檢測茶葉中吡蟲啉殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測茶葉中吡蟲啉殘留的酶聯(lián)免疫 試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 啦蟲啉（Imidacloprid)，又稱咪姐胺、姐虱凈，是新一代氯代尼古丁殺蟲劑，具有 廣譜、高效、低毒、低殘留，害蟲不易產(chǎn)生抗性，對人、畜、植物和天敵安全等特點(diǎn)，并有觸殺、 胃毒和內(nèi)吸多重藥效。害蟲接觸藥劑后，中樞神經(jīng)正常傳導(dǎo)受阻，使其麻痹死亡。速效性好， 藥后1天即有較高的防效，殘留期長達(dá)25天左右。藥效和溫度呈正相關(guān)，溫度高，殺蟲效果 好，生產(chǎn)上主要用于防治刺吸式口器害蟲。
[0003] 吡蟲啉殺蟲譜較廣，包括同翅目、纓翅目、鞘翅目、雙翅目及鱗翅目等，尤其對刺吸 式害蟲具有內(nèi)吸性和高殘效的特點(diǎn)，目前，吡蟲啉在世界范圍內(nèi)的銷售額位列殺蟲劑的首 位。吡蟲啉制劑產(chǎn)品，在我國已獲得在茶樹上的登記使用，用于防治茶樹上的主要害蟲小綠 葉蟬、黑刺粉虱，效果優(yōu)于噻嗪酮、醚菊酯、抗蚜威和殺螟丹等農(nóng)藥。日本規(guī)定吡蟲啉在茶葉 中的限量標(biāo)準(zhǔn)為l〇mg/kg，我國規(guī)定茶葉中P比蟲啉最大殘留限量為0. 5mg/kg。
[0004] 我國茶葉品質(zhì)優(yōu)良、口感獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，是我國浙江、貴州、福建等省的重要經(jīng)濟(jì) 作物，我國茶文化源遠(yuǎn)流長，茶葉是我國百姓生活中，必不可少的飲品，同時(shí)，我國出產(chǎn)的茶 葉，深受國際市場的青睞，遠(yuǎn)銷歐盟、日本、韓國、美國等國家和地區(qū)。
[0005] 從現(xiàn)有技術(shù)和相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)看，目前針對吡蟲啉殘留的檢測方法主要是儀器 方法，高效液相法（HPLC)、氣相色譜法（GC)、電化學(xué)分析法（EA)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 (GC-MS)等，儀器方法具備檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，但是檢測樣本前處理繁瑣、耗 時(shí)，樣品還需提取和凈化處理，同時(shí)儀器檢測方法需要昂貴的大型儀器和設(shè)備、配備專業(yè)的 檢測技術(shù)人員，進(jìn)行操作和管理，無法進(jìn)行現(xiàn)場大規(guī)模檢測，時(shí)效性差，難以推廣。近年來藥 物殘留免疫檢測技術(shù)已經(jīng)在食品質(zhì)量安全快速檢測中，得到了廣泛的應(yīng)用，且逐漸被人們 所認(rèn)可，酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)具有樣品前處理簡單，檢測快速、靈敏、特異性好、準(zhǔn)確度高等特 點(diǎn)，能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的要求，從而彌補(bǔ)儀器檢測的不足。
[0006] 在國際市場競爭日益激烈、食品安全日益重視的今天，尋求茶葉中快速檢測農(nóng)藥 殘留的有效手段至關(guān)重要。本發(fā)明提供的吡蟲啉殘留酶聯(lián)免疫試劑盒只需一步反應(yīng)，耗時(shí) 45分鐘，即可得到檢測結(jié)果，且檢測限為100μg/kg，靈敏度可達(dá)lug/kg，優(yōu)于同類產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠檢測茶葉樣本中吡蟲啉殘留量的酶聯(lián)免疫試劑 盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法。
[0008] 本發(fā)明試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標(biāo)板、吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、 底物顯色液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液，所述包被原為吡蟲啉偶聯(lián)抗原，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo) 記抗抗體。
[0009]所述吡蟲啉偶聯(lián)抗原是由吡蟲啉半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述吡蟲啉半抗原 是由氧化還原反應(yīng)得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血 清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原，優(yōu)選牛血清蛋白和卵清蛋白。
[0010] 所述吡蟲啉特異性抗體是以吡蟲啉偶聯(lián)抗原作為免疫原制備獲得，所述吡蟲啉特 異性抗體可為吡蟲啉單克隆抗體或吡蟲啉多克隆抗體，其中優(yōu)選吡蟲啉單克隆抗體。
[0011] 所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，其中優(yōu)選羊抗鼠抗抗體。
[0012] 所述酶標(biāo)二抗的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶；酶標(biāo)二抗是采用戊二醛法或過碘酸鈉 法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。
[0013]為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底 物顯色液、終止液、洗滌液、復(fù)溶液。
[0014] 所述吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品溶液5瓶，濃度分別為0 μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/ L〇
[0015] 當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，所述底物顯色液由底物顯色A液和底物顯色B液 組成，A液為過氧化氫或過氧化脲，B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，所述終止液為l~2mol/ L的硫酸或鹽酸緩沖液。
[0016] 所述洗滌液優(yōu)選為pH值7. 4,含有0. 5%~1. 0%吐溫-20、0. 01%。~0. 03%。疊氮化鈉 防腐劑、〇.l~〇. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0017] 所述復(fù)溶液優(yōu)選為pH值7. 0,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積 百分比。
[0018]其中在酶標(biāo)板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽 緩沖液，封閉液為pH值7. 1~7. 5,含有1%~3%酪蛋白、0. 1~0. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述 百分比為重量體積百分比。
[0019] 本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/ml，每孔加 入100μ1，37°C避光孵育2h或4°C過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌1次，每次30s，拍干， 然后在每孔中加入150μ1封閉液，37°C避光孵育l~2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜 真空密封保存。
[0020] 本發(fā)明的檢測原理為： 在微孔條上預(yù)包被吡蟲啉偶聯(lián)抗原，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加入吡蟲啉特 異性抗體溶液，樣本中的吡蟲啉與酶標(biāo)板上包被的吡蟲啉偶聯(lián)抗原競爭抗吡蟲啉特異性抗 體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光度值與吡蟲啉的含量呈負(fù)相 關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得到樣本中吡蟲啉的殘留量；同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系 列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中吡蟲啉殘留量的濃度范圍。若無酶標(biāo) 儀，則不加終止液，用目測法可進(jìn)行判定。
[0021] 本發(fā)明檢測吡蟲啉的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用競爭ELISA方法定性或定量檢測 樣品中吡蟲啉的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批 量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確 度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便 利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便的特點(diǎn)，適于大批量樣品篩選的定性、定量。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :吡蟲啉半抗原合成路線圖； 圖2 :吡蟲啉半抗原核磁共振氫譜圖； 圖3:試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明，而不是來限制本發(fā)明的范圍。
[0024] 實(shí)施例1試劑盒組分的制備 1、吡蟲啉半抗原的制備 25ml三角瓶中加入吡蟲啉0. 10g，加入適量二氯甲烷，使其完全溶解，加入5ml巰基丙 酸，加入1. 0-2. 0g氫氧化鉀作為催化劑，加熱回流，提取純化，干燥所得淡黃色固體即為吡 蟲啉半抗原，如圖1所示。 取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測定，如圖2所示，4. 7ppm左右的峰為咪唑啉環(huán)上的兩個(gè) 亞甲基信號峰，5.Oppm左右的峰為芐基信號峰，7. 2-8. 7ppm為氨基與芳環(huán)混合信號峰，說 明目標(biāo)半抗原合成成功。
[0025] 2、抗原的制備 稱取32. 5mg半抗原溶解于2mLDMF溶液中，加入60mgEDC和60mgNHS(溶于2mL水 中）進(jìn)行活化30分鐘，加入到100-250mg載體蛋白BSA(溶于3mL水中）進(jìn)行偶聯(lián)制備出免 疫原，用0. 02mol/LPB緩沖液透析3天，每天早晚更換透析液，透析完成后用于動物免疫制 備出抗體。同樣的方法將半抗原與載體蛋白0VA進(jìn)行偶聯(lián)制出包被原用于抗體檢測。
[0026] 3、吡蟲啉單克隆抗體的制備 動物免疫：將上述步驟得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為200μg/只， 使其產(chǎn)生抗血清。
[0027] 細(xì)胞融合和克隆化：小鼠血清測定結(jié)