專利名稱：轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法。

背景技術：
通過生物技術將克隆的外源基因人為地整合到昆蟲基因組內(nèi)、并穩(wěn)定地遺傳和表達，這樣的昆蟲叫做轉(zhuǎn)基因昆蟲。轉(zhuǎn)基因昆蟲能夠形成一個具有相應外源基因的新的品種，其利用價值在于 (1)開展基礎理論研究； (2)生產(chǎn)外源蛋白； (3)開展經(jīng)濟昆蟲的分子育種； (4)開展害蟲的生物防治。
在轉(zhuǎn)基因昆蟲研究中，多采用紅色熒光基因、綠色熒光基因等作為標志基因(也稱報告基因)，確定及選擇轉(zhuǎn)基因昆蟲，熒光蛋白的含量是標志基因表達量的體現(xiàn)，也是很多外源基因與標志基因結合構成的融合蛋白表達量的體現(xiàn)。當前對轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光蛋白的表達檢測主要是處在肉眼觀測的定性階段，對融合蛋白表達量的檢測主要是解剖昆蟲，通過分子生物學或分析化學的分析檢測方法得到。本發(fā)明可以在不損傷昆蟲、不需分子生物學或生物化學分析測試的情況下，只需通過熒光觀察和數(shù)碼照像，就可獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量的觀察值，達到定量地估量轉(zhuǎn)基因效率、估量外源基因與標志基因結合構成的融合蛋白表達量的目的。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是 轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法 1)是利用熒光體視顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因昆蟲的個體，用數(shù)碼相機或數(shù)碼CCD攝影設備，在暗室中按1/60秒-20秒曝光時間攝取表達熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲圖像； 2)運用圖像處理技術，首先將所得昆蟲圖像進行預處理，明確圖像中昆蟲部分和黑色背景界限，再將所攝取的表現(xiàn)熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲的RGB彩色圖像轉(zhuǎn)化為相應顏色分量的灰度圖像，按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，根據(jù)該直方圖，按照選擇能夠清晰分割圖像背景和昆蟲部分的最小閾值的要求，確定二值化分割圖像的閾值，然后利用該閾值進行二值化分割圖像，得到一張與原圖像素大小一樣，但昆蟲部分像素值為1、即為白色，背景部分像素值為0、即為黑色的二值圖像，最后，利用中值濾波消除圖像斑點，確定中值濾波的鄰域大?。? 3)根據(jù)所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，利用matlab應用數(shù)學軟件，累加灰度圖像中分離所得昆蟲部分像素值，除以所取的像素點數(shù)，所得平均值作為轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達量的相對數(shù)值。
所述的圖像處理技術，使用photoshop圖像處理軟件、開源圖像處理軟件Gimp、或者matlab應用數(shù)學軟件，或者采用c、python編程語言編程實現(xiàn)。
所述的相應顏色分量是根據(jù)轉(zhuǎn)基因昆蟲表達的熒光蛋白顏色確定，Red熒光基因是轉(zhuǎn)化為紅色顏色分量的灰度圖像，GFP、EGFP熒光基因是轉(zhuǎn)化為綠色顏色分量的灰度圖像，CFP和ECFP熒光基因是轉(zhuǎn)化為藍色顏色分量的灰度圖像。
所述的利用matlab應用數(shù)學軟件，是利用matlab應用數(shù)學軟件的圖像處理工具箱，建立了一個可供調(diào)用的函數(shù)meanRGB，程序代碼如下 function r=meanRGB(filename,rgb,threshold,neighborhood)f=imread(filename);g=f(:,:,rgb);b=im2bw(g,threshold/256);if neighborhood　　m=medfilt2(b,[2*neighborhood+1,2*neighborhood+1]);else　　m=bendr=0;n=0;h=size(f,1);w=size(f,2);for x=1:1:h　　for y=1:1:w<!-- SIPO <DP n="2"> --><dp n="d2"/>　　 if m(x,y)　　 n=n+1;　　 r=r+double(g(x,y));　　endendendr=r/n;r=int16(r); 這個函數(shù)調(diào)用的接口是 輸入的參數(shù)filename為所攝取表達熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲圖像的文件名。rgb表明測量是紅、綠、藍哪種顏色的熒光紅色熒光則該參數(shù)值為1，綠色熒光則該參數(shù)值為2，藍色熒光則該參數(shù)值為3。threshold為本技術方案第二步所確定的閾值。neighborhood為本技術方案第二步所確定中值濾波鄰域大小。
該函數(shù)調(diào)用后返回取得的結果即為圖像中昆蟲部分像素值平均值，也即用來衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達量的相對量的數(shù)值。
本發(fā)明具有的有益的效果是本發(fā)明可以在不損傷昆蟲、不需分子生物學或生物化學分析測試的情況下，只需通過熒光觀察和數(shù)碼照像，就可獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量的觀察值，達到定量地估量轉(zhuǎn)基因效率、估量融合蛋白表達量的目的。



圖1是紅色熒光蛋白(Red)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像； 圖2是分割圖1得到的位于圖1上面的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像； 圖3是分割圖1得到的位于圖1下面的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像； 圖4是經(jīng)過預處理的圖2； 圖5是經(jīng)過預處理的圖3； 圖6是圖4紅色顏色分量的灰度圖象； 圖7是圖5紅色顏色分量的灰度圖象； 圖8是圖6的直方圖； 圖9是圖7的直方圖； 圖10是對圖6應用閾值10進行二值化所得的二值圖像； 圖11是對圖6應用閾值11進行二值化所得的二值圖像； 圖12是對圖6應用閾值12進行二值化所得的二值圖像； 圖13是對圖6應用閾值13進行二值化所得的二值圖像； 圖14是對圖6應用閾值14進行二值化所得的二值圖像； 圖15是對圖6應用閾值15進行二值化所得的二值圖像； 圖16是對圖6應用閾值16進行二值化所得的二值圖像； 圖17是對圖6應用閾值17進行二值化所得的二值圖像； 圖18是對圖6應用閾值18進行二值化所得的二值圖像； 圖19是對圖6應用閾值19進行二值化所得的二值圖像； 圖20是對圖6應用閾值20進行二值化所得的二值圖像； 圖21是對圖16進行鄰域的大小為10的中值濾波后所得的圖； 圖22是對圖7應用閾值10進行二值化所得的二值圖像； 圖23是對圖7應用閾值11進行二值化所得的二值圖像； 圖24是對圖7應用閾值12進行二值化所得的二值圖像； 圖25是對圖7應用閾值13進行二值化所得的二值圖像； 圖26是對圖7應用閾值14進行二值化所得的二值圖像； 圖27是對圖7應用閾值15進行二值化所得的二值圖像； 圖28是對圖7應用閾值16進行二值化所得的二值圖像； 圖29是對圖7應用閾值17進行二值化所得的二值圖像； 圖30是對圖7應用閾值18進行二值化所得的二值圖像； 圖31是對圖7應用閾值19進行二值化所得的二值圖像； 圖32是對圖7應用閾值20進行二值化所得的二值圖像； 圖33是對圖7應用閾值21進行二值化所得的二值圖； 圖34是對圖7應用閾值22進行二值化所得的二值圖像； 圖35是GFP轉(zhuǎn)基因家蠶RGB彩色圖像； 圖36是圖35綠色顏色分量的灰度圖象； 圖37是圖36的直方圖； 圖38是應用閾值10進行二值化分割所得的二值圖； 圖39是應用閾值11進行二值化分割所得的二值圖； 圖40是應用閾值12進行二值化分割所得的二值圖； 圖41是應用閾值13進行二值化分割所得的二值圖； 圖42是應用閾值14進行二值化分割所得的二值圖； 圖43是應用閾值15進行二值化分割所得的二值圖； 圖44是應用閾值16進行二值化分割所得的二值圖； 圖45是應用閾值17進行二值化分割所得的二值圖； 圖46是應用閾值18進行二值化分割所得的二值圖； 圖47是應用閾值19進行二值化分割所得的二值圖； 圖48是應用閾值20進行二值化分割所得的二值圖； 圖49是應用閾值21進行二值化分割所得的二值圖； 圖50是應用閾值22進行二值化分割所得的二值圖； 圖51是GFP轉(zhuǎn)基因家蠶； 圖52是圖51綠色顏色分量的灰度圖象； 圖53是圖52的直方圖； 圖54是應用閾值2進行二值化分割所得的二值圖； 圖55是應用閾值3進行二值化分割所得的二值圖； 圖56是應用閾值4進行二值化分割所得的二值圖； 圖57是應用閾值5進行二值化分割所得的二值圖； 圖58是應用閾值3進行二值化分割后再經(jīng)過中值濾波所得的二值圖； 圖59是Red轉(zhuǎn)基因昆蟲； 圖60是Red轉(zhuǎn)基因昆蟲紅色顏色分量的灰度圖像； 圖61是圖60的直方圖； 圖62是應用閾值10進行二值化分割所得的二值圖； 圖63是應用閾值11進行二值化分割所得的二值圖； 圖64是應用閾值12進行二值化分割所得的二值圖； 圖65是應用閾值13進行二值化分割所得的二值圖； 圖66是應用閾值14進行二值化分割所得的二值圖； 圖67是應用閾值15進行二值化分割所得的二值圖； 圖68是應用閾值16進行二值化分割所得的二值圖； 圖69是應用閾值17進行二值化分割所得的二值圖； 圖70是應用閾值18進行二值化分割所得的二值圖； 圖71是應用閾值19進行二值化分割所得的二值圖； 圖72是應用閾值20進行二值化分割所得的二值圖； 圖73是應用閾值18進行二值化分割后再經(jīng)過中值濾波所得的二值圖。

具體實施例方式 實施例1 1、利用OLYMPUS SZX9體視顯微鏡(解剖鏡)觀測，激發(fā)光濾光片波長為545-580nm，發(fā)射光濾光片波長為610-的熒光裝置，用NiKon公司的COOLPIX4500數(shù)碼照相機觀察轉(zhuǎn)基因家蠶1齡幼蟲，在暗室中按1/2秒曝光攝取表達紅色熒光蛋白(Red)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像(圖1)。
圖1中有兩條轉(zhuǎn)基因家蠶1齡幼蟲，將圖1分割成圖2，圖3。
2、利用photoshop軟件分別對圖2、圖3進行預處理。
2.1利用photoshop工具箱中的畫筆工具進行預處理，得到圖4，圖5，使得圖像中昆蟲部分和黑色背景界限分明。
2.2因為本實施例中轉(zhuǎn)基因家蠶表達的熒光基因為紅色熒光(Red)基因，所以將RGB彩色圖像轉(zhuǎn)換為紅色顏色分量的灰度圖象，得到圖6，圖7。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動面板的“通道”的紅色選項。
2.3按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，得到圖8，圖9。在photoshop中操作即為選擇界面中左邊的浮動面板的“直方圖”。
仔細觀察以上兩幅直方圖，發(fā)現(xiàn)它們都有兩個峰。因為圖片是在黑暗環(huán)境中攝取，背景為黑色并且像素值大小越低，該像素值所代表的顏色就越黑。所以可以認為第一個峰代表圖像中的黑色背景部分，第二個峰代表圖像中的家蠶部分。選擇第一個峰和第二個峰之間的谷底靠近第一峰的一個像素數(shù)值開始，以1為梯度，不斷增大該值，直到能將圖像中背景部分和家蠶部分清晰的分開為止，選擇該值作為進行圖像二值化的閾值。
對于圖6，我們選擇像素值10作為開始嘗試的閾值，得到應用閾值10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20對圖6進行二值化的二值圖圖10，圖11，圖12，圖13，圖14，圖15，圖16，圖17，圖18，圖19，圖20。在photoshop中操作為選擇“菜單欄→圖像→調(diào)整→閾值”，在跳出的對話框中輸入所用的閾值，按“確定”就得到相應的二值圖像。
比較觀察二值圖10至圖20，當用閾值10-15進行二值化圖像分割時(圖10～圖15)，所得的二值圖家蠶形體周圍有比較多的小白色斑點，家蠶部分的輪廓不清晰，說明這些值不是好的閾值。當閾值為16時(圖16)，所得的二值圖家蠶形體周圍的小的白色斑點減少，昆蟲部分的輪廓比較清晰。但是當閾值為17-20時(圖17～圖20)，雖然家蠶形體周圍小的白色斑點消失，但是家蠶部分出現(xiàn)較大的黑色斑點(家蠶尾部)，也即在當閾值為17-20時圖像的家蠶部分有較大部分像素點會被誤認為背景。所以，選擇16作為圖6的閾值。為了清除圖16中的白色斑點，需要對圖16進行中值濾波，取能夠?qū)唿c去掉的最小值作為中值濾波鄰域的大小。在photoshop中選擇“菜單欄→濾鏡→雜色→中間值”，在跳出的對話框中輸入所用的濾波鄰域的大小，從1開始不斷增大該值，直到能夠?qū)唿c完全去掉為止。記取此時所用的鄰域的大小。對于圖片11，選擇的鄰域的大小為10，得到圖21。
也就是說對于圖4(即圖6的原圖)，按照技術方案第二步對其進行處理，確定它二值化分割的閾值為16，中值濾波的鄰域大小為10。
同理對于圖7，我們同樣選擇像素值10作為開始嘗試的閾值，得到應用閾值10-22對圖7進行二值化的二值圖(圖22～圖34)。
同樣地，比較觀察二值圖22至圖34，當閾值大于20后，即圖32、圖33、圖34，圖片中家蠶部分和黑色背景部分能夠清晰地分開。在這種情況下，為遵循“選擇能夠清晰分割圖像背景和家蠶部分的最小閾值”的要求，所以選擇20作為閾值。
因為用閾值20進行二值化圖像分割得到的圖32，沒有小的白色斑點，所以沒有必要進行中值濾波，也就是中值濾波的鄰域的大小為0。
也就是說對于圖5(即圖7的原圖)，按照技術方案第二步對其進行處理，確定它二值化分割的閾值為20，中值濾波的鄰域大小為0。
3、根據(jù)第二步所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGB，計算圖像中家蠶部分像素值平均值，也即用來衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達量的相對量的數(shù)值。
對于圖4(文件名為“ph4.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph4.jpg’，1，16，10)，調(diào)用所得的結果為132。
對于圖5(文件名為“ph5.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph5.jpg’，1，20，0)，調(diào)用所得的結果為148。
本實施例在同樣條件下對2個轉(zhuǎn)基因家蠶個體進行攝影，獲得2個轉(zhuǎn)基因家蠶熒光基因表達量的相對數(shù)值，圖4的結果為132，圖5的結果為148，說明圖5對應的轉(zhuǎn)基因家蠶表達的紅色熒光蛋白含量高于圖4，也即圖5對應的轉(zhuǎn)基因家蠶熒光基因表達的效率較高。
實施例2 1、利用OLYMPUS SZX9體視顯微鏡(解剖鏡)觀測，熒光裝置的激發(fā)光濾光片波長為460-490nm，發(fā)射光濾光片波長為510-550，用NiKon公司的COOLPIX 4500數(shù)碼照相機觀察轉(zhuǎn)基因家蠶2齡幼蟲，在暗室中按1秒曝光時間攝取表達綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像(圖35)。
2、利用photoshop軟件對圖35按上面說明的技術方案步驟二進行處理。
2.1因為該圖像中昆蟲部分和黑色背景界限已經(jīng)比較分明，所以就無需再作圖像預處理。
2.2因為本實施例中轉(zhuǎn)基因家蠶表達的熒光基因為綠色熒光(GFP)基因，所以將RGB彩色圖像轉(zhuǎn)換綠色顏色分量的灰度圖象，得到圖36。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動面板的“通道”的綠色選項。
2.3按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，得到圖37。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動面板的“直方圖”。
直方圖37有兩個峰，其中第一個峰代表圖像中的黑色背景部分，第二個峰代表圖像中的家蠶部分。所以，選擇第一個峰和第二個峰的谷底靠近第一峰的一個值，10，為開始嘗試的閾值，得到應用閾值10-22對圖36進行二值化的二值圖，得到圖38至圖50。在photoshop中操為選擇“菜單欄→圖像→調(diào)整→閾值”，在跳出的對話框中輸入所用的閾值，按“確定”就得到相應的二值圖像。
比較觀察二值圖38至圖50，當閾值大于20后，即圖48、圖49、圖50，圖片中家蠶部分和黑色背景部分能夠清晰地分開。在這種情況下，為了減少人為原因造成的誤差，遵循“選擇能夠清晰分割圖像背景和家蠶部分的最小閾值”的要求，所以選擇20作為閾值。
因為用閾值20進行二值化圖像分割得到的圖48，沒有小的白色斑點，所以沒有必要進行中值濾波，也就是中值濾波的鄰域的大小為0。
也就是說對于圖35(即圖36的原圖)，按照技術方案第二步對其進行處理，確定它二值化分割的閾值為20，中值濾波的鄰域大小為0。
3、根據(jù)第二步所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGB，計算圖像中家蠶部分像素值平均值，也即用來衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達量的相對量的數(shù)值。
對于圖35(文件名為“ph35.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph35.jpg’，2，20，0)，計算所得的結果為140。
實施例3 1、利用OLYMPUS SZX12體視顯微鏡(解剖鏡)觀測，激發(fā)光濾光片波長為460-490nm，發(fā)射光濾光片波長為510-550的熒光裝置，用數(shù)碼CCD攝影設備，按8秒曝光攝取轉(zhuǎn)基因家蠶3齡幼蟲，在暗室中攝取表達綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像(圖51)，該圖比實施例2中的圖像暗，說明GFP基因的表達比實施例2弱。
2、利用photoshop軟件對圖51按上面說明的技術方案步驟二進行處理。
2.1因為該圖像中家蠶部分和黑色背景界限已經(jīng)比較分明，所以就無需再作圖像預處理。
2.2因為本實施例中轉(zhuǎn)基因家蠶表達的熒光基因為綠色熒光(GFP)基因，所以將RGB彩色圖像轉(zhuǎn)換綠色顏色分量的灰度圖象，得到圖51。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動面板的“通道”的綠色選項。
2.3按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，得到圖53。在photoshop中操作為選擇界面中左邊的浮動面板的“直方圖”。
直方圖52有兩個峰，其中第一個峰代表圖像中的黑色背景部分，第二個峰代表圖像中的家蠶部分。但是，由于本圖中轉(zhuǎn)基因家蠶gfp基因表達量較少，家蠶部分較為暗淡，所以兩個峰之間間隔較小，我們選擇第一個峰和第二個峰的谷底靠近第一峰的一個值，2，為開始嘗試的閾值，按應用閾值2、3、4和5對圖52進行二值化，得到圖54至圖57。在photoshop中操為選擇“菜單欄、圖像、調(diào)整、閾值”，在跳出的對話框中輸入所用的閾值，按“確定”就得到相應的二值圖像。
比較觀察以上的二值圖，發(fā)現(xiàn)當用閾值2進行二值化圖像分割(圖54)，所得的二值圖家蠶形體周圍有比較多的小白色斑點，家蠶部分的輪廓不太清晰，說明該值不是好的閾值。當閾值為3時(圖55)，所得的二值圖家蠶形體周圍的小的白色斑點減少，昆蟲部分的輪廓比較清晰。但是當閾值為4、5時(圖56、圖57)，雖然家蠶形體周圍小的白色斑點消失，但是家蠶部分出現(xiàn)較大的黑色斑點(家蠶胸部)，也即在當閾值大于3時圖像的家蠶部分有較大部分像素點會被誤認為背景。所以，選擇3作為圖52的閾值。
為了清除圖55中的黑色背景中白色斑點和家蠶部分黑色斑點，需要對圖55進行中值濾波，取能夠?qū)唿c去掉的最小值作為中值濾波鄰域的大小。在photoshop中選擇“菜單欄→濾鏡→雜色→中間值”，在跳出的對話框中輸入所用的濾波鄰域的大小，從1開始不斷增大該值，直到能夠?qū)唿c完全去掉為止。記取此時所用的鄰域的大小。對于圖片55，選擇的鄰域的大小為4，得到圖58。
3、根據(jù)第二步所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGB，計算圖像中家蠶部分像素值平均值，也即用來衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達量的相對量的數(shù)值。
對于圖51(文件名為“ph51.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph51.jpg’，2，3，4)，計算所得的結果為25。
實施例4 1、利用OLYMPUS SZX9體視顯微鏡(解剖鏡)觀測，激發(fā)光濾光片波長為545-580nm，發(fā)射光濾光片波長為610-的熒光裝置，用NiKon公司的COOLPIX4500數(shù)碼照相機觀察轉(zhuǎn)基因家蠶1齡幼蟲，在暗室中按1/2秒曝光攝取表達紅色熒光蛋白(Red)的轉(zhuǎn)基因家蠶圖像(圖59)。
2、上面說明的技術方案步驟二所描述的圖片處理方法不僅可以在photoshop軟件中的交互界面中實現(xiàn)，還可以用matlab數(shù)學軟件編程實現(xiàn)。下面我們就利用matlab按照技術方案步驟二對圖59進行處理。
2.1因為該圖像中昆蟲部分和黑色背景界限已經(jīng)比較分明，所以就無需再作圖像預處理。
2.2在matlab軟件環(huán)境中，讀入圖像，因為是dsRed轉(zhuǎn)基因昆蟲轉(zhuǎn)入表達的是紅色熒光蛋白，故將RGB彩色圖像轉(zhuǎn)化為R(red)值的灰度圖像(圖60)。Matlab代碼image＝imread(‘Red.jpg’)； Red.jpg為圖59的文件名 red_image＝image(:，:，1) 2.3生成直方圖(圖61)，直方圖中存在明顯的兩個峰，其中第一個峰代表圖像中的黑色背景部分，第二個峰代表圖像中的家蠶部分。選擇第一個峰和第二個峰之間的谷底靠近第一峰的區(qū)的像素值10作為開始嘗試的閾值，得到應用閾值10-20對圖60進行二值化的二值圖圖62-圖72。
同樣地，選用能夠較為清晰分割圖像背景和昆蟲部分的最小閾值18。
2.4對圖70進行中值濾波去噪聲(即二值中的小斑點)，選擇能夠?qū)唿c去掉的最小值作為中值濾波鄰域的大小。在matlab中，調(diào)用medfilt2函數(shù)，從中值濾波鄰域最小值1開始，以1為梯度，逐步增大中值濾波鄰域值，選擇能夠?qū)唿c去掉的最小值作為中值濾波鄰域的大小，得數(shù)值5。Matlab代碼 生成圖像直方圖imhist(red_image) 根據(jù)閾值二值化binary_image＝im2bw(red_image，18/255) 中值濾波medfilted_image＝medfilt2(binary_image，[5，5]) 也就是說對于圖59(即圖60的原圖)，按照技術方案第二步對其進行處理，確定它二值化分割的閾值為18，中值濾波的鄰域大小為5(圖73)。
3、根據(jù)第二步所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGB，計算圖像中家蠶部分像素值平均值，也即用來衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達量的相對量的數(shù)值。
對于圖59(文件名為“ph59.jpg”)，調(diào)用matlab函數(shù)meanRGBmeanRGB(‘ph59.jpg’，1，18，5)，所得的結果為185。
權利要求
1.轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，其特征在于
1)是利用熒光體視顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因昆蟲的個體，用數(shù)碼相機或數(shù)碼CCD攝影設備，在暗室中按1/60秒-20秒曝光時間攝取表達熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲圖像；
2)運用圖像處理技術，首先將所得昆蟲圖像進行預處理，明確圖像中昆蟲部分和黑色背景界限，再將所攝取的表現(xiàn)熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲的RGB彩色圖像轉(zhuǎn)化為相應顏色分量的灰度圖像，按所得灰度圖像像素值的分布生成直方圖，根據(jù)該直方圖，按照選擇能夠清晰分割圖像背景和昆蟲部分的最小閾值的要求，確定二值化分割圖像的閾值，然后利用該閾值進行二值化分割圖像，得到一張與原圖像素大小一樣，但昆蟲部分像素值為1、即為白色，背景部分像素值為0、即為黑色的二值圖像，最后，利用中值濾波消除圖像斑點，確定中值濾波的鄰域大??；
3)根據(jù)所得的閾值和中值濾波的鄰域大小，利用matlab應用數(shù)學軟件，累加灰度圖像中分離所得昆蟲部分像素值，除以所取的像素點數(shù)，所得平均值作為轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達量的相對數(shù)值。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，其特征在于所述的圖像處理技術，使用photoshop圖像處理軟件、開源圖像處理軟件Gimp、或者matlab應用數(shù)學軟件，或者采用c、python編程語言編程實現(xiàn)。
3.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，其特征在于所述的相應顏色分量是根據(jù)轉(zhuǎn)基因昆蟲表達的熒光蛋白顏色確定，Red熒光基因是轉(zhuǎn)化為紅色顏色分量的灰度圖像，GFP、EGFP熒光基因是轉(zhuǎn)化為綠色顏色分量的灰度圖像，CFP和ECFP熒光基因是轉(zhuǎn)化為藍色顏色分量的灰度圖像。
4.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法，其特征在于所述的利用matlab應用數(shù)學軟件，是利用matlab應用數(shù)學軟件的圖像處理工具箱，建立了一個可供調(diào)用的函數(shù)meanRGB，程序代碼如下
function r＝meanRGB(filename，rgb，threshold，neighborhood)
f＝imread(filename)；
g＝f(，，rgb)；
b＝im2bw(g，threshold/256)；
if neighborhood
m＝medfilt2(b，[2*neighborhood+1，2*neighborhood+1])；
else
m＝b
end
r＝0；
n＝0；
h＝size(f，1)；
w＝size(f，2)；
for x＝1:1:h
for y＝1:1:w
if m(x，y)
n＝n+1；
r＝r+double(g(x，y))；
end
end
end
r＝r/n；
r＝int16(r)；
這個函數(shù)的調(diào)用接口是
輸入的參數(shù)filename為所攝取表達熒光的轉(zhuǎn)基因昆蟲圖像的文件名；rgb表明測量是紅、綠、藍哪種顏色的熒光。紅色熒光則該參數(shù)值為1，綠色熒光則該參數(shù)值為2，藍色熒光則該參數(shù)值為3；threshold為本權利要求書特征(2)所確定的閾值。neighborhood為本權利要求書特征(2)所確定的中值濾波鄰域大?。?br> 該函數(shù)調(diào)用后取得的結果即為圖像中昆蟲部分像素值平均值，也即用來衡量轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達的相對量的數(shù)值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量無損傷測定方法。是通過熒光體視顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因昆蟲個體，用數(shù)碼相機或數(shù)碼CCD攝影設備攝取圖像，利用圖像處理軟件，將所得圖像進行預處理，再將所攝取的RGB彩色圖像轉(zhuǎn)化為相應顏色分量的灰度圖像，確定二值化分割圖像的閾值和用于消除圖像二值化后斑點的中值濾波的鄰域大小，用matlab應用數(shù)學軟件計算所得昆蟲形體部分熒光值的平均值，作為轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達量的相對數(shù)值。它可在不損傷昆蟲、不需分子生物學或生化測試的情況下，通過熒光觀察和數(shù)碼照像，可獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲熒光基因表達相對量，達到定量地估量轉(zhuǎn)基因效率、估量外源基因與標志基因結合構成的融合蛋白表達量的目的。
文檔編號G06T7/60GK1912140SQ20061005282
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月7日 優(yōu)先權日2006年8月7日
發(fā)明者楊元杰, 鐘伯雄, 魯華云, 丁農(nóng) 申請人:浙江大學