一種誘變處理生物材料的方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明“一種誘變處理生物材料的方法”，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。其特征在于：采用以下步驟：（1）在固體培養(yǎng)基上涂布待處理的細(xì)胞，（2）對涂布的細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，所述細(xì)胞指微生物細(xì)胞、動植物懸浮狀細(xì)胞。本發(fā)明的方法一方面能顯著提到誘變效率，提高篩選效率。另一方面，有利于采用結(jié)合自動化高通量實驗設(shè)備進(jìn)行誘變育種。
【專利說明】一種誘變處理生物材料的方法及裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物試驗方法，特別是一種高通量處理生物材料的方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]目前絕大多數(shù)實驗室對生物材料特別是微生物進(jìn)行誘變處理的方法，其處理過程大多如下:(I)誘變處理:通過物理誘變或化學(xué)誘變等方法，對盛裝在容器中的微生物樣品進(jìn)行誘變處理；(2)涂布平板:誘變處理結(jié)束后，將菌液涂布在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)長出單菌落；(3)分析單菌落篩選突變株。
[0003]上述現(xiàn)有方法的缺點在于，盛裝在容器中的液體狀態(tài)下的微生物，在接受誘變處理時，尤其是接受物理方法處理時，由于菌體之間相互遮擋，或液體對于處理劑量削弱作用，會降低處理效果，導(dǎo)致誘變效率低。
[0004]上述處理方法也不利于高通量及自動化操作。高效率的微生物誘變、選育方法和技術(shù)是目前生物【技術(shù)領(lǐng)域】的研究熱點，并有很大的市場需求；配合高通量篩選技術(shù)開發(fā)高效的突變方法很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域存在的需求，提供一種誘變處理生物材料的方法及相應(yīng)的裝置。技術(shù)方案如下:
[0006]一種誘變處理生物材料的方法，其特征在于采用以下步驟:
[0007](I)在固體培養(yǎng)基上均勻涂布待處理的細(xì)胞，
[0008](2)對涂布的細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，
[0009]所述細(xì)胞指微生物細(xì)胞。
[0010]所述誘變處理指采用物理方法，如紫外線、Y射線、等離子體、電磁輻射等，輻照涂布于固體培養(yǎng)基上的細(xì)胞。
[0011]所述誘變處理指涂布待處理的細(xì)胞之后再涂布化學(xué)誘變劑，然后進(jìn)行培養(yǎng)。
[0012]誘變處理結(jié)束之后還包括培養(yǎng)，所述生物材料細(xì)胞指微生物，所述培養(yǎng)包括培養(yǎng)長成菌落。
[0013]所述培養(yǎng)還包括將長成的菌落擴(kuò)繁成菌液。
[0014]所述培養(yǎng)基中添加有化學(xué)誘變劑。
[0015]一種誘變處理生物材料的方法，其特征在于:
[0016](I)在添加有化學(xué)誘變劑的固體培養(yǎng)基上涂布待處理的細(xì)胞，
[0017](2)培養(yǎng)涂布在固體培養(yǎng)基的細(xì)胞。
[0018]涂布待處理的細(xì)胞之后，對涂布的待處理細(xì)胞進(jìn)行物理輻照處理，所述物理輻照處理是指采用紫外線、Y射線、等離子體、電磁輻射等，輻照涂布于固體培養(yǎng)基上的細(xì)胞。 [0019]所述涂布待處理的細(xì)胞，涂布濃度為:使經(jīng)過誘變處理之后在固體培養(yǎng)基表面長出的細(xì)胞的密度為每平方厘米少于等于50個。[0020]本發(fā)明提供了一種誘變處理微生物的方法，與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于:將帶誘變處理的細(xì)胞先均勻涂布于營養(yǎng)平板上，再進(jìn)行誘變處理。誘變處理之后再進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)出的單菌落中選育突變株。本發(fā)明的方法的突出優(yōu)點體現(xiàn)在兩方面:一方面能夠顯著提高誘變效率。均勻涂布在平板上的細(xì)胞都能夠接受到同等強(qiáng)度的誘變處理劑量，處理結(jié)束后經(jīng)培養(yǎng)長出的菌落中發(fā)生突變菌落比例大幅度提高，有效地提高了誘變和篩選效率；另一方面，本發(fā)明的方法更易于于采用自動化的高通量處理設(shè)備來實現(xiàn)誘變處理及篩選工作。
[0021]本發(fā)明的方法中，誘變處理可以指物理誘變，包括紫外、Y射線、等離子體處理等；也可以是化學(xué)誘變處理，包括在平板培養(yǎng)基中添加化學(xué)誘變試劑和/或在平板培養(yǎng)基表面涂布化學(xué)誘變劑?；瘜W(xué)誘變劑可以是本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中報道的任何誘變試劑。
[0022]本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，既采用了化學(xué)誘變也采用了物理誘變，即在培養(yǎng)基中添加化學(xué)誘變劑，涂布待處理菌液之后接受等離子體處理。
[0023]本發(fā)明的方法中，對于在平板培養(yǎng)基上涂布細(xì)胞，涂布密度應(yīng)保證每平方厘米不超過100個；或者取決于誘變處理后細(xì)胞的死亡率，涂布的濃度的標(biāo)準(zhǔn)是:在誘變處理之后長出的菌落的密度為每平方厘米上長出的菌落數(shù)不多于5個。誘變處理后細(xì)胞的死亡率取決于處理方式(物理或化學(xué)，物理處理中的劑量、處理時間，化學(xué)處理中的劑量、處理劑種類等都會影響待處理細(xì)胞的死亡率)。為了獲得每種誘變處理方式下的細(xì)胞死亡率的準(zhǔn)確數(shù)字，在每批誘變處理實驗之前，可以做一個獲得死亡率數(shù)據(jù)的預(yù)實驗。在本發(fā)明的兩個具體實施例中，涂布生物材料為微生物(乳酸菌和酵母菌)，涂布適宜濃度為IO2~IO3個/ml，每個標(biāo)準(zhǔn)平板涂布100 μ I。
[0024]本發(fā)明實施例1和2的實驗數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明的微生物誘變處理方法有效
[0025]的規(guī)避了菌株因風(fēng)干、滲透壓改變，處理過程中載片滑落、菌液飛濺等客觀因素的影響，有效提高了誘變效率。
[0026]術(shù)語界定:
[0027]本發(fā)明所用的術(shù)語“涂布”，是一個動作，從本發(fā)明的上下文可以看出，其目的在于使待處理的生物細(xì)胞在平板上分散的到一定程度，例如本發(fā)明限定的誘變處理后長出的細(xì)胞數(shù)不超過50個/每平方厘米的密度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1采用本發(fā)明的方法誘變處理乳酸菌對比試驗，
[0029]圖2采用本發(fā)明的方法誘變處理酵母菌對比試驗，
[0030]其中橫坐標(biāo)為處理時間，縱坐標(biāo)為致死率。
【具體實施方式】
[0031] 實施例1采用本發(fā)明的方法誘變處理乳酸菌
[0032]設(shè)備:ARTP (常壓室溫等離子體)誘變育種系統(tǒng)
[0033]試劑:0.9%生理鹽水，MRS固體培養(yǎng)基配方:蛋白胨10g/L、牛肉粉5g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖20g/L、醋酸鈉5g/L、檸檬酸二銨2g/L、吐溫801mL、磷酸氫二鉀(7H20)2g/L、乙酸鈉(3H20)5g/L、檸檬酸三銨 2g/L、硫酸鎂(7H20)0.2g/L、硫酸錳(4H20)0.05g/L、瓊脂 15g/L0[0034]待處理菌液:嗜酸乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)ACCC10637,來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心
[0035]固體培養(yǎng)基:MRS固體培養(yǎng)基
[0036]對照試驗步驟:
[0037](1)制備菌懸液:將乳酸菌原始菌株用MRS固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)時間24h，刮取菌體于生理鹽水中，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌液；
[0038](2)制備樣品載片:取新鮮制備的菌液稀釋至細(xì)胞濃度0D_=0.5~1，滴加10~20uL至滅菌冷卻后的載片上；
[0039](3)誘變處理:以10SLM為氣體流量，以O(shè)~90s為處理時間對樣品載片進(jìn)行等離子體誘變；
[0040](4)誘變后，將載片上的菌膜洗脫，相應(yīng)稀釋后，涂布MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、35 °C，計算致死率。
[0041](5)實驗結(jié)果如附圖1對照組所示，其中，橫坐標(biāo)為處理時間，縱坐標(biāo)為致死率。
[0042]本發(fā)明的方法的步驟:
[0043](I)制備菌懸液:將乳酸菌原始菌株用MRS固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度35°C，培養(yǎng)時間24h，刮取菌體于生理鹽水中，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌液；
[0044](2)涂布平板:取新鮮制備的菌液稀釋至細(xì)胞濃度約為IO2~IO3個/mL，取IOOuL涂布平板；
[0045] (3)誘變處理:以10SLM為氣體流量，以O(shè)~90s為處理時間對平板進(jìn)行等離子體誘變；
[0046](4)誘變后，將載片上的菌膜洗脫，相應(yīng)稀釋后，涂布MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、35 °C，計算致死率。
[0047](5)實驗結(jié)果如附圖1平板組所示，其中，橫坐標(biāo)為處理時間，縱坐標(biāo)為致死率。
[0048]由圖1可知，與對照組相比，利用平板處理得到的致死率雖然比對照組低，但致死率曲線平滑穩(wěn)定，波動幅度較小，有效的排除了菌株因風(fēng)干、滲透壓改變，處理過程中載片滑落、菌液飛濺等客觀因素的影響，有效提高了誘變效率。
[0049]實施例2采用本發(fā)明的方法誘變處理酵母菌
[0050]設(shè)備:ARTP (常壓室溫等離子體)誘變育種系統(tǒng)
[0051]試劑:0.9%生理鹽水，PDA固體培養(yǎng)基配方:馬鈴薯浸粉5g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L、氯霉素 0.lg/L。
[0052]待處理菌液:畢赤酵母(Pichia pastoris)21003,購自來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌
種保藏管理中心
[0053]固體培養(yǎng)基:PDA固體培養(yǎng)基
[0054]對照試驗步驟:
[0055](I)制備菌懸液:將酵母菌原始菌株用PDA固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間48h，刮取菌體于生理鹽水中，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌液；
[0056](2)制備樣品載片:取新鮮制備的菌液稀釋至細(xì)胞濃度0D_=0.5~1，滴加10~20uL至滅菌冷卻后的載片上；
[0057](3)誘變處理:以10SLM為氣體流量，以O(shè)~120s為處理時間對樣品載片進(jìn)行等離子體誘變；
[0058](4)誘變后，將載片上的菌膜洗脫，相應(yīng)稀釋后，涂布PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48h、28°C，計算致死率。實驗結(jié)果如附圖2對照組所示，其中，橫坐標(biāo)為處理時間，縱坐標(biāo)為致死率。
[0059]本發(fā)明的方法的步驟及條件:
[0060](I)制備菌懸液:將乳酸菌原始菌株用PDA固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間48h，刮取菌體于生理鹽水中，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌液；
[0061](2)涂布平板:取新鮮制備的菌液稀釋至細(xì)胞濃度約為IO2~IO3個/mL，取IOOuL涂布平板；
[0062](3)誘變處理:以10SLM為氣體流量，以O(shè)~120s為處理時間對平板進(jìn)行等離子體誘變；
[0063](4)誘變后，將載片上的菌膜洗脫，相應(yīng)稀釋后，涂布PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48h、28°C，計算致死率。實驗結(jié)果如附圖2平板組所示，其中，橫坐標(biāo)為處理時間，縱坐標(biāo)為致死率。
[0064]由圖2可知，與對照組相比，利用平板處理得到的致死率雖然比對照組低，但致死率曲線平滑穩(wěn)定，波動幅度較小，有效的排除了菌株因風(fēng)干、滲透壓改變，處理過程中載片滑落、菌液飛濺等客觀因素的影響，有效提高了誘變效率。
【權(quán)利要求】
1.一種誘變處理生物材料的方法，其特征在于:采用以下步驟: (1)在固體培養(yǎng)基上涂布待處理的細(xì)胞， (2)對涂布的細(xì)胞進(jìn)行誘變處理， 所述細(xì)胞指微生物細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述誘變處理指采用紫外、鈷60或常壓室溫等離子體輻照涂布在固體培養(yǎng)基上的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述誘變處理指涂布待處理的細(xì)胞之后再涂布化學(xué)誘變劑，然后進(jìn)行培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，誘變處理結(jié)束之后還包括培養(yǎng)，所述生物材料細(xì)胞指微生物，所述培養(yǎng)包括培養(yǎng)長成菌落。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述培養(yǎng)還包括將長成的菌落擴(kuò)繁成菌液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一所述的方法,所述培養(yǎng)基中添加有化學(xué)誘變劑。
7.一種誘變處理生物材料的方法，其特征在于: (1)在添加有化學(xué)誘變劑的固體培養(yǎng)基上涂布待處理的細(xì)胞， (2)培養(yǎng)涂布在固體培養(yǎng)基的細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于涂布待處理的細(xì)胞之后，對涂布的待處理細(xì)胞進(jìn)行物理輻照處理，所述物理輻照處理采用紫外、鈷60或常壓室溫等離子體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8任一所述的方法，所述涂布待處理的細(xì)胞，涂布濃度為:使經(jīng)過誘變處理之后在固體培養(yǎng)基表面長出的細(xì)胞的密度為每平方厘米少于等于50個。
【文檔編號】C12N15/01GK103911363SQ201310749658
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月31日
【發(fā)明者】畢鮮榮, 王立言 申請人:無錫思清源生物科技有限公司