。將芯片置于芯片干燥機(jī)(博奧生物，Slidewasher)，離心干燥。
[0026] 9)掃描。按照掃描儀(博奧生物，Luxscan 10K)操作規(guī)范和使用說明操作，設(shè)置參 數(shù)為：532nm(或?qū)?yīng)熒光波長(zhǎng)），Power 100%，PMT value 500
[0027] 10)數(shù)據(jù)提取:將對(duì)應(yīng)GAL文件打開，將芯片圖像和GAL文件每個(gè)陣列整體對(duì)齊，按 下自動(dòng)對(duì)齊按鈕，提取數(shù)據(jù)并保存LPR文件。
[0028](二)基于自行設(shè)計(jì)（自制)蛋白質(zhì)小芯片的活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物的驗(yàn)證 [0029]基于第一步的初篩結(jié)果，選擇差異較為明顯的94個(gè)結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)及本研究 團(tuán)隊(duì)既通過雙向凝膠電泳技術(shù)分離獲得的6個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，第二步自行設(shè)計(jì)（自制)含 100個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)小芯片，送公司點(diǎn)片，每個(gè)蛋白重復(fù)兩點(diǎn)點(diǎn)制，進(jìn)行200余份血清樣本 的臨床驗(yàn)證。
[0030] 1.檢測(cè)原理:特異性的抗體(包括IgG、IgM或其它類型抗體）與固定于芯片上的蛋 白進(jìn)行結(jié)合，清洗去除未結(jié)合的抗體和其它蛋白質(zhì)，再用抗人IgM焚光標(biāo)記二抗(cy5標(biāo)記， 呈現(xiàn)紅色）和抗人IgG熒光二抗(cy3標(biāo)記，呈現(xiàn)綠色)檢測(cè)，通過熒光掃描儀讀取信號(hào)，信號(hào) 的強(qiáng)弱與抗體的親和力和數(shù)量呈正相關(guān)。
[0031 ] 2.樣品要求:患者血清，凍存于-80度（由專利申請(qǐng)人提供）。
[0032] 3.準(zhǔn)備以下溶液：
[0033] 1)封閉液：lmllO%BSAm，加入9ml lx PBSml溶液，混勻。
[0034] 2)孵育液：lx PBST lx PBST1 溶液。
[0035] 3)清洗液：lx PBST。
[0036] 4 ·操作步驟：
[0037] 1)預(yù)封閉：使用芯片孵育盒，加入5ml封閉液，將芯片從_80°C取出，正面朝上置于 孵育盒中；再橫向放在側(cè)擺搖床上，50-60rpm，室溫，lOmin。
[0038] 2)封閉：倒棄封閉液，迅速加入5ml新的封閉液，側(cè)擺搖床20-30rpm，室溫2h。
[0039] 3)樣本孵育：倒棄封閉液，分別使用lXPBS，0.2XroS ddH 20q清洗1次，5min/次;然 后離心干燥。將專用圍欄安裝加入樣本:孵育液稀釋然后離心干燥。將專用圍欄安裝加入樣 本:孵育液稀釋然后離心干燥。將專用圍欄安裝加入樣本:孵育液稀釋1:200,并加入芯片 200ul體積，側(cè)擺搖床20-30rpm，4度過夜。
[0040] 4)清洗:將芯片取出（注意不能觸及或劃破的上表面)摘除圍欄，置于加入有40ml 清洗液的芯片盒，劇烈晃動(dòng)10-15次，并更換清洗液，再劇烈晃動(dòng)10-15次，充分去除游離一 抗;再次更換清洗液，至于水平搖床上充分去60-70，5min每次，清洗3次。
[0041 ] 5)熒光標(biāo)記I gG/1 gM二抗孵育：倒棄清洗液，迅速加入預(yù)先準(zhǔn)備好的二抗孵育液 3ml(l: 1000稀釋），側(cè)擺搖床20_30rpm，避光，室溫45min。注意需要避光。
[0042] 6)清洗:同步驟"4"。注意該過程應(yīng)避光操作。
[0043] 7)完成后用ddH 20清洗5min X 2次，并沖洗10s。注意該過程應(yīng)避光操作。
[0044] 8)干燥。將芯片置于芯片機(jī)，離心干燥。
[0045] 9)掃描。按照掃描儀的操作規(guī)范和使用說明，設(shè)置參數(shù)為：6 3 5 nm，P 〇 w e r 10 0 % Power,PMT value 400：532nm,Power 100%,PMT value 400〇
[0046] 10)數(shù)據(jù)提取:將對(duì)應(yīng)GALGAL文件打開，將芯片圖像GAL文件每個(gè)陣列整體對(duì)齊，按 下自動(dòng)對(duì)齊按鈕，提取數(shù)據(jù)并保存GPR文件。
[0047]二、數(shù)據(jù)分析與文獻(xiàn)資料查閱
[0048] 1.為了消除不同樣品、不同芯片之間的系統(tǒng)性差異帶來的誤差，需要對(duì)芯片數(shù)據(jù) 進(jìn)行歸一化處理。歸一化過程中，每個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的兩個(gè)點(diǎn)取平均值作為該蛋白響應(yīng)的信號(hào) 值。
[0049] 2.數(shù)據(jù)分析：按結(jié)核病診斷意義，將樣本組分為3組：正常對(duì)照組、結(jié)核潛伏感染 組、以及活動(dòng)性結(jié)核病組，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病診斷性血清分子標(biāo)志物。
[0050] 3.首先較獨(dú)立篩選出候選標(biāo)志物:根據(jù)每個(gè)蛋白對(duì)每個(gè)樣本的響應(yīng)信號(hào)值，假設(shè) 該蛋白在所對(duì)比的兩組樣本中具有顯著性差異且在TB組樣本中呈更強(qiáng)的響應(yīng)(免疫響應(yīng)較 強(qiáng)），并計(jì)算其可信程度，以T test的P值來表征，當(dāng)P Value<0.05時(shí)，表示具有顯著差異； 同時(shí)計(jì)算兩組樣本的信號(hào)均值差異比，以fold change(fc，fc = log2(TB組/對(duì)照組））來表 示，fc越大，表示響應(yīng)程度越高；另外，對(duì)于候選標(biāo)志物的組合，根據(jù)已知分組樣本的響應(yīng) 值，基于SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件，構(gòu)建判別函數(shù)，并最終繪制R0C曲線，給出臨床診斷評(píng)價(jià)指標(biāo)： 特異性和靈敏度。
[0051 ] 4.進(jìn)一步通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，優(yōu)化出最優(yōu)組合，并生成判別函數(shù)(Discrimination Function)，參數(shù)具體為:采用步進(jìn)式方法，以均值為描述參數(shù)，基于fisher函數(shù)系數(shù)的統(tǒng)計(jì) 分析，從標(biāo)志物優(yōu)選出血清分子標(biāo)志物。
[0052] 5.針對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病診斷的實(shí)際問題，從大量樣本中，優(yōu)先進(jìn)行正常對(duì)照組、結(jié)核 潛伏感染組以及活動(dòng)性肺結(jié)核組進(jìn)行診斷，最終獲得15個(gè)標(biāo)志物組合，分別為MT1560IgG， Rv0049IgM,Rv0270IgM,Rv0350IgG,Rv0350IgM,Rv0494IgM,Rvl597IgM,Rvl860IgG, Rvl876IgM，Rv2031cIgG，Rv2352cIgM，Rv2450cIgM，Rv2511IgG，Rv2688cIg]\^PRv3480cIgM。 這些標(biāo)志物組合，可較為準(zhǔn)確地區(qū)分活動(dòng)性肺結(jié)核與其它樣本組，可作為診斷活動(dòng)性肺結(jié) 核的候選標(biāo)志物，特異性為90.3%，靈敏度為85.4%。
[0053]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟 悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn) 單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一組活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物，其特征在于，包括抗MT1560IgG抗體、抗Rv0049IgM抗 體、抗Rv〇270IgM抗體、抗Rv0350IgG抗體、抗Rv0350IgM抗體、抗Rv0494IgM抗體、抗 Rvl597IgM 抗體、抗 Rv2450cIgM 抗體、抗 Rv2511IgG 抗體、抗 Rv2688cIgM 抗體、抗 Rv3480cIgM 抗體，抗Rv 18601 gG抗體、抗Rv 18761 gM抗體、抗Rv2031 c I gG抗體和抗Rv2352c I gM抗體，其序 列對(duì)應(yīng) SEQ:ID:NO:l-SEQ:ID:NO:15。2. 權(quán)利要求1所述活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物在篩選活動(dòng)性結(jié)核病診斷產(chǎn)品中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物及其用途，該組活動(dòng)性結(jié)核病診斷標(biāo)志物的序列對(duì)應(yīng)SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：15。該組結(jié)核病診斷標(biāo)志物來自結(jié)核分枝桿菌的15個(gè)抗原，判斷被檢人是否為活動(dòng)結(jié)核病，檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)組合診斷活動(dòng)性結(jié)核病的最佳工作點(diǎn)的特異性為90.3％，靈敏度為85.4％，均高于現(xiàn)有技術(shù)中活動(dòng)結(jié)核病診斷的指標(biāo)，且本技術(shù)為血清學(xué)檢測(cè)，標(biāo)本容易獲取，適用于各種可疑活動(dòng)性結(jié)核病，包括活動(dòng)性肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。
【IPC分類】G01N33/569
【公開號(hào)】CN105548545
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610089179
【發(fā)明人】陳玲, 張泓, 蘭遠(yuǎn)波, 唐明美, 曹志敏, 文強(qiáng), 李娜娜, 張建勇
【申請(qǐng)人】遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年2月17日