定的。當(dāng)在注射后20-30分鐘測試化合物，例如i.v.或s.c.注射，將大鼠放置在跖肌裝置中并讓其適應(yīng)環(huán)境，同時(shí)等待開始發(fā)揮藥效。當(dāng)在注射后60分鐘或更久測試化合物，將大鼠與其室友放回其原先的籠子中。大鼠通常放于其原先的籠子中與其原先的室友在一起，以使在一組大鼠中重新建立社會(huì)結(jié)構(gòu)的緊張壓力最小。30分鐘后，將大鼠放置于跖肌裝置上，并等待30分鐘讓其適應(yīng)跖肌機(jī)器。測試如上進(jìn)行。讀取兩次數(shù)據(jù)。測試標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)是鎮(zhèn)靜和安靜的，然而是警覺的，并處于正確位置，爪子的皮膚與機(jī)器的玻璃表面之間沒有尿液或糞便。如果有以下狀況，不能測試動(dòng)物-動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)中，包括在嗅聞、理毛和探查。-動(dòng)物在睡眠中。-動(dòng)物明顯表現(xiàn)出緊張的體征(緊張性不動(dòng)、發(fā)聲、耳朵變平)，除非這些可能是藥物的副作用且無法避免。-動(dòng)物放置的方法使爪子不能直接接觸玻璃(爪子靜止放在尾巴端上)；-注射失敗時(shí)動(dòng)物的爪子呈現(xiàn)藍(lán)色。在該情況中，該動(dòng)物完全不能參加試驗(yàn)(在初期)。當(dāng)出現(xiàn)尿液或糞便，移開動(dòng)物，將玻璃表面擦干凈，再重新放置動(dòng)物。當(dāng)動(dòng)物在睡眠，或表現(xiàn)出緊張性不動(dòng)，試驗(yàn)者可輕輕地移動(dòng)盒子，或用手在盒子前面輕輕移動(dòng)，引起大鼠短暫的注意。在整個(gè)試驗(yàn)中都應(yīng)密切觀察動(dòng)物的行為。再測試在試驗(yàn)的任何時(shí)間，如果試驗(yàn)者不確定爪子回縮是對(duì)熱刺激的反應(yīng)，可在5-8分鐘后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行再測試。這可能歸因于動(dòng)物突然活動(dòng)，或在刺激作用時(shí)排尿或排便?？山邮艿姆磻?yīng)下列的任何表現(xiàn)被認(rèn)為是對(duì)熱刺激的反應(yīng)-爪子從玻璃上回縮(之后常常出現(xiàn)舔爪)-身體的側(cè)方運(yùn)動(dòng)(被刺激爪的對(duì)側(cè))-腳趾從玻璃上移開-發(fā)炎爪子的中心面(中爪)從玻璃上移開分析數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SEM表達(dá)。用T-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)首次接受試驗(yàn)組和發(fā)炎大鼠組的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用單側(cè)ANOVA，接著用Dunnett的多重比較檢驗(yàn)(post-hoc)來評(píng)價(jià)藥物的有效性。最小p值≤0.05，則認(rèn)為組間差異顯著。藥物代謝和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)申請(qǐng)人意料不到發(fā)現(xiàn)化合物中一種或多種藥物代謝和藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)得到改進(jìn)，歸因于式I中芐基-哌嗪部分中下部的芐基的氟取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)由于本發(fā)明的化合物，某些反應(yīng)代謝產(chǎn)物減少或消除。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的一些化合物由于其對(duì)2D6和3A4細(xì)胞色素P450弱親和力而提供改善的生物利用度。下列測定方法證明這些化合物的一個(gè)或多個(gè)意料不到的性質(zhì)。微粒體培養(yǎng)將本發(fā)明的化合物(10μM標(biāo)稱起始濃度)獨(dú)立地與大鼠肝臟微粒體(0.5mg/ml蛋白)在0.1MKH2PO4緩沖液(pH7.4)，以及5mMMgCl2和5mM捕集試劑(谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)，或者CH3ONH2)中，在37℃下培養(yǎng)60分鐘。向培養(yǎng)混合物加入NADPH(1mM)使反應(yīng)開始，加入等量酸化(0.1％甲酸的乙腈溶液)使反應(yīng)終止。肝細(xì)胞培養(yǎng)將本發(fā)明的化合物(10μM標(biāo)稱起始濃度)獨(dú)立地與新鮮分離的大鼠(SpragueDawley)肝細(xì)胞和冷藏保存的狗(Beagle)肝細(xì)胞(1×106細(xì)胞/mL)在pH7.4，37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。肝細(xì)胞培養(yǎng)混合物包含的WilliamsE介質(zhì)，補(bǔ)無有25mMHEPES、1％ITS-G溶液(LifeTechnologies，Cat.No.41400-045)、10mMHEPES(pH7.4)和2mML-谷氨酰胺。向培養(yǎng)混合物中加入等量酸化(0.1％甲酸的乙腈溶液)使反應(yīng)終止。LS-MS分析蛋白沉淀后，用LC-MS完全掃描測定樣品上清液的代謝產(chǎn)物。獲得每種被檢測的代謝產(chǎn)物的分子量信息。從附加的LC-MS/MS試驗(yàn)獲得的裂解譜幫助確定初級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。儀器HPLCHP1100HPLCSystem(HewlettPackard，D-76337Waldbronn，Germany)MSLCQ(FinniganCorporation，355RiverOaksParkway，SanJose，CA)MS條件(LCQ)源電壓4.5Kv毛細(xì)管溫度180℃護(hù)套氣流80Aux氣流5來源類型EPI電離方式正HPLC條件柱PhenomenexSynergiMAX-RP，4μ，2.0×150mm(Phenomenex，Torrance，CA)流動(dòng)相A＝0.1％甲酸水溶液，B＝ACN流速0.2mL/min溫度45℃檢測儀LCQ質(zhì)譜儀梯度法時(shí)間AB0901030406030.1109033109033.19010409010試驗(yàn)結(jié)果用于觀測化合物的主要生物轉(zhuǎn)化路徑是N-脫乙烷化，N-脫烷烴化和羥基化。對(duì)于具有氟取代的芐基-哌嗪基部分的本發(fā)明化合物，在大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)物中沒有檢測到苯上的谷胱甘肽加合物。相反的，對(duì)于沒有氟取代的芐基環(huán)的類似化合物，在大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測到所述環(huán)上的一些谷胱甘肽加合物。體內(nèi)微量滲析方法步驟把大鼠隨機(jī)分成八個(gè)處理組載體安靜，載體應(yīng)激，藥物安靜，藥物應(yīng)激。在試驗(yàn)前2小時(shí)把微透析探針(CMA/12，對(duì)mPFC，4mm膜長度)植入腦中，并且使用流速為1.1mL/min的人工CSF(aCSF，CMAMicrodialysisAB)灌注2小時(shí)以穩(wěn)定基線。采集三個(gè)20分鐘樣本以定義基線，經(jīng)由腹膜內(nèi)對(duì)動(dòng)物注射載體或化合物，并且在隨后的5小時(shí)內(nèi)進(jìn)行樣本采集。在化合物給藥后20分鐘開始應(yīng)激反應(yīng)范例程序。立即(在線)在HPLC系統(tǒng)上對(duì)樣本進(jìn)行注射以分析一元胺的濃度。將在給藥化合物/載體前采集的三個(gè)樣本中的神經(jīng)傳遞素濃度進(jìn)行平均，定義為基線(100％)。然后，隨后的微透析法中的神經(jīng)傳遞素濃度表示為基線水平的百分比形式。應(yīng)激反應(yīng)操作在應(yīng)激反應(yīng)操作中，使用配有光，緊張和震動(dòng)器的標(biāo)準(zhǔn)被動(dòng)避免盒(MedAssociates，Inc)。盒子放置在消音室中。應(yīng)激反應(yīng)范例在一天內(nèi)發(fā)生。動(dòng)物在2小時(shí)內(nèi)適應(yīng)該室，然后在6分鐘內(nèi)，暴露在一系列的閃光中，隨后是電足擊(持續(xù)時(shí)間0.5秒，強(qiáng)度1.5mA，總共10次電擊)?！鞍察o”組是指暴露于帶有光的室中，但是沒有進(jìn)行震動(dòng)。40分鐘后繼續(xù)重復(fù)動(dòng)物的光刺激，但是不進(jìn)行震動(dòng)。給藥所有化合物均溶解于無菌蒸餾水(載體)并在應(yīng)激反應(yīng)操作前20分鐘向腹膜內(nèi)(IP)給藥。HPLC和電化學(xué)檢測HPLC系統(tǒng)包括5041泵，Model5200ACoulochemII監(jiān)測器，MD-1503×150mm柱，model5041安培計(jì)單元(都來自ESAInc)以及在線注射器(來自BASInc)。流動(dòng)相是75mMNa2HPO4，25mMEDTA，1.7mM1-辛烷硫酸，100μl/L三乙胺，10％乙腈，pH3.0。電位設(shè)置為+0.65V，流速持續(xù)在0.3ml/min。使用基于PC的采集/分析系統(tǒng)(501ComputerandA/DSoftware，ESA，Inc)收集數(shù)據(jù)，積分并傳送到試算表/圖解軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。對(duì)6-8只大鼠一組，將大腦內(nèi)微量滲析探針放置在內(nèi)側(cè)的額前皮質(zhì)(此處神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)信號(hào)最強(qiáng))，對(duì)大鼠進(jìn)行上述的條件反射規(guī)范，在用載體處理的動(dòng)物中觀察到去甲腎上腺素(NE)和多巴胺增加。本發(fā)明化合物阻斷NE和多巴胺的持續(xù)增加。Geller-Siefter-焦慮模型方法在沖突試驗(yàn)中，饑餓的動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)操作室中，被訓(xùn)練成在兩種條件下壓迫杠桿得到食物。第一個(gè)條件，是非壓迫性部分，當(dāng)平均17次壓迫杠桿后，食物被運(yùn)送到(也稱為VR17強(qiáng)化方案)。第二個(gè)條件，壓迫性部分，其通過在操作室內(nèi)的閃光發(fā)出信號(hào)，當(dāng)平均17次壓迫杠桿后，食物也被運(yùn)送，但在單獨(dú)的VR17方案內(nèi)，還另外對(duì)籠子底進(jìn)行電擊。每日試驗(yàn)包括5個(gè)交替出現(xiàn)的每個(gè)部分壓迫性(持續(xù)3分鐘)以及非壓迫性(持續(xù)3分鐘)。壓迫性部分中的壓迫杠桿的次數(shù)明顯比非壓迫性部分中的低?？菇箲]藥，例如地西泮，在一定劑量范圍內(nèi)能增加動(dòng)物在壓迫性部分壓迫杠桿的次數(shù)，而不會(huì)改變在非壓迫性部分壓迫杠桿的次數(shù)。本發(fā)明的化合物在該試驗(yàn)中表現(xiàn)出抗焦慮作用。實(shí)施例本發(fā)明將通過下列實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述，這些實(shí)施例將描述本發(fā)明化合物如何制備、純化、分析以及生物學(xué)檢測，并且不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。中間體14-碘-N，N-二乙基苯甲酰胺在0℃下向4-碘-苯酰氯(75g)在500mLCH2Cl2中的混合物中加入Et3N(50mL)和Et2NH(100mL)的混合物。加入后，所得反應(yīng)混合物在1小時(shí)內(nèi)回溫至室溫，并用飽和氯化銨洗滌。有機(jī)萃取物經(jīng)干燥(Na2SO4)、過濾并濃縮。殘余物從熱己烷中重結(jié)晶，得到80g中間體1。中間體24-[羥基(3-硝基苯基)甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺將N，N-二乙基-4-碘苯甲酰胺(5.0g，16mmol)溶解于THF(150mL)并在氮?dú)鈿夥障吕鋮s至-78℃。在-65至-78℃下，在10min內(nèi)逐滴加入n-BuLi(15mL，1.07M己烷中的溶液，16mmol)。在-78℃下將溶液通過導(dǎo)管加入到3-硝基苯甲醛(2.4g，16mmol)在甲苯/THF(約1∶1，100mL)的溶液中。30min后加入NH4Cl(水溶液)。有機(jī)相經(jīng)真空濃縮，用EtOAc/water萃取，干燥(MgSO4)并蒸發(fā)，殘余物經(jīng)硅膠色譜(0-75％EtOAc/庚烷)純化得到中間體2(2.6g，50％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δH1.0-1.3(m，6H)，3.2(m，2H)，3.5(m，2H)，5.90(s，1H)，7.30-7.40(m，4H)，7.50(m，1H)，7.70(d，J＝8Hz，1H)，8.12(m，1H)，8.28(m，1H)。中間體3N，N-二乙基-4-[(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺向醇中間體2(10.01g，30.5mmol)在二氯甲烷(200mL)的溶液中加入亞硫酰溴(2.58mL，33.6mmol)。室溫中1小時(shí)后，反應(yīng)物用飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)洗滌，并分離有機(jī)層。用二氯甲烷(3×100mL)洗滌水層，合并有機(jī)相并干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮。將粗制的芐基溴溶解于乙腈(350mL)，并加入哌嗪(10.5g，122mmol)。在65℃下加熱反應(yīng)物1小時(shí)后，用飽和氯化銨/乙酸乙酯洗滌并分離有機(jī)層。水層用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，合并有機(jī)相經(jīng)干燥(Na2SO4)，過濾和濃縮得到外消旋的中間體3。中間體4bN，N-二乙基-4-[(R)-(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺將外消旋的中間體3溶解于乙醇(150mL)，并加入二對(duì)甲苯酰-D-酒石酸(11.79g，1當(dāng)量)。產(chǎn)品在12小時(shí)內(nèi)析出。過濾收集固體，并重新溶解于回流的乙醇中，直到所有固體溶解(約1200mL乙醇)。固體冷卻后，過濾收集并重復(fù)重結(jié)晶一次。過濾收集固體，并用氫氧化鈉水溶液(2M)處理，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)萃取物經(jīng)干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮得到1.986g中間體4b。1HNMR(400MHz，CDCl3)δH1.11(brs，3H)，1.25(brs，3H)，2.37(brs，4H)，2.91(t，J＝5Hz，4H)，3.23(brs，2H)，3.52(brs，2H)，4.38(s，1H)，7.31-7.33(m，2H)，7.41-7.43(m，2H)，7.47(t，J＝8Hz，1H)，7.75-7.79(m，1H)，8.06-8.09(m，1H)，8.30-8.32(m，1H)。在HPLC上用以下條件測定手性純度ChiralpackAD柱(DaicelChemicalIndustries)低速1ml/分鐘25℃下洗脫30分鐘等度的15％乙醇(含有0.1％v/v二乙基胺)和85％己烷(含有0.1％v/v二乙基胺)分子的停留時(shí)間＝20分鐘中間體4aN，N-二乙基-4-[(S)-(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺(S)對(duì)映異構(gòu)體中間體4a可通過上述拆分操作將上述溶液與二對(duì)甲苯酰-L-酒石酸反應(yīng)獲得?；衔?4-{(S)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟芐基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺向中間體4a(467mg)在1，2-二氯乙烷(13ml)中的溶液中加入4-氟苯甲醛(252μL；2當(dāng)量)以及三乙酰氧基硼氫化鈉(498mg；2當(dāng)量)。反應(yīng)物在室溫下于氮?dú)夥罩袛噭?dòng)18小時(shí)并濃縮。加入飽和碳酸氫鈉，用三份二氯甲烷萃取水層，合并的有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將化合物溶解于乙醇，四氫呋喃，水和飽和氯化銨(4ml；比例4∶2∶1∶1v/v)的混合物。加入納米鐵顆粒(3刮刀末端量)，所得溶液在微波爐中于150℃下加熱10分鐘。所得混合物冷卻，用硅藻土過濾并濃縮。殘余物通過硅膠快速色譜純化，用1％至5％MeOH的二氯甲烷梯度溶液洗脫。獲得的產(chǎn)品溶解于二氯甲烷中，其中已加入有1.2mL1MHCl的乙醚溶液。除去溶劑分離出無色固體產(chǎn)品即化合物1的鹽酸鹽(164mg，30％產(chǎn)率)。純度(HPLC)＞99％；光學(xué)純度(手性HPLC)＞99％；1HNMR(400MHz，CD3OD)，1.08(t，J＝6.5Hz，3H)，1.21(t，J＝6.5Hz，3H)，3.20-3.26(m，4H)，3.51-3.54(m，6H)，4.43(s，2H)，7.19-7.23(m，2H)，7.34(d，J＝8.0Hz，1H)，7.40(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.63(m，3H)，7.70-7.82(m，4H).實(shí)驗(yàn)值C，54.63；H，6.49；N，8.68.C29H36N4OF×4.1HCl×0.8H2O×0.1C4H10O的理論值C，57.67；H，6.51；N，8.67％?；衔?4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟芐基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺向中間體4b(5.790g，14.6mmol)在1，2-二氯乙烷(60mL)的溶液中加入4-氟苯甲醛(2.04mL，19.0mmol)以及三乙酰氧基硼氫化鈉(4.02g，19.0mmol)。室溫下20小時(shí)后，用碳酸氫鈉水溶液中止反應(yīng)，并分離有機(jī)相。水層用二氯甲烷(3×100mL)萃取，合并的有機(jī)萃取物經(jīng)干燥(Na2SO4)，過濾和濃縮。殘余物經(jīng)快速色譜純化，用30％至50％丙酮的己烷溶液洗脫，得到無色泡沫(5.285g，71％)，其為硝基中間體。將該硝基中間體(5.285g，10.4mmol)溶解于乙醇，四氫呋喃，水和飽和氯化銨水溶液(比例4∶2∶1∶1v/v)的混合物(100mL)中，并加入鐵顆粒(0.63mg，11.5mmol)。反應(yīng)物加熱回流，定期加入更多的鐵顆粒?；亓?90℃)24小時(shí)后，反應(yīng)物冷卻至室溫，用硅藻土過濾并濃縮。向殘余物中加入碳酸氫鈉溶液和二氯甲烷。分離有機(jī)層，用二氯甲烷(3×100mL)萃取水層，合并的有機(jī)相經(jīng)干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮。產(chǎn)品在硅膠上純化，用1％至5％甲醇的二氯甲烷溶液洗脫得到淺黃色泡沫化合物2(3.505g)。從上述快速色譜中另外獲得的不純的物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行第二次快速色譜，以純化，用100％乙酸乙酯至5％甲醇的乙酸乙酯溶液洗脫再得到0.949g化合物2。一共獲得物質(zhì)4.454g(90％產(chǎn)率)。純度(HPLC)＞99％；光學(xué)純度(手性HPLC)＞99％；1HNMR(400MHz，CD3OD)，1.08(t，J＝6.5Hz，3H)，1.21(t，J＝6.5Hz，3H)，3.20-3.26(m，4H)，3.51-3.54(m，6H)，4.43(s，2H)，7.19-7.23(m，2H)，7.34(d，J＝8.0Hz，1H)，7.40(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.63(m，3H)，7.70-7.82(m，4H)。實(shí)驗(yàn)值C，54.00；H，6.34；N，8.47.C29H35FN4O×4.7HCl×0.2C4H10O×0.1H2O理論值C，54.02；H，6.37；N，8.46％。化合物34-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺向中間體4b(298mg，0.752mmol)在1，2-二氯乙烷(8.5ml)中的溶液中加入2-氟苯甲醛(160mg，1.503mmol，2當(dāng)量)以及三乙酰氧基硼氫化鈉(319mg，1.503mmol，2當(dāng)量)。反應(yīng)物在室溫下于氮?dú)夥罩袛噭?dòng)18小時(shí)后，濃縮。加入飽和的碳酸氫鈉，水溶液用三份二氯甲烷萃取，合并的有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將化合物溶解于乙醇，四氫呋喃，水和飽和氯化銨(3ml；比例4∶2∶1∶1v/v)的混合物中。加入納米鐵顆粒(3刮刀末端量)，所得溶液在微波爐中150℃下加熱10分鐘。所得混合物冷卻后，用硅藻土過濾并濃縮。將粗制品溶解于CH2Cl2并用水洗滌。分離有機(jī)層，水層用二氯甲烷萃取。合并的有機(jī)層經(jīng)干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮。產(chǎn)品經(jīng)反相HPLC(5-50％CH3CN/H2O梯度溶液，包含0.1％TFA)純化得到化合物3，為TFA鹽(0.28g，46％產(chǎn)率)。該物質(zhì)從CH3CN/H2O中凍干，形成淺黃色粉末。1HNMR(400MHz，CD3OD)1.08(t，J＝6.6Hz，3H)，1.22(t，J＝6.6Hz，3H)，2.39(brs，2H)，3.02(brs，2H)，3.18-3.38(m，4H)，3.43(brs，2H)，3.52(q，J＝6.8Hz，2H)，4.43(s，2H)，4.53(s，1H)，7.09(dt，J＝2.3，6.8Hz，1H)，7.24-7.30(m，1H)，7.30-7.41(m，6H)，7.52-7.60(m，4H).C29H35FN4O×2.8TFA×0.4H2O的理論值C，51.88；H，4.86；N，6.99.實(shí)驗(yàn)值C，51.89；H，4.89；N，6.97％.M.S.(理論值)475.3(MH+)，M.S.(實(shí)驗(yàn)值)475.2(MH+).HPLCk’2.35；純度＞99％(215nm)，＞99％(254nm)，＞99％(280nm).HPLC條件ZorbaxC-18，梯度10-95％B，流速1mL/min，25℃，A0.1％TFA的H2O溶液，B0.1％TFA的MeCN溶液。旋轉(zhuǎn)[α]16D＝-8.91(c＝1.179，MeOH)?；衔?4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺向中間體4b(281mg，0.709mmol)在1，2-二氯乙烷(8ml)中的溶液中加入3-氟苯甲醛(180mg，1.417mmol，2當(dāng)量)以及三乙酰氧基硼氫化鈉(300mg，1.417mmol，2當(dāng)量)。反應(yīng)物在室溫下于氮?dú)夥罩袛噭?dòng)18小時(shí)，并濃縮。加入飽和的碳酸氫鈉，水層用三份二氯甲烷萃取，合并的有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾并濃縮。將產(chǎn)品溶解于乙醇，四氫呋喃，水和飽和氯化銨(3ml；比例4∶2∶1∶1v/v)的混合物中。加入納米鐵顆粒(3刮刀末端量)，所得溶液在微波爐中150℃下加熱10分鐘。所得混合物冷卻后，用硅藻土過濾并濃縮。將所得產(chǎn)品溶解于CH2Cl2并用水洗滌。分離有機(jī)層，水層用二氯甲烷萃取。合并的有機(jī)層經(jīng)干燥(Na2SO4)，過濾并濃縮。產(chǎn)品經(jīng)反相HPLC(5-50％CH3CN/H2O梯度溶液，包含0.1％TFA)純化得到化合物4，為TFA鹽(0.375g，65％產(chǎn)率)。該物質(zhì)從CH3CN/H2O中凍干得到淺黃色固體。1HNMR(400MHz，CD3OD)1.08(t，J＝6.4Hz，3H)，1.21(t，J＝6.8Hz，3H)，2.38(brs，2H)，3.00(brs，2H)，3.16-3.28(m，4H)，3.40(brs，2H)，3.51(q，J＝6.8Hz，2H)，4.37(s，2H)，4.56(s，1H)，7.18(ddd，J＝1.2，2.3，7.8Hz，1H)，7.24(ddd，J＝1.0，2.7，8.8Hz，1H)，7.28-7.38(m，4H)，7.55(d，J＝8.2Hz，2H).C29H35FN4O×2.7TFA×1.1H2O理論值C，51.50；H，5.01；N，6.98.實(shí)驗(yàn)值C，51.52；H，5.01；N，6.87％.M.S.(理論值)475.3(MH+)，M.S.(實(shí)驗(yàn)值)475.2(MH+).HPLCk’2.43；純度＞99％(215nm)，＞99％(254nm)，＞99％(280nm).HPLC條件ZorbaxC-18，梯度10-95％B，流速1mL/min，25℃，A0.1％TFA的H2O溶液，B0.1％TFA的MeCN溶液.旋轉(zhuǎn)[α]16D＝-8.94(c＝1.04，MeOH)。權(quán)利要求1，式I的化合物，其藥學(xué)上可接受鹽，其溶劑化物、其前藥，其非對(duì)映異構(gòu)體，其一種或多種對(duì)映異構(gòu)體，及它們的混合物2.權(quán)利要求1所述的化合物，其藥學(xué)上可接受鹽，其溶劑化物、其前藥，其非對(duì)映異構(gòu)體，其一種或多種對(duì)映異構(gòu)體，及它們的混合物，其中所述化合物選自其藥學(xué)上可接受的鹽，一種或多種分離的對(duì)映異構(gòu)體及其混合物。3.權(quán)利要求1所述的化合物，其藥學(xué)上可接受鹽，其溶劑化物、其前藥，其非對(duì)映異構(gòu)體，其一種或多種對(duì)映異構(gòu)體，及它們的混合物，其中所述化合物選自及其藥學(xué)上可接受的鹽。4.權(quán)利要求1所述的化合物，其藥學(xué)上可接受鹽，其溶劑化物、其前藥，其非對(duì)映異構(gòu)體，其一種或多種對(duì)映異構(gòu)體，及它們的混合物，其中所述化合物選自及其藥學(xué)上可接受的鹽。5.權(quán)利要求1所述的化合物，其藥學(xué)上可接受鹽，其溶劑化物、其前藥，其非對(duì)映異構(gòu)體，其一種或多種對(duì)映異構(gòu)體，及它們的混合物，其中所述化合物選自及其藥學(xué)上可接受的鹽。6.權(quán)利要求1所述的化合物，其藥學(xué)上可接受鹽，其溶劑化物、其前藥，其非對(duì)映異構(gòu)體，其一種或多種對(duì)映異構(gòu)體，及它們的混合物，其中所述化合物選自及其藥學(xué)上可接受的鹽。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物，其藥學(xué)上可接受鹽，其溶劑化物、其前藥，其非對(duì)映異構(gòu)體，其一種或多種對(duì)映異構(gòu)體，及它們的混合物，其用作藥物。8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物在制備治療疼痛，焦慮或抑郁的藥物中的用途。9.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物和藥學(xué)上可接受載體。10.一種治療溫血?jiǎng)游锾弁吹姆椒ǎㄏ蛐枰@種治療的動(dòng)物給藥治療有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物的步驟。11.一種治療溫血?jiǎng)游锝箲]的方法，包括向需要這種治療的動(dòng)物給藥治療有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物的步驟。12.一種治療溫血?jiǎng)游镆钟舻姆椒ǎㄏ蛐枰@種治療的動(dòng)物給藥治療有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物的步驟。13.一種治療溫血?jiǎng)游锱两鹕〉姆椒ǎㄏ蛐枰@種治療的動(dòng)物給藥治療有效量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的化合物的步驟。14.制備式I化合物的方法，包括將N，N-二乙基-4-[(3-硝基苯基)(1-哌嗪基)甲基]苯甲酰胺與R-CH2X或R-CHO反應(yīng)形成中間體化合物；用合適的還原劑還原中間體化合物，其中R選自2-氟苯基，3-氟苯基和4-氟苯基；并且X選自Cl、I、Br、-OTs(甲苯磺酰基)和-OMs(甲磺?；?。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中還原劑選自氫，鋅和鐵。16.一種化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽，所述化合物選自對(duì)映異構(gòu)體純的4-{(S)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟芐基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；對(duì)映異構(gòu)體純的4-{(R)-(3-氨基苯基)[4-(4-氟芐基)哌嗪-1-基]甲基}-N，N-二乙基苯甲酰胺；對(duì)映異構(gòu)體純的4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(2-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺；和對(duì)映異構(gòu)體純的4-[(R)-(3-氨基苯基)[4-[(3-氟苯基)甲基]-1-哌嗪基]甲基]-N，N-二乙基苯甲酰胺。專利摘要制備下列式的化合物，和其鹽，對(duì)映異構(gòu)體，以及包含該化合物的藥物組合物。它們用于治療，尤其用于治療疼痛，抑郁和焦慮。文檔編號(hào)A61K31/495GK1993338SQ20058002627公開日2007年7月4日申請(qǐng)日期2005年7月27日發(fā)明者威廉·布朗,安德魯·格里芬,托馬斯·赫德齊克,卡拉·馬西亞格,蓋納迪·斯馬金,克里斯托弗·沃波爾申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX,EndNote,RefMan