專利名稱：利用水稻轉錄因子基因snac2提高植物耐冷耐鹽能力的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領域。具體涉及一種水稻DNA片段(基因)的分離克隆、功能驗證和應用。所述的基因與植物耐冷和耐鹽有關。將該基因的完整翻譯區(qū)(Coding sequence)與玉米的強啟動子(Ubiquitin1)結合后直接轉入一般植物體，轉基因植株的耐冷和耐鹽能力顯著提高。
背景技術：
植物在生長的過程中會受到諸多環(huán)境因素的影響，干旱、鹽害和低溫往往導致農(nóng)作物的大規(guī)模減產(chǎn)，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。為了抵抗或適應環(huán)境不利因素，植物體感受細胞外環(huán)境條件的變化并通過多種途徑將其傳遞到細胞內(nèi)，會誘導表達一些應答基因，產(chǎn)生一些使細胞免受干旱、高鹽、低溫等脅迫傷害的功能蛋白、滲透調(diào)節(jié)物質以及傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉錄因子，從而對外界的變化做出相應的反應(Xiong等Cell signaling during cold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。而那些功能基因對環(huán)境做出反應的過程中能否正確表達受到調(diào)控因子特別是轉錄因子的精細調(diào)節(jié)。而目前在許多植物中發(fā)現(xiàn)AP2/EREBP，Zinc finger，Myb，bZIP和NAC類轉錄因子家族在不同的逆境脅迫下，可誘導表達或被抑制，因而認為這些轉錄因子家族在植物對逆境的應答過程中起著非常重要的調(diào)控作用。因此分離和鑒定對逆境起核心調(diào)控作用的轉錄因子，并用于作物抗逆境的遺傳改良，對育種有著重要的意義。目前人們已在植物抗性改良方面作了嘗試，利用DREB1A和DREB2A培育的轉基因擬南芥植株，其低溫耐性和干旱，高鹽耐性都比野生型強(Liu Q等Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with anEREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.1998，101391-1406.)。美國Michigan州立大學的Thomashow MF研究小組利用擬南芥CBF1基因，進行遺傳轉化，也培育出耐寒性增強的植株。
水稻是最重要的糧食作物之一，耐冷或耐鹽的水稻對我們來說具有重要的意義，因而找出與抗冷或耐鹽的轉錄因子，培育耐冷和耐寒的品種對提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個包含有耐冷和耐鹽相關轉錄因子基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用這個基因改良水稻或其它植物的抗逆性。對這個基因進行結構分析其屬于植物特異的轉錄因子NAC家族，而且是與逆境相關的，因此被命名為SNAC2。
本發(fā)明涉及分離和應用一種包含SNAC2基因的DNA片段，該片段賦予植物在低溫等逆境條件下，增強耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當于SEQ IDNO1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的SNAC2基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技術，從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的SNAC2基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術，可以分離得到包含SNAC2基因的序列，將這一序列與任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體轉化植株，可獲得對低溫，高鹽脅迫耐受力得到增強的轉基因植株。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種強啟動子或誘導型啟動子。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時，也可使用增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。
攜帶有本發(fā)明SNAC2基因的表達載體可通過使用Ti質粒，植物病毒載體，直接DNA轉化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞(Weissbach，1998，Method for Plant MolecularBiology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant MolecularBiology(2ndEdition)。
可使用包括本發(fā)明的SNAC2基因的表達載體轉化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育抗鹽或抗寒的植物品種。
本發(fā)明基因是受逆境誘導表達的，因此其啟動子是誘導型啟動子，將本發(fā)明的啟動子區(qū)段與任何感興趣的基因同時連入合適的表達載體，并轉化植物宿主，在逆境條件下可誘導表達基因，提高植物對逆境的耐受能力。
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


序列表SEQ ID NO1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有SNAC2基因編碼區(qū)DNA片段序列。其中SEQ ID NO1中第112-1023位堿基所示的序列為編碼區(qū)(CDS)圖1SNAC2基因分離和鑒定流程圖。
圖2用Northern雜交檢測SNAC2基因在干旱，高鹽，低溫和ABA等逆境脅迫不同時間點的表達水平。
圖3是本發(fā)明構建的SNAC2基因超量表達載體pU1301-SNAC2。
圖4SNAC2基因在轉基因植株中的表達情況，第一道為對照，其余為轉基因獨立轉基因植株。
圖5苗期SNAC2超量表達轉基因家系在低溫脅迫后恢復期的生長情況。其中，每個小紅桶一半種植對照，一半為本發(fā)明的轉基因植株。低溫脅迫為4℃生長箱16小時光照/8小時黑暗脅迫5天，然后在正常條件恢復生長。
圖6苗期SNAC2超量表達轉基因家系在高鹽中的生長情況。發(fā)芽4天的幼苗轉至含有150mM NaCl的MS培養(yǎng)基中生長18天后的圖片(A)及株高和根長的統(tǒng)計結果(B)。
圖7酵母中的反式激活實驗和酵母單雜交實驗驗證SNAC2具有轉錄激活和DNA結合的特性。A為反式激活實驗；B為酵母單雜交實驗。
圖8SNAC2基因在植物細胞內(nèi)的亞細胞定位。其中A為構建的載體示意圖；B為在共聚焦顯微鏡的觀察結果，(i)為愈傷切片在熒光染料碘化丙啶染色后觀察的結果，(ii)為綠色熒光下GFP表達的圖像，(iii)為紅綠熒光合成的結果。
圖9是本發(fā)明用于構建融合表達基因的載體載體(pCAMBIA1391U-EGFP)具體實施方式
本發(fā)明的前期工作獲得了來源于水稻品種明恢63(一種中國普遍推廣應用的一個水稻品種)的cDNA克隆99C10。該cDNA是SNAC2基因的全長cDNA，是一個抗旱相關轉錄因子。主要依據(jù)有以下幾個方面(1)采用cDNA芯片數(shù)據(jù)(未發(fā)表)分析發(fā)現(xiàn)cDNA克隆99C10在水稻品種“中旱5號”(由中國上海農(nóng)科院提供的一個公開使用的一個水稻品種)干旱脅迫處理15天表達量增加3.5倍。對其進行測序，分析發(fā)現(xiàn)該基因就是OsNAC6(Genebank數(shù)據(jù)庫登錄號為AK068392)。鑒于該克隆表達量在干旱處理后的明顯差異和其功能特征，認為99C10克隆所代表的基因在逆境下參與調(diào)控基因的表達。(2)對其進行逆境條件下的表達譜分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)在脅迫處理的過程中，表達量有明顯的提高。(3)，將其全長基因在植株中超量表達，轉基因植株的耐冷性和抗高鹽能力大大增強(圖4和圖5)。這些結果都表明SNAC2基因是一個逆境相關調(diào)控基因，不僅參與調(diào)控抗旱，也參與調(diào)控抗高鹽和寒冷。
以下實施例進一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎上分離克隆包含有SNAC2基因完整編碼區(qū)段的DNA片段以及驗證SNAC2基因功能的方法(發(fā)明流程如圖1所示)。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例1分離克隆包含有SNAC2基因區(qū)段的DNA片段通過水稻品種“中旱5號”(由中國上海農(nóng)科院提供的一個公開使用的一個水稻品種)的干旱誘導基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個受干旱強烈誘導(干旱脅迫后期表達量提高3.5倍以上)的EST(表達序列標簽)，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因為轉錄因子家族NAC的一個成員，并且是全長序列，其對應日本水稻全長數(shù)據(jù)庫(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)中的cDNA克隆J013149P14。根據(jù)該克隆序列，本發(fā)明設計了引物T050F，該引物的序列如下所示(5’-CAGGTACCGCCAAGCCCTCCTCTCCTCTTCCCAT-3’，序列特異引物外加接頭KpnI位點)和T050R(5’-CAGGATCCCCTCGTCGTCGTTCAGTCC-3’，序列特異引物外外加接頭BamHI)，將該克隆的1-1269bp序列從“中旱5號”品種中反轉錄擴增出來。擴增產(chǎn)物就是本發(fā)明的序列1-1269bp(該序列在本發(fā)明的SEQ ID NO中，其表達載體pU1301-SNAC2參見圖3)。具體步驟為采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)從干旱脅迫處理的水稻品種“中旱5號”中提取葉片總RNA(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉錄酶(購自Invitrogen公司)將其反轉錄合成cDNA第一鏈，反應條件為65℃5min，42℃50min，70℃10min。根據(jù)cDNA克隆J013149P14的序列設計的巢式引物將其從反轉錄產(chǎn)物中擴增出來，反應條件為94℃預變性2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的全長基因。該克隆命名為PGEM-SNAC2。
實施例2檢測水稻內(nèi)源基因SNAC2的誘導表達以水稻品種“中旱5號”為材料，在3葉期分別進行干旱、冷害和高鹽脅迫以及ABA(脫落酸)處理。干旱處理是用20％的聚乙二醇(商品名為PEG6000)浸泡幼苗根部，分別于0h，0.5h，1h，2h，4h，6h后取樣。冷害處理是將上述水稻幼苗置于4℃生長箱，0h，1h，8h，12h后取樣。高鹽脅迫是將幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中并在0h，4h，8h，16h后取樣。ABA處理是將幼苗根部浸泡在100μM/L ABA溶液中并在0h，0.5h，3h，6h，12h和24h后取樣。提取葉片的總RNA(Trizol試劑，購自Invitrogen公司)后按Sambrook等的《分子克隆》(科學出版社，北京，1999年版)有關實驗操作方法進行RNA轉膜，并以SNAC2為探針做Northern雜交。結果表明，本發(fā)明克隆的基因SNAC2能被干旱、冷害、高鹽和脫落酸(ABA)誘導表達(如圖2所示)，是一個與逆境相關的轉錄因子。
實施例3，SNAC2基因超量表達載體的構建，轉化根據(jù)實施例2的結果，知道本發(fā)明基因SNAC2是能被干旱、冷害、高鹽和ABA誘導表達的，為了能更好地闡明此基因的功能，申請人將其在水稻中超量表達，從轉基因植株的表型來驗證。方法是首先將實施例1中得到的陽性克隆pGEM-SNAC2質粒用BamHI和KpnI雙酶切，回收外源片段；同時，用同樣的方法酶切攜帶玉米強啟動子Ubiquitin1的遺傳轉化載體pU1301(pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉化載體pCAMBIA1301(來自澳大利亞CAMBIA實驗室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)基礎上改建的，攜帶具有組成型和超量表達特征的玉米強啟動子Ubiquitin1的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化載體)，酶切完畢，用氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含SNAC2基因的酶切片段和酶切的pU1301載體做連接反應，轉化大腸桿菌DH10β(菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得本發(fā)明的轉化載體pU1301-SNAC2(構建過程如圖3所示)。
本發(fā)明的遺傳轉化方法是，通過農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉化的方法將其導入到水稻品種中花11(中國水稻研究所提供的一個公開使用的一個水稻品種)中，經(jīng)過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉基因植株。本發(fā)明的具體的轉化步驟參見Hiei等人報道的轉化方法(參見Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6271-282)進行?；蛘邊⒄毡旧暾埲藢＠枮閆L200410061011.7(發(fā)明名稱利用水稻干旱誘導基因啟動子LEAP改良植物抗旱性，專利授權日2006年5月31日)所示的方法進行。本發(fā)明通過上述方法獲得的轉基因水稻植株命名為T050U。本發(fā)明總共獲得獨立轉基因水稻植株23株。
實施例4SNAC2基因轉基因T2家系苗期耐冷篩選為了驗證轉基因水稻植株的耐冷性是否增強以及其增強是否與轉入的SNAC2基因有關，本發(fā)明采用Northern雜交技術(Church GM and Gilbert W，Genomic sequencing.Proc Natl Acad SciUSA，1984，811991-1995)對部分轉基因水稻植株中SNAC2基因的表達進行檢測(圖3為Northern雜交(方法同實施例2)的結果，并對本發(fā)明T2代植株的部分家系進行了耐冷性篩選。具體步驟如下T2代家系的種子在含有50mg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基發(fā)芽5天后，將發(fā)芽一致的幼苗移栽到小紅桶中，一半種植轉基因超量表達植株，一半種植陰性對照植株。在植株長到4葉期時，對其進行4℃低溫處理(4℃生長箱，16小時光照/8小時黑暗)，處理5天后，觀察了轉基因植株和對照植株的表型，似乎沒有顯著性差異，但將它們轉到正常自然環(huán)境恢復生長3天后，發(fā)現(xiàn)大部分對照植株卷葉并萎焉，而轉基因植株只有很少的卷葉現(xiàn)象；當恢復生長7天后，對照植株基本全都枯黃死去，而轉基因超量表達家系還有近50％的存活率(見圖5)。該結果說明SNAC2基因的確與耐冷相關，其超量表達能提高轉基因植物的耐冷性，轉基因水稻植株的抗性增強確實與轉入的SNAC2基因有關。
實施例5SNAC2基因轉基因T2家系苗期抗鹽篩選在實施例4中我們已證明本發(fā)明基因SNAC2轉基因植株苗期的耐冷性極顯著高于對照，為了驗證SNAC2轉基因水稻植株是否還具有其他的抗逆效果，本實施例中對其進行了高鹽環(huán)境中植株的生長勢比較。具體方法如下將上述T2代轉基因超量表達家系，在含有50mg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基發(fā)芽4天長勢一致的轉基因和對照的幼芽轉到含有150mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基的小方盒中生長，觀察長勢并在18天后測量了每株幼苗的根長和株高。測量結果表明在高鹽生長環(huán)境中，SNAC2超量表達或誘導表達轉基因和對照植株的根長沒有差異；但株高有很明顯的差異，對照植株在高鹽環(huán)境中生長受到明顯的抑制，它們的生長勢將近只有轉基因超量表達家系的60％(見圖6)。這些結果表明在高鹽生長環(huán)境中，SNAC2超量表達轉基因幼苗比對照植株有更高的耐鹽能力，表明本發(fā)明基因SNAC2轉基因植株能顯著提高植物的抗高鹽性。
實施例6SNAC2基因具有轉錄激活和DNA結合的特性轉錄因子具有DNA結合特性和轉錄激活特性，在信號傳導或逆境誘導下，結合下游基因啟動子的順式作用元件，從而啟動下游靶基因的表達。而本發(fā)明基因為誘導型轉錄因子，為了驗證本發(fā)明基因SNAC2是否具有轉錄激活和DNA結合功能，本實例利用在酵母細胞的反式激活實驗和單雜交實驗來驗證SNAC2蛋白作為轉錄因子的DNA結合活性和轉錄調(diào)控(激活)功能。首先將SNAC2基因構建到酵母GAL4-DB融合表達載體pDEST32(購自Invitrogen公司)，將其轉化酵母細胞Y187(購自CLONTHCH公司)，經(jīng)β-Galactosidase酶活性實驗(Yeast handbook，CLONTECH)，觀察酵母是否顯藍色確定報告基因LacZ的表達，從而確定基因是否具有激活功能。實驗結果表明本發(fā)明的基因確實具有轉錄激活特性(圖7A)。Hu等(Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.ProcNatl Acad Sci USA，2006，10312987-12992)研究結果表明SNAC1能結合在擬南芥中鑒定的NAC識別位點NACRS類似的DNA序列，為了進一步驗證水稻其它的NAC類蛋白SNAC2是否也能結合這一序列，本實施例分析了SNAC2蛋白與OsERD1啟動子(來自水稻基因ERD1)中含CATGTG和CACG序列的DNA在酵母中的互作關系。申請人將全長的SNAC2編碼序列與酵母載體pGAD-RecT7(購自CLONTHCH公司)的GAL4-activation domain融合后的表達載體pGAD-SNAC2和pHIS-cis(見Hu等Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC(NAC)transcriptionfactor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci USA，2006，10312987-12992)共同轉化酵母細胞Y187，同時也轉化了陽性對照(pHIS53/p53GAD)和陰性對照(pGAD-SNAC2/pHIS53)。結果顯示在沒有3-AT的酵母平皿SD/Leu-/Trp-/His-上，目標轉化子、陰性對照和陽性對照轉化子都能生長；但當加入20mmol/L的3-AT(3-氨基三唑)時，陰性對照轉化子不能在SD/Leu-/Trp-/His-培養(yǎng)基上生長，而陽性對照和目標轉化子都能很好的生長(圖6B)。此結果表明SNAC2也能識別并結合到OsERD1啟動子區(qū)包含CATGTG和CACG的序列，在酵母細胞中具有轉錄激活功能；同時也說明水稻的NAC蛋白能識別與擬南芥NAC蛋白識別類似的序列。這些結果表明本基因具有轉錄激活和DNA結合的轉錄因子的特性。
反式激活實驗具體實施步驟為1.將SNAC2基因全長融合到酵母表達載體pDEST32(購自Invitrogen公司)。
根據(jù)全長cDNA克隆序列按照pDEST32載體的讀碼框(見Invitrogen說明)設計基因引物F(5-TAGAATTCGACGAGGAGCTGGTGATGC-3，特異引物外加EcoRI位點)和R(5-TAGGATCCATTTAGGTGACACTATAG-3，特異引物外加BamHI位點)，將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過PEG8000純化后與中間載體pDONR221(購自Invitrogen公司)進行BP重組反應，反應體系為5μl，PCR產(chǎn)物200ng，pDONR221 50ng，5XBP Clonase Reaction Buffer 2μl，BPClonase Mix 2μl，置于25℃5個小時左右，轉化大腸桿菌DH10β(購自Invitrogen公司)，篩選陽性克隆，然后將所需陽性克隆質粒通過LR重組反應(詳見Gateway重組系統(tǒng)說明)將其攜帶的基因片段融合到酵母表達載體pDEST32，步驟為BP反應陽性質粒100ng，pDEST32 50ng，5XLR Clonase Buffer 2μl，LR Clonase Mix 2μl，25℃5個小時左右，轉化大腸桿菌DH10β(購自Invitrogen公司)，篩選陽性克隆。
2.醋酸鋰(LiAc)法酵母感受態(tài)的制備及轉化(CLONTECH，Yeast Protocols Handbook)1)試劑及其配方
A，YPD培養(yǎng)基(medium)20g蛋白胨(Difco peptone)10g酵母提取物(Yeast extract)20g葡萄糖(glucose)用蒸餾水定容至1L，pH7按照常規(guī)方法高壓蒸汽(121℃)滅菌15分鐘B，SD/Leu培養(yǎng)基(medium)6.7g酵母氮堿(Yeast nitrogen base without amino acids)20g瓊脂粉(Agar powder)20g葡萄糖(glucose)0.69g-Leu DO Supplement(購于CLONTECH公司)用蒸餾水定容至1L，按照常規(guī)方法高壓蒸汽(121℃)滅菌15分鐘C，10TE buffer0.1M Tris-HCl，10mM EDTA pH 7.5，高壓蒸汽(121℃)滅菌D，10LiAc1M lithium acetate(醋酸鋰)，pH 7.5，高壓蒸汽(121℃)滅菌E，PEG/LiAc solution(聚乙二醇/醋酸鋰溶液)終濃度. 配10ml溶液的配方PEG4000 40％8ml of 50％PEGTEbuffer1X 1ml of 10X TELiAc1X 1ml of 10X LiAc2)步驟A，先用1ml YPD溶液將直徑大小為2-3mm的酵母單菌落打散，轉移到含有10ml YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，B，在轉速為250rpm下，30℃培養(yǎng)16-18小時，使OD600＞1.5C，取5ml左右上述菌液到另一含有50mlYPD培養(yǎng)基的三角瓶，檢測濃度使OD600＝0.2-0.3D，30℃培養(yǎng)3小時(230rpm)，此時，OD600＝0.4-0.6，如果OD600＜0.4，可能培養(yǎng)有問題E，將菌液至于50ml離心管，室溫1000xg離心5分鐘，F(xiàn)，去掉上清，用滅菌的雙蒸水重懸細胞，室溫1000xg離心5分鐘，G，去上清，用1ml現(xiàn)配的1x TE/1x LiAc將酵母細胞混勻H，將200ng融合質粒DNA置于1.5-ml離心管，加入100ul酵母感受態(tài)細胞混勻，加入600ul PEG/LiAc，高速離心混勻，30℃培養(yǎng)30min(200rpm)
I，加入70ul的DMSO(100％，二甲基亞砜)，輕柔上下顛倒數(shù)次，42℃水浴15min后置于冰上2minJ，室溫14000rpm離心5秒，去上清，用500ul 1x TE buffer打散細胞。
K，取100ul轉化細胞均勻涂于-Leu/SD平皿，在30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2-4天直至克隆出現(xiàn)。
3，用β-Galactosidase實驗中報告基因LacZ表達情況驗證SNAC2基因及其缺失突變體的轉錄活性。
1)試劑及配方A，Z bufferNa2HPO4·7H2O16.1g/LNaH2PO4·H2O 5.5g/LKCl 0.75g/LMgSO4·7H2O 0.246g/L調(diào)節(jié)pH到7.0，按照上述常規(guī)方法滅菌。
B，X-gal stock solution(20mg/ml)C，Z buffer/X-gal solution100ml Z buffer0.27ml β-mercaptoethanol1.67ml X-gal stock solution2)步驟A，將轉化的克隆長到1-3mm(30℃，2-4天)B，將合適大小的圓形無菌Watman濾紙放置于10cm無菌平皿，加入2.5-5ml左右Zbuffer/X-gal solution，將其潤濕，忌氣泡。
C，用鑷子將另一張干凈無菌濾紙置于長有克隆的平皿上，輕壓濾紙，使克隆粘附到濾紙上D，當濾紙已濕潤，用鑷子揭開濾紙，將粘附有克隆的面朝上，放置于液氮10秒后，將其置于室溫解凍，這樣凍融的目的是使酵母細胞破碎F，小心將這濾紙克隆面朝上置于先前潤濕的濾紙上，忌氣泡G，將濾紙在30℃放置(30min-8hr)，根據(jù)藍色斑出現(xiàn)的情況來判斷基因是否具有激活功能。
酵母單雜交實驗具體實施步驟為1.將SNAC2基因全長融合到酵母表達載體pGAD-Rec2(購自CLONTECH公司)。
根據(jù)全長cDNA克隆序列按照pGAD-Rec2載體的讀碼框設計基因引物F(5-TAGAATTCGACGAGGAGCTGGTGATGC-3，特異引物外加EcoRI酶切位點)和R(5-TAGGATCCCCTCGTCGTCGTTCAGTCC-3，特異引物外加BamHI酶切位點)，將得到的PCR產(chǎn)物雙酶切并用氯仿異戊醇純化后與經(jīng)過同樣雙酶切的載體pGAD-Rec2連接，轉化大腸桿菌DH10β(購自Invitrogen公司)，用同樣的酶切方法驗證篩選陽性克隆，獲得酵母轉化載體pGAD-SNAC2。
2.將含有CATGTG和CACG核心序列的OsERD1啟動子區(qū)90bp三次重復序列連入載體pHIS2(購自CLONTECH公司)。
將含有核心序列為CATGTG和CACG的OsERD1啟動子區(qū)90bp(5’-CCCCGCGCGACGTCGACAAGTCGACAAGTGCGAGGAGCTAGCCATGTGGGTCGTGCCCGCGCGCGCCACGGCACGGCAACCCCGGAAACG-3’)三次串聯(lián)重復序列經(jīng)公司合成兩端帶有EcoRI和SacI位點定向連入酵母載體pHIS2，用同樣的酶切方法驗證篩選陽性克隆，獲得酵母轉化載體pHIS2-cis。
3.感受態(tài)細胞的制備和酵母載體的轉化(方法與反式激活實驗相同)，將目標雙載體(同時準備陽性對照和陰性對照)轉化后的細胞涂皿SD/Leu-/Trp-后30℃培養(yǎng)箱生長直至菌落大小為2mm左右。
4.將同一菌落在含有0mM，10mM，20mM，30mM和40mM的3-AT的SD/Leu-/Trp-/His-的平皿上劃線生長看菌的長勢。
實施例7，SNAC2的亞細胞定位為了確定SNAC2基因在細胞的表達部位，進一步進行了GFP-NLS(核定位信號)融合蛋白構建，即根據(jù)GFP的表達情況來確定基因在細胞內(nèi)的表達模式。首先參照前人發(fā)表的NAC基因(Miki Fujita，Kazuo Shinozaki et al，A Dehydration-induced NAC protein，RD26，is involved in anovel ABA-dependent stress-signaling pathway.Plant J(2004)39，863-876和Honghong Hu et al，Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance andsalt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci USA，2006，10312987-12992)分析該基因的核定位信號(NLS)可能位于71-83AA，根據(jù)此序列與GFP融合后在細胞內(nèi)的表達部位可確定該基因的亞細胞定位。將本發(fā)明序列的1-144AA片段融合到pCAMBIA1391-GFP載體(帶有ubiquitin1啟動子)上，因此我們通過PSNAC2⊿SNAC2-GFP轉基因植株中GFP在細胞內(nèi)的表達部位即可推測SNAC2蛋白的細胞定位。pCAMBIA1391-EGFP載體是在國際上通用的植物遺傳轉化載體pCAMBIA1391基礎上改建的(如圖9所示)，將其攜帶的GUS基因換成EGFP基因，GFP前帶有Ubiquitin1啟動子，pCAMBIA1391載體來自澳大利亞CAMBIA實驗室公開使用(Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture)。
融合基因載體構建的具體方法如下設計引物PF(5-GGATCCCTCCTCTCCTCTTCCCAT，加接頭BamHI位點)和PR(5-GAATTCGTTCTTCTTGCGG，加入接頭EcoRI)，以上述實施例1中構建的載體pGEM-SNAC2為模板，通過擴增程序(94℃預變性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃0.5min，30個循環(huán)；72℃延伸5min)將其擴增出來，擴增產(chǎn)物通過EcoRI和HindIII雙酶切，連入已進行同樣雙酶切的pCAMBIA1391-EGFP載體。將融合載體p1391-GFP-NLS用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化法轉化水稻愈傷(其具體方法同實施例3所述)，在潮霉素(其具體方法同實施例3所述)的選擇壓力下得到抗性愈傷，在熒光顯微鏡下觀察到GFP表達(如圖8A所示)，將表達的抗性愈傷制成切片，并在共聚焦顯微鏡下觀察GFP在細胞內(nèi)的表達情況。圖8B顯示在共聚焦顯微鏡下GFP只在細胞核中表達，說明1-144AA的序列已包含NLS，可將GFP定位在細胞核，即SNAC2蛋白定位在細胞核。本實例證明本發(fā)明序列的1-144AA片段包含完整的NLS，可將SNAC2蛋白定位在細胞核內(nèi)。
序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>利用水稻轉錄因子基因SNAC2提高植物耐冷耐鹽能力<130>
<141>2007-03-12<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1529<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
<221>gene<222>(1)..(1529)<223>
<220>
<221>CDS<222>(112)..(1023)<223>
<400>1gccaagccct cctctcctct tcccaacact agtaggataa agccacagag agagcagtag60tagtagcgag ctcgccggag aacggacgat caccggagaa gggggagaga g atg agc117Met Ser1ggc ggt cag gac ctg cag ctg ccg ccg ggg ttc cgg ttc cac ccg acg165Gly Gly Gln Asp Leu Gln Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr5 10 15gac gag gag ctg gtg atg cac tac ctc tgc cgc cgc tgc gcc ggc ctc213Asp Glu Glu Leu Val Met His Tyr Leu Cys Arg Arg Cys Ala Gly Leu20 25 30ccc atc gcc gtc ccc atc atc gcc gag atc gac ctc tac aag ttc gat261Pro Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asp
35 40 45 50cca tgg cag ctt ccc cgg atg gcg ctg tac gga gag aag gag tgg tac309Pro Trp Gln Leu Pro Arg Met Ala Leu Tyr Gly Glu Lys Glu Trp Tyr55 60 65ttc ttc tcc ccg cga gac cgc aag tac ccg aac ggg tcg cgg ccg aac357Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn70 75 80cgc gcc gcc ggg tcg ggg tac tgg aag gcg acc ggc gcc gac aag ccg405Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro85 90 95gtg ggc tcg ccg aag ccg gtg gcg atc aag aag gcc ctc gtc ttc tac453Val Gly Ser Pro Lys Pro Val Ala Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr100 105 110gcc ggc aag gcg ccc aag ggc gag aag acc aac tgg atc atg cac gag501Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Glu Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu115 120 125 130tac cgc ctc gcc gac gtc gac cgc tcc gcc cgc aag aag aac agc ctc549Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser Ala Arg Lys Lys Asn Ser Leu135 140 145agg ttg gat gat tgg gtg ctg tgc cgg att tac aac aag aag ggc ggg597Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys Gly Gly150 155 160ctg gag aag ccg ccg gcc gcg gcg gtg gcg gcg gcg ggg atg gtg agc645Leu Glu Lys Pro Pro Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Gly Met Val Ser165 170 175agc ggc ggc ggc gtc cag agg aag ccg atg gtg ggg gtg aac gcg gcg693Ser Gly Gly Gly Val Gln Arg Lys Pro Met Val Gly Val Asn Ala Ala180 185 190gtg agc tcc ccg ccg gag cag aag ccg gtg gtg gcg ggg ccg gcg ttc741Val Ser Ser Pro Pro Glu Gln Lys Pro Val Val Ala Gly Pro Ala Phe195 200 205 210ccg gac ctg gcg gcg tac tac gac cgg ccg tcg gac tcg atg ccg cgg789Pro Asp Leu Ala Ala Tyr Tyr Asp Arg Pro Ser Asp Ser Met Pro Arg
215 220 225ctg cac gcc gac tcg agc tgc tcg gag cag gtg ctg tcg ccg gag ttc 837Leu His Ala Asp Ser Ser Cys Ser Glu Gln Val Leu Ser Pro Glu Phe230 235 240gcg tgc gag gtg cag agc cag ccc aag atc agc gag tgg gag cgc acc 885Ala Cys Glu Val Gln Ser Gln Pro Lys Ile Ser Glu Trp Glu Arg Thr245 250 255ttc gcc acc gtc ggg ccc atc aac ccc gcc gcc tcc atc ctc gac ccc 933Phe Ala Thr Val Gly Pro Ile Asn Pro Ala Ala Ser Ile Leu Asp Pro260 265 270gcc ggc tcc ggc ggc ctc ggc ggc ctc ggc ggc ggc ggc agc gac ccc 981Ala Gly Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro275 280 285 290ctc ctc cag gac atc ctc atg tac tgg ggc aag cca ttc tag1023Leu Leu Gln Asp Ile Leu Met Tyr Trp Gly Lys Pro Phe295 300acgaccaaaa aaaaaaaaaa acaaccgcat tggcagcaat ggtgtcactg aacaccgtgc 1083aggctagcta gcttcatggc cggtgaactt tgactcaggc gagccgccgg agttgactca 1143aagataatta aaagaagtgt tttaagtgga ttggattgga ttagacagag gagatgagga 1203ctcgagaaag gcggcgatga gaccgtggtt ggggggaccc tggcctggac tgaacgacga 1263cgaggcagca gcagaaagat ggtgcaattg catcgggtgg catgtcagtg tgtgtgtata 1323gtggcatgta catagtacat ggtgattgat tcggtataca gggggctagc tttcctgttt 1383ctgtttcttc attggttaat tattactccc attataaggt cttcttcagg gttgctagct 1443taattaatta attaattagc ccagtggttg aagtgtaagt caaaattcat caagtcagag 1503actggaataa tacaatacag tactgc 1529<210>2<211>303<212>PRT<213>水稻(Oryza sativa)<400>2Met Ser Gly Gly Gln Asp Leu Gln Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His1 5 10 15Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Met His Tyr Leu Cys Arg Arg Cys Ala
20 25 30Gly Leu Pro Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys35 40 45Phe Asp Pro Trp Gln Leu Pro Arg Met Ala Leu Tyr Gly Glu Lys Glu50 55 60Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg65 70 75 80Pro Asn Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp85 90 95Lys Pro Val Gly Ser Pro Lys Pro Val Ala Ile Lys Lys Ala Leu Val100 105 110Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Glu Lys Thr Asn Trp Ile Met115 120 125His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser Ala Arg Lys Lys Asn130 135 140Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys145 150 155 160Gly Gly Leu Glu Lys Pro Pro Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Gly Met165 170 175Val Ser Ser Gly Gly Gly Val Gln Arg Lys Pro Met Val Gly Val Asn180 185 190Ala Ala Val Ser Ser Pro Pro Glu Gln Lys Pro Val Val Ala Gly Pro195 200 205Ala Phe Pro Asp Leu Ala Ala Tyr Tyr Asp Arg Pro Ser Asp Ser Met210 215 220Pro Arg Leu His Ala Asp Ser Ser Cys Ser Glu Gln Val Leu Ser Pro225 230 235 240Glu Phe Ala Cys Glu Val Gln Ser Gln Pro Lys Ile Ser Glu Trp Glu245 250 255Arg Thr Phe Ala Thr Val Gly Pro Ile Asn Pro Ala Ala Ser Ile Leu260 265 270Asp Pro Ala Gly Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser275 280 285
Asp Pro Leu Leu Gln Asp Ile Leu Met Tyr Trp Gly Lys Pro Phe290 295 300
權利要求
1.SNAC2基因介導的賦予植物對低溫和鹽脅迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第112-1023位堿基所示的序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質相同的蛋白質的DNA序列。
2.合適啟動子連接的權利要求1所述的DNA序列。
3.權利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO1所示的DNA序列。
4.權利要求1或3所述的DNA序列的表達載體。
5.權利要求4所述的表達載體是pU1301-SNAC2。
6.權利要求1所述的DNA序列在增加水稻對干旱和鹽脅迫耐受能力中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領域。具體涉及一種水稻DNA片段(基因)的分離克隆、功能驗證和應用。所述的基因與植物耐冷和耐鹽有關。將該基因的完整翻譯區(qū)與玉米的強啟動子(Ubiquitin1)結合后直接轉入一般植物體，轉基因植株的耐冷和耐鹽能力顯著提高。本發(fā)明克隆得到SNAC2基因介導的賦予植物對低溫和鹽脅迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ IDNO1中第112－1023位堿基所示的DNA序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質相同的蛋白質的DNA序列。本發(fā)明還涉及所述基因的DNA序列在增加水稻對干旱和鹽脅迫耐受能力中的應用。
文檔編號C12N15/82GK101045929SQ20071005165
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月12日 優(yōu)先權日2007年3月12日
發(fā)明者胡紅紅, 熊立仲 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學