專利名稱：具有超薄封閉二氧化硅層的磁性粒子及其制造和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種涂有二氧化硅(Si02)的磁性粒子，其中，硅酸鹽層封 閉、致密，且具有厚度極薄的特點，其厚度僅在幾納米范圍內(nèi)(由此，下文 也稱其為"二氧化硅納米層")。此外，本發(fā)明還涉及一種制備這種含硅酸鹽 磁性粒子的改良方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，這種方法可以獲得具有封閉硅酸鹽 層的產(chǎn)品，從而使純度大幅提高。通過這種新方法還能避免磁鐵礦表面不受 控制地形成硅酸鹽聚集體，從而有利于下文將要說明的特性和生物用途。此 外，這種新方法還可在分級離心基礎(chǔ)上減少納米固體顆粒。本發(fā)明的磁性粒 子具有最佳磁化性能和懸浮性能，并且能非常有利地脫離塑料表面。這種涂 有二氧化硅的高純度磁性粒子優(yōu)選用于從細胞樣品或組織樣品中分離核酸， 其中，這種樣品基質(zhì)分離借助于磁場而實現(xiàn)。這種粒子特別適用于對核酸(大 多源于生物體樣品)自動提純，以便通過各種擴增方法對其進行分析。
背景技術(shù)：
最近一段時間以來，分子診斷學變得越來越重要。分子診斷學已進入了 對疾病的臨床診斷階段。這包括分子標記測量，這種測量可改善疾病診斷、 早期查明、治療過程中的病癥監(jiān)控、疾病預(yù)后和藥物療效或副作用的預(yù)測(包 括檢測傳染病病原體，檢測基因組突變，依據(jù)給定的或在病情發(fā)展過程中取 得的遺傳樣品預(yù)測藥物的療效和副作用，發(fā)現(xiàn)正在擴散的腫瘤細胞以及疾病 易感體質(zhì)風險因數(shù)的鑒定等)。目前，獸醫(yī)學、環(huán)境分析學和食品檢測領(lǐng)域 也應(yīng)用到了分子診斷學的方法。更進一步的應(yīng)用為病理/細胞學研究院或法律 問題調(diào)查中展開的研究?；蛟\斷學目前也應(yīng)用于保健領(lǐng)域(例如對庫存血 進行是否含有傳染病病原體的檢驗)，立法者計劃通過法律手段對這種檢驗 加以規(guī)范。臨床分子診斷學所用的方法(例如雜交技術(shù)或擴增技術(shù)，如PCR (Polymerase Chain Reaction, 聚合酶鏈反應(yīng))、TMA ( Transcription Mediated Amplification,轉(zhuǎn)錄介導的擴增)、LCR ( Ligase Chain Reaction,連接酶鏈反 應(yīng))、bDNA ( branched DNA,分支DNA)或NASBA- (Nucleic Acid Sequence Based Amplification,基于核酸序列的擴增))在基礎(chǔ)性科學研究領(lǐng)域中也屬 于常規(guī)方法。
實施分子診斷學分析的前提通常是從待分析樣品中分離出DNA或 RNA。雖然存在允許核酸分離和檢測反應(yīng)同時進行的分析方法(例如基于 bDNA的試驗)，^旦作為分子診斷學中應(yīng)用最廣泛的生物分子方法，PCR由 于會受外因影響而幾乎總是要求預(yù)先對核酸進行提純。
傳統(tǒng)的核酸制備方法以液-液萃取為基礎(chǔ)。例如從組織樣品中苯酚-氯仿
萃取DNA。但巨大的工作量和部分情況下需要使用劇毒物質(zhì)的條件，使這
類方法在近年來遠不如基于固相的方法受歡迎。
使用基于固相的核酸萃取方法時，無論具體問題是什么，樣品制備屬于
分析過程，其大致可分為四個基本步驟1.調(diào)整固相；2.使分析物與固相 進行選擇性結(jié)合或特異結(jié)合，去除多余的樣品基質(zhì)；3.從固相中洗去有可能 存在的雜質(zhì)；4.對提純后濃縮的分析物進行洗脫。
在核酸的選擇性和可逆性結(jié)合方面利用了核酸早已為人所知的特性，在 高離液鹽或其他高鹽(即高濃度離液鹽或其他高濃度鹽)條件下，將核酸特 異性地與含二氧化硅的吸附材料(例如玻璃粉[Proc. Natl. Acad. USA 76 (1979) 615-619, Anal. Biochem. 121 (1982) 382-387]、硅藻土 diamatomeenerde [Methods Enzymol. 65 (1979) 176-182]或天然硅石[J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 495-503， EP 0 389 063 Bl])結(jié)合。隨后借助一種含有水溶性有機溶劑的緩沖 劑(通常為低級脂肪醇)從吸附劑中洗去雜質(zhì)，對基質(zhì)進行干燥，并用蒸餾 水或所謂的低鹽緩沖劑(即低離子強度的緩沖劑)對所吸附的核酸進行洗脫。
在價格低廉的全自動核酸分離方面，使用超順磁吸附材料的方法的作用 越來越大。
最簡單的實施例(WO 01/46404)是在對為^^支術(shù)用途(例如電子照相調(diào) 色劑)而商業(yè)化制備的磁性粒子不采取進一步改性措施的情況下就將其直接 用于核酸制備。
這種大規(guī)模生產(chǎn)的產(chǎn)品雖然滿足了幾個最重要的先決條件，例如一定的 核酸吸附率和磁化率，但在另一方面，這些通過商業(yè)途徑可購得的產(chǎn)品并未 滿足某些對于取得高靈敏及可再現(xiàn)結(jié)果而言不可或缺的重要邊界條件。舉例 而言，在病毒診斷(例如HCV或HIV)領(lǐng)域非常重要的一點是，從血清或 血漿中萃取定量的病毒核酸(即接近100%的產(chǎn)率)，以便從中推導出確的 血清/血漿病毒濃度，并據(jù)此決定所需采用的治療方法。磁性粒子的純度在光 學分析中也起著決定性作用。正是由于磁性粒子大多仍呈微孔狀，因而從粒 子內(nèi)部擴散出來的鐵原子會使溶液變色，從而對透射測量和反射測量造成嚴
重影響。
因此，目前有大量描述生物用途磁性粒子研發(fā)情況的文獻，尤其是手動 核酸分離和自動核酸分離方面的研發(fā)情況。
其中，表面具有大密度SiOH基團的磁性粒子具有很重要的作用。因為 SiOH基團可與核酸進行可逆結(jié)合。二氧化硅改性磁性粒子也是本發(fā)明的主題。
為能取得高靈敏、定量及可再現(xiàn)結(jié)果，這種磁性粒子除磁化性和核酸結(jié) 合能力外還須符合一系列其他邊界條件，下文將對這些邊界條件進行詳細說明。
粒度和粒度分布
事實表明，由Fe304 (磁鐵礦)構(gòu)成、主粒度范圍約為0.1 pm至1 (im
的電子照相調(diào)色劑用磁性粒子(例如可從Fa. Lanxess公司購得的名為 BayoxideE的產(chǎn)品)具有近乎理想的粒度條件。因為通過這種粒度可實現(xiàn)對 于生物用途而言重要的"懸浮穩(wěn)定性"的重要邊界條件。這種懸浮穩(wěn)定性必 須滿足的條件是搖勻后幾分鐘(例如10至15分鐘)內(nèi)(核酸的吸附階段) 不出現(xiàn)明顯的沉淀現(xiàn)象，而施加磁場后，為盡可能縮短分析時間，帶有核酸 的》茲性粒子必須在短短的幾分鐘(例如1至5分鐘)內(nèi)完全分離。
就這一方面而言，可使用的Fe304 (磁鐵礦)磁性粒子上仍然存在的缺 陷是還含有少量納米范圍內(nèi)的極細的磁性粒子。
這種會因其較大表面而結(jié)合大量核酸的非期望副產(chǎn)品在磁場中無法在 短短的幾分鐘內(nèi)分離，因而(正是在核酸的定量測定方面)可能會導致這部 分核酸所含信息的丟失。
除產(chǎn)量損失外，這還會導致出現(xiàn)渾濁的黃褐色上清液，這種黃褐色上清 液不僅會給產(chǎn)品銷售帶來不利影響，也會對洗脫液的光度分析造成一定影 響。
因此，如果能針對此處所述的生物用途對這部分"納米^t性粒子"進4亍 分離，是非常有利的。 硅酸鹽含量
如上文所述，幾種大規(guī)才莫生產(chǎn)的石茲性粒子(例如Fa. Lanxess公司的 BayoxideE系列)在未經(jīng)過專門的二氧化硅后處理的情況下仍具有一定的核 酸結(jié)合能力，這是因為這類磁性粒子在大批量生產(chǎn)下，在表面也具有少量 SiOH基團。這類產(chǎn)品由于核酸吸附量較低而相應(yīng)需要相對較高的磁性粒子 量，這會加大小體積樣品的處理難度。
此外，這類產(chǎn)品具有相對于此處所述用途而言不利的容器壁(例如進行 核酸提純時通常所需用到的微量滴定板上的玻璃或塑料壁)潤濕特性。因此， 懸浮液中殘留有大量未改性的相對疏水的磁性粒子，這些磁性粒子吸附在微 量滴定板壁上，從而影響移液精度，并造成產(chǎn)量損失。
在此情況下，具有大密度SiOH表面基團的粒子的特性非常有利，這種 粒子由于其所具有的親水性可以非常有利地從塑料壁(例如上述微量滴定 板)上滾落。
因此，在很多用于核酸分離的磁性粒子研發(fā)產(chǎn)品中，二氧化硅含量相對 于磁鐵礦含量更為重要。如WO 01/71732中所述，在存在》茲性粒子的情況下 對活性硅土化合物(例如四乙氧基硅烷(TEOS))進行水解可得到二氧化硅 粒子，這些二氧化硅粒子可被所夾雜的;茲鐵礦;茲化。由于表面的SiOH基團 密度很大，因此，這種粒子雖然具有良好的核酸結(jié)合能力和有利的微量滴定 板壁潤濕特性，但在另一方面，由于磁鐵礦含量減少，粒子的磁性也相應(yīng)地 被大幅削弱。此外，通過這種方式制成的磁性二氧化硅粒子具有較為不利的 形態(tài)特性，例如其粒度和粒度分布非常不均勻，其中需要指出的是，大體積 的非球形粒子在自動移液過程中可能會引起堵塞。
可萃取成分
用磁性粒子法分離出來的核酸通常還需接受進一步的處理，例如PCR
(Polymerase Chain Reaction, 聚合酶鏈反應(yīng))、TMA ( Transcription Mediated Amplification,轉(zhuǎn)錄介導的擴增)、LCR ( Ligase Chain Reaction,連4妄酶纟連反 應(yīng))、或NASBA- (Nucleic Acid Sequence Based Amplification,基于才t西臾序歹寸 的擴增)。此處涉及的是高靈敏的酶控方法，會被各種例如具有酶阻斷劑作 用的雜質(zhì)和鐵化合物影響。
因此，用于核酸提純的磁性粒子必須滿足特別的純度要求。如果使用大 頭見模生產(chǎn)的氧化鐵(例如Fa. Lanxess公司的Bayoxide),帶來的問題就是不 可忽視的，因為磁鐵礦粒子具有一定的孔隙度和表面粗糙度。因此，雜質(zhì)可 能在氧化鐵制備過程和隨后的二氧化硅處理過程中嵌入微孔內(nèi)，這些雜質(zhì)在 接下來的過程中不是起到酶阻斷劑的作用，就是由于自身顏色而對光度分析 造成干擾。

發(fā)明內(nèi)容
從可購得的磁性粒子出發(fā)，本發(fā)明的目的是制備一種具有大密度SiOH 表面基團和致密的封閉硅酸鹽表面層的二氧化硅改性磁性粒子。通過二氧化 硅改性，初始產(chǎn)品的形態(tài)和極好的磁性都不會受到較大影響。二氧化硅涂層 也會給塑料表面的潤濕特性帶來有利影響。此外，二氧化硅改性磁性粒子在 可萃取雜質(zhì)方面經(jīng)過了 一定程度的優(yōu)化，使得磁鐵礦的芯內(nèi)不會滲出雜質(zhì)和
鐵化合物，從而避免生物檢測反應(yīng)和光度分析受到干擾。 現(xiàn)有技術(shù)
WO 03/058649從Fa. Lanxess公司的磁性粒子Bayoxide E出發(fā)，說明了 一種用水玻璃溶液(例如Fa. Cognis公司的水玻璃HK 30 )在粒子表面沉積 二氧化硅的方法。通過對Bayoxide E/水玻璃溶液的pH值進行逐步稀釋，即 等同于將pH值從強堿性(pH 11.5)逐步轉(zhuǎn)移到中性(pH 7),就可在磁性 粒子表面進行柔和的二氧化硅沉積。如WO 03/058649 +所述，如果通過添 加酸來使pH值下降(WO 98/31840)，酸滴入點上的水玻璃就會不受控制地 轉(zhuǎn)變成二氧化硅(Si02),磁性粒子積聚在二氧化硅的結(jié)構(gòu)中，從而使得上 文所述的在磁性粒子表面進行的可控二氧化硅沉積無法實現(xiàn)。盡管如此，通 過WO 03/058649中所說明的"成批處理法"仍無法完全避免表面上形成極 小的二氧化硅聚集體。
也就是說，WO 03/058649中所述的二氧化硅改性磁性粒子雖然在表面 結(jié)構(gòu)和核酸結(jié)合能力方面顯示出了良好特性，但在對相關(guān)懸浮液進行長期性 能檢驗時(幾個星期)，觀察到了非常不利的黃褐色上清液。在通常都會使 用表面活性劑的生物化—驗中，只需較短時間就能觀察到這種效果。除水玻璃 成分外，通過分析法還能從這部分有色上清液中檢測出痕量的4失化合物和極 細的磁鐵礦粒子。顯然，這些雜質(zhì)是從二氧化硅表面嵌入多孔的磁性粒子結(jié) 構(gòu)內(nèi)，并從此處開始隨時間推移逐步向外擴散。此外，這些觀察結(jié)果還表明
了 ，通過WO 03/058649中所說明的成批處理法無法制備完全封閉或分布均 勻的硅酸鹽層，因而也無法避免鐵化合物的滲出。
具體實施例方式
為能除去上文所述的可萃: 又干擾成分，本發(fā)明實施了下文將要加以說明 的方法優(yōu)化措施，其中，本發(fā)明的改進之處可通過與WO 03/058649中所述 方法的比較而得到體現(xiàn)。在下文將要說明的試驗中，使用的并不是WO 03/058649中所用的Bayoxide E 8707 (不再是標準產(chǎn)品)，而是非常相似的型 號Bayoxide E 8706。兩種情況下涉及的都是由于生產(chǎn)原因而含有少量Si的 Fe304磁鐵礦，其中，型號8707的Fe/Si含量為99.1/0.9, Bayoxide E 8706 為99.4/0.4。本發(fā)明的方法的重要之處在于表面特性，主要是Fe304磁鐵礦的 pH值。pH值為6.5的Bayoxide E 8707具有弱酸性表面，而本發(fā)明所用的型 號Bayoxide E 8706所測出的pH值為中性，根據(jù)不同批次，甚至測出了弱減^ 性值(pH7.5)。本發(fā)明令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，即便是這種弱堿性表面特性也能誘 發(fā)水玻璃-二氧化硅分離。 一般情況下是通過添加酸來從強石成性水玻璃溶液 中分離出二氧化硅。
在進行比較試驗的過程中，本發(fā)明令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，如果用一種連續(xù)處 理法(例如膜法)來代替WO 03/058649中所述的pH值逐步降低法，就能 在可萃取成分方面取得明顯有所改善的結(jié)果。其中，使用"錯流微濾"，通 過一個小時的反應(yīng)時間可對水玻璃/磁性粒子懸浮液實現(xiàn)提純，下文將在實例 中對此進4亍詳細說明。如M .穆爾德(M. Mulder )在《膜技術(shù)基本原理》(Basic Principles of Membrane Technology )中所說明的那樣，"錯流微濾，，是一種已 知的在低超壓情況下進行的分離或提純方法。這種方法在體積恒定(即通過 輸入相同體積流量的淡水來置換含有雜質(zhì)的滲透物體積流量)的情況下實 施。與生物學中已知的滲析法不同，微濾過程中，根據(jù)孔隙的具體直徑，不 僅可分離出低分子鹽，還能分離出顆粒狀雜質(zhì)。這種連續(xù)提純處理一直進行 到排出的滲透物純度與所輸入淡水的純度相當為止，大約需持續(xù)12至15小 時。
在用ESCA進行表面分析表征時，本發(fā)明令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過這種方 式制成的二氧化硅改性磁性粒子在二氧化硅表面方面具有一種新型的(即超
薄的)二氧化硅結(jié)構(gòu)，這種二氧化硅結(jié)構(gòu)可以改善提純效果，提高純度。這 種二氧化硅納米層的特點在于一個均勻分布在整個粒子表面上的、厚度不超 過5nm的硅酸鹽層。此外，通過本發(fā)明的方法還能實現(xiàn)2nm的層厚，非常 有利的情況下也能實現(xiàn)0.5 nm至0.2 nm的層厚。經(jīng)過這種涂層處理的粒子 所具有的表面涂層的特征(例如)在于，其可避免鐵離子滲入周圍溶液中。
下文將在實例3中對二氧化硅層厚為0.2 nm的磁性粒子的制備方法進行 說明。
此外，本發(fā)明的方法的特征還在于一個致密的封閉硅酸鹽層，這個硅酸 鹽層也可改善純度和上清液中可觀察到的沾污效應(yīng)。與WO 03/058649中所 說明的方法相比，使用本發(fā)明的方法制成的具有二氧化硅涂層的磁性粒子的 純度有了明顯改善。因此，制成和洗凈后，上清液不會再出現(xiàn)看得見的變色 現(xiàn)象(參見實例2和3 )。借助于致密的封閉二氧化硅層可避免看得見或看不 見的雜質(zhì)(例如鐵離子)滲出，這些雜質(zhì)會對生物試驗的擴增方法或光學分 析造成干擾(參見實例4和5 )。
除此之外，本發(fā)明還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在上文所述的膜濾法中通過緩慢 的持續(xù)稀釋將pH值降到中性值，可近乎完全地避免磁鐵礦表面形成硅酸鹽 聚集體，或者說，與WO 03/058649中所說明的"成批處理法"相比，借此 可進一步大幅減少形成在磁鐵礦表面的硅酸鹽聚集體。這種定義明確的硅納 米層會對下文將要說明的特性和生物用途產(chǎn)生有利影響。
此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，如果在膜法之后實施分級離心法(可對緩慢沉淀 下來的氧化鐵粒子進行分離)，就可實現(xiàn)以獲得純凈的上清液為目的的附加 性產(chǎn)品優(yōu)化。
通過這種方式制成的懸浮液形式的樣品符合了所有的標準，例如與初始 產(chǎn)品完全相同的磁化性、穩(wěn)定不變的形態(tài)、良好的核酸結(jié)合能力、可從微量 滴定板壁上滾落的有利特性、突出的懸浮穩(wěn)定性(即在短短的幾分鐘內(nèi)在上 清液中未出現(xiàn)明顯雜質(zhì)的情況下在磁場中順利分離出磁性粒子)。
"涂有二氧化硅的磁性粒子，，這一表述包括涂有二氧化硅納未層的磁鐵礦芯。
"致密的封閉二氧化硅層，，這一表述包括厚度在5 nm以內(nèi)的均勻均質(zhì)的 單分子至多分子二氧化硅層，層厚優(yōu)選為2 nm，特別優(yōu)選為0.5 nm至0.2 nm。 這個封閉的二氧化硅層可避免鐵化合物和鐵離子滲入涂有二氧化硅的磁性 粒子的周圍環(huán)境中。
"改良的制備方法，，這一表述包括一個借助微濾或超濾單元而實現(xiàn)的、 既易于實施又很徹底的清洗過程，這個清洗過程可使涂有二氧化硅的磁性粒 子具有極高的純度。使用這種方法時， 一開始硅酸鹽納米層會沉淀在粒子表 面，隨后，反應(yīng)液會以可控方式得到持續(xù)性的緩慢稀釋，從而其pH值降到 中性，借此可在磁鐵礦表面形成一個極其均勻、致密的封閉型均質(zhì)硅酸鹽層。 此外還可避免形成具有干擾作用的硅酸鹽聚集體，或者i兌，可顯著減少具有 干擾作用的硅酸鹽聚集體。
"借助離心技術(shù)減少納米微粒成分"這一表述包括離心技術(shù)或簡單的重 力技術(shù)的應(yīng)用。其中，有用成分發(fā)生沉淀，而非期望的納米微粒成分則可與 上清液一起去除。借助超速離心法確定粒度分布后，可借助減少了的微粒狀 成分對這種效應(yīng)進行檢測。離心技術(shù)是對約3000 g的初始懸浮液進行離心分 離15分鐘，去除上清液后加入同等量的水或緩沖劑，進行再懸浮，并將這 些步驟重復(fù)多次(最多可達10次)。采用重力技術(shù)時，只需等待較長時間而 不采用離心分離，直至大部分粒子沉淀在容器底部為止，隨后再置換掉水性 上清液。
"最佳磁化性能"這一表述包括本發(fā)明的粒子的下述特性，即具有盡可 能大的磁鐵礦含量，因此，從外部向反應(yīng)容器上施加磁場時，本發(fā)明的粒子 可在短短的幾分鐘(例如1至5分鐘)內(nèi)在提純過程中與樣品基質(zhì)完全分離。 這一點主要是針對下述情況而言，即在自動移液設(shè)備上實施的自動方法所用 的提純時間盡可能短，以及將磁場強度有限的價格盡可能低廉的磁體用作硬 件成分。"懸浮性能"這一表述包括本發(fā)明的粒子的下述特性，即在提純階段，本發(fā)明的粒子基于最佳粒度分布而在搖勻后的幾分鐘(例如10至15分鐘) 內(nèi)(核酸的吸附階段)不出現(xiàn)明顯的沉淀現(xiàn)象。"脫離塑料表面的最佳脫離性能"這一表述包括本發(fā)明的粒子的下述特 性，即本發(fā)明的粒子基于親水的表面特性而與生物提純過程所用的塑料物品之間具有很小的親合性。所用的塑料物品包括聚苯乙烯、聚乙烯容器和聚丙 烯容器以及由類似塑料制成的任意形狀和任意尺寸的微量滴定板。其中，本發(fā)明的磁性粒子的特殊二氧化硅層與這些塑料表面之間存在排斥性的相互 作用，因此，涂層磁性粒子會從這些表面上滾落，而不與之發(fā)生較大的相互 作用，這種較大的相互作用最終會在核酸的生物提純過程中導致產(chǎn)量損失。"分離，，這一表述包括使用上述涂有二氧化硅的磁性粒子對生物樣品進 行核酸提純，主要分成以下幾個單個步驟a) 用裂解緩沖液將樣品溶解在反應(yīng)容器內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后加入特定而言含 有高離液鹽、優(yōu)選含有高摩爾濃度的異硫氰酸胍的結(jié)合緩沖液b) 加入涂有硅酸鹽的^茲性粒子c) 在能使核酸結(jié)合到磁性粒子上的溫度下進行培養(yǎng)d) 通過施加磁場從待反應(yīng)物中去除未結(jié)合成分，石茲場使磁性粒子與周 圍液體分離e) 多次添加清洗緩沖液，在粒子發(fā)生磁化以將不確定的結(jié)合分子從核 酸中清除后，再去除清洗緩沖液f) 在核酸與磁性粒子分離的情況下加入洗脫緩沖液g) 重新施加磁場后將分離帶有核酸的洗脫液"自動提純，，這一表述包括這種方法的實施方案，即全部或^5l在幾個分步驟中取消操作人員的手動操作，自動提純主要在以下幾個步驟中實施用 專用緩沖劑溶解生物組織樣品、添加磁性粒子、在一定的溫度條件下進行培 養(yǎng)、去除未吸附的樣品成分、清洗步驟、在一定的溫度條件下從粒子上洗脫 已結(jié)合的核酸、從粒子懸浮液中分離出洗脫液。"核酸"這一表述包括寡聚和聚合核糖核苷酸或鏈長超過10個單體單元 的2'-脫氧核糖核香酸。核酸中的單體單元通過相鄰羊體單元的3'-和5'-羥基 之間的磷酸二酯鍵而連接起來， 一個雜環(huán)堿基通過糖苷鍵結(jié)合在碳水化合物成分的l'-原子上。核酸可通過形成分子間氫^:而構(gòu)成雙^隨和三鏈分子。"核酸"也指蛋白質(zhì)/核酸復(fù)合物和帶有合成核苷酸的核酸，例如嗎啉或 PNA ( peptide nucleic acid， 肽核酸)。
"生物組織樣品，，這一表述包括含核酸的生物材料，例如全血、血清或血漿(特別是含病毒的血清或血漿，其中尤指感染了 HIV和HCV的血清樣品)、"血沉棕黃層"(即血液中的白細胞成分)、排泄物、腹水、涂片、唾液、 器官抽出物、活組織檢查、組織切片(尤指用含福爾馬林的固定劑嵌在石蠟 中的各種固定程度不一的組織切片)、分泌物、液體、膽汁、淋巴液、小便、 大便、精液、細胞和細胞培養(yǎng)物。"生物組織樣品，，也可以是來自于生化處 理過程、隨后需加以提純的核酸。"通過各種擴增方法進行檢測"這一表述包括借助各種分子生物技術(shù)(特別是PCR、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)、 LCA或NASBA)復(fù)制已提純的核酸 和在此之后進行的或同步進行的擴增產(chǎn)物檢測。"通過各種擴增方法進行檢 測"也指用信號擴增法(例如bDNA)進行的檢測，即不通過核酸擴增而實 現(xiàn)的檢測。PCR檢測可特別通過借助熒光技術(shù)的動態(tài)方法在"實時"條件下 進行,或在傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠上進行。"實時"PCR可在使用相應(yīng)校準器的 情況下對核酸進行非常有效的定量測定。其中，對于臨床靈敏度而言關(guān)鍵且 起限制作用(避免假陰性結(jié)果)的是核酸的有效提純，即將核酸有效地結(jié)合 到磁性粒子上，并在PCR相容條件下可逆地將其釋放。本發(fā)明的另 一主題是用于實施本發(fā)明的方法的試劑盒，其包含以下各組 成部分(a) 用于溶解樣品的試劑(b) 含二氧化硅的磁性粒子或含二氧化硅的磁性粒子的懸浮液(c) 清洗緩沖液(d) 洗脫緩沖液有關(guān)試劑盒的各組成部分的用途和用法，參見上文中的實施方案和下文 中的實例。也可以不同于此的其他形式對試劑盒的單個或多個組成部分進行 使用。通過本發(fā)明可在使用專門制備的涂二氧化硅^^性粒子的基礎(chǔ)上，借助相 應(yīng)的擴增技術(shù)對生物組織樣品的提純物進行特別有效的、自動的定量核酸檢測。本發(fā)明借此為核酸診斷學作出了重要貢獻。 實例下面涉及的是實施上述方法的詳細報告。這些實例給出了適用于待提純 核酸的精確反應(yīng)條件，但可依據(jù)待提純核酸對各項參數(shù)(例如磁性粒子量、 培養(yǎng)和清洗溫度、培養(yǎng)和清洗時間、裂解緩沖液濃度、清洗緩沖液濃度和洗脫緩沖液濃度)進行修改。實例一用Bayoxide E 8706和水玻璃37/40通過逐步降低pH值制備涂 有硅酸鹽的磁鐵礦粒子(與WO 03/058649 Al中公開的方法相同)反應(yīng)部分在帶有KPG攪拌器的6 1三頸燒瓶內(nèi)加入4000 g的水玻璃溶液37/40 (Cognis有限公司)。 一邊攪拌一邊在10分鐘內(nèi)加入2000 g的Bayoxide 8706 (Bayer股份公司)。隨后在室溫下再攪拌一個小時。 處理攪拌器關(guān)閉后，涂有二氧化硅的》茲鐵礦粒子沉淀下來。必要時可通過施 加磁場使這個過程加速進行。等待一個小時后抽出上清液。加入4i水，撹 拌約10分鐘。再次將上清液抽出。這個清洗過程還需重復(fù)至少四次，直至 最終的洗水達到7.5-7.0的pH值為止。二氧化硅磁性粒子的特性Zeta電位 -50.2根據(jù)ESCA的二氧化硅含量 7.0原子％ Si純度在室溫下靜置10天后，上清液變成了黃/褐色。實例二用Bayoxide E 8706和水玻璃37/40，通過"錯流微濾"連續(xù)降 低pH值來制備涂有硅酸鹽的高純度磁鐵礦粒子。重復(fù)實例一中所述的反應(yīng)部分，但不是以逐步或成批的方式，而是借助 Fa. PAIX公司的帶有0.2 |im Supor⑧膜盒的微濾單元"Centramate "來進行 處理。為此，用泵通過軟管將磁性粒子懸浮液抽出，并將其引導到膜盒上，倒 掉滲透物，但將滯留物重新導入反應(yīng)容器內(nèi)。在粒子懸浮液中再次加入與滲 透物等量的懸浮液。經(jīng)過12小時的過濾后，滲透物在pH值和電導率方面均達到了原水的品 質(zhì)，提純過程至此結(jié)束。最終產(chǎn)品的特性Zeta電位-41mVSi含量 根據(jù)ESCA為4.9原子％ Si。初始產(chǎn)品Bayoxide 8706的二 氧化硅含量2.4原子。/。Si。據(jù)此，2.5原子％ Si的差量通過用水玻璃實施的二氧化硅處理后沉淀在 粒子表面。由此產(chǎn)生的二氧化硅層厚為0.4nm。純度經(jīng)超濾提純的粒子懸浮液在室溫下靜置好幾個月后，其上清液也 未出現(xiàn)變色現(xiàn)象。實例三用BavoxideE 8706和水玻璃37/40通過"錯流微濾"連續(xù)降低pH值， 隨后實施分級離心法，以制備涂有硅酸鹽的高純度磁鐵礦粒子，用離心器(Eppendorf 5810)對3225 g的實例二中所述的最終產(chǎn)品進行 7分鐘的離心分離。當產(chǎn)品的主要部分(> 98%)沉淀下來后，將深褐色上 清液倒掉。將沉淀物重新放入水中，并對其進行離心分離，將其與有色上清液分離。 這個分級離心過程還需重復(fù)8次，直至得到無色的上清液為止。 最終產(chǎn)品(第九份離心產(chǎn)物)的特性 Zeta電位-35 mVSi含量 3.0% Si。 0.6原子％的差量通過用水玻璃實施的二氧化硅
處理后沉淀在粒子表面。由此產(chǎn)生的二氧化硅層厚為0.2 nm。純度通過這種方法制成的磁性粒子懸浮液的上清液在放置好幾個月后 仍完全保持無色。這種產(chǎn)品品質(zhì)主要在磁性分離方面具有很高的價值。因此，施加;茲體后， 在不超過20秒的時間內(nèi)就可觀察到絕對純凈的上清液。實例四對來自于涂二氧化硅》茲性粒子的懸浮液的水性上清液進行光學測量這個試驗采用的是兩份批號分別為H正13266 (源于本發(fā)明的方法的實 例二和實例三)和HIE12106R2 (源于WO 03/058649 A1中公開的方法，基 于Bayoxide E 8707 )的涂二氧化硅》茲性粒子的水性上清液，用Nanodrop公 司的分光計測定的其吸收光譜在221 -750 nm范圍內(nèi)(參見

圖1 )。從這些光諳中得出的水體光語用作參考。還將另 一份水體光i普用作對照 樣品(零線)。從光譜中可以看出，批號為HIE 13266的涂二氧化硅^t性粒子的水性上 清液具有與水相似的吸收性能。而批號為HIE 12106R2的上清液的吸收曲線 則顯示出了明顯不同的更強的吸收性能(范圍約在500 nm )。從中可以看出，與通過依次進行多次清洗或通過逐步降低pH值(另見 WO 03/058649 Al )而制成的HIE 12106R2粒子相比，本發(fā)明的新型制備方 法(即在^f敫濾單元中連續(xù)清洗(粒子HIE 13266))可以改善沾污效應(yīng)或減少 滲入上清液中的鐵化合物。粒子HIE 12106R2的這種沾污效應(yīng)體現(xiàn)在上清液 放置一段時間后所發(fā)生的可見變色現(xiàn)象和強度有所增大的吸收特性上。此外 還可看出，通過本發(fā)明的方法實現(xiàn)的上清液中的這種有所改善的沾污效應(yīng)表 明粒子上有封閉的二氧化硅層。實例五涂有二氧化硅的磁性粒子的水性上清液在RT-PCR時的特性在磁化條件下對兩份不同的涂二氧化硅磁性粒子(批號HIE 13266和 HIE 12106R2)的水性上清液進行^f企測。批號為HIE 13266的粒子用本發(fā)明 的制備方法通過在微濾單元內(nèi)連續(xù)清洗而制成(參見實例二和實例三)。批 號為HIE 12106R2的粒子通過依次進行的多次清洗而制成(參見WO 03/058649 Al ，基于Bayoxide E 8707 )。隨后對兩份上清液進行定量RT-PCR:在Stratagene公司的MX4000上進行所謂的定量RT ( Reverse Transcription,反轉(zhuǎn)錄)-PCR。其中，在三份20 pi的預(yù)混試劑中分別加入兩 種粒子的5 pl上清液和5 iil對照用水。預(yù)混試劑中含有下列成分400 nM 引物A、 400 nM引物B、 10 ng MCF-7 RNA( Ambion )、 Taqman引物200 nM、 一份緩沖劑A、 5 mM MgCl2; 1.2 mM dNTP、 8 U RNase抑制劑、20 U MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶、1.25 U Taq Gold (均來自Applied Biosystems公司)。PCR方案為 45。C時30分鐘，95。C時10分鐘，96。C時15秒鐘內(nèi)45個循環(huán)，63。C時60 秒鐘，72'C時30秒4f。將配制品放入96孔微量滴定板(Stratagene ),鎖緊96孔微量滴定板后 將其放入分析器內(nèi)。分析器啟動后，在信號曲線的擴增指數(shù)范圍內(nèi)選定一個
基值(熒光強度)的情況下為每份樣品分配一個特有的Ct值(使選定基值與 擴增曲線相交的循環(huán)數(shù))。從圖2中可以看出，粒子H正13266的上清液的擴增曲線與作為樣品的 水的擴增曲線相似。而從圖2的右邊可看到，HIE 12106R2上清液的擴增曲 線約偏移了三個Ct值，這表明，RT-PCR的效率受到了干擾或不利影響。
權(quán)利要求
1.一種涂有二氧化硅的磁性粒子，其特征在于，所述涂有二氧化硅的磁性粒子具有一個最大層厚為5nm的含有硅酸鹽的封閉表面涂層。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂有二氧化硅的磁性粒子，其中，硅酸鹽的 最大層厚為2 nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的涂有二氧化硅的磁性粒子，其中，硅酸鹽的 最大層厚為0.5 nm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的涂有二氧化硅的磁性粒子，其中，磁性 材料為氧化鐵或》茲鐵礦。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的涂有二氧化硅的磁性粒子，其特征在于， 粒度分布介于0.1 和1 fim之間。
6. —種制備4艮據(jù)權(quán)利要求1至5所述的粒子的方法，其特征在于， 先通過鐵粒子表面特性誘發(fā)硅酸鹽從水玻璃或硅溶膠中分離出來，并沉積在磁鐵礦粒子上，隨后通過緩慢、持續(xù)的稀釋將pH值降到中性pH值， 對所述表面進行整平和密封。
7. —種通過使用根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的磁性粒子來對生物組織樣 品進行核酸提純的方法。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于， 所述核酸涉及的是RNA或DNA。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于， 涉及的是HCV或HIV的RNA。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于， 涉及的是來自于固定組織樣品的RNA或DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種涂有二氧化硅(SiO₂)的磁性粒子，其中，二氧化硅層封閉、致密，且具有厚度極薄的特點，其厚度僅在幾納米范圍內(nèi)(下文也稱其為“二氧化硅納米層”)。此外，本發(fā)明還涉及一種制備這種含二氧化硅磁性粒子的改良方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，通過這種方法不僅能獲得具有封閉二氧化硅層的產(chǎn)品，還能大幅提高純度。通過這種新方法還能避免磁鐵礦表面不受控制地形成硅酸鹽聚集體，從而對下文將要說明的特性和生物用途產(chǎn)生有利影響。此外，這種新方法還可在分級離心基礎(chǔ)上減少納米固體顆粒。本發(fā)明的磁性粒子具有最佳磁化性能和懸浮性能，并且能非常有利地脫離塑料表面。這種涂有二氧化硅的高純度磁性粒子優(yōu)選用于從細胞樣品或組織樣品中分離核酸，其中，這種樣品基質(zhì)分離借助于磁場而實現(xiàn)。這種粒子特別適用于核酸(大多源于生物體樣品)的自動提純，以便通過各種擴增方法對其進行檢測。
文檔編號H01F1/12GK101213619SQ200680020971
公開日2008年7月2日 申請日期2006年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月23日
發(fā)明者卡爾海因茨·希爾登布蘭德, 吉多·亨尼格 申請人:西門子醫(yī)療系統(tǒng)診斷股份有限公司