果較高后,取其脾細(xì)胞,按8:1 (數(shù)量配比)比 例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液,篩選陽性孔。利用有限 稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化,直到得到分泌吡蟲啉單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0028] 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇:將單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成IX106個(gè)/ml的細(xì)胞懸 液,在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管,立即放入37°C水浴中速融,離心去除凍存液后, 移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0029] 單克隆抗體的生產(chǎn)與純化:將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 5ml/只,7天后 腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X105個(gè)/只,7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸 錢法進(jìn)彳丁腹水純化, _20°C保存。
[0030] 4、羊抗鼠抗抗體的制備 以羊?yàn)槊庖邉游?,以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊,得到羊抗鼠抗抗體。
[0031] 5、酶標(biāo)記抗抗體的制備 將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。改良后 的反應(yīng)體系中酶與抗體的摩爾濃度比為1. 8-2. 5:1。
[0032] 6、酶標(biāo)板的制備 用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/ml,每孔加入100μ1,37°C避光孵育2h,傾去孔 中液體,用洗滌液洗滌1次,每次30s,拍干,然后在每孔中加入150μ1封閉液,37°C避光孵 育2h,傾去孔內(nèi)液體拍干,干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0033] 實(shí)施例2檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建 組建檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒,包含下述組分: (1) 包被吡蟲啉偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板; (2) 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液5瓶,濃度分別為0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L; (3) 抗體濃縮液; (4) 酶標(biāo)二抗; (5) 底物顯色液由底物顯色A液和底物顯色B液組成,底物顯色A液為過氧化脲,底物 顯色B液為四甲基聯(lián)苯胺; (6) 終止液為2mol/L硫酸; (7) 洗滌液為pH值7. 4,含有0· 5%~L0%吐溫-20、0· 01%。~0· 03%。疊氮化鈉防腐劑、 0. 1~0. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液,所述百分比為重量體積百分比; (8) 復(fù)溶液為pH值7. 0,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液,所述百分比為重量體積百分比。
[0034] 實(shí)施例3茶葉中吡蟲啉殘留的檢測 1、樣品前處理 稱取1. 〇g粉碎后茶葉樣本至50ml聚苯乙烯離心管中,加入5ml甲醇,用振蕩器振蕩lmin,3000g室溫下離心5min,移取上清50μ1至2ml潔凈干燥聚苯乙稀離心管中,加入 950μ1復(fù)溶液,用渦旋儀渦動混勻,取50μ1用于分析。
[0035] 2、抗體濃縮液與酶標(biāo)二抗混合:將抗體濃縮液和酶標(biāo)二抗以1:10的體積混合(即 1份抗體濃縮液與10份酶標(biāo)二抗混合)。
[0036] 3、用試劑盒檢測 向包被有吡蟲啉偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板微孔中加入吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液或經(jīng)前處理的樣 品溶液50μ1/孔,然后加入抗體濃縮液與酶標(biāo)二抗的混合液50μ1/孔,輕輕振蕩混勻, 用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min;小心揭開蓋板膜,倒出孔內(nèi)液體,每孔加 入250μ1洗滌液充分洗滌4~5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干;每孔加入底物顯色A液 50μ1,底物顯色B液50μ1,輕輕振蕩混勾,用蓋板膜蓋板后置25°C避光顯色15min;每孔 加入終止液2mol/L硫酸50μ1,輕輕振蕩混勻,用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處(建議用雙波 長450/630nm檢測,請?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測定每孔吸光度值(0D值)。
[0037] 4、檢測結(jié)果分析 標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的平均吸光度值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(〇標(biāo)準(zhǔn))的平均吸光度值,再 乘以100%,得到標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以吡蟲啉標(biāo) 準(zhǔn)品濃度(μg/L)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,如圖3所示。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn) 曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中吡蟲啉 實(shí)際濃度。
[0038] 實(shí)施例4吡蟲啉技術(shù)參數(shù)的確定試驗(yàn) 1、試劑盒靈敏度和檢測限 按照常規(guī)方法測定試劑盒靈敏度,試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)為1yg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍 為1~27μg/L,IC5。(50%抑制濃度)浮動范圍為11~15μg/L;對20份樣品進(jìn)行檢測,從標(biāo) 準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)于各百分吸光度值的濃度,以20份樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表 示檢測限,結(jié)果得該方法對樣本的檢測限為100μg/kg,靈敏度1μg/kg。
[0039] 2、樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 以回收率作為準(zhǔn)確度評價(jià)指標(biāo),重復(fù)測定某一濃度樣品的檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD%)作為精密度評價(jià)指標(biāo)。計(jì)算公式為:回收率(%)=實(shí)際測定值/理論值X100%,其 中理論值為樣品的添加濃度;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD% =SD/XX100%,其中SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差,X為 測定數(shù)據(jù)的平均值。
[0040] 按50、150μg/kg、450μg/kg三個(gè)濃度吡蟲啉對茶葉樣品進(jìn)行添加回收測定,每 個(gè)樣品做3個(gè)平行,用三批不同試劑進(jìn)行測定,計(jì)算樣品的平均回收率及精密度,平均回收 率在89. 5%~101. 2%之間;批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。
[0041]
[0042] 3、試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn) 試劑盒保存條件為2~8°C,經(jīng)過12個(gè)月的測定,試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50% 抑制濃度、吡蟲啉添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮在運(yùn)輸和使用過程中,會有非正 常保存條件出現(xiàn),將試劑盒在37°C保存條件下放置12天,進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明該 試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求??紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生,將試劑盒放入_20°C冰箱冷凍 7天,測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2~8°C至 少保存12個(gè)月以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測茶葉中吡蟲啉殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于包括:包被有偶聯(lián)抗原 的酶標(biāo)板、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述吡蟲啉偶聯(lián)抗原是由吡蟲啉半抗原與 載體蛋白偶聯(lián)得到,載體蛋白可為牛血清白蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白。3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述吡蟲啉半抗原是由氧化還原反應(yīng)得 至1J,分子結(jié)構(gòu)式為:4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述吡蟲啉特異性抗體是以吡蟲啉偶聯(lián)抗 原作為免疫原制備獲得,所述吡蟲啉特異性抗體優(yōu)選吡蟲啉單克隆抗體。5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物 酶,底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲,底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺, 終止液為l~2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液。6. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述洗滌液為pH值7. 4,含有0. 5%~1. 0% 吐溫-20、0. 01%。~0. 03%。疊氮化鈉防腐劑、0. 1~0. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液;所述復(fù)溶液為 pH值7. 0、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液,所述百分比為重量體積百分比。7. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為 0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測茶葉中吡蟲啉殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法,它包括:包被有吡蟲啉偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、底物顯色液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液。本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒可用于快速檢測茶葉中吡蟲啉的含量,具有操作簡便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本篩查的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/543, G01N33/535
【公開號】CN105301233
【申請?zhí)枴緾N201510517049
【發(fā)明人】馮才偉, 崔海峰, 何方洋, 馮靜, 萬宇平, 謝體波, 扶勝, 陸葦, 魏麗麗
【申請人】貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年8月21日